專利名稱：：來自癌胚胎抗原-未成熟層粘連蛋白受體蛋白的t細胞表位及其醫(yī)藥用途的制作方法來自癌胚胎抗原-未成熟層粘連蛋白受體蛋白的T細胞表位及其醫(yī)藥用途描述本發(fā)明涉及免疫治療方法，以及用于免疫治療方法的分子與細胞。具體地，本發(fā)明涉及癌癥的免疫治療，尤其是包含血液肺瘤在內(nèi)的若干腫瘤病種。本發(fā)明還涉及腫瘤相關(guān)的T輔助細胞肽表位，其單獨地或與其它腫瘤相關(guān)肽一起作為刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗組合物的活性藥物成分。具體地，本發(fā)明涉及兩種新的衍生自人癌胚胎(oncofoetal)抗原未成熟層粘連蛋白受體(OFA/iLR)的HLAI類或II類分子的肽序列，其能夠被用在疫苗或其它藥物組合物中以引發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答。出于本發(fā)明的目的，通過參考的方式將所有的參考文獻整體并入。發(fā)明背景免疫應(yīng)答的刺激依賴于存在被宿主免疫系統(tǒng)視為外來物的抗原。腫瘤相關(guān)抗原的發(fā)現(xiàn)已使得使用宿主免疫系統(tǒng)干擾腫瘤生長成為可能。目前正在研究將利用免疫系統(tǒng)的體液和細胞效應(yīng)的不同機制用于癌癥免疫治療。細胞免疫應(yīng)答的特殊成分能夠特異識別與破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤的細胞群中或從外周血分離出細胞毒性T細胞暗示這些細胞在抗癌的天然免疫防御中起重要作用(Cheeveretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.1993690:101-112;RosenbergSA.Sheddinglightonimmunotherapyforcancer(癌癥免疫治療的曙光).NEnglJMed.2004Aprl;350(14):1461-3.)。特別是€08+T細胞(TCD8+)在這類應(yīng)答中起重要作用，該CD8+T細胞識別由主要組織相容性復合體(MHC)I類分子所攜帶的通常為8至10個殘基長的肽，該肽來自定位在細胞核或細胞質(zhì)中的蛋白，或來自缺陷核糖體蛋白(DRIPs)。DRIPs是肽的基本來源且組成核糖體不完全翻譯的產(chǎn)物，且最早由J.Yewdell小組提出(SchubertU，AntonLC，GibbsJ,NorburyCC，YewdellJW，BenninkJR.Rapiddegradationofalargefractionofnewlysynthesizedproteinsbyproteasomes(新合成蛋白中的大部分被蛋白酶體快速降解).Nature.2000Apr13;404(6779):770-4)。人類的MHC分子也被稱為人類白細胞抗原(HLA)。MHC分子有兩大類，其能夠被帶有T細胞受體的T細胞識別MHCI類分子，其能夠在大多數(shù)有核細胞中找到，該細胞提呈由內(nèi)源蛋白和較大肽的蛋白水解切割產(chǎn)生的肽。MHCII類分子能夠在如巨噬細胞和樹突狀細胞的專職抗原提呈細胞(APC)、B纟田胞、內(nèi)皮細胞以及在正常狀況下并不在其細胞表面上表達MHCII類分子的腫瘤與腫瘤基質(zhì)的改變的細胞上發(fā)現(xiàn)，且MHCII類分子提呈負載有在細胞內(nèi)吞作用中被APC攝取的外源蛋白的肽，或者進入II類MHC區(qū)室并隨后被處理且負載于II類MHC復合體上的肽。肽與MHC-I的復合物被CD8+陽性的細胞毒性T細胞所識別，肽與MHC-II的復合物被CD4+輔助性T細胞所識別(總體描述于CharlesA.,Jr.Janeway,PaulTravers，MarkWalport,MarkJ.Shlomchik所著的Immunobiology(免疫學)中)。肽必須與MHC分子結(jié)合才能激發(fā)(引發(fā))細胞免疫應(yīng)答。這個過程依賴于MHC分子的等位基因和所述肽的氨基酸序列的多態(tài)性。結(jié)合于MHCI類分子的肽通常長8至IO個殘基且在其序列中含有兩個保守的殘基("錨")，該保守的殘基與MHC分子上對應(yīng)的結(jié)合槽相互作用(參見發(fā)表在Immunogenetics上的第二個歹l)表(RammenseeH,BachmannJ,EmmerichNP，BachorOA,StevanovicS.SYFPEITHI:databaseforMHCligandsandpeptidemotifs(SYFPEITHI:MHC配體和肽基序的數(shù)據(jù)庫).Immunogenetics.1999Nov;50(3-4):213-9)?，F(xiàn)今有許多小鼠和人類TCD8+的例子，其特異識別腫瘤細胞且在過繼轉(zhuǎn)移后具有治療活性，在某些例子中能誘導完全緩解。然而，盡管T細胞具有清除肺瘤的潛能，從多數(shù)癌癥的進行性生長明顯看出許多腫瘤在體內(nèi)逃過被TCD8+識別。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多腫瘤是致免疫的，但有效的抗肺瘤免疫應(yīng)答刺激難以證明最近的證據(jù)顯示免疫能夠?qū)е驴狗瘟鱿嚓P(guān)肽的強烈T細胞應(yīng)答(SpeiserDE,LienardD,RuferN,Rubio-GodoyV,RimoldiD,LejeuneF，KriegAM,CerottiniJC,RomeroP.RapidandstronghumanCD8+Tcellresponsestovaccinationwithpeptide,IFA,andCpGoligodeoxynucleotide7909(對寸吏用肽、IFA和CpG寡脫氧核苷酸7909的疫苗接種的快速和強烈的人CD8+T細胞應(yīng)答).JClinInvest.2005Mar;115(3):739-46.SchagK，SchmidtSM,MullerMR,WeinschenkT,AppelS,WeekMM,GmnebachF,StevanovicS,RammenseeHG，BrossartP.IdentificationofC-metoncogeneasabroadlyexpressedtumor-associatedantigenrecognizedbycytotoxicT-lymphocytes(鑒定C-met癌基因作為被細胞毒性T細胞識別的廣泛表達的腫瘤相關(guān)抗原).ClinCancerRes.2004Junl;10(ll):3658-66)。被腫瘤特異性細胞毒性T細胞所識別的抗原，即它們的表位，能夠是衍生自所有蛋白類別的分子，例如酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等。在www.syfpeithi.org可查到結(jié)合或/人MHCI類和II類分子洗脫下來的肽的綜合名單。此外，肺瘤相關(guān)抗原例如還可以只在胂瘤細胞中存在，例如作為突變基因的產(chǎn)物。良好的例子是起T細胞表位作用的、來自K-ras、BCR-abl和突變p53的MHCI類分子配體。肺瘤相關(guān)抗原的另一重要類別是組織特異的結(jié)構(gòu)，例如在不同種類的腫瘤以及睪丸的健康組織中表達的CT("睪丸癌")抗原。與MHC分子結(jié)合的其它肺瘤相關(guān)肽產(chǎn)生自基因，與相同器官或組織的健康細胞相比，以及與來自其它組織的健康細胞相比，其在癌細胞中以更高的拷貝數(shù)表達。以c-met為例，參見SchagK,SchmidtSM,MullerMR,WeinschenkT,AppelS,WeekMM,GrunebachF,StevanovicS,RammenseeHG，BrossartP.IdentificationofC-metoncogeneasabroadlyexpressedtumor-associatedantigenrecognizedbycytotoxicT-lymphocytes(鑒定C-met癌基因4乍為被細胞毒性T細胞識別的廣泛表達的腫瘤相關(guān)抗原).ClinCancerRes.2004Junl;10(ll):3658-66。其它肺瘤相關(guān)肽產(chǎn)生自保留于腫瘤細胞中不分泌的抗原(如來自粘蛋白家族的蛋白)。其它來源可以是異常轉(zhuǎn)錄本(移碼)，來自翻譯后蛋白-蛋白融合的接合位置的肽。在www.cancerimmunity.org可查到科學文獻中所4是及的腫瘤相關(guān)抗原的綜合名單。已經(jīng)鑒定了多種腫瘤相關(guān)抗原。此外，正在進行大量研究以鑒定其它腫瘤相關(guān)抗原。某些腫瘤相關(guān)抗原，在本領(lǐng)域中也被稱為腫瘤特異抗原，是組織特異的。實例包括，但不限于，黑素瘤的酪氨酸酶，前列腺癌的PSA與PSMA以及淋巴瘤中的染色體交換，例如bcr/abl。然而，許多已鑒定的腫瘤相關(guān)抗原在多種腫瘤中出現(xiàn)，且有些在幾乎所有的腫瘤種類中出現(xiàn)，例如實際上導致轉(zhuǎn)化事件的致瘤性蛋白和/或肺瘤抑制基因(腎癌的肺瘤抑制基因例如綜述在LinehanWM,WaltherMM，ZbarB.Thegeneticbasisofcancerofthekidney(腎癌的遺傳基礎(chǔ)).JUrol.2003Dec;170(6Pt1):2163陽72)。在BertVogelstein與KennethW.Kinzler于2002年所著的TheGeneticBasisofHumanCancer(人類癌癥的遺傳基礎(chǔ))中可找到人類癌癥的遺傳原因的更通用綜述。例如，控制細胞生長與分化的正常細胞蛋白，例如p53(其為肺瘤抑制基因的實例)、ras、c-met、myc、pRB、VHL與HER-2/neu等，能夠累積突變導致這些基因產(chǎn)物的過度表達由此使它們具有致癌性(McCartey等人CancerResearch199815:582601-5;Disis等人CibaFound.Symp.1994187:198-211)。在多種癌癥中，這些突變蛋白能夠作為腫瘤特異免疫應(yīng)答的目標。癌胚胎未成熟層粘連蛋白受體(OFA/iLRP)廣泛地表達在包括血液肺瘤在內(nèi)的許多種人類肺瘤中(RohrerJW,BarsoumAL,CogginJHJr.Thedevelopmentofanewuniversaltumorrejectionantigenexpressedonhumanandrodentcancersforvaccination,preventionofcancer,andanti-tumortherapy(在人和嚙齒動物癌癥中表達的用于疫苗接種、預防癌癥和抗腫瘤治療的新的通用腫瘤排斥抗原的開發(fā)).ModAspImm翻biol.2001;5:191-195.BarsoumAL,RohrerJW,CogginJH.37kDaoncofoetalantigenisanautoimmunogenichomologueofthe37kDalamininreceptorprecursor(37kDa癌胚胎抗原是37kDa層粘連蛋白受體前體的自身免疫性同源物).CellMolBiolLett.2000;19:5535-5542.CastronovoV.Lamininreceptorsandlaminin-bindingproteinsduringtumorinvasionandmetastasis(月中瘤4曼入和轉(zhuǎn)移中的層粘連蛋白受體和層粘連蛋白結(jié)合蛋白).InvasionMetas.1993;13:1-30.CogginJHJr，Barsoum,AL，RohrerJW.TumorsexpressbothuniqueTSTAandcrossprotective44kDaoncofetalantigen沐達獨特TSTA和交叉保護44kDa癌胚胎抗原的腫瘤).ImmunolToday.1998;19，405-408.CogginJHJr,BarsoumAL,RohrerJW.37kiloDaltononcofetalantigenproteinandimmaturelamininreceptorproteinareidentical,universalT隱cellinducingimmunogensonprimaryrodentandhumancancers(37kDa癌胚胎抗原蛋白和未成熟層粘連蛋白受體蛋白在原發(fā)性嚙齒動物和人類癌癥中是相同的、通用的T細胞誘導免疫原).AnticancerRes.1999;19,5535-5542),{旦其并不出現(xiàn)在正常的成人分化組織中。