專利名稱：：主鏈環(huán)化的促黑皮質素激素(αMSH)類似物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及促黑皮質素激素(aMSH)類似物(melanocortinstimulatinghormone(aMSH)analogs)、含有所述促黑皮質素激素類似物的藥物組合物以及使用這樣的化合物來治療包括肥胖癥的代謝紊亂的方法。
背景技術：
：肥胖癥的治療世界范圍內的肥胖癥患病率日漸增長并且目前被認為是二十一世紀西方世界的主要流行病。美國超過50%的人口被認為超重，其中超過25%的人被診斷為臨床上的肥胖。統(tǒng)計數(shù)據顯示肥胖癥始于年輕時期——15%的兒童和少年體重超重，該數(shù)據比25年前所報道的高出3倍。因此，研究預防肥胖癥的療法具有明確的經濟和醫(yī)學理據。目前，全世界的許多科學家和制藥公司正在探索適于解決此問題的藥理學解決方案。已知較高的身體肥胖是II型糖尿病最高的風險因素，并且是心血管疾病的高風險因素。肥胖癥^皮^H人為以下的風險因素高血壓、動月永粥樣硬化、充血性心力衰竭、中風、膽嚢疾病、骨關節(jié)炎、睡眠呼吸暫停；生殖障礙(reproductivedisorders)，如多嚢卵巢綜合征、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌；以及全身麻醉并發(fā)癥增加的發(fā)病率(參見，如，Kopelman,Nature404:635-43,2000)。肥胖癥縮短壽命并且?guī)砣缟纤龅牟⒋娌?co-morbidities)以及諸如以下疾病的嚴重風險感染、靜脈曲張、黑棘皮癥、濕滲、運動不耐受(exerciseintolerance)、胰島素抵抗、高血壓、高膽固醇血癥、膽石癥、矯形損傷(orthopedicinjury)和血才全栓塞性疾病(Rissanen等人，BMJ301:835-7,19卯)。肥胖癥還是稱為胰島素抵抗綜合征或"X綜合征"的病癥組的風險因素。肥胖癥是由進入身體的卡路里數(shù)量與同時被利用和消耗的能量之間的慢性失調引起的。因此，食用高卡路里的食物并且缺乏體育活動可導致肥胖。盡管在食物利用率和體育活動方面存在很大變動，但是哺乳動物中的能量儲存卻保持著相對的恒定。通過受瘦素激發(fā)的內分泌反饋回路來實現(xiàn)這種嚴密的調節(jié)。由脂肪細胞產生的瘦素向下丘腦發(fā)送營養(yǎng)狀況的信號。血漿中瘦素的濃度與脂肪組織的質量有關并且在禁食期間下降。瘦素信號觸發(fā)了涉及調節(jié)食欲和能量消耗的神經肽的神經內分泌響應。瘦素中的一部分還影響腦垂體的分泌，從而介導了以下與食物剝奪相關聯(lián)的適應性激素反應循環(huán)曱狀腺激素水平的變化、生殖能力和線性生長的抑制。促進食^t的肽(神經肽Y、食欲肽等)受到瘦素的抑制，相反瘦素激發(fā)了^L食欲減退的信號。目前，所有可獲得的用于治療肥胖癥的藥物均是次優(yōu)的。當前可獲得的肥胖癥的治療包括奧利司他和西布曲明。奧利司他(四氫泥泊司它汀(tetrahydrolipstatin))是由鏈霉菌屬的霉菌生成的天然脂肪酶抑制劑獲得的合成藥物。該藥物與胰脂肪酶的活性位點共價結合，所述胰脂肪酶是負責甘油三酯水解的主要的酶，甘油三酯占飲食脂肪的99%;該藥物還抑制了其它腸和腸外的脂肪酶，但是所述藥物的作用局限于腸腔，原因是其基本上為非吸收性的。治療劑量的奧利司他(每天3次，每次120mg)阻斷了大約30%的飲食脂肪的消化和吸收，這只占其重量減輕作用的部分而非全部，剩下的可歸因于患者選^^避免能夠引起胃腸道副作用的高脂肪食物。西布曲明是中樞作用食欲抑制劑，其也具有溫和的產熱性能。西布曲明通過增強于下丘腦和其他腦部區(qū)域作用以誘導負能不足的兩種一元胺(即5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素)的作用而起作用。當在嚙齒類和低級的靈長類中進行中樞注射時，5-HT和去甲腎上腺素均抑制食物掘^取并通過刺激至產熱組織的交感神經傳出而增加能量消耗。西布曲明阻斷兩種一元胺的重攝取，并由此提高所述一元胺在突觸間隙中的利用率；與芬氟拉明不同的是，西布曲明并未促進5-HT從5-羥色胺能神經末梢的釋放。去曱腎上腺素重攝取的抑制增加了交感緊張，其結果包括所希望的產熱作用和不希望的心血管副作用一一血壓和脈率的升高。由于西布曲明對兩種一元胺的作用，而使其被稱為"SNRT(5-羥色胺/去曱腎上腺素重攝取抑制劑)。新型抗肥胖藥物的潛在的CNS靶包括食物攝取和能量調節(jié)中所涉及的各種肽。這些肽是有關轉化為口服活性的抗肥胖藥物的熱點研究的主題。這些肽包括神經肽Y(NPY)、食欲肽和黑皮質素。應強調的是這些肽類似物不能跨越腸壁，因而不具有口服生物利用度。黑皮質素激動肽一種被提議用于這種顯著健康問題的藥物療法的解決方案是調節(jié)身體中控制食物消耗和代謝平衡的生物化學通路。"黑皮質素通路"是關鍵的能量平衡內分泌調節(jié)系統(tǒng)(Cummings和Schwartz2000,NatGenet.26(1):8-9)。用于控制熱量攝取的藥理學方法的現(xiàn)有技術集中于"黑皮質素通路，，反饋級聯(lián)過程的晚期。該過程包括將分解代謝的內源性神經肽促黑皮質素激素(aMSH)結合于其黑皮質素亞型4(MC4)受體，從而產生對抗作用。這種黑皮質素(MC)亞型受體調節(jié)脂肪燃燒的速率并因此影響重量穩(wěn)態(tài)(Luevano，C.H.等人，Biochemistry,2001.40:p.6164-6179)。由于其直接參與攝食行為，因此MC4受體是設計選擇性強效激動劑以治療肥胖癥的靶以及設計選擇性拮抗劑以治療厭食癥的靶。中樞黑皮質素系統(tǒng)在能量穩(wěn)態(tài)的調節(jié)中起關鍵作用。黑皮質素肽(a，β,"促黑激素和促腎上腺皮質激素ACTH)是黑皮質素受體的內源性激動劑配體，且通過阿黑皮素(POMC)基因轉錄物的翻譯后加工獲得。所有的黑皮質素肽激動劑均含有核心四肽His-Phe-Arg-Trp，其是配體選捧性和黑皮質素受體興奮的原因。因此，可以將四肽His-Phe-Arg-Tip作為設計對抗肥胖癥的治療劑的先導(Haskell-Luevano，Lim等人.2000，Peptides.21(1):49-57)。迄今為止，黑皮質素家族包括5種已鑒別的、刺激cAMP第二信使信號轉導途徑的受體(MC1R-MC5R)。黑皮質素家族成員間的序列同源性范圍從35%至60%(Cone等人，Rec.Prog.HormoneRes.1996,51:287-318),但是這些受體的功能卻各異。例如，MC1-R是響應MC1-R的強效激動劑aMSH來調節(jié)色素沉著的G蛋白偶聯(lián)受體。MC1-R受體的激動導致黑素細胞興奮，從而產生真黑素并增加皮膚癌的風險。MC1-R的激動還可以具有神經學效應。MC2-R活性的激發(fā)可導致腎上lli且織癌。MC3-R和MC5-R的激動效應仍未知。所有的黑皮質素受體均可響應肽激素類的促黑素細胞激素(MSH)。由于各種受體的功能各異，因而使得同時激動多種黑皮質素受體的活性具有？1起不期望的副作用的潛力。因此，希望獲得受體選擇性的激動劑?？诜幬锸┯帽Ａ袅俗顑?yōu)的化學實體全身給藥途徑，特別是用于治療諸如肥胖癥的慢性疾病。然而，作為廣泛的腸內代謝降解和弱的腸滲透性的結果，肽具有差的口服生物利用度。肽在腸腔和刷狀緣中的酶穩(wěn)定性是決定肽口服生物利用度的主要因素，原因是這些區(qū)域具有大量的蛋白水解酶。因此，蛋白水解酶顯著地削弱了完整肽繼口服施用后到達全身循環(huán)的能力。對于四(和更大的)肽而言，超過90%的蛋白水解活性是由結合于刷狀緣膜的酶產生的。弱的肽滲透性一般歸因于導致低細胞穿透的、不相容的理化性質的組合。因此，肽的成功口服遞送將取決于設計來改變這些潛在藥物的物理化學特性以改善代謝穩(wěn)定性和腸滲透性而不影響所述藥物藥理活性的策略。由于內源性aMSH的肽類似物在血液和胃腸(GI)道中均具有弱的代謝穩(wěn)定性(極短的半衰期)，因此其不能用作對抗肥胖癥的治療化合物。已經證明將具有MC4-F激動劑活性的aMSH的環(huán)狀七肽類似物注射入小鼠第三腦室或進行腹膜內注射時，可在小鼠中引起持久的食物攝取抑制作用。當與MC4-R拮抗劑共同施用時，這種效應是可逆的(Fan等人，Nature,1997385:165-168)。因此，MC4-R活性的激動劑可用于治療或預防肥胖癥。美國專利申請公布No.20010056179公開了具有黑皮質素-4受體(MC4-R)激動劑活性的選擇性線性肽。WO2003/095474公開了具有黑皮質素-4受體激動劑活性的具體的肽衍生物。WO2005/009950公開了哌啶衍生物，所述哌咬衍生物為人黑皮質素-4受體的選擇性激動劑。美國專利申請公布No.20020143141公開了具有MC4-R激動劑活性的選擇性內酰胺橋連的環(huán)狀肽。WO02/18437公開了具有用于治療肥胖癥的MC4-R激動劑活性、經由二硫化物或內酰胺橋環(huán)化的肽。WO2003/006604公開了作為有效的選擇性黑皮質素-4受體激動劑的環(huán)狀肽。WO2005/030797公開了具有MC4-R激動劑活性的、包括7-12個氨基酸的環(huán)狀肽。然而，這些肽類似物不能跨越腸壁，因而不具有口服生物利用度。改善的肽類似物作為有機化學和分子生物學主要進展的結果，目前可以足夠用于藥理學和臨床應用的量來制備生物活性肽。