OFA-iLRP能夠;故T細胞與B細胞特異識別，這使其成為若干癌癥病種中用于疫苗接種方法的有吸引力的靶分子。使用經(jīng)編碼OFA-iLR的RNA轉(zhuǎn)染的樹突狀細胞(DC),能夠在體外或體內(nèi)產(chǎn)生抗造血靶細胞的腫瘤特異T細胞應(yīng)答(SiegelS,WagnerA，KabelitzDetal.Coggin,J.Jr.,Barsoum,A.，Rohrer,J.,Schmitz,N.，Zeis,M.InductionofcytotoxicTcellresponsesagainsttheoncofoetalantigen-immaturelamininreceptorforthetreatmentofhematologicalmalignancies(i秀導^元癌胚月臺^t原、-未成熟層粘連蛋白受體的細胞毒性T細胞應(yīng)答用于血液腫瘤的治療).Blood2003;102，4416-4423.)。美國專利第6,753,314號描述了包含第一多肽與第二多肽的純化的蛋白復合物，其中所述復合物包含第一多肽的氨基酸序列(SMIl，SEQIDNO:359),以及第二多肽(BASl,SEQIDNO:518)，以ProPair267a-267b表示。美國專利第4，861，710號公開了包含編碼層粘連蛋白的細胞表面受體的重組cDNA克隆的克隆以及各自的探針。為了使蛋白被細胞毒性T細胞識別為腫瘤特異抗原并為了用于治療，必須滿足特定的前提條件。抗原應(yīng)當主要由腫瘤細胞表達而非由正常健康的組織表達或以相當小量表達。更理想地，各自的抗原不4又在一種腫瘤中表達，且還以高濃度表達(例如每個細胞的拷貝數(shù))。最重要的是抗原氨基酸序列中存在表位，因為這種衍生自腫瘤相關(guān)抗原的肽("致免疫肽")應(yīng)該會導致體外或體內(nèi)的T細胞應(yīng)答。直到目前，已描述了許多將抗原靶向II類處理途徑中的策略。將抗原提呈細胞(APC)與感興趣的抗原一起孵育以使得抗原被攝取并處理(Chaux,P.，Vantomme,V.，Stroobant，V.,Thielemans,K.,Corthals,J.，Luiten,R.，Eggermont,A.M.，Boon,T.&vander,B.P.(1999)J.Exp.Med.189,767-778)。其它方法使用包含溶酶體靶序列的融合蛋白。在抗原提呈細胞中表達時，這種融合蛋白將抗原導向II類處理區(qū)室中(Marks,M.S.，Roche,P.A.，vanDonselaar,E.,Woodruff,L，Peters,P.J.&Bonifacino,J.S.(1995)J.CellBiol.131,351-369,Rodriguez,F.,Harkins，S.,Redwine,J.M.,dePereda,J.M.&Whitton，J.L.(2001)J.Virol.75，10421-10430)。同樣地，已經(jīng)開發(fā)了用于將肽以及其它活性藥物成分遞送至pAPC的特殊脂質(zhì)體制劑(WalterS，HerrgenL,SchoorO,JungG,WernetD,BuhringHJ，RammenseeHG，StevanovicS.Cuttingedge:predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti陽CD28-coatedmicrospheres(邊緣技術(shù)人CD8T細月包的預定親合性擴展到校準MHC/抗CD28包被的微球上).JImmunol.2003Nov15;171(10):4974-8.)。另一個可選擇的方法是在體外或體內(nèi)外部加載pAPC的MHC分子。在這種方式中，將抗原提呈細胞與過量的肽在細胞培養(yǎng)基中孵育，導致竟爭結(jié)合APC表面上的MHC分子。T輔助細胞在組織CTL在抗肺瘤免疫中的效應(yīng)性功能中起重要作用。激發(fā)1111型丁輔助細胞應(yīng)答的丁輔助細胞表位支持€08+殺傷T細月包的效應(yīng)性功能，其包括抗肺瘤細胞的細胞毒功能，該肺瘤細胞在其細胞表面展示腫瘤相關(guān)肽/MHC分子復合物。以這種方法，腫瘤相關(guān)的T輔助細胞肽表位，單獨地或與其它腫瘤相關(guān)肽組合，能夠作為刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗組合物的活性藥物成分。因此，腫瘤疫苗開發(fā)中的主要任務(wù)是鑒別和表征能夠被〔04+CTL識別的新的肺瘤相關(guān)抗原以及由其書f生的致免疫的T輔助細胞。因此，本發(fā)明的目的是提供如下肽的新的氨基酸序列該肽具有與人主要組織相容性復合體(MHC)I類分子結(jié)合的能力且激發(fā)T細胞應(yīng)答，該依據(jù)本發(fā)明，通過提供腫瘤相關(guān)肽完成此目標，該肽選自至少在序列上含有所附序列表中的任一的SEQIDNo.l和SEQIDNo.2序列的肽，其中所述肽具有與人主要組織相容性復合體(MHC)I類分子結(jié)合的能力，其中人主要組織相容性復合體(MHC)I類分子包含但不限于最常表達于高加索人種的HLA等位基因HLA-A2(包括HLA-A2的亞型，例如HLA-A*0201)。本發(fā)明還涉及兩個新的衍生自癌胚胎抗原-未成熟層粘連蛋白受體蛋白的HLAI類分子的肽序列，所述兩個新的肽序列能夠用于疫苗組合物以引發(fā)抗胂瘤免疫應(yīng)答。所述兩個新的肽序列是通過新的可通用的組合方法鑒定的，該方法用于鑒定定義的_即腫瘤相關(guān)-抗原的未知的天然處理的HLAI類配體。因此，發(fā)明人鑒定了兩個不同的衍生自O(shè)FA/iLR蛋白的HLA-A*0201特異的T細胞表位，這兩個表位能夠誘導抗人類腫瘤細胞的特異T細胞反應(yīng)性，該人類肺瘤細胞包括但L不限于各種血液鐘瘤。本發(fā)明的第一方面是提供肽，其含有任一的氨基酸序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或其變體，條件是該肽不是書f生所述氨基酸序列的完整人類多肽(即癌胚胎抗原-未成熟層粘連蛋白受體蛋白(OFA/iLRP);關(guān)于登錄號，參見下文所附表1)。如下文所述，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的肽，均被確定為被帶有I類MHC的細胞所提呈。因此，這些特定的肽以及其它包含所述序列的肽(即書亍生的肽)最有可能均引發(fā)特異的T細胞應(yīng)答，盡管這些被誘導的應(yīng)答在程度上會在肽與肽之間不同。例如，差異可以是由所述肽中的突變造成的(見下文)。目前本領(lǐng)域技術(shù)人員詳細了解可以用來測定單個肽誘-導的應(yīng)答程度的方法，特別是參考本文的實例與相關(guān)文獻。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽基本上由任一的氨基酸序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或其變體組成。"基本上由......組成"應(yīng)指本發(fā)明的肽，除了任一的序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或其變體之外，包含另外的位于N末端和/或C末端的延伸的氨基酸，該延伸的氨基酸并不必須是作為所述肽的核心序列的肽的一部分，所述肽的核心序列包含結(jié)合基序并作為激發(fā)免疫應(yīng)答的T輔助表位。然而，這些延伸對于提供將本發(fā)明的肽有效引入至細胞可以是重要的。關(guān)于給定氨基酸序列的"變體"，發(fā)明人是指例如一或兩個氨基酸殘基的側(cè)鏈被改變(例如以另一天然存在的氨基酸殘基的側(cè)鏈或某些其它側(cè)鏈取代它們)使得所述肽依然能夠以基本上與由給定氨基酸序列組成的肽相同的方式與HLA分子結(jié)合。例如，肽可被修飾使得其至少保留，如果沒有改善的話，與適當?shù)腗HC分子，如HLA-A,相互作用或結(jié)合的能力，且使得至少保留，如果沒有改善的話，產(chǎn)生活化CTL的能力，該活化的CTL能夠識別并殺滅表達含有本發(fā)明各方面所定義的氨基酸序列的多肽的細胞。如能夠從下文描述的數(shù)據(jù)庫得到，HLA-A結(jié)合肽的某些位置是典型的錨定殘基，這些殘基形成適配HLA結(jié)合槽的結(jié)合基序的核心序列。對于與T細胞受體相互作用并非必需的那些氨基酸殘基可以通過用另一氨基酸替代而修飾，這些氨基酸的摻入基本上不影響T細胞反應(yīng)性并且不消除與相關(guān)MHC的結(jié)合。因此，除了已給出的限定條件外，本發(fā)明的肽可以是任何包含所給出的氨基酸序列或其部份或變體的肽(本發(fā)明人所指的術(shù)語"肽"包含寡肽或多肽)。已知由II類MHC提呈的肽是由含某些HLA特異氨基酸基序以及，任選地，N和/或C末端延伸的"核心序列"組成的，該N和/或C末端延伸不干擾核心序列的功能(即，被認為與肽和T細胞間的相互作用無關(guān))。該N和/或C末端延伸可以分別長1至IO個氨基酸。因此，II類MHC體內(nèi)提呈的本發(fā)明的優(yōu)選肽的總長度介于9至30個氨基酸之間?？梢灾苯邮褂眠@些肽以負載MHCII類分子或者所述序列可依據(jù)下文中的描述被克隆至載體。因為這些肽形成細胞內(nèi)較大肽的處理終產(chǎn)物，所以也能夠使用較長的肽。本發(fā)明的肽可以是任何大小，但通常它們的分子量小于100000，優(yōu)選小于50000,更優(yōu)選小于10000且通常約為5000。以氨基酸殘基的數(shù)目而言，本發(fā)明的肽可以含有少于1000個殘基，優(yōu)選少于500個殘基，更優(yōu)選少于100個殘基。在本發(fā)明的另一方面中，與上文對MHCII類分子所說明的情況相似，本發(fā)明的肽(盡管主要與MHCI類分子相關(guān))可用于激發(fā)II類MHC特異性應(yīng)答，因為ILR1與ILR2能夠同時展示HLAII類分子的核心或部份序列(與下述表中所示的特定HLAII類等位基因匹配)。如上，N和/或C末端延伸可以分別長1至IO個氨基酸。因此，本發(fā)明的優(yōu)選肽的總長度介于9至30個氨基酸之間?？梢灾苯邮褂眠@些肽以負載MHCII類分子或者所述序列可以依據(jù)下文的描述被克隆至載體。因為這些肽形成細胞內(nèi)較大肽的處理終產(chǎn)物，所以也可以使用較長的肽。本發(fā)明此實施方案的肽可以是任何大小，但通常它們的分子量可以小于100000，優(yōu)選小于50000，更優(yōu)選小于10000且通常約為5000。以氨基酸殘基的數(shù)目而言，本發(fā)明的肽可以含有少于1000個殘基，優(yōu)選少于500個殘基，更優(yōu)選少于100個殘基。表A:ILRl-含有HLAII類分子的某些HLA特異的氨基酸基序的"核心序列"。匹配的氨基酸以斜體字母表示。通過計算機程序PAProC(http:〃www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)和SYFPEITHY(http:〃www.syfpeithi.de)進4亍的子貞測。HLA-DRB1*010115個氨基酸殘基-3-2-l123456789+1+2+3分數(shù)RTWEK丄〖爿爿/26TWEK丄^/26RAIVAIENPADVSVI25EK丄〖爿//EN24KRTwEK〖丄/20HLA-DRB1*0301(DR17)15個氨基酸殘基-3-2-11246789+1+2+3分數(shù)WEK〖〖及/K爿/E20i/ENPADVSV19INKRTWEK丄丄18HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)15個嚴'基瞎L殘基-3-2-l12346789+1+2+3分數(shù)WEK〖^及爿//E26EK〖丄爿EN20^//ENPADVSV20爿ENPADVsVI20HLA-DRB1*070115個氨基酸殘基■3-2-11246789+1+2+3分數(shù)WEK〖〖I/爿/E22iENpADVSV20EK丄〖7爿/EN18HLA-DRB1*1501(DR2b)15個氨基酸殘基-3-2-l123456789+1+2+3分數(shù)EK丄丄爿爿^爿/EN24INKRTwEK丄〖爿i20KL丄爿/KENP20ENPADVSVI18表B:ILR2-含有HLAII類分子的某些HLA特異的氨基酸基序的"核心序列"。匹配的氨基酸以斜體字母表示。通過計算機程序PAProC(http:〃www.uni國tuebingen.de/imi/kxi/)和SYFPEITHY(http:〃www.syfpeithi.de)進4亍的預測。HLA-DRB1*010115個氨基酸殘基-3-2-1123456.7.8.9+1+2+3分數(shù)EASYVNLPTIJICWJ733LPTI爿丄CWrZ)S戶丄RY23HLA-DRB1*0301(DR17)15個氨基酸殘基-3-2-l123456789+1+2+3分數(shù)I〖CrDS戶丄RYVDI20HLADRB1*0401(DR4Dw4)15個氨基酸殘基-3-2-l123456789+1+2+3分數(shù)EASYvNLpTIJ￡Ctvr28yvnLptI爿1Crd20NPTI爿丄CTVT"5尸丄R18HLA-DRB1*070115個氨基酸殘基-3-2-l123456789+1+2■+3分數(shù)EASYvNLpTIj￡cr26Ti丄civrz)51p丄RYVD24HLA-DRB1*1501(DR2b)15個氨基酸殘基-3-2-1123456789+1+2+3分數(shù)Ti)SP丄RYVDIAIPCN20LPTIALCNTDSPLRY18TIALCNTDSPLRYVD18如果使用比約12個氨基酸殘基更長的肽直接結(jié)合MHC分子，優(yōu)選地，位于核心HLA結(jié)合區(qū)兩側(cè)的殘基是基本上不影響該肽特異結(jié)合MHC分子的結(jié)合槽的能力或向CTL提呈該肽的那些殘基。然而，如上文已指明的，應(yīng)理解可以使用較大的肽，特別是當由多核普酸編碼時，因為這些較大的肽可被適當?shù)目乖岢始毎瑪嗷?。發(fā)明人所指的"肽"不只包含其中由肽(-CO-NH-)鍵連接氨基酸殘基的分子，也包括其中肽鍵反轉(zhuǎn)的分子。這種連接順序顛倒-改變構(gòu)型的肽模擬物可以用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如在Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中所描述的那些，通過引用的方式將其并入本文。該方法包括制備含有涉及骨架變化而非側(cè)鏈方向變化的假肽。Meziere等人(1997)顯示，這些^f艮肽至少對MHCII類分子和T輔助細胞應(yīng)答是有效的。這種連接順序顛倒-改變構(gòu)型的肽，其含有NH-CO鍵而非CO-NH肽鍵，對蛋白水解的抗性要強的多。通常，本發(fā)明的肽，如果在抗原提呈細胞中表達，可以被處理以便于產(chǎn)生能夠與適當?shù)腗HC分子結(jié)合的片段并且被適當?shù)募毎岢什⒁l(fā)適當?shù)腡細胞應(yīng)答。應(yīng)理解從該肽產(chǎn)生的片段也可以是本發(fā)明的肽。方便地，本發(fā)明的肽含有包括給定氨基酸序列或其部份或變體的部分，以及賦予某些期望特性的其它部分。例如，該其它部卩分可以包含其它的T細胞表位(不管是否與含有第一T細胞表位的部分衍生自同一多肽)，或者其可以包含載體蛋白或肽。因此，在一實施例中本發(fā)明的肽為截短的人類蛋白或蛋白片斷與另一多肽部分的融合蛋白，條件是所述人類部分含有一個或多個本發(fā)明的氨基酸序列。在特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的肽包含本發(fā)明的氨基酸序列以及至少一個另外的T細胞表位，其中該另外的T細胞表位能夠促4吏產(chǎn)生針對表達肺瘤相關(guān)抗原的腫瘤種類的T細胞應(yīng)答。因此，本發(fā)明的肽包含也能夠用作疫苗的稱為"串珠(beadsonastring)'，的多肽。由下文將會理解在某些應(yīng)用中本發(fā)明肽的可被直接使用(即，它們并非通過多核苷酸在患者細胞中或者在給予患者的細胞中的表達而產(chǎn)生)；在這些應(yīng)用中優(yōu)選的是所述肽含有少于100或50個殘基。本發(fā)明的優(yōu)選的肽顯示全長介于9至30個氨基酸。優(yōu)選的是本發(fā)明的肽能夠與HLA-A2結(jié)合。特別優(yōu)選的是所述肽選擇性結(jié)合HLA-A*0201。本發(fā)明人所指的"異常表達，，包含以下含義與正常表達水平相比，多肽是過表達的，或者在衍生腫瘤的組織中基因是沉默的但在腫瘤中表達。發(fā)明人所指的"過度表達，，是指多肽的表達量至少是正常組織中的1.2倍；優(yōu)選為正常組織中存在水平的至少2倍，最優(yōu)選至少5或104咅。肽(至少是含有氨基酸殘基間肽4建的那些)可以通過在Lu等人(1981)J.Org.Chem.46,3433及其中的參考文獻中所公開的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺方式合成。通過9-芴曱氧羰基(Fmoc)基團提供暫時的N-氨基基團保護。使用20%的哌啶的二曱基曱酰胺溶液重復切除此對堿高度敏感的保護基團。側(cè)鏈官能度可以以其丁醚(在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁酯(在谷氨酸和天冬氨酸的情況下)、丁氧基羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯曱基衍生物(在半胱氨酸的情況下)、4-曱氧基-2，3,6三曱基苯磺?；苌?在精氨酸的情況下)保護。當谷氨酰胺或天冬酰胺是C末端殘基時，將4,4'-二曱氧基二苯甲基基團用作保護側(cè)鏈酰胺基功能度。固相支持物是基于由三種單體二甲基丙烯酰胺(骨架單體)、二丙烯酰乙二胺(交聯(lián)劑)與丙烯酰肌氨酸曱酯(官能化劑)所組成的聚二甲基丙烯酰胺聚合物。所用的肽與樹酯間可切割的連接劑是對酸敏感的4-羥曱基苯氧基乙酸衍生物。除天冬酰胺和谷氨酰胺是以反向的N,N-二環(huán)己基碳二亞胺/l-羥基苯并三唑介導的連接方法加入外，其它所有氨基酸衍生物均以其預制的對稱無水衍生物被加入。所有連接與去保護反應(yīng)均以茚三酮、三硝基苯磺酸或吲咮醌(isotin)測試方法監(jiān)測。合成完成后，通過用含有50%清除劑混和物的95%三氟醋酸處理從樹脂支持物上切割下肽并伴隨除去側(cè)鏈保護基團。常用的清除劑有乙二硫醇、酚、苯甲醚和水，確切的選擇依賴于被合成的肽的氨基酸組成。固相與液相方法的組合用于肽的合成也是可能的(例如參見BmckdorferT，Marder0,AlbericioF.Fromproductionofpeptidesinmilligramamountsforresearchtomulti-tonsquantitiesfordrugsofthefuture。人用于研究的以毫克量級生產(chǎn)肽到未來用于藥物的以數(shù)噸量級生產(chǎn)).CurrPharmBiotechnol.2004Feb;5(l):29-43及其中的參考文獻)。真空蒸發(fā)除去三氟醋酸，接著以二乙醚研制得到粗制的肽?；蛘撸梢栽诘蛪簝龈汕笆褂名}交換方法(TFA-〉醋酸)。任何存在的清除劑可以通過簡單的萃取方法去除，低壓凍干水相得到不含清除劑的粗制的肽。用于肽合成的試劑一般可由Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,NottinghamNG72QJ，UK購得?？梢酝ㄟ^例如大小排阻層析、離子交換層析、疏水相互作用層析以及(通常)使用乙腈/水梯度分離的逆相高效液相色譜中的任何一種或其組合實現(xiàn)純化?？梢允褂帽由玦普法、逆相高效液相色譜、酸水解后的氨基酸分析、Edman測序以及通過快原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析，以及MALDI與ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析進行肽的分析。本發(fā)明的其它方面提供編碼本發(fā)明肽的核酸(如多核苷酸)。該多核苷酸可為DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或其組合，且該多核苷酸可以含有或不含內(nèi)含子，只要其編碼所述肽。當然，只有含有由天然存在的肽鍵連接的天然存在的氨基酸殘基的多肽才可能由多核苷酸編碼。本發(fā)明的其它方面提供能夠表達本發(fā)明多肽的表達載體。已經(jīng)開發(fā)出許多方法以可操作地連接多核苷酸，特別是DNA，和載體，例如通過互補的粘性末端。舉例來說，可以將互補的同聚物加到名炎插入載體DNA中的DNA片斷上。該載體DNA和DNA片斷隨后通過互補的同聚物尾部之間的氫鍵連接而形成重組DNA分子。含有一個或多個限制位點的合成接頭提供連接DNA和載體的其它方法。用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I處理如前所述以內(nèi)切核酸酶限制消化而產(chǎn)生的DNA片斷，所述兩種酶以其3'-5，核酸外切酶活性去除突出的3'單鏈末端，并以其聚合酶活性填補凹進的3，末端。因此這些活性的組合產(chǎn)生平末端DNA片斷。然后在例如噬菌體T4DNA連接酶的能夠催化平末端DNA分子連接的酶的存在下，將平末端片斷與大摩爾/升的過量的接頭分子一起孵育。因此，該反應(yīng)的產(chǎn)物是在其末端帶有聚合物接頭序列的DNA片斷。這些DNA片斷然后以適當?shù)南拗泼盖懈?，并連接到表達載體中，該表達載體已經(jīng)被產(chǎn)生與DNA片斷的那些末端兼容的末端的酶切開。含有多種限制性核酸內(nèi)切酶位點的合成接頭可從包括InternationalBiotechnologiesInc.,NewHaven,CN,USA,在內(nèi)的許多來源購得。修飾編碼本發(fā)明多肽的DNA的理想方法是4吏用如Saiki等人(1988)Science239,487-491所公開的聚合酶鏈反應(yīng)。此方法可用于將DNA引入適當載體，例如通過在適當?shù)南拗莆稽c中構(gòu)建，或者可以用本領(lǐng)域已知的其它有用方法修飾DNA。