因此在最近幾年中，確立了用于治療和診斷疾病的、其中涉及肽的新方法。然而，使用肽作為治療劑和診斷劑受到以下因素的限制a)弱的組織穿透；b)對于胃腸道和血清中蛋白酶解的低的代謝穩(wěn)定性；c)口服攝入后差的吸收，其可特別歸因于肽相對高的分子量或特異性轉運系統(tǒng)的缺乏或兩者都有；d)通過肝和腎的快速排泄；和e)由于肽受體廣泛分布于有機體而產生的不期望的非靶器官系統(tǒng)中的副作用。希望獲得具有更高特異性的肽類似物，從而實現(xiàn)提高的臨床選擇性。制備克服天然肽分子缺陷的構象約束的肽類似物并由此提供改善的治療性能將是最有益的。Gilon等人提出構象約束肽的新概念上的方法(Biopolymers，1991，31，745),其提出肽的主鏈環(huán)化。主鏈環(huán)化是將構象約束施加于肽的一般方法。在主鏈環(huán)化中，肽主鏈中的原子(N和/或C)相互共價連接形成環(huán)。這種策略的理論優(yōu)勢包括經由肽主鏈的碳或氮來實現(xiàn)環(huán)化的能力，且不干擾對于與給定肽的特異性受體相互作用而言至關重要的側鏈。Gilon和同事做出了進一步的公開(WO95/33765、WO97/09344、US5,723,575、US5,811,392、US5，883，293、US6,265,375和US6,407059),其提供了主鏈環(huán)化的肽類似物合成中所需要的結構單元(buildingunits)的制備方法。還公開了使用這些方法可以成功地制備出以下主鏈緩激肽類似物的環(huán)化的肽類似物(US5,874,529)和具有促生長素抑制素活性的主鏈環(huán)化的肽類似物(WO98/04583、WO99/65508、US5,770,687、US6,051,554和US6,355,613)。尚需合成具有增加的體內穩(wěn)定性的、口服可利用的aMSH擬肽(peptidomimetic)類似物，以便用于治療諸如肥胖癥的代謝紊亂。希望獲得對MC4受體具有更高親合力和選4奪性的aMSH肽類似物，并由此獲得用于治療代謝紊亂的藥物化合物。
發(fā)明內容本發(fā)明提供了治療上有用的aMSH類似物(其為主鏈環(huán)狀的肽類似物)、包括這些aMSH類似物的藥物組合物及其使用方法。本發(fā)明特別提供了用于治療代謝紊亂的、受體特異性的aMSH主鏈環(huán)化的類似物。對肥胖癥關聯(lián)的黑皮質素-4受體(MC-4R)具有激動劑活性的、根據本發(fā)明的新類似物可用于治療包括肥胖癥的代謝紊亂。根據本發(fā)明所提供的類似物具有延長的代謝穩(wěn)定性、高的腸滲透性、口服利用率和體內藥理活性。根據本發(fā)明的一方面，提供了主鏈環(huán)化的aMSH類似物，該類似物包括引入至少一個結構單元的4至12個氨基酸的肽序列，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、碌u醚、碌u代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中所述至少一個結構單元經由橋基連接至選自由第二結構單元、所述肽序列的氨基酸殘基的側鏈和N末端氨基酸殘基組成的組的部分，以形成環(huán)狀的結構。優(yōu)選地，所述肽序列引入了5至8個氨基酸。根據一些實施方案，橋基是具有如下通式(VII)的化學連接體Z-(CH2)m-M-(CH2)n式(vII)其中m和n分別獨立地為1至8的整數(shù)；M選自二硫化物、酰胺、硫醚、石克代酸酯、亞胺、醚或烯橋組成的組，且Z不存在或者為包括兩個羧基的分子。本發(fā)明的一個實施方案是通式I的主鏈環(huán)狀的肽類似物(SEQIDNO:2):<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式(i)其中R為氨基酸的側鏈，X為OH、NH2或酯，m表示從1至8的整數(shù)，并且n表示從1至8的整數(shù)。根據一些實施方案，m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。根據本發(fā)明的另一個實施方案是式II的主鏈環(huán)狀的肽類似物(SEQIDNO:3):<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(II)其中m表示從1至8的整數(shù)，且n表示從l至8的整數(shù)。根據一些實施方案，m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。根據式II的優(yōu)選的肽是其中環(huán)大小為約20至約27個原子的那些肽。更優(yōu)選的肽選自以下肽組成的組根據式II的肽，其中n=2,m=2;根據式II的肽，其中n=3，m=3;根據式II的肽，其中n^3,m二2;根據式II的肽，其中n二3,m二5;根據式II的肽，其中n^2,m二4。目前一個優(yōu)選的實施方案是其中n^2且m二2的式n的肽，此處表示為BBC-1。根據本發(fā)明的另外的實施方案是式m的主鏈環(huán)狀的肽類似物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中n表示從1至8的整數(shù)。根據一些實施方案，n表示從2至6的整數(shù)。根據式III的優(yōu)選的肽選自以下肽組成的組根據式m的肽，其中n=2;根據式m的肽，其中n=3;根據式in的肽，其中n=4根據式ni的肽，其中n=6。根據本發(fā)明的另一個實施方案是式IV的主鏈環(huán)狀的肽類似物:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(iv)其中n表示從l至8的整數(shù)。根據一些實施方案，n表示從2至6的整數(shù)。根據式IV的優(yōu)選的肽選自以下肽組成的組根據式IV的肽，其中n=2;根據式IV的肽，其中11=3;根據式IV的肽，其中n=4;根據式IV的肽，其中n=6。根據本發(fā)明的另一方面，提供了包括aMSH主鏈環(huán)狀的肽類似物作為活性成分的藥物組合物。根據一個實施方案，該藥物組合物經配制用于口服施用。根據另外的方面，本發(fā)明提供了用于治療或預防與黑皮質素-4受體活性關聯(lián)的疾病或病癥的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的包括aMSH的主鏈環(huán)狀肽類似物作為活性成分的藥物組合物。根據一些實施方案，所述病癥為代謝紊亂。根據一個實施方案，所述代謝紊亂為糖尿病。根據優(yōu)選的實施方案，所述代謝紊亂為肥胖癥。根據另一個實施方案，活性成分的量范圍從約10昭/kg至1000嗎/kg。根據又一方面，本發(fā)明提供了aMSH的主鏈環(huán)狀的肽類似物在制備用于治療或預防與黑皮質素-4受體活性關聯(lián)的疾病或病癥的藥物中的用途。結合以下的附圖、說明和權利要求，本發(fā)明這些和其他的實施方案將變得顯而易見。附圖簡述困l描繪了合成根據本發(fā)明的肽文庫的圖解(m=2、3、4、5;n=2、3、4、6)。圖2描述了受保護的源自甘氨酸的結構單元的合成。圖3描述了根據本發(fā)明的主鏈環(huán)化(BBC)文庫的一般結構。圖4顯示來自文庫I的MC-4肽與具有已知的腸滲透性的標準分子相比較的滲透性系數(shù)值(Papp):甘露醇顯示出弱的滲透性，而睪酮和普萘洛爾表示出強的腸滲透性。困5證實了肽的主鏈環(huán)化對大鼠腸刷狀緣膜中代謝穩(wěn)定性的影響。困6顯示主鏈環(huán)狀的肽BBC-1的化學結構。圖7證實了BBC-1對小鼠食物消耗的影響。將數(shù)據表示為平均值土SEM。通過使用Dunnett事后^r驗的單因素方差分析來進行統(tǒng)計分析；*，P<0.05。圖8A-B顯示由反相HPLC(RP-HPLC)(8A)和MALDI國TOFMS(8B)進行的BBC1表征。發(fā)明詳述目前公開了主鏈環(huán)狀的擬肽方法已經導致具有黑皮質素-4受體激動劑活性的主鏈環(huán)狀肽aMSH類似物的發(fā)現(xiàn)。所述(xMSH類似物優(yōu)選通過口服施用，用于治療包括肥胖癥的代謝紊亂。根據本發(fā)明，具有強的腸滲透性、延長的代謝穩(wěn)定性、口服利用率和體內藥理活性的aMSH主鏈環(huán)狀的肽類似物選自主鏈環(huán)化的肽類似物的文庫。如此處所用，術語"主鏈環(huán)狀的肽類似物，，指氨基酸殘基序列，其中所述肽主鏈中的至少一個氮或碳與選自另一個這樣的氮或碳的部分、側鏈或所述肽的一個末端連接在一起。此外，該序列中的一個或多個肽4定可以被還原或由非肽鍵所取代。術語"氨基酸"指具有氨基和羧酸基團、優(yōu)選在碳主鏈上以1,2-、1，3-或1，4-模式進行取代的化合物。a-氨基酸是最優(yōu)選的，并且其包括在蛋白質中發(fā)現(xiàn)的20種天然氨基酸(其為除了甘氨酸之外的L-氨基酸)、相應的D-氨基酸、相應的N-曱基氨基酸、側鏈修飾的氨基酸、蛋白質中未發(fā)現(xiàn)的生物合成的可利用的氨基酸(如，4-羥基-脯氨酸、5-羥基-賴氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、p-氰基酸(p-cyanolanine))和合成得到的a-氨基酸，如氨基異丁酸、正亮氨酸、正纈氨酸、同型半胱氨酸和同型絲氨酸。p丙氨酸和Y氨基丁酸分別為1，3和1,4-氨基酸的實例，并且其他多種氨基酸為本領域公知。