在此方法中將被酶促擴增的DNA的兩側(cè)為兩個特異引物，該引物本身被包括到擴增的DNA中。所述特異引物可含有限制性核酸內(nèi)切酶識別位點，它們能夠被用于使用本領(lǐng)域已知的方法向表達載體中克隆。然后在適當宿主中表達所述DNA(或RNA，在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下)以產(chǎn)生含有本發(fā)明化合物的多肽。因此，可以根據(jù)已知技術(shù)使用、根據(jù)本文的教導適當?shù)匦揎椊M成本發(fā)明化合物的編碼所述多肽的DNA，以構(gòu)建表達載體，該載體隨后用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎员磉_及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這些技術(shù)包括在以下專利中公開的那些于1984年4月3日授予Rutter等人的美國專利4,440,859、于1985年7月23日授予Weissman等人的美國專利4,530,901、于1986年4月15日授予Crowl等人的美國專利4,582,800、于1987年6月30日授予Mark等人的美國專利4,677,063、于1987年7月7日授予Goeddel等人的美國專利4,678,751、于1987年11月3日授予Itakura等人的美國專利4,704,362、于1987年12月1日授予Murray等人的美國專利4,710,463、于1988年7月12日授予Toole等人的美國專利4,757,006、于1988年8月23日授予Goeddel等人的美國專利4,766,075、于1989年3月7日授予Stalker等人的美國專利4,810,648，將以上所有專利通過參考的方式并入本文?？梢詫⒔M成本發(fā)明化合物的編碼所述多肽的DNA(或RNA,在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況中)與許多種其它的DNA序列連接用于引入適當宿主。該伴隨DNA將會取決于宿主的性質(zhì)、或?qū)NA引入宿主的方式，以及是期望附加體保持(episomalmaintenance)還是期望整合。通常，DNA以適當方向與正確的閱讀框插入例如質(zhì)粒的表達載體中而表達。如果需要，可以將DNA與被期望宿主所識別的適當?shù)霓D(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控核苷酸序列連接，雖然表達載體中通常提供這些調(diào)控。然后通過標準技術(shù)將載體引入宿主。通常，并非所有的宿主都被載體轉(zhuǎn)化。因此，選擇被轉(zhuǎn)化的宿主細胞是必要的。一種選擇技術(shù)包括將DNA序列以及任何必要的控制元件引入表達載體，該DNA序列編碼轉(zhuǎn)化細胞中的可選"t奪的性狀，例如對抗生素的抗藥性?；蛘?，這種可選擇性狀的基因可位于另一載體上，該載體被用來共轉(zhuǎn)化期望的宿主細胞。然后根據(jù)本文所公開的教導、在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當條件下將已被本發(fā)明的重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主細胞培養(yǎng)足夠時間，以使所述肽表達，該肽隨后能夠被回收。已知許多表達載體系統(tǒng)，包括細菌(例如大腸桿菌與枯草芽孢桿菌(5ac〃/twsi/Z"/^))、酵母(^口酉良酒酵母(SaccAaraw少c&scereWw'ae))、絲^1犬真菌(如曲霉菌(A^erg/〃w力)、才直物細胞、動物細胞與昆蟲細胞。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)可以是Awells細胞。啟動子是由DNA序列所形成的表達控制元件，其允許RNA聚合酶的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄發(fā)生。與典型細菌宿主兼容的啟動子序列通常在質(zhì)粒載體中提供，該質(zhì)粒載體含有便利的限制位點用于插入本發(fā)明的DNA片段。典型的原核載體質(zhì)粒為可購自BioradLaboratories(Richmond,CA，USA)的pUCl8、pUC19、pBR322與pBR329，以及可購自Pharmacia(Piscataway，NJ,USA)的pTrc99A與pKK223畫3。典型的哺乳動物細月包載體質(zhì)粒為可購自Pharmacia(Piscataway,NJUSA)的pSVL。此載體使用SV40晚期啟動子驅(qū)動克隆基因的表達，在T抗原產(chǎn)生細胞，例如COS-l細胞中發(fā)現(xiàn)最高水平的表達?？烧T導的哺乳動物表達載體的實例是PMSG，也可購自Pharmacia。這個載體使用小鼠乳癌病毒長末端重復的糖皮質(zhì)激素誘導的啟動子，以驅(qū)動克隆基因的表達。有用的酵母質(zhì)粒載體為pRS403-406與pRS413-416,通?？少徸許tratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037,USA。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405與pRS406是酵母整合型質(zhì)粒(YIps)，并且包含酵母的可選擇標志物HIS3、TRP1、LEU2與URA3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母中心粒質(zhì)粒(Ycps)。本領(lǐng)域公知用于多種宿主細胞的其它載體和表達系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的多核苷酸載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。該宿主細胞可以是原核的或真核的。在某些情況下細菌細胞可以是優(yōu)選的原核宿主細^<，典型為大腸桿菌菌才朱，例如可購自BethesdaResearchLaboratoriesInc.,Bethesda，MD,USA的大腸桿菌菌才朱DH5,以及可由美國典型培養(yǎng)物j呆藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，Rockville,MD,USA)獲得的RR1(編號ATCC31343)。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲與哺乳動物細胞，優(yōu)選的脊推動物細胞例如來自小鼠、大鼠、猴子或人類原始纖維細胞的或腎細胞系的那些。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500與YPH501，通?？捎蒘tratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037，USA購得。優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括可以CCL61自ATCC取得的中國蒼鼠卯巢細胞(CHO)、可以CRL1658自ATCC取得的NIHSwiss小鼠胚胎細胞NIH/3T3、可以CRL1650自ATCC取得的猴腎衍生的COS-1細胞以及人類胚胎腎細胞293細胞。優(yōu)選的昆蟲細胞是Sf9細胞，其可一皮桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染。'通過公知的方法完成用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適當?shù)募毎拗鳎龇椒ㄍǔＨQ于所用的載體類別。關(guān)于原核宿主細胞的轉(zhuǎn)化，例如參見Cohen等人(l972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110以及Sambrook等人(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。酵母細胞的轉(zhuǎn)化描述于Sherman等人(1986)MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryManual(酵母遺傳學中的方法，實'驗室手冊),ColdSpringHarbor,NY。Beggs(1978)Nature275,104-109中的方法也是有用的。關(guān)于脊推動物細胞，用于轉(zhuǎn)染這類細胞的試劑，例如磷酸4丐與DEAE-右旋糖酐或脂質(zhì)體配方，可自StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg，MD20877,USA取得。電穿孔也用于轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染細胞，且本領(lǐng)域公知用于轉(zhuǎn)化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞與脊推動物細胞。能夠通過公知技術(shù)鑒別成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的細胞。例如，能夠培養(yǎng)由引入本發(fā)明的表達構(gòu)建體得到的細胞以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。能夠收集并裂解細胞，并使用例如Southern(1975)J.Mol.Biol.98,503或Berent等人(1985)Biotech,3,208所述的方法檢測其DNA成分以檢測DNA的存在?；蛘?，上清液中蛋白的存在能夠如以下所述用抗體一企測。除了直接測定重組DNA的存在外，當重組DNA能夠指導蛋白的表達時，能夠用公知的免疫學方法確認成功轉(zhuǎn)化。例如，用表達載體成功轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生呈現(xiàn)適當抗原性的蛋白。收集疑似被轉(zhuǎn)化的細胞樣本并使用適當抗體測定蛋白。因此，除了轉(zhuǎn)化的宿主細胞本身，本發(fā)明還涉及那些細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(克隆均質(zhì)的)培養(yǎng)物，或衍生自單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。應(yīng)理解本發(fā)明的某些宿主細胞可用于制備本發(fā)明的肽，例如細菌、酵母與昆蟲細胞。然而，其它宿主細胞在某些治療方法中可能有用。使得這些肽可以被負載于適當?shù)腗HC分子中。本發(fā)明的其它方面提供生產(chǎn)用于靜脈注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)、皮內(nèi)注射(i.d.)、腹膜內(nèi)注射(i.p.)、肌內(nèi)注射(i.m.)的肽的方法。肽注射的^f尤選方式為s.c.、i.d.、i.p.、i.m.與i.v.。DNA注射的j尤選方式為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.與i.v.。可以給予1至500mg之間劑量的肽或DNA。