Statine樣(Statine-Uke)電子等排物(包括兩種氨基酸的二肽，其中以CHOH代替CONH鍵)、羥基乙烯電子等排物(包括兩種氨基酸的二肽，其中以CHOHCH2代替CONH鍵)、被還原的酰胺電子等排物(包括兩種氨基酸的二肽，其中以CH2NH鍵代替CONH鍵)和硫代酰胺電子等排物(包括兩種氨基酸的二肽，其中以CSNH鍵代替CONH鍵)也是本發(fā)明有用的殘基。本發(fā)明中使用的氨基酸是商業(yè)上可獲得的或可通過常規(guī)的合成方法獲得的那些氨基酸。某些殘基可能需要特殊的方法來引入肽，并且連續(xù)的、發(fā)散的或匯集的合成肽序列的方法在本發(fā)明中是有用的。根據IUPAC規(guī)定，天然編碼的氨基酸及其衍生物由三字母的代碼表示。當沒有指示時，使用L異構體。在殘基縮寫之前，將D異構體標為"D"。如本領域技術人員已知的，氨基酸的保守置換在本發(fā)明的范圍內。氨基酸保守置換包括一種氨基酸與另一種具有相同類型官能團或側鏈的氨基酸的置換，所述官能團或側鏈如脂肪族的、芳香族的、正電荷的、負電荷的。這些置換可以提高口服生物利用度、增強進入中樞神經系統(tǒng)的穿透、靶向特異性的細胞群等等。技術人員將理解，改變、添加或除去編碼序列中單個氨基酸或小百分比氨基酸的對肽、多肽或蛋白質序列的個別置換、去除或添加是"保守修飾的變體，，，其中所述改變導致了氨基酸與化學性質類似的氨基酸的置換。提供官能類似的氨基酸的保守置換表為本領域所公知。以下六組各自包括相互為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯基丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。如此處所用，"肽，，指經由肽鍵連接的氨基酸序列。根據本發(fā)明的肽包括4至12個氨基酸殘基、優(yōu)選5至8個殘基的序列。根據本發(fā)明的肽類似物可以任選地包括至少一個酰胺取代鍵，如脲鍵、氨基曱酸酯鍵、氨磺酰鍵、肼鍵或任何其它共價鍵。本發(fā)明肽的鹽和酯均包括在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明肽的鹽為生理上可接受的有機鹽和無機鹽。本發(fā)明肽的功能衍生物覆蓋了可以通過本領域已知的方式來從作為殘基上的側鏈或N-或C-末端基團出現(xiàn)的官能團制備的衍生物，并且只要所述衍生物保持為藥學上可接受的，即，只要所述衍生物均可包括在本發(fā)明中。例如，這些衍生物可以包括羧基的脂肪族酯；通過與氨或與伯胺或仲胺反應生成的羧基酰胺；通過與?；糠?如，烷?；蛱辑h(huán)的芳酰基)反應形成的氨基酸殘基游離氨基的N-?；苌?；或通過與?；糠址磻纬傻挠坞x羥基(例如絲氨酸或蘇氨酰殘基的羥基)的O-酰基衍生物。術語"類似物”指除了一個或多個氨基酸改變之外，具有根據本發(fā)明的氨基酸序列的分子。合適的"類似物，，的設計可以是計算機輔助的。根據本發(fā)明的肽類似物可以任選地包括至少一個酰胺置換鍵，如脲鍵、氨基甲酸酯鍵、氨磺酰鍵、肼鍵或任何其它共價鍵。術語"擬肽"指以如下方式修飾的根據本發(fā)明的肽其包括至少一個非編碼的殘基或非肽鍵。例如，這樣的修飾包括一個或多個殘基的烷基化和更具體的曱基化、插入非天然的氨基酸或將天然的氨基酸置換為非天然的氨基酸、使用其他的共價鍵來置換酰胺鍵。根據本發(fā)明的擬肽可以任選地包括至少一個鍵，該鍵為酰胺置換鍵，如脲鍵、氨基曱酸酯鍵、氨磺酰鍵、肼鍵或任何其它共價鍵。合適的"擬肽"的設計可以是計算機輔助的。"穩(wěn)定的化合物“或"穩(wěn)定的結構”在此處是指足夠穩(wěn)固以便能夠從反應混合物分離至有效純度并配制成有效治療劑的化合物。如此處所用，術語"取代的"指在指定原子上的任何一個或多個氫原子被替換為來自指定組的選擇，條件是不能超過指定原子的正常原子價并且該取代得到穩(wěn)定的化合物。當任何變量(例如n、m等)在本文任何部分或任何式中出現(xiàn)超過一次時，其在每種情況下的定義獨立于其在任何其他情況下的定義。此外，取代基和/或變量的組合只有在該組合得到穩(wěn)定的化合物時才是允許的。術語"受體激動劑"指可以與細胞上的受體結合以產生天然物質特有的生理反應的分子。術語"MC-4受體激動劑"優(yōu)選地指，該分子能夠模擬通過MC受體亞型-4介導的aMSH的至少一種作用的分子。如此處所用，短語"治療有效量"指施用至宿主以獲得針對本文公開的適應癥(例如但不限于肥胖癥)的期望結果的新型主鏈環(huán)化的肽類似物或含有該類似物的組合物的量。肽的主鏈環(huán)化主鏈環(huán)化的類似物是經由橋基來環(huán)化的肽類似物，其中所述橋基與允許新的非肽鍵合的氨基酸的a氮或a羰基相連。一般而言，用以從其結構單元構建這樣的肽類似物的過程依賴于已知的肽合成原理；最方便地是，可以根據已知的固相肽合成原理來實施所述過程。在主鏈環(huán)化的肽的固相合成期間，將受保護的結構單元偶聯(lián)至肽鏈的N末端或者通過與其他氨基酸偶聯(lián)相似的步驟偶聯(lián)至肽樹脂。在肽組裝完成后，從結構單元的官能團除去保護性基團，并且通過將結構單元的官能團與第二官能團偶聯(lián)來實現(xiàn)環(huán)化，所述第二官能團選自第二結構單元、所述肽序列的氨基酸殘基的側鏈和N末端氨基酸殘基。如此處所用，術語"主鏈環(huán)狀的肽"或"主鏈環(huán)狀的類似物"指線性肽的類似物，所述線性肽包括引入至少一個結構單元的、優(yōu)選為3至24個氨基酸的肽序列，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括酰胺、硫醚、硫代酸酯、二硫化物、脲、氨基曱酸酯或氨磺酰，其中至少一個結構單元經由所述橋基相連而形成環(huán)狀的結構，所述環(huán)狀的結構具有選自由第二結構單元、所述序列的氨基酸殘基的側鏈或末端氨基酸殘基組成的組的部分。"結構單元"(BU)指Na或Ca衍生的氨基酸。Na衍生的氨基酸由通式(V)表示<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(v>其中X是選自亞烷基、取代的亞烷基、亞芳基、環(huán)亞烷基和取代的環(huán)亞烷基組成的組的間隔基；R'是任選地與特定保護基結合的氨基酸側鏈；并且G是選自胺、硫醇、醇、羧酸、磺酸鹽、酯和烷基卣組成的組的官能團；將其引入肽序列且隨后經由官能團G與所述肽序列中的一個氨基酸側鏈、與一個肽末端或與另一個(0官能化的氨基酸衍生物來選擇性地環(huán)化。本發(fā)明通過使用通式(VI)的Na衍生的甘氨酸來舉例說明<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(VI)其中X為亞烷基，R'為氫；且G為胺；將其引入肽序列且隨后經由官能團G與和所述肽序列的N末端相連的羧基來選擇性地環(huán)化。在本發(fā)明的結構單元以其化學結構被描述為部分肽序列，或者縮寫為相應修飾的氨基酸的三字母代碼，之前帶有反應性基團的類型(N代表胺，C代表羧基)。例如，N-Gly描述了具有胺反應性基團的修飾的Gly殘基，因此，才艮據本發(fā)明，在主鏈環(huán)化的肽序列之內的N-Gly等于NH-(CH2)n-N-CH2-CONH2。用于生產結構單元的方法學在以WO95/33765和WO98/04583公布的國際專利申請中以及在美國專利第5,770,687號和5,883,293號中描述，此處特別通過引用將其全部內容并入，如同此處提出其全部內容一樣。根據本發(fā)明的術語"橋基"指化學連接體或間隔基，其將肽主鏈的氮原子與第二結構單元、序列的氨基酸殘基的側鏈或末端的氨基酸殘基相連。根據一些實施方案，所述化學連接體或間隔基由通式(VII)表示Z-(CH2)m-M-(CH2)n式(vn)其中m和n分別獨立地為1至8的整數(shù)；M選自二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亞胺、醚或烯橋組成的組；并且Z不存在或為包括兩個羧基的分子，如二羧酸殘基。根據本發(fā)明的Z的非限制性實例為琥珀酸殘基和苯二甲酸殘基?？梢允褂帽绢I域已知的任何方法來合成根據本發(fā)明的主鏈環(huán)化的肽，所述方法包括擬肽的方法學。這些方法包括固相合成法以及溶液相合成法。據此描述了這些方法的非限制性實例?？梢允褂帽绢I域已知的用來制的范圍中。根據本發(fā)明的主鏈環(huán)化的類似物的設計和合成方法在以下的專利中公開美國專利第5,811,392、5,874,529、5,883,293、6,051,554、6,117,974、6,265,375、6,355613、6,407059、6,512092號;以及國際申請WO95/33765、WO97/09344、WO98/04583、WO99/31121、WO99/65508、WO00/02898、WO00/65467和WO02/062819。此處通過引用將所有這些方法的全部內容并入。主鏈環(huán)化最為顯著的優(yōu)勢在于1)在不破壞肽的任何側鏈下獲得肽序列的環(huán)化，從而減少失去生物識別(如，與特異性受體結合)所必須的官能團以及功能的機會；2)通過允許變更橋的長度和鍵的類型(如，酰胺、二硫化物、硫醚、硫代酸酯、脲、氨基曱酸酯或氨磺酰等)、鍵的方向以及鍵在環(huán)中的位置來實現(xiàn)肽構象的優(yōu)化；3)當應用于已知活性的線性肽的環(huán)化時，可以如下方式設計橋最小化與肽的活性區(qū)域及其關聯(lián)受體的相互作用。