本發(fā)明的其它方面提供殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽，該方法包含給予患者有效量的本發(fā)明的肽、或有效量的多肽或編碼所述肽的表達載體，其中所述肽的量或所述多肽或表達載體的量有效激發(fā)所述患者體內(nèi)抗靶細胞的免疫應(yīng)答。所述耙細胞通常為腫瘤或癌細胞，特別是白血病或淋巴瘤細胞。所述肽或編碼肽的核酸組成腫瘤或癌癥疫苗。該疫苗可被直接給予患者，進入受影響的器官或全身性給予，或離體給予得自患者的細胞或人細胞系，所述細胞或細胞系隨后再給予患者，或者在體外用于從得自患者的免疫細胞中篩選出亞群，該亞群然后再被給予患者。如果將核酸在體外給予細胞，則該細胞可被用于共轉(zhuǎn)染以便于共表達免疫刺激細胞因子，例如白細胞介素2。所述肽可以是基本上純的，或與例如Detox的免疫刺激佐劑混合，或與免疫刺激細胞因子組合使用，或與例如脂質(zhì)體的適合遞送系統(tǒng)一同給予。肽可以與適當?shù)妮d體如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露聚糖結(jié)合(參見WO95/18145與Longeneckeretal(1993)Ann.NYAcad.Sci.690,276-291》肽還可以被標記，或為融合蛋白或雜種分子。預期具有本發(fā)明序列的肽刺激008+CTL。然而，在有CD4+T細胞提供協(xié)助時刺激更有效。因此，融合伙伴或雜種分子的一部分適當?shù)靥峁┐碳D4+T細胞的表位。CD4+刺激表位為本領(lǐng)域公知并包括在破傷風類毒素中所確定的那些。所述多核苷酸可以是基本上純的，或包含在適當?shù)妮d體或遞送系統(tǒng)中。適當?shù)妮d體和遞送系統(tǒng)包括病毒的，例如基于腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰滲病毒、腺相關(guān)病毒或含有多種病毒的成分的雜種病毒。非病毒遞送系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)與陽離子聚合物，其為DNA遞送領(lǐng)域公知。還可以使用物理性傳遞，例如"基因4倉"。所述肽或由所述核酸編碼的肽可以是融合蛋白，例如與刺激CD8+T細胞的表位形成融合蛋白。用于癌癥疫苗的肽可以是任何適當?shù)碾?。具體地，其可以是適當?shù)?個氨基酸的肽或適當?shù)?個或8個或10個或11個或12個氨基酸的肽。較長的肽也可能是適合的，但附表1中所描述的9個或10個氨基酸的肽是優(yōu)選的。適當?shù)?，任何給予患者的核酸均是無菌的和無熱原的?？寐兜腄NA可以被肌內(nèi)或皮內(nèi)或皮下給予。所述肽可以被肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈或皮下給予(還參見關(guān)于生產(chǎn)肽的方法)。優(yōu)選地，作為活性藥物組分的肽與佐劑一同給予，該佐劑例如IL-2、IL-12、GM-CSF、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑或脂質(zhì)體制劑。例如可在BrinkmanJA，F(xiàn)auschSC，WeberJS，KastWM.Peptide-basedvaccinesforcancerimmunotherapy(用于癌癥免疫治療的基于肽的疫苗).ExpertOpinBiolTher.2004Feb;4(2):181-98中找到最優(yōu)選的佐劑。疫苗接種導致由專職性抗原提呈細胞刺激的CTL應(yīng)答；一旦CTL被激活(primed)，增強胂瘤細胞中的MHC表達可能是有利的。將疫苗靶向特殊的細胞群也可能是有用的，例如抗原提呈細胞，通過注射位置、使用靶向載體和遞送系統(tǒng)、或選擇性純化來自患者的這類細胞群然后離體給予所述肽或核酸(例如可以如Zhou等人(1995)Blood86,3295-3301與Roth等人(1996)Scand.J.Immunology43,646-651中所述分選樹突狀細胞)。例如，靶向載體可以含有指導抗原在適當位置表達的組織特異或肺瘤特異的啟動子。因此，本發(fā)明的其它方面提供有效抵抗癌癥、或癌細胞或肺瘤細胞的疫苗，該疫苗含有有效量的本發(fā)明的肽，或者含有有效量的編碼該肽的核酸。還優(yōu)選的是該疫苗是核酸疫苗。已知用編碼多肽的核酸疫苗如DNA疫苗接種導致T細胞應(yīng)答。最優(yōu)選的疫苗是包含一種(合成的)肽或多種肽(即，單獨的或與1、2、3、4、5、6或甚至更多種肽組合，參見下文)。方便地，核酸疫苗可以含有任何適當?shù)暮怂徇f送手段。所述核酸，優(yōu)選DNA,可以是棵露的(即基本上不含其它欲給藥的成份)或者其可以通過脂質(zhì)體或作為病毒載體遞送系統(tǒng)的一部份被遞送。相信樹突狀細胞吸收核酸并表達所編碼的多肽可能是激發(fā)免疫應(yīng)答的機制；然而，樹突狀細胞可以不經(jīng)轉(zhuǎn)染而仍然起重要作用，因為它們可以從組織中轉(zhuǎn)染的細胞獲得表達的肽。向肌肉內(nèi)給予疫苗如DNA疫苗是優(yōu)選的。向皮膚內(nèi)給予疫苗也是優(yōu)選的。核酸疫苗可以不加佐劑給予。核酸疫苗還可以與佐劑如BCG或明礬一起給予。其它適合的佐劑包括衍生自皂苷的Aquila'sQS21stimulon(AquilaBiotech,Worcester,MA,USA)、分枝桿菌提取物與合成的細菌細胞壁模擬物衍生，以及專有的佐劑如Ribi'sDetox。也可以使用另一種由皂苷衍生的佐劑，QuilA(Superfos，Denmark)。核酸疫苗不加佐劑給予是優(yōu)選的。也可使用其它佐劑如弗氏佐劑。給予連接有鑰孔蟲戚血藍蛋白的肽也可能是有用的，優(yōu)選與佐劑一同給予。多核苷酸介導的癌癥免疫療法描述于Conry等人(1996)SeminarsinOncology23,135-147;Condon等人(1996)NatureMedicine2,1122-1127;Gong等人(1997)NatureMedicine3,558-561;Zhai等人(1996)J.Immunol.156,700-710;Graham等人(1996)IntJ.Cancer65,664-670;以及Burchell等人(1996)pp309-313In:BreastCancer,Advancesinbiologyandtherapeutics(乳&泉癌，生物學和治療學的進展)，Calvo等人(eds)，JohnLibbeyEurotext，通過參考的方式將上述所有并入本文。本發(fā)明的其它方面提供本發(fā)明的肽、或編碼該肽的多核苷酸或表達載體在制備用于殺滅患者體內(nèi)靶細胞的藥物中的用途，該靶細胞表達包含本發(fā)明氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的其它方面提供體外產(chǎn)生活化的細胞毒性T細胞(CTL)的方法，該方法包括在體外將CTL與在適當抗原提呈細胞表面表達且負載有抗原的人類MHCI類分子接觸一段足夠的時間，使得以抗原特異性方式活化所述CTL，其中該抗原為本發(fā)明的肽。適當?shù)?，所述CTL是CD8+輔助細胞。MHCI類分子可表達在任何適當細胞的表面上，且優(yōu)選的是，如果該細胞在自然狀況下不表達MHCI類分子(在此情況下該細胞被轉(zhuǎn)染以表達這類分子)，或者該細胞的抗原處理或抗原提呈途徑有缺陷。以這種方式，在活化CTL前用所選的肽抗原基本上完全地激發(fā)表達MHCI類分子的細胞是可能的。抗原提呈細胞(或刺激細胞)通常在其表面具有MHCI類分子，且其本身基本上不能將所選的抗原負載到所述MHCI類分子上。如下文中更加詳細描述的，在體外該MHCI類分子可容易地凈皮負載所選4奪的抗原。優(yōu)選地，哺乳動物細胞缺乏或有降低水平或降低功能的TAP肽轉(zhuǎn)運蛋白。缺乏TAP肽轉(zhuǎn)運蛋白的細胞包括T2、RMA-S與果蠅細胞。TAP是"抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白"。人肽負載缺陷細胞系T2可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,USA以目錄編號CRL1992取得，以參考的方式并入本文。便利地，在轉(zhuǎn)染前所述宿主細胞基本上不表達MHCI類分子。還優(yōu)選的是刺激細胞表達對于T細胞共刺激重要的分子，例如任意的B7.1、B7.2、ICAM-1與LFA3。許多MHCI類分子以及共刺激分子的核酸序列可由GenBank與EMBL數(shù)據(jù)庫公開取得。在其它實施方案中，也可以使用HLA分子的組合，例如本文的表A與表B中所述的MHCII類分子。Thomson等人(1996)J.Immunol.157,822-826與WO96/03144中描述了使用重組多表位疫苗遞送多個CD8+CTL表位，通過參考的方式將兩者均并入本文。關(guān)于本發(fā)明，在單一疫苗中包括肽(或編碼肽的核酸)是期望的，其中所述肽以任何順序包括本發(fā)明的氨基酸序列以及另一CD8+T細胞刺激表位。這種疫苗將會對治療癌癥特別有用。這種"串珠"疫苗是典型的DNA疫苗。同時激發(fā)依賴II類MHC的免疫應(yīng)答與依賴I類MHC的免疫應(yīng)答有導致CD4陽性T細胞的區(qū)域性THi樣T細胞反應(yīng)的優(yōu)勢，由此支持依賴I類MHC的CD8陽性T細胞。許多其它方法可以用來在體外產(chǎn)生CTL。例如，Peoples等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92,432-436與Kawakami等人(1992)J.Immunol.148,638643中所描述的方法使用自體腫瘤浸潤淋巴細胞產(chǎn)生CTL。Plebanski等人(1995)Eur.J.Immunol.25,1783-1787利用自體外周血淋巴細胞(PLB)制備CTL。Jochmus等人(1997)J.Gen.Virol.78,1689-1695描述通過使用經(jīng)肽或多肽致每丈的樹突狀細胞以產(chǎn)生自體CTL。Hill等人(1995)J.Exp.Med.181,2221-2228與Jerome等人(1993)J.Immunol.151,1654-1662描述了使用B細胞產(chǎn)生自體CTL。此外，使用肽或多肽致敏的或經(jīng)重組病毒感染的巨噬細胞，可用于制備自體CTL。S.Walter等人(WalterS,HerrgenL,SchoorO,JungG,WernetD,BuhringHJ,RammenseeHG,StevanovicS.Cuttingedge:predeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres(邊緣技術(shù)人CD8T細胞的預定親合性擴展到MHC/抗CD28包凈皮的孩t球上)。JImmunol.2003Nov15;171(10):4974-8)描述了在體外使用人工抗原提呈細胞激活T細胞，此方法也適于產(chǎn)生抗所選肽的T細胞。同種異基因的細胞也可用于制備CTL，且W097/26328中詳細描述了此方法，通過參考的方式并入本文。例如，除了果蠅細胞與T2細胞外，其它細胞也可^皮用于提呈抗原，例如CHO細胞、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘病毒感染的靶細胞。此外植物病毒也可被使用(例如參見Porta等人(1994)Virology202,449-955，其描述了開發(fā)虹豆花葉病毒作為提呈外源肽的高產(chǎn)量系統(tǒng))。抗本發(fā)明肽的活化CTL被用于治療。