這就減少了環(huán)化臂妨礙識別和干擾功能的機會。"主鏈環(huán)狀的擬肽”方法的原理基于以下步驟(i)闡明靶蛋白質中的活性殘基，(ii)設計并建立包括活性殘基的原型(prototypic)主鏈環(huán)狀的肽系綜(ensemble)及其類似于母蛋白質的構象的模型，(iii)環(huán)掃描(cycloscan)每種主鏈環(huán)狀的原型直到發(fā)現(xiàn)先導化合物為止，(iv)對最佳的先導化合物進行結構分析，并(v)通過迭代(iteration)優(yōu)化。"循環(huán)掃描，，是基于構象約束的主鏈環(huán)狀肽文庫的選擇方法，該方法允許快速檢測由給定序列衍生的最具活性的主鏈環(huán)狀的肽，所述給定序列如WO97/09344中所公開的。此處通過引用將該公開的教導全部并入。循環(huán)掃描的多樣性允許以逐步分立的方式來產生大量僅其構象不同的順序偏向的肽，其中所述多樣性包括主鏈環(huán)化的模式、環(huán)的位置、環(huán)的大小和環(huán)的化學性質。藥理學除了其他考慮之外，本發(fā)明的新型活性成分為肽、肽類似物或擬肽的事實說明該制劑適用于遞送這些類型的化合物。但是通常由于易受到胃酸或腸酶的消化，因而使得肽不太適合進行口服施用。根據本發(fā)明，為了合成代謝穩(wěn)定的和口服可利用的擬肽類似物，使用了新的主鏈環(huán)化方法。本發(fā)明肽的優(yōu)選給藥途徑是口服施用。其他的給藥途徑為關節(jié)內、靜脈內、肌內、皮下、皮內或膜內。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領域公知的過程來制備，例如，通過常規(guī)的混合、溶解、?；?、研磨、精細粉碎、制糖衣片(dragee-making)、磨細、乳化、包嚢、包埋或冷凍干燥過程。因此，可以常規(guī)的方式使用一種或多種生理學上可接受的載體(包括賦形劑和輔料)來配制依據本發(fā)明使用的藥物組合物，所述載體有助于將活性化合物加工可以在藥學上使用的制劑。適當?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的推入配合型(push-fit)膠嚢以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠嚢。推入配合型膠嚢可以包括與填充劑(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)、潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)以及任選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠嚢中，可以將活性化合物溶解或懸浮于適合的液體中，所述液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。為了進行注射，可以將本發(fā)明的化合物在水溶液中、優(yōu)選在生理學相容的緩沖液中配制，所述緩沖液如Hank's溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。為了經粘膜施用，在制劑中使用了適合于待透過的屏障的滲透劑。諸如聚乙二醇的這樣的滲透劑通常為本領域已知。糖衣片片芯(Drageecores)可以具有適宜的涂層。為了這個目的，可以使用濃縮的糖溶液，所述糖溶液可以任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠(carb叩olgel)、聚乙二醇、二氧化鈦、漆用溶液和適合的有機溶劑或溶劑混合物。可以向片劑或糖衣片涂層中加入染料或顏料以識別或表征不同的活性化合物劑量組合。為了口腔施用，該組合物可以釆用以常M^方式配制的片劑或4t劑的形式。為了吸入施用，才艮據本發(fā)明使用的變型(variants)可以氣溶膠噴霧的形式從加壓的包裝或使用合適的推進劑的噴霧器方便地遞送，所述推進劑如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟曱烷或二氧化碳。在加壓氣溶膠的情況中，可以通過提供用以遞送測定量的閥來確定劑量單位。例如，可以將用于吸入器或吹入器的明膠的膠嚢和藥筒制成含有肽與適宜的粉末基質(如，乳糖或淀粉)的粉末混合物。用于胃腸外施用的藥物組合物包括水溶性形式的活性成分的水溶液。此外，可以將活性化合物的懸浮液制備為適當?shù)暮妥⑸鋺腋∫?。適宜的天然或合成載體為本領域所公知(Pillai等人，Curr.Opin.Chem.Biol.5，447:2001)。任選地，該懸浮液還可以包含增加了化合物的溶解度的適宜的穩(wěn)定劑或物質，以允許制備非常濃的溶液。可選地，活性成分可以為粉末形式，在使用前用適宜的載體(如，無菌無熱原水)進行重構。例如，還可以使用諸如可可脂或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基質來將本發(fā)明的化合物配制成直腸組合物，如栓劑或滯留(retention)灌腸劑。適合在本發(fā)明上下文中使用的藥物組合物包括其中活性成分以有效實現(xiàn)預期目的量包括在其中的組合物。更具體地，治療有效量指可以有效地預防、減輕或改善受治療患者的疾病癥狀的化合物的量。治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力之內?？梢酝ㄟ^細胞培養(yǎng)或實驗動物的標準藥物規(guī)程，如，通過測定受試化合物的IC50(提供50%抑制作用的濃度)和LD50(造成50%受試動物死亡的致死劑量)來確定此處描述的肽的毒性和治療效果?？梢允褂脧倪@些細胞培養(yǎng)試驗和動物研究獲得的數(shù)據來配制一系列用于人的劑量。所述劑量可以根據所采用的劑型和所利用的給藥途徑而改變。精確的配方、給藥途徑以及劑量可以由私人醫(yī)師考慮患者的情況來進行選擇(如，在Fingl等人1975年的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1p.l中)。這種藥物組合物優(yōu)選的施用劑量范圍為每天約0.1μg/kg體重至約20mg/kg體重。優(yōu)選地，活性成分的數(shù)量范圍為約10μg/kg至1000ng/kg。根據待治療的病癥的嚴重性和反應性，劑量給藥還可以為緩慢釋放組合物的單獨施用，其中治療療程可從幾天持續(xù)到幾周，或者直到治愈，或者直到疾病狀態(tài)得到緩解。當然，即將施用的組合物的量將取決于受治療的受試者、痛苦的嚴重程度、施用的方式、處方醫(yī)師的診斷以及所有其他相關的因素。ocMSH類似物的一般篩選通常在體外測試aMSH類似物對結合于其黑皮質素-4(MC4)受體的天然肽(剌鼠(Agouti)關聯(lián)蛋白)的抑制作用。可以進一步在體外測試該類似物對環(huán)腺苷酸(cAMP)濃度的影響。可以在體內測試該類似物的腸滲透性和代謝穩(wěn)定性。可以在臨床前模型中對該類似物做進一步的體內測試，以便確定施用的最佳模式和適當?shù)膭┝?，并且證實這些新的潛在治療藥物的安全性和功效。實施本發(fā)明的優(yōu)選方式根據本發(fā)明，公開了新的肽類似物，其特征在于所述肽類似物使用與a氨基酸的a氮相連的橋基來引入新的結構單元。具體地，這些化合物為包括4至12個氨基酸肽序列的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，所述類似物引入了至少一個結構單元，所述結構單元包含與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、硫醚、疏代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中至少一個結構單元經由橋基連接于第二結構單元、所述肽序列的氨基酸殘基的側鏈或N末端的氨基酸殘基，以便形成環(huán)狀的結構。優(yōu)選地，所述肽序列引入了4至12個殘基，更優(yōu)選引入5至8個氨基酸。根據本發(fā)明的原理，提供了基于活化MC4受體的激素aMSH活潑區(qū)域的主鏈環(huán)狀的肽。為了這種目的，合成了基于MC4R活性母序列Phe-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2(SEQIDNO:1)的主鏈環(huán)狀的肽文庫。文庫中所有的肽均具有母序列。所述肽的環(huán)大小和環(huán)化學性質彼此不同。研究所有肽的MC4R官能度和選擇性以及體外腸吸收和腸代謝降解。發(fā)現(xiàn)一種此處指定為BBC-1的肽是高度官能和高度選擇性的，同時其具有高的腸代謝穩(wěn)定性和滲透性。小鼠體內研究顯示當口服施用時，在24hr的時期內食物消耗減少40%。目前根據本發(fā)明優(yōu)選的實施方案為式II的主鏈環(huán)狀的肽類似物(SEQIDNO:3)。此處將本發(fā)明目前優(yōu)選的肽指定為BBC-1(圖6)。發(fā)現(xiàn)因其特異性活化MC4R而選擇的BBC-1是酶穩(wěn)定的，同時具有增強的體外腸滲透性。小鼠一次口服施用BBC-1導致24小時的食物消耗減少。本發(fā)明的主鏈環(huán)狀的類似物以高親合力結合于MC4受體。這種受體的選擇性預示了潛在的體內生理選擇性。此外，本發(fā)明首次提供了獲得具有特異性MC4受體選擇性的一組主鏈環(huán)化類似物的可能性。這就使得其在包括肥胖癥的代謝紊亂中具有治療用途?？梢允褂帽景l(fā)明的ccMSH類似物來治療肥胖癥或預防超重、調節(jié)食欲、誘發(fā)飽腹感、預防在成功的重量減輕后的重量恢復、增加能量消耗并治療與超重或肥胖癥相關的疾病或病狀。含有本發(fā)明aMSH類似物的藥物組合物可以配制成通過各種方式以強效施用于經歷不期望的體重升高的人或動物患者，所述不期望的體重升高可以單獨或作為不利的醫(yī)學病癥或疾病(如，n型糖尿病)的一部分。本發(fā)明的aMSH類似物可作為主要的藥劑用于治療II型糖尿病，以及用于治療I型糖尿病。根據本發(fā)明的aMSH類似物還可作為輔助劑用于治療I型糖尿病或II型糖尿病。aMSH類似物可以用于由異常的葡萄糖代謝引起的或與異常的葡萄糖代謝同時發(fā)生的疾病的治療。aMSH類似物可以用于延緩從葡萄糖耐量降低(IGT)至II型糖尿病的進展，以及用于延緩從II型糖尿病至胰島素依賴型灃唐尿病(insulinrequiringdiabetes)的進展。目前已經大致地描述了本發(fā)明，并且通過參考以下的實施例可以更容易地理解本發(fā)明，所述實施例經由說明的方式提供并且不預期限制本發(fā)明。實施例材料與方法肽合成受保護的氨基酸、9-藥基甲基氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)、溴-三-p比咯烷酮-六氟磷酸鱗(phosphoniumhexafluorophosphate)(PyBrop)、Rink酰胺甲基二苯曱基胺(MBHA)聚苯乙烯樹脂(Rinkamidemethylbenzhydrylamine(MBHA)polystyreneresins)以及許多用于固相肽合成(SPPS)的有機物和載體從NovaBiochemicals(Laufelfmgen,Switzerland)購買。雙(三氯曱基)碳酸酯(BTC)從Lancaster(Lancashire,England)購買，用于高效液相色譜(HPLC)的三氟乙酸(TFA)和溶劑從Bio-Lab(Jerusalem,Israel)購買。二幾乙酸、1，2-二氨基乙烷、1,3-二氨基丙烷和1,4-二氨基丁烷從Merck(Darmstadt,Germany)購買，四(三苯膦)把(0)從ACROS(Geel,Belgium)購買。有機化學溶劑從Frutarom(Haifa,Israel)購買。通過BrukerAMX-300MHz分光計記錄核磁共振(NMR)譜。通過FinniganLCQDUO離子阱質譜儀進行質譜。通過MerckF24560硅膠板(Darmstadt,Germany)進行薄層色譜(TLC)。使用多孔層實心球分析RP柱(Ci8，4.6x250mm，產品號201TP54)以及Merck-HitachiL-7100泵和在215nm運作的Merck-HitachiL-7400可變波長4企測器來施行HPLC分析。流動相由梯度系統(tǒng)組成，其中溶劑A相當于具有0.1。/。TFA的水，以及溶劑B相當于具有0.1%TFA的乙腈(ACN)。流動相在0至5min時以95%的A開始，隨后從5至55min為從5%B至95%B的線性梯度。該梯度在95%B保持另外5min，且隨后從60至65min降到95%A和5%B。該梯度在95%A保持另外5min以達到柱平衡。流動相的流速為1mL/min。通過采用多孔層實心球制備RP柱(C8,22x250mm，產品號218TP1022)的反相HPLC(RP-HPLC)(L-6200A泵，Merck-Hitachi,日本)來進行肽的純化。所有制備HPLC均使用具有溶劑A和溶劑B的梯度系統(tǒng)來實施，其中溶劑A相當于具有0.1%TFA的水，溶劑B相當于具有0.1%TFA的ACN。實施例1.主鏈環(huán)狀的aMSH類似物的固相肽合成(困1)遵循以下的通用Fmoc化學實驗方案在設置有熔結玻璃底部的反應容器中進行合成將Rink酰胺曱基二苯曱基胺(MBHA)樹脂(1g,0.66mmol/g)在N-曱基吡咯烷酮(NMP)中預溶脹2h。使用20%哌啶的NMP實施Fmoc脫保護步驟(2x30min),隨后使用NMP(5x2min)和DCM(2x2min)洗滌。如下進行結構單元Fmoc-Na(乙胺-Alloc)Gly-OH(Fmoc-GlyN2)與樹脂的偶聯(lián)以及Fmoc-氨基-酸-OH(Fmoc-Axx-OH)與結構單元的偶聯(lián)將Fmoc-GlyN2(3eq.，1.98mmol)和雙-(三氯曱基)碳酸酯(BTC，三光氣)(1當量，0.66mmol)懸浮于DCM中。向冰浴中預冷卻的懸浮液加入2,4,6-可力丁(10當量，6.6mmol)。在所有固體溶解后(約lmin),將該溶液傾倒至樹脂上并在室溫下振搖3h。重復一次該偶聯(lián)循環(huán)。在第二次偶聯(lián)循環(huán)結束時，使用DCM洗滌肽基-樹脂(5x2min)。在第一氨基酸后進行帽化(Capping),并且通過使肽基-樹脂與乙酸酐(l.lmL,0.5M)、二異丙基乙胺(D正A)(0.5mL，0.125M)在二曱基曱酰胺(DMF)(25mL)中的混合物反應來重復兩次。在使用DMF(5x2min)、DCM(2x2min)和NMP(2x2min)洗滌樹脂后進4亍帽化。以上述相同的方式使用BTC作為偶聯(lián)劑來進行Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc－Arg(Pbf)－OH、Fmoc－D-Phe-OH和Fmoc-Phe-OH的偶聯(lián)。在1當量DMAP和10當量D正A存在下，使肽基-樹脂(Phe)最后的氨基酸與IO當量琥珀酸酐(m=2)的NMP于室溫?；?h。使用NMP(2x5min)和DCM(2x5min)洗滌樹脂，在干燥器中干燥過夜，并在氬下使用四(三苯膦)鈀(0)(0.1當量，0.066mmol)在含有乙酸(5%)和N-曱基嗎啉(morpholin)(2.5%)NMP中來施行從結構單元除去Alloc保護基。該步驟在劇烈振搖下避光操作4h。使用氯仿(chlorofome)(8x2min)和具有0.5%DIEA的NMP(3x2min)來實施洗滌步驟。繼Alloc脫保護之后，通過加入6當量PyBoP和12當量D正A的NMP(重復兩次)來使肽環(huán)化。使用NMP(5x2min)和DCM(5x2min)進行洗滌步驟。肽基-樹脂在真空下干燥過夜。使用95%TFA、2.5。/。TDW和2.5。/。三異丙基硅烷(TIS)的預冷卻混合物來同時進行樹脂的裂解和側鏈保護基的去除。在加入樹脂后，于冰浴中攪拌該混合物30min,且隨后于室溫振搖2.5h。通過氮氣流來4吏合并的TFA濾液蒸發(fā)至干燥。使用冷醚研磨含油的殘留物三次以除去清除劑，并通過離心除去醚。將干燥的粗品肽溶解于ACN/H20(1:1)并進行冷凍干燥。實施例2.結構單元的合成(i)根據圖2來進行源自甘氨酸的結構單元的合成。(ii)制備Alloc-NH(CH2)2-4NH2(1)將1mol的1，2-二氨基乙烷、1,3-二氨基丙烷或1,4-二氨基丁烷(10當量，分別為66.85m"l,82.40m"l或98.05m"l)溶解于氯仿(500mL)并在冰浴中冷卻。在0。C下于3h內向冷卻的溶液中逐滴加入含有0.1mol氯曱酸烯丙酯(Allylchloroformat)(1當量)的氯仿(250mL),然后在室溫下攪拌過夜。用水(200mLx2)洗滌反應混合物，經硫酸鈉干燥并真空蒸發(fā)。(iii)合成AllocNH-(CH2)n-NH-CH2-COOH(2)將NaCNBH3(1.1當量，0.052mol)加入MeOH(100mL)中?；衔?1)(0.0454mol)溶解于MeOH(50mL)，并加至NaCNBH3溶液。加入乙酮酸(Glyoxilicacid)(0.95當量，0.0434mol)并使反應攪拌過夜。在減壓下蒸發(fā)MeOH。(iv)合成Fmoc-Gly(Nn)Alloc-OH(3)將殘留物溶解于水(110mL)中，并加入三乙胺(11mL，0.079mol)。加入含F(xiàn)moc-OSu(9.82g，0.0291mol)的AcCN(170mL)并攪拌反應4h,同時使用三乙胺將pH保持為堿性。使用石油醚PE(180mLx3)和7:3的醚:PE(180mLx3)來洗滌反應混合物。在冷卻期間使用2MHC1(lOmL)將水層酸化至pH3-4，并使用乙酸乙酯(EA)(150mLx4)進行萃取。有機層用1MHC1(100mLx2)和飽和KHS04(100mLx2)洗滌，經Na2S04干燥并在真空下蒸發(fā)得到5.50g,0.0115mol(39.5%)隨后凝固的無色油。該產物在沒有進一步純化下用于SPPS。實施例3.肽合成表l示出主鏈環(huán)狀的肽的結構及其MS和純度。所有的肽均具有相同的序列——即Phe-DPhe-Arg-Trp-Gly-NH2，并且具有相同的內酰胺環(huán)位在Gly的N"與氨基末端之間。文庫中的肽的環(huán)大小和環(huán)化學性質^&此不同。環(huán)大小的范圍/人20個原子(肽MCR4-1)至25個原子(肽MC4-14)。環(huán)化學性質的差異是通過改變烷基鏈n和m的相對尺寸來實現(xiàn)的，所述烷基鏈n和m的相對尺寸導致環(huán)大小相同但內酰胺環(huán)中的酰胺鍵位置不同的肽。例如，肽MCR4-6、MCR4-10和MCR4-11均具有22個原子的環(huán)尺寸，但是它們的n和m卻各異。