因此，本發(fā)明的其它方面提供由本發(fā)明前述方法獲得的活化CTL。本發(fā)明的其它方面提供活化的CTL，該CTL選擇性識別表達包含本發(fā)明氨基酸序列的多肽的細胞。優(yōu)選地，CTL通過與HLA/肽復合物相互作用(例如結(jié)合)識別所述細胞。所述CTL可用于殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達包含本發(fā)明的氨基酸序列的多肽，其中該患者被給予有效量的活化的CTL。給予患者的CTL可從患者取得并以如上所述活化(即，它們是自體CTL)?；蛘撸珻TL不來自患者但來自另一個體。當然，優(yōu)選所述個體是健康個體。本發(fā)明人所指的"健康個體"是指該個體總體健康狀況良好，優(yōu)選具有有活力的免疫系統(tǒng)，更優(yōu)選地，不患有任何能夠容易地測定或4企測到的疾病?；罨腃TL表達T細胞受體(TCR),該T細胞受體涉及識別表達所述多肽的細胞。乂人活化的CTL克隆編碼該TCR的cDNA并且轉(zhuǎn)移至其它CTL中表達是有用的。在體內(nèi)，本發(fā)明的CD8+CTL的靶細胞可以是腫瘤、白血病或淋巴瘤的細胞(其表達I類MHC)和/或環(huán)繞腫瘤(腫瘤細胞)的基質(zhì)細胞(其有時也表達I類MHC)。特異于本發(fā)明肽的本發(fā)明CTL克隆的TCR已經(jīng)被克隆。使用(i)TCR可變區(qū)特異的單克隆抗體，以及(ii)使用對Va和Vp基因家族特異的引物的RT-PCR確定TCR在所述CTL克隆中的使用。從由CTL克隆提取的多腺苷mRNA制備cDNA文庫。使用對TCRa和P鏈的C末端部分特異的以及對確定的Va和P片斷的N末端部分特異的引物。使用高保真DNA聚合酶擴增TCRa和b鏈的完整cDNA,且擴增產(chǎn)物被克隆至適當?shù)目寺≥d體。通過Chung等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12654-12658所述的方法可以將克隆的a和P鏈基因裝配成單鏈TCR。在這個單鏈構(gòu)建體中，VaJ片段之后是VDJ片段，其后是Cp片段，再其后是CD3鏈的跨膜與胞質(zhì)片斷。此單鏈TCR隨后被插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體中(依據(jù)其感染成熟的人€08+T細胞以及介導基因表達的能力，可以使用一系列的載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)Kat是一種優(yōu)選的可能(參見Finer等人(1994)Blood83，43)。高滴度的雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒被用于感染分離自腫瘤患者外周血的純化的CD8+或CD4+T細胞(根據(jù)出版在Roberts等人(1994)Blood84，2878-2889中的實-驗方案，以參考的方式并入本文)?？笴D3抗體被用于激發(fā)純化的CD8+T細胞的增殖，其還促進逆轉(zhuǎn)錄病毒整合以及單《連TCRs的穩(wěn)定表達。通過用特異于單鏈TCR的抗體染色被感染的CD8+T細胞來測定逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的效率。轉(zhuǎn)導的CD8+T細胞的體外分析發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)與使用異種限制的(allo-restricted)CTL克隆所觀察到的相同的腫瘤特異殺滅作用，所述TCR鏈最初克隆自這些CTL。具有預期特異性的轉(zhuǎn)導的CD8+T細胞可以用于腫瘤患者的過繼免疫治療?？梢杂?08至1()H個自體的、轉(zhuǎn)導的CTL治療患者。用于將基因引入CTL的其它適當系統(tǒng)描述于Moritz等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,4318-4322,以參考的方式并入本文。Eshhar等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,720-724與Hwu等人(1993)J.Exp.Med.178,361-366也描述了CTL的轉(zhuǎn)染。因此，本發(fā)明的其它方面提供TCR，其識別表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽的細胞，該TCR可由活化的CTL取得。除了TCR外，與TCR在功能上等價的分子也包括在本發(fā)明中。這包括與TCR在功能上等價的、能夠執(zhí)行與TCR相同功能的任何分子。具體地，這些分子包括經(jīng)基因工程制成的三結(jié)構(gòu)域單鏈TCR，通過Chung等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12654-12658所描述的方法制備，以參考的方式并入本文且參見上文。本發(fā)明還包含編碼TCR或功能等價分子的多核苷酸，以及編碼TCR或其功能等價分子的表達載體。適于表達本發(fā)明TCR的表達載體包括上文中有關(guān)于本發(fā)明肽的表達所描述的那些。然而，優(yōu)選地，所述表達載體是能夠在轉(zhuǎn)染后在CTL中表達TCR的那些。本發(fā)明的其它方面提供殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽，該方法包含以下步驟(l)從患者取得CTL;(2)向所述細胞中引入編碼TCR或其功能等價分子的多核苷酸，如前文所定義；(3)將步驟(2)中產(chǎn)生的細胞引入患者體內(nèi)。本發(fā)明的其它方面提供殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有在本發(fā)明的第一或第二或第三方面中定義的本發(fā)明氨基酸序列的多肽，該方法包含以下步驟(l)由所述患者取得抗原提呈細胞，如樹突狀細胞；(2)離體地，將所述抗原提呈細胞與在本發(fā)明的第一或第二或第三方面中定義的肽、或編碼所述肽的多核苷酸接觸；以及(3)將這樣處理后的抗原提呈細胞引入患者體內(nèi)。優(yōu)選地，抗原提呈細胞是樹突狀細胞。適當?shù)兀瑯渫粻罴毎窃?jīng)抗原性肽致敏的自體樹突狀細胞。該抗原性肽可以是引起適當T細胞應(yīng)答的任何適當?shù)目乖噪摹Ｊ褂媒?jīng)肺瘤相關(guān)肽致敏的自體樹突狀細胞的T細胞療法公開在Murphy等人(1996)TheProstate29,371-380與Tjua等人(1997)TheProstate32，272-278。在其它實施方案中，抗原提呈細胞，如樹突狀細胞，與編碼本發(fā)明肽的多核苷酸接觸。該多核苷酸可以是任何適當?shù)亩嗪塑账?，且?yōu)選其能夠轉(zhuǎn)導樹突狀細胞，因此導致肽的提呈和誘導免疫。便利的，所述多核苷酸可以被包括在病毒多核苷酸或病毒中。例如，顯示腺病毒轉(zhuǎn)導的樹突狀細胞誘導涉及MUC1的抗原特異性抗腫瘤免疫(參見Gong等人(1997)GeneTher.4,1023-1028)。類似地，可以使用基于腺病毒的系統(tǒng)(例如參見Wan等人(1997)Hum.GeneTher.8,1355-1363);可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(Specht等人(1997)J.Exp.Med.186,1213-1221與Szabolcs等人(1997);還可以使用血液顆粒介導的向樹突狀細胞的轉(zhuǎn)移(Tuting等人(1997)Eur.J.Immunol.27,2702-2707);RNA也可被使用(Ashley等人(1997)J.Exp.Med.186,11771182)。應(yīng)當理解，關(guān)于殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，特別優(yōu)選的是靶細胞是癌細胞，更優(yōu)選白血病或淋巴瘤細胞。特別優(yōu)選的是，使用本發(fā)明方法治療的患者具有HLA-A2類型。因此，在優(yōu)選實施方案中，該患者的HLA單倍型在治療前就被確認。HLA單倍型的確定可以使用任何合適的方法進行，這些方法為本領(lǐng)域公知。本發(fā)明特別包含使用本發(fā)明的肽(或編碼它們的多核苷酸)用于活化體內(nèi)免疫接種；用于體外操作自體樹突狀細胞隨后將該操作的樹突狀細胞引入體內(nèi)以活化CTL應(yīng)答；用于體外活化自體CTL隨后進行過繼治療(即，該操作的自體CTL被引入患者體內(nèi))；用于體外活化來自健康供者(MHC相配的或不相配的)的CTL隨后進行過繼治療。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的疫苗被單獨地或與另一癌癥治療方法組合給予宿主以防止或抑制肺瘤形成。肽疫苗可以不加佐劑給予。肽疫苗也可以與佐劑如BCG或明礬一起給予。其它適當?shù)淖魟┌ㄑ苌栽碥盏腁quila'sQS21stimulon(AquilaBiotech,Worcester,MA，USA)、分枝桿菌提取物與合成的細菌細胞壁模擬物、以及專有的佐劑如Ribi'sDetox。也可使用另一種皂苷衍生的佐劑QuilA(Superfos,Denmark)。也可使用其它的佐劑，例如CpG寡核苷酸、穩(wěn)定的RNA、咪p奎莫特(可以商標名AldaraTM購自3MPharma,U.S.A.)、不完全弗氏佐劑(可以商品名MontanideISA-51購自SeppicS.A.,Paris,France)、脂質(zhì)體制劑或GM-CSF。給予連接有鑰孔蟲戚血藍蛋白的肽也可以是有用的，優(yōu)選與佐劑一同給予。本發(fā)明的肽還可以被用作診斷試劑。使用該肽能夠分析在CTL群中是否存在特異抗某種肽的或被治療誘導的CTL。此外，能夠使用具有抗所定義肽的反應(yīng)性的那些肽測定前體T細胞的增加。此外，所述肽可以作為標志物以監(jiān)測表達衍生自該肽的所述抗原的腫瘤疾病的進展。在所附表l中，列出了使用的或確認的肽。此外，在該表中給出了所述肽在相應(yīng)蛋白中的相應(yīng)位置。小鼠OFA/iLR在美國國家衛(wèi)生院(NationalInstituteofHealth)的生物技術(shù)信息國家中心("NationalCentreforBiotechnologyInformation")的Genbank中的登錄號為AAD26866(參見http:www.ncbi.nlm.nih.gov)。人OFA/iLR在美國國家衛(wèi)生院的生物技術(shù)信息國家中心(參見http:www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genbank中的登錄號為，例如，AAC50652或AAP35883。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的肽被用于染色白細胞，特別是T細胞。這種用途特別有優(yōu)點如果其可以證實在CTL群中是否存在抗某種肽的特異CTL。此外，所述肽能夠作為標志物用于確定腫瘤性疾病或障礙中治療的進展。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，肽被用于制備抗體。可以通過注射肽免疫動物以及隨后純化免疫球蛋白以標準方式獲得多克隆抗體。單克隆抗體能夠以標準實驗方案制備，例如在MethodsEnzymol.