因此，肽MCR4-6的n=3以及m^3，而肽MCR4-10的n=2以及m=4,肽MCR4-11的n=4以及m=2。實施例4.腸滲透性的評價細胞的生長和維持；從ATCC獲得Caco-2細胞，并且隨后在5%的C02氣氛和相對濕度95%下，使其以大約0.5x106細胞/燒瓶于37°C的75cn^燒瓶中生長。生長培養(yǎng)基由Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)(DMEM)組成，其添加有10%熱滅活的胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸(NEAA)和2mML-谷氨酰胺。培養(yǎng)基每周更換兩次。制備用于轉運研究的細胞；為了進行轉運研究，將傳代范圍為60-66的細胞以25x105細胞/cn^的密度接種在具有0.4pm孔和1cn^表面積的未處理的聚碳酸酯膜培養(yǎng)插入物上。將含有Caco-2單層的培養(yǎng)插入物置入12mm的Costar24轉孔板(transwellsplates)中。每隔一天更換培養(yǎng)基。在接種后21-23天，當細胞完全分化并且TEER值穩(wěn)定時(300-500pcm2)進行轉運研究。實驗方案通過從單層的兩側除去培養(yǎng)基并替換為加熱至37。C的頂端的緩沖液(550^1)和基底外側的緩沖液(1200^1)而開始轉運研究。細胞在振搖下(100圈/min)于37。C孵育30分鐘時間。在孵育周期之后，除去緩沖液并替換為基底外側的1200^d基底外側緩沖液。事先將測試溶液加熱至37。C并將其(600^1)加至單層的頂面。在實驗開始時立即從頂面取出50pl樣品，使得實驗期間的頂端體積為550W。在實驗期間，細胞在振搖下保持在37。C。在預計的時間(30、60、90、120、150和180min)，從基底外側取出200^樣品并替換為相同體積的干凈基底外側緩沖液，從而維持恒定的體積。實施例5.腸代謝穩(wěn)定性的評價通過Ca+十沉淀法(PEERCE)從組合的十二指腸、空腸和上回腸(upperileum)來制備刷狀緣膜小泡(BBMVs)。使用冰冷的0.9%Nacl漂洗5只雄性Wistar大鼠的腸(200-250g),并清除粘液(mucos),使用載玻片從內腔的表面刮下粘膜并立即放入含有50nMKcl和10mMTris-HCl(pH7.5，4°C)的緩沖液中，并通過Ploytron(PolytronPT1200，KinematicaAG，Switzerland)來勻漿該混合物。將CaCl加至10mM的終濃度。將該勻漿在4°C下振搖30min,之后以10,000g離心10min(離心機)，然后將上清液以48,000g離心30min，通過將粒狀沉淀懸浮于300mM的甘露醇和10mM的Hepes/Tris(pH7.5)并以24,000g/hr離心來進行另外的兩項純化步驟。使用刷狀緣膜酶標記物GGT、LAP和堿性磷酸酶對純化的刷狀緣膜進行分析。在這些研究期間，刷狀緣膜酶的富集可以在13倍和18倍之間變動。實施例6.受體結合試驗使用結合緩沖液8來洗滌轉染的CHO細胞并將其分配入96-孔板(大約40,000細胞/孔)。然后在37℃下于每個含有0.05ml結合緩沖液的孔中孵育細胞2h，其中該緩沖液含有恒定濃度的[1251]NDP-a-MSH和適當濃度的未標記的配基。在孵育后，使用0.2ml的水冷結合緩沖液洗滌細胞并使用0.2ml的0.1NNaOH使其從板中分離。計算放射性(Wallac，Wizardautomaticgammacounter(自動Y計數(shù)器))并使用用于方文射性配體結合分析的軟件包(WanSystem,Umea,Sweden)來分析數(shù)據，其將數(shù)據與通過一般稱為計算機模型的方法從質量作用定律獲得的公式進行擬合。所述結合試驗在雙孔(duplicatewells)中進行。實施例7.受體活化的測定(cAMP作為探針的試驗)cAMP富集試驗在轉染后48h,使用PBS洗滌CHO細胞一次并且隨后使用含有0.02%EDTA(Sigma)的PBS使其從板中分離。通過離心收獲分離的細胞并將其懸浮于含有0.5mMIBMX、2mMHEPES(IBMX緩沖劑)(pH7.5)的Hanks'平衡鹽溶液(Invitrogen)中。在37℃孵育15min以允許IBMX^聶取后，向含有各種濃度激動劑或含有10pM福司柯林的0.1mlIBMXi爰沖液中加入0.4ml的細胞懸浮液(5x105細胞/ml)。此后將細胞在37℃孵育15min以便允許cAMP富集。通過加入0.5ml的5%三氯乙酸來終止活性，并且通過cAMP125I閃爍迫近分析系統(tǒng)(AmershamBiosciences)來只于溶4匕細I包釋力文的cAMP進行分析。使用GraphPadPrism軟件來計算具有95%置信區(qū)間的EC5。值(使用非線性回歸分析擬合具有可變斜率的S型劑量反應曲線)。實施例8.三種主鏈環(huán)狀的肽文庫的表征表l:文庫l的表征(式II)<table>compelxtableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table><row><column>BBC6</column><column>3</column><column>3</column><column>22</column><column>864.45</column><column>865.13</column><column>84.2</column></row><row><column>BBC7</column><column>3</column><column>24</column><column>892.48</column><column>893.40</column><column>89.3</column></row><row><column>BBC8</column><column>3</column><column>2</column><column>21</column><column>850.43</column><column>851.60</column><column>88.8</column></row><row><column>BBC9</column><column>2</column><column>5</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.47</column><column>97.6</column></row><row><column>BBC10</column><column>2</column><column>4</column><column>22</column><column>864.45</column><column>865.70</column><column>97.8</column></row><row><column>BBC11</column><column>4</column><column>2</column><column>22</column><column>864.45</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC12</column><column>4</column><column>3</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.33</column><column>97.8</column></row><row><column>BBC13</column><column>4</column><column>4</column><column>24</column><column>892.48</column><column>894.00</column><column>79.2</column></row><row><column>BBC14</column><column>4</column><column>5</column><column>25</column><column>906.49</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC15</column><column>4</column><column>23</column><column>878.46</column><column>879.72</column><column>96,2</column></row><row><column>BBC22</column><column>6</column><column>2</column><column>24</column><column>892.48</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC23</column><column>6</column><column>3</column><column>25</column><column>906.49</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC24</column><column>6</column><column>4</column><column>26</column><column>920.52</column><column>--</column><column>IP</column></row><row><column>BBC25</column><column>6</column><column>5</column><column>27</column><column>948.58</column><column>--</column><column>IP</column></row><table>合成并表征了基于活化MC4受體(參見圖3)的激素aMSH活躍部位的三種主鏈環(huán)狀的肽文庫(參見表1-3)。測試了文庫I的主鏈環(huán)狀的肽與已知的標準樣品相比較的腸滲透性。如圖4所示，肽BBC1(圖6)具有高的腸滲透性。表4示出這些肽對MC4R的ICs。值。所有的肽均具有與天然激素(70nM)相似的ICso值，其中兩種類似物具有更好的親合力。圖5示出肽的腸代謝穩(wěn)定性。環(huán)狀的肽與線性類似物相比，具有延長的代謝穩(wěn)定性。通過反相HPLC(RP-HPLC)和基質輔助激光解吸電離飛4亍時間質譜(matrix-associatedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectroscopy)(MALDI-TOFMS)來施行BBC1肽的表征(分別為圖8A和圖8B)。表2:文庫2的表征(式III)<table>complextableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table><row><column>BBC19</column><column>3</column><column>892.06</column><column>N.D.</column></row><row><column>BBC21</column><column>4</column><column>906.08</column><column>N.D.</column></row><row><column>BBC27</column><column>6</column><column>934.14</column><column>N.D.<table>表3:文庫3的表征(式IV)<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>N.D.——未測定表4:BBC肽的ICso值<table><row><column>肽</column><column>IC50nM</column></row><row><column>BBC1</column><column>90</column></row><row><column>BBC6</column><column>110</column></row><row><column>BBC8</column><column>60</column></row><row><column>BBC7</column><column>100</column></row><row><column>BBC9</column><column>100</column></row><row><column>BBC10</column><column>120</column></row><row><column>BBC12</column><column>100</column></row><row><column>BBC13</column><column>100</column></row><row><column>BBC15</column><column>60</column></row><row><column>BBC16</column><column>100</column></row><row><column>BBC17</column><column>90<table>實施例9.評價口llife用BBC-1對正常小鼠食物消耗作用的體內研究在隔離的籠子里飼養(yǎng)7-8周大的ICR:Hsd(CD-I)雄性小鼠，并且將其保持在23土rC的12小時光亮、12小時黑暗的循環(huán)中(0700-1900小時光亮)。允許隨意地給小鼠喂水以及喂食標準的食物顆粒(chowpellets)。小鼠一到達即允許其適應1周。在禁食16小時后，使動物(n=8)經受一次BBC1(100pg/ml,1000昭/ml)或載體(水)的口服灌胃(PO,5ml/kg)。在施用后立即喂食固定量的食物，并且在1、2、3、4、5、8和24小時后重新稱重。在隨后24小時期間，小鼠并未顯示出測試項目的任何特殊的給藥后臨床癥狀。如圖7所示，當口服施用時，BBC-1在24小時的時間內將小鼠的食物消耗減少到40%。這些結果表明通過利用主鏈環(huán)化可能合成出生物活性的肽，所述生物活性的肽在腸環(huán)境下是穩(wěn)定的并且可跨越腸壁，因此，其具有潛在的良好口服生物利用度而且同時保持其藥理活性。具體實施方案的前述描述充分揭示了本發(fā)明的一般特征，使得其他人通過應用現(xiàn)有的知識可以隨時對這樣具體的實施方案進行修改和/或使其適用于各種應用，而無需過多的實驗并且不脫離一般概念，因此，應該并且預期將這樣的修改和改進理解為在所公開的實施方案等同的含義和范圍內。盡管本發(fā)明已經結合其具體實施方案進行了描述，但是明顯的是，許多備選方案、改進和變動對于本領域技術人員將是顯而易見的。因此，預期包括所有落入所附權利要求的精神和寬范圍內的這樣的備選方案、改進和變動。應理解的是，雖然詳細描述和具體實施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但由于根據該詳細的描述使得在本發(fā)明的精神和范圍內的各種改變和改進對于本領域技術人員而言變得顯而易見，因此本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述和具體實施例僅作為示例給出。權利要求1.一種主鏈環(huán)化的αMSH類似物，其包括引入至少一個結構單元的4至12個氨基酸的肽序列，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中至少一個結構單元經由所述橋基連接于選自第二結構單元、所述肽序列氨基酸殘基的側鏈和N末端氨基酸殘基組成的組的部分，以形成環(huán)狀的結構。2.根據權利要求1所述的aMSH類似物，其中所述橋基是具有如下通式(VII)的化學連接體-Z-(CH2)m-M-(CH2)n-式(vii)其中m和n分別獨立地為1至8的整數(shù)；M選自二硫化物、酰胺、硫醚、石危代酸酯、亞胺、醚或烯橋組成的組；且Z不存在或為包括兩個羧基的分子殘基。3.根據權利要求1所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其具有如下通式(I)(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>式U)其中R為氨基酸的側鏈，X為OH、NH2或酯，m表示從l至8的整數(shù)，并且n表示從1至8的整數(shù)。4.根據權利要求3所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中m表示從2至5的整數(shù)，并且n表示從2至6的整數(shù)。5.根據權利要求3所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其具有如下通式(II)(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>其中m表示從1至8的整數(shù)，并且n表示從l至8的整數(shù)。6.根據權利要求5所迷的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中m表示從2至5的整數(shù)，并且n表示從2至6的整數(shù)。7.根據權利要求6所述的主鏈環(huán)化的ctMSH類似物，其中所述類似物選自以下肽組成的組才艮據式II的肽，其中n==2，m==2;根據式n的肽，其中n==3,m==3;才艮據式n的肽，其中n==3，m==2;才艮據式n的肽，其中ii==3,m==5;^f艮據式n的肽，其中n==2，m==4。和8.根據權利要求7所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中n^2,且m=2。9.根據權利要求1所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其具有如下通式(III):<formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>式(ni)其中n表示從l至8的整數(shù)。10.根據權利要求9所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中n表示從2至6的整數(shù)。11.根據權利要求10所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。12.根據權利要求1所述的主4連環(huán)化的aMSH類似物，其具有如下通式(IV):<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>式(IV)其中n表示從1至8的整數(shù)。13.