(1986),121,Hybridomatechnologyandmonoclonalantibodies(雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體)中所描述的。本發(fā)明的其它方面涉及與藥物組合物，其含有一種或多種本發(fā)明的肽。該組合物用于腸胃外給藥，如皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或口服給藥。為此，所述肽被溶于或懸浮于藥物可接受的、優(yōu)選水性載體中。此外，所述組合物可含有賦形劑如緩沖劑、黏合劑、破裂劑、稀釋劑、調(diào)味劑、潤滑劑等等。也可以將肽與免疫刺激物質(zhì)如細胞因子一同給予?？捎糜谶@些組合物的賦形劑的完全名單例如可由A.Kibbe，HandbookofPharmaceuticalExcipients(藥物賦形劑手冊)，3.Ed.，2000,AmericanPharmaceuticalAssociationandpharmaceutical中得到。藥物制劑包含至少一種包含4壬意的SEQIDNo.l至SEQIDNo.2的本發(fā)明的肽，該藥物制劑被給予患有與各自的肽或抗原相關(guān)的腫瘤性疾病的患者。特別要治療的疾病是表達OFA/iLRP的惡性疾病，如白血病(例如AML或CLL)或骨髓瘤(例如MM)。由此，CTL特異的免疫反應(yīng)免疫應(yīng)答可一皮激發(fā)。本發(fā)明的另一方面，兩種或多種本發(fā)明的肽的組合可用作疫苗，直接混合或用在同一治療方案中。此外，可以使用與其它肽如II類MHC特異性肽的組合。技術(shù)人員能夠通過測試選擇優(yōu)選的致免疫肽的組合，該測試例如體外產(chǎn)生T細胞并測試其功效與整體存在，某些T細胞對某些肽的增殖、親和力和擴展，以及T細胞的功能性，例如通過分析IFN々(參見下文的實例)、IL-12或穿孔素的產(chǎn)生。通常，混合最有效的肽作為疫苗用于上述的目的。適合的疫苗將包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種不同的肽，優(yōu)選4、5、6或7種不同的肽，最優(yōu)選6種不同的肽。最后，疫苗能夠取決于將接受治療的患者所患癌癥的特定類型以及疾病的狀態(tài)、之前的治療方案、患者的免疫狀態(tài)，以及，當然，該患者的HLA單倍型。鑒定腫瘤相關(guān)抗原的T輔助細胞表位在抗癌免疫療法中是重要的工作。為了鑒定源自O(shè)FA-iLR蛋白的T細胞結(jié)合表位，合成了由計算才幾程序PAProC(http:〃www.uni-tuebingen.de/imi/kxi/預測的14個肽(參見下文)和SYFPEITHY(http:〃www.syfpeithi.de)與HLA-A*0201分子的結(jié)合。在使用TAP(抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白)缺陷的T2細胞系的體外重建測定中，若與流感病毒核蛋白58—66相比，只有兩種肽(iLRl,iLR2)對HLA-A^201(圖11A和IIB)顯示較強親合力。在經(jīng)iLRl或iLR2肽致敏的完全成熟DC的存在下，能夠由健康的HLA-A+0201+供者產(chǎn)生CTL細胞系。肽滴定曲線顯示iLRl與iLR2特異的CTL對于肽/MHC復合物(圖5和圖10)有高親合力。對iLRl(圖l)或iLR2(圖6)特異的CTL細胞系均引發(fā)抗HLA-A承0201+血液腫瘤細胞系、原發(fā)性惡性AML原始細胞(分別參見圖4A、4B與8A、8B)和CLL細胞(分別參見圖3A、3B與9A、9B)的強的細胞溶解活性，但對HLA-A2陰性的耙與正常造血細胞(AzW.)則無殺傷力。抗體封閉實驗(圖2與圖7)顯示由對肽特異的CD8+T細胞誘導的I類MHC限制性殺滅。為確定HLA-A*0201+AML、CLL與多發(fā)性骨髓瘤中iLRl和iLR2特異T細胞的頻率，進行ELISPOTIFN-7分泌測定(表3至表5)。在患有血液腫瘤的HLA-A^^l+患者中，分別在25/50(50%)和20/50(40%)人中可檢測到顯著水平的iLRl或iLR2肽特異的T細胞，然而在正常個體的外周血樣本中并無自發(fā)性的抗iLRl或iLR2的T細胞應(yīng)答發(fā)生(表2)。在一個CLL患者與另一個AML患者中，可以產(chǎn)生對iLRl和iLR2肽表位特異的自體CTL細胞系，引發(fā)針對自體和同種異基因的HLA-A2匹配的靶細胞的有效細胞毒活性。本發(fā)明人以前曾顯示在患有OFA/iLR+腫瘤的小鼠(RohrerJW,RohrerSD，BarsoumA,CogginJHJr.Differentialrecognitionofmurinetumor-associatedoncofoetaltransplantationantigenandindividuallyspecifictumortransplantationantigensbysyngeneicclonedBalb/candRFMmouseTcells(同基因克隆的Balb/c和RFM小鼠T細胞對鼠肺瘤相關(guān)癌胚胎移植抗原和個體特異的腫瘤移植抗原的差異識別).JImmunol.1994;152:745-764)和晚期乳腺癌患者中(RohrerJW,BarsoumAL，DyessDLetal.Humanbreastcarcinomapatientsdevelopclonableoncofoetalantigen-specificeffectorandregulatoryTlymphocytes(人乳腺癌患者發(fā)展可克隆的癌胚胎抗原特異的效應(yīng)性和調(diào)節(jié)性T纟田胞).JImmunol.1999;162:6880-6892.11.RohrerJW，CogginJHJr.CD8TcellclonesinhibitantitumorTcellfunctionbysecretingIL-10(CD8T細胞克隆通過分泌IL-10抑制抗腫瘤T細胞功能).J.Immunol.1995;155:5719.)均能夠發(fā)現(xiàn)分泌白細胞介素10的OFA/iLR特異的調(diào)節(jié)性CD8+T細胞克隆。Su等人(SuZetal.ImmunologicalandClinicalresponsesinmetastaticrenalcancerpatientsvaccinatedwithtumorRNA-transfecteddendriticcells(用經(jīng)月中瘤RNA壽爭導的樹突狀細胞疫苗接種的轉(zhuǎn)移性腎癌患者的免疫學和臨床反應(yīng)).CancerRes.2003;63:2127-2133)報道了抗來自轉(zhuǎn)移性腎癌患者的OFA/iLR的I類MHC限制性表位的T細胞。在這項研究中，該作者還報道了接受自體樹突狀細胞治療性疫苗接種的患者中出乎意料的低死亡率，這些樹突狀細胞經(jīng)編碼OFA/iLR和其它推定腫瘤抗原的RNA轉(zhuǎn)染。然而，Su等人并未公開來自O(shè)FA/iLR的表位的數(shù)目、HLA限制性與化學特征。H。ltl等人(H6ltlLetal.Immunotherapyofmetastaticrenalcellcarcinomawithtumorlysate-pulsedautologousdendriticcells(肺瘤溶胞產(chǎn)物致敏的自體樹突狀細胞對轉(zhuǎn)移性腎細胞癌的免疫治療).Clin.CancerRes.2002;8:3369-3376)揭示了更多的i正據(jù)顯示OFA/iLR對于基于治療性疫苗刺激特異細胞免疫應(yīng)答的癌癥免疫治療可能是非常有用的。該作者發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性腎細胞癌(RCC)患者中，在6個接受負載有自體或同種異基因的腫瘤細胞溶胞產(chǎn)物的自體樹突狀細胞疫苗接種的患者中有5人對OFA/iLR有增強的免疫應(yīng)答。此外，Hmtl等人沒有公開來自O(shè)FA/iLR的表位。有趣的是，有最強的抗OFA/iLR免疫應(yīng)答的患者有完全和部份的臨床反應(yīng)。在本發(fā)明人的小規(guī)模早期CLL患者(BinetA)中沒有檢測到相關(guān)的特異于iLRl或iLR2肽的分泌IL-10的T細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。本發(fā)明人正參與實—險以更精確地揭示在分泌或IL-10的特異抗OFA/iLR的T細胞與CLL或多發(fā)性骨髓瘤患者的疾病時期之間的可能關(guān)系。簡而言之，本發(fā)明人最先鑒定了衍生自O(shè)FA/iLR蛋白的兩個不同的HLA-A*0201特異的肽表位。這些肽可作為在表達OFA/iLR的惡性疾病進行腫瘤免疫學研究與疫苗接種策略的有用工具。本發(fā)明的其它方面涉及殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有本文給出的氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明的肽、或本發(fā)明的核酸、或本發(fā)明的表達載體，其中所述肽的量、所述核酸的量或所述表達載體的量在所述患者中有效激發(fā)抗靶細胞的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的其它方面涉及殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽，該方法包含給予患者有效量的本發(fā)明定義的細胞毒性T細胞(CTL)。本發(fā)明的其它方面涉及殺滅患者體內(nèi)靶細胞的方法，該靶細胞表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽，該方法包含以下步驟(l)從患者取得細胞毒性T細胞(CTL);(2)向所述細胞引入如本發(fā)明所定義的編碼T細胞受體(TCR)或功能等價分子的核酸；(3)將步驟(2)中產(chǎn)生的細胞引入患者體內(nèi)。優(yōu)選地，所述靶細胞是癌癥細胞。更優(yōu)選地，所述癌癥是表達含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽的白血病或淋巴瘤。應(yīng)當理解本文所公開和描述的本發(fā)明的特征不僅能夠用在所指明的相關(guān)組合中，也能夠不悖離本發(fā)明所指范圍以單獨方式使用。將通過參考以下附圖、序列表與實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。下文的實施例僅供說明目的而非限制本發(fā)明。SEQIDNo1至SEQIDNo2顯示T細胞表位的肽序列，該肽序列含有由I類MHC提呈的本發(fā)明的肽。SEQIDNo6至SEQIDNo17顯示實施例中使用的肽序列。圖1顯示ILRl特異的CTL識別多種細胞系。圖2顯示識別CD8、I類MHC或ILRl的TCR的抗體阻止耙細"包溶解。圖3顯示HLA-A*02/ILR1特異CTL殺滅來自CLL患者的腫瘤細胞；(A)第一次實驗；(B)第二次實驗。圖4顯示HLA-A*02/ILR1特異CTL殺滅來自AML患者的腫瘤細胞；(A)第一次實驗；(B)第二次實驗。圖5A顯示ILRl特異CTL對肽致敏的T2耙細胞溶解的劑量依賴。圖5A顯示冷靶對ILRl特異CTL的抑制(冷靶抑制測定)。圖6顯示ILR2特異CTL識別多種細胞系。圖7顯示識別CD8、I類MHC或ILR2的TCR的抗體阻止把細月包溶解。圖8顯示HLA-A*02/ILR2特異CTL殺滅來自AML患者的腫瘤細胞；(A)第一次實驗；(B)第二次實驗。圖9顯示HLA-A*02/ILR2特異CTL殺滅來自CLL患者的腫瘤細胞；(A)第一次實驗；(B)第二次實驗。