根據權利要求12所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中n表示從2至6的整數(shù)。14.根據權利要求13所述的主鏈環(huán)化的aMSH類似物，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。15.—種藥物組合物，其包括作為活性成分的主鏈環(huán)狀的肽，所述肽包括引入至少一個結構單元的4至12個氨基酸的aMSH類似物，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、硫醚、石克代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中至少一個結構單元經由所述橋基連接于選自第二結構單元、所述肽序列氨基酸殘基的側鏈和n末端氨基酸殘基組成的組的部分以形成環(huán)狀結構；所述組合物進一步包括藥學上可接受的載體。16.根據權利要求15所述的藥物組合物，其中所述橋基是具有如下通式(VII)的化學連接體<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula>式(VII)其中m和n分別獨立地為1至8的整數(shù)；M選自二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亞胺、醚或烯橋組成的組；并且Z不存在或為包括兩個羧基的分子殘基。17.根據權利要求15所述的藥物組合物，其中所述肽具有如下通式I(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage5</formula>式(1)其中R為氨基酸的側鏈，X為OH、NH2或酯，m表示從1至8的整數(shù)，且n表示從1至8的整數(shù)。18.根據權利要求17所述的藥物組合物，其中m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。19.根據權利要求17所述的藥物組合物，其中所述肽具有如下通式II(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage5</formula>式(II)其中m表示從1至8的整數(shù)，且n表示從l至8的整數(shù)。20.根據權利要求19所述的藥物組合物，其中m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。21.根據權利要求20所述的藥物組合物，其中所述肽選自以下肽組成的組根據式II的肽，其中n=2,m=2;根據式n的肽，其中n=3,m=3;根據式II的肽，其中11=3，=2;根據式II的肽，其中n=3,m=5;和根據式II的肽，其中n=2，m=4。22.根據權利要求21所述的藥物組合物，其中n=2，且m=2。23.根據權利要求15所述的藥物組合物，其中所述肽具有如下通式III:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(III)其中n表示從1至8的整數(shù)。24.根據權利要求23所述的藥物組合物，其中n表示從2至6的整數(shù)。25.根據權利要求24所述的藥物組合物，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。26.根據權利要求15所述的藥物組合物，其中所述肽具有如下通式IV:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>CO-Phe-DPhe-Arg-Trp-N-CH2-C-NH2式(iv)其中n表示從1至8的整數(shù)。27.根據權利要求26所述的藥物組合物，其中n表示從2至6的整數(shù)。28.根據權利要求27所述的藥物組合物，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。29.根據權利要求15所述的藥物組合物，其經配制用于口服施用。30.—種用于治療或預防與黑皮質素-4受體活性關耳關的疾病或病癥的方法，其包括向需要其的患者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的主鏈環(huán)狀的肽，所述肽包括引入至少一個結構單元的4至12個氨基酸的aMSH類似物，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、硫醚、硫代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中至少一個結構單元經由所述橋基連接于選自第二結構單元、所述肽序列氨基酸殘基的側鏈和N末端氨基酸殘基組成的組的部分，以形成環(huán)狀結構。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述橋基是具有如下通式(VII)的化學連接體式(VII)-Z-(CH2)m-M-(CH2)n-其中m和n分別獨立地為1至8的整數(shù)；M選自二碌u化物、酰胺、石克醚、硫代酸酯、亞胺、醚或烯橋組成的組；并且Z不存在或為包括兩個羧基的分子殘基。32.根據權利要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式I(SEQIDNO:2):<formula>seeoriginaldocumentpage7</formula>(式I)其中R為氨基酸的側鏈，X為OH、NH2或酯，m表示從l至8的整數(shù)，且n表示從1至8的整數(shù)。33.根據權利要求32所述的方法，其中m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。34.根據權利要求32所述的方法，其中所述肽具有如下通式II(SEQIDNO:3):<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>式(II)其中m表示從1至8的整數(shù)，且n表示從l至8的整數(shù)。35.根據權利要求34所述的方法，其中m表示從2至5的整數(shù)，且n表示從2至6的整數(shù)。36.根據權利要求35所述的方法，其中所述肽選自以下肽組成的組根據式II的肽，其中n^2，m二2;根據式II的肽，其中n二3,m二3;才艮據式II的肽，其中n二3,m二2;根據式II的肽，其中n-3,m-5;和才艮據式II的肽，其中n-2,m-4。37.根據權利要求36所述的方法，其中n二2,m二2。38.才艮據權力要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式III:<formula>seeoriginaldocumentpage8</formula>式III)其中n表示從1至8的整數(shù)。39.根據權利要求38所述的方法，其中n表示從2至6的整數(shù)。40.根據權利要求39所述的方法，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。41.根據權利要求30所述的方法，其中所述肽具有如下通式IV:<formula>seeoriginaldocumentpage9</formula>其中n表示從l至8的整數(shù)。42.根據權利要求41所述的方法，其中n表示從2至6的整數(shù)。43.根據權利要求42所述的方法，其中n表示選自2、3、4和6的整數(shù)。44.根據權利要求30所述的方法，其中所述病癥為代謝紊亂。45.根據權利要求44所述的方法，其中所述代謝紊亂為肥胖癥。46.根據權利要求44所述的方法，其中所述代謝紊亂為糖尿病。47.根據權利要求46所述的方法，其中所述糖尿病為II型沖唐尿病。48.根據權利要求30所述的方法,其中所述藥物組合物經配制用于口月l施用。49.根據權利要求30所述的方法，其中所述活性成分的量的范圍為約10jig/kg至1000|ig/kg。50.—種主鏈環(huán)化的aMSH類似物在制備用于治療或預防與黑皮質素_4受體活性關聯(lián)的疾病或病癥的藥物中的用途，其中所述類似物包括引入至少一個結構單元的4至12個氨基酸的肽序列，所述結構單元包括與橋基相連的肽主鏈中的一個氮原子，所述橋基包括二硫化物、酰胺、硫醚、石危代酸酯、亞胺、醚或烯橋，其中至少一個結構單元經由所述橋基連接于選自第二結構單元、所述肽序列氨基酸殘基的側鏈和N末端氨基酸殘基組成的組的部分，以形成環(huán)狀的結構。全文摘要公開了新的主鏈環(huán)化的肽，其為α-促黑皮質素激素(αMSH)類似物(α-melanocortinstimulatinghormone(αMSH)analogs)并具有改善的黑皮質素-4受體激動劑活性。所公開的主鏈環(huán)化的肽類似物具有獨特的且優(yōu)于其它類似物的性能，如代謝穩(wěn)定性、提高的口服生物利用度、改善的腸滲透性和體內藥理活性。還公開了包括所述主鏈環(huán)化的αMSH類似物的藥物組合物以及使用這樣的組合物來治療包括肥胖癥的代謝紊亂的方法。文檔編號C07K7/00GK101203527SQ200680018722公開日2008年6月18日申請日期2006年5月31日優(yōu)先權日2005年5月31日發(fā)明者亞尼弗·林德,塞繆爾·海斯,暗嫩·霍夫曼,柴姆·吉倫申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展公司