圖10A顯示ILR2特異CTL對肽致敏的T2耙細胞溶解的劑量依賴。圖1OB顯示冷靶對ILR2特異CTL的抑制(冷耙抑制測定)。圖ll顯示在使用TAP(抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白)缺陷的T2細月包系的重建分析中，與流感病毒核蛋白58—66比較，只有兩種肽(iLRl、iLR2)對HLA-A*0201顯示較強的結(jié)合親合力(圖11A與IIB)。與ILR3至ILR14以及來自流感病毒的參照肽(Fluml)比較，iLRl與iLR2肽顯示對HLA-A^2有良好的結(jié)合親合力。圖12顯示代表性的來自外周血的對A2/RPS-001與A2/RPS-002特異的CD8+淋巴細胞的微球驅(qū)動擴增的四聚體分析。如前所述(Walter,S,等人CuttingEdge:PredeterminedavidityofhumanCD8TcellsexpandedoncalibratedMHC/anti-CD28-coatedmicrospheres(前沿人CD8T細胞的預定親合性擴增到校準的MHC/抗CD28包被的孩t球上).J.Immunol.171(10):4974-8,2003)略加》務(wù)改，在孔中用微球每周一次刺激取自健康HLA-A2+供者HBC-065的每孔lx106個富集CD8+的PBMCs，該微球與抗CD28以及高密度肺瘤抗原A*0201/RPS-001(上圖)或高密度腫瘤抗原A*0201/RPS-002(下圖)偶聯(lián)。體外刺激3次后，兩種孔中的細胞均以抗體CD8FITC加上四聚體A2/RPS-001與A2/RPS-002PE染色。細胞被限制在淋巴細胞群中(左圖及中間圖)或限制在CD8+淋巴細胞群中(右圖)。數(shù)字代表CD8+淋巴細胞中的四聚體百分比。RPS-001=LLAARAIVAI(SEQID-No,1);RPS-002=[ne2]ALCNTDSPL(SEQID-No.2)。實施例本申請中使用的縮寫Ab:抗體Ag:抗原APC:抗原提呈細胞CD:分化抗原cpm:每分鐘計數(shù)DC:樹突狀細胞EBV:愛-巴病毒(人類皰滲病毒第四型)ESI:電噴射離子化HLA:人類白細胞抗原HPLC:高效液相色"i普IFN:擾素Ii:恒定鏈(CD74)IL:白細胞介素MALDI:基質(zhì)輔助激光解吸電離MHC:主要組織相容性復合體MS:質(zhì)譜分析OD45Q:波長為450納米處的光密度PBMC:外周血單核細胞PCR:聚合酶鏈式反應(yīng)PHA:植物血凝素SDS畫PAGE:十二烷基石克酸鈉畫聚丙烯酰胺凝膠電泳S丄刺激指數(shù)TOF:飛4亍時間細胞系、腫瘤樣本與外周血單核細胞(PBMC)本研究使用的所有細胞系均得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA,USA)。PBMC、CD34+祖細胞、骨髓細胞與肺瘤樣本分別收集自健康供者、急性粒細胞白血病(AML)患者、慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者以及多發(fā)性骨髓瘤患者，而且在告知同意和通過協(xié)會審查之后?？贵w抗MAM-6的抗體AlexisCorp.,Switzerland,通過AXXORADEUTSCHLANDGmbH,Gallusstrasse10,D-35305Grtnberg取得。Product-Nr.SIG-614?？笻LA-A*02抗體克隆BB7.2來自BDPharmingen,Cat,Nr.551230?？笴D8抗體克隆SFCI21Thy2D3(T8)來自BeckmanCoulter,Part.-Nr.6602139?？筎CR抗體克隆BMA031來自BeckmanCoulter,Part-Nr.IMl楊?？笴D4抗體克隆SFCI12T4D11(T4)來自BeckmanCoulter,Part.-Nr.6602138?？笻MFG-1抗體克隆1.10.F3來自BeckmanCoulter,Part.-Nr.IM0271。肽肽FluMl58—66(GILGFVFTL)、fflV-Pol476—484(ILKEPVHGV,ELISPOT測定的陰性對照)msurv33(LYLKNYRIA，對H2d特異的鼠survivin肽表位，T2結(jié)合測定的陰性對照)、iLRl59-6S(LLAARAIVAI)、iLR2146—154(ALCNTDSPL)、iLR360.68(LAARAIVAI)、iLR458.66(LLLAARAIV)、iLR57.15(VLQMKEEDV)、iLR650.58(NLKRTWEKL)、iLR766.74(VAIENPADV)、iLR8139.147(YVNLPTIAL)、iLR9177—185(MLAREVLRM)、iLR10249-257(SEGVQVPSV)、iLRll18—26(FLAAGTHLG)、iLR1257—66(KLLLAARAIV)、iLR1367.76(AIENPADVSV)、iLR14173.182(LMWWMLAREV)均購自Biosynthan(Berlin,Germany),純度高于90%且經(jīng)過高效液相色譜與質(zhì)譜分析。肽合成與分析在自動化肽合成儀EPS221(Abimed,Langenfeld，Germany)中依照Fmoc/tBu方法合成肽。在用TFA/酚/乙二硫醇/苯曱硫醚/水(90/3.75/1.25/2.5/2.5體積比)處理1至3小時從樹脂上移除后，(含精氨酸的肽)肽從甲基^又丁基醚沉淀，用甲基叔丁基醚洗滌一次，再以乙醚洗滌兩次，然后重新懸浮于水中再凍干。合成產(chǎn)物以HPLC(Varianstar,Zinsseranalytics,Mtinchen，Germany)與MALDI-TOF質(zhì)譜(future,GSG,Bruchsal，Germany)分析。純度低于80%的肽用制備型HPLC純化。T2結(jié)合測定T2全細胞結(jié)合測定采用Casati等人(CasatiC,DalerbaP,RivoltiniLetal.Theapoptosisinhibitorproteinsurvivininducestumor-specificCD8+andCD4+Tcellsincolorectalcancerpatients(細J包凋亡抑制蛋白survivin在直腸結(jié)腸癌患者中誘導胂瘤特異的CD8+和CD4+T纟田月包).CancerRes.2003;63,4507-4515)的實-險方案進行。人CTL的產(chǎn)生使用描述于別處(ZeisM,SiegelS,SchmitzM等人InductionofcytotoxicTlymphocytesagainsthematologicneoplasmsbysurvivinRNA-transfecteddendriticcells(通過survivinRNA轉(zhuǎn)染的樹突狀細月包i秀導抗血液瘤的細胞毒性T細胞).JImmunol.2003;170，5391-5397)的方法產(chǎn)生源自健康111^-八*0201+個體的CTL。為誘導得自AML與CLL患者的自體的OFA/iLR肽特異的CTL，使用免疫磁珠(MACS⑧，Miltenyi,Bergisch-Gladbach，Germany)從PBMC分離CD8+T細胞，并與經(jīng)自體OFA/iLR肽致敏的完全成熟DC—起培養(yǎng)，再在白細胞介素2(lng/ml，CellConcepts，Weisskirch,Germany)的存在下用經(jīng)自體OFA/iLR肽致壽丈的PBMC重復刺激。經(jīng)過至少4次每周1次的重復刺激后，用常規(guī)的4小時"鉻釋放測定確定CTL的反應(yīng)性。冷靶抑制測定與抗體封閉實驗按以前所述進行(ZeisM，SiegelS,SchmitzM等人InductionofcytotoxicTlymphocytesagainsthematologicneoplasmsbysurvivinRNA-transfecteddendriticcells(通過survivinRNA轉(zhuǎn)染的初十突狀細月包i秀導抗血液瘤的細胞毒性T細胞).JImmunol.2003;170,5391-5397)。ELISPOT測定為測定患者中對OFA/iLR肽特異的T細胞的頻率，使用干擾素-7-ELISPOT-試劑盒(Interferon-7-ELISPOT-Kit,BectonDickinson,Heidelberg,Germany)依照制造商的說明進行ELISPOT測定。表l:本發(fā)明中所鑒定的肽和腫瘤相關(guān)T輔助細胞肽表位。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>No.23.FluMl58—66GILGFVFTLSEQID-No.34.HIV-Pol476—484ILKEPVHGVSEQID-No.45.msurv33LYLKNYRIASEQID-No.56.iLR360.68LAARAIVAISEQID-No.67.iLR458—66LLLAARAIVSEQID-No.78.iLR57-15VLQMKEEDVSEQID-No.89.iLR650—58NLKRTWEKLSEQID-No.910.iLR766—74VAIENPADVSEQID-No.1011.iLR8139-147YVNLPTIALSEQID-No.1112.iLR9177—185MLAREVLRMSEQID-No.1213.iLR10249—257SEGVQVPSVSEQID-No.1314.iLRll,FLAAGTHLGSEQID-No.1415.iLR1257—66KLLLAARAIVSEQID-No.1516.iLR1367-76AIENPADVSVSEQID-No.16ELISPOT測定中的陰性對照對H2d特異的鼠survivin肽表位，T2結(jié)合測定的陰性對照17.iLR14173-182LMWWMLAREVSEQID-No.17結(jié)果肽ILRl(LLAARAIVAI，SEQIDNo.l)與ILR2(ALCNTDSPL，SEQIDNo.2)在所有的ELISPOT分析中，IFN-7陽性點的數(shù)目是每105個外周血單核細胞。分析前，在白細胞介素2(10units/ml)與肽(10mg/106PBMC/mL)的存在下，將從患者和健康供者取得的T細胞先培養(yǎng)7天。在IFN-7ELISPOT分析中，所有經(jīng)探測的健康供者樣本均有低數(shù)量的響應(yīng)ILRl或ILR2的CTL(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>005550064400766008770090001000Oil0001200013330144401555在所有測試的CLL患者腫瘤樣本中，12/20(60%)有顯著的(>20)抗ILR1肽的CTL應(yīng)答，9/16(56%)在IFN-7ELISPOT分析中有抗ILR2肽的應(yīng)答。這兩個ILR衍生肽的陽性染色的CTL的中間數(shù)與用來自流感病毒基質(zhì)蛋白的常見HLA-A*02-限制性回憶抗原得到的應(yīng)答數(shù)目的55%(ILR2)和76%(ILR1)相當，幾乎每個成年人之前都應(yīng)該有抗該流感病毒基質(zhì)蛋白的細胞免疫應(yīng)答(表3)。表3_指示CLL患者患者^皮測試HLA-A*02為陽性ELISPOT干擾素7(IFN-7)檢測肽氨基酸LLAARAIVAIALCNTDSPLGILGFVFTL序列肽命名ILR1ILR2FluMl<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在所有測試的AML患者腫瘤樣本中，6/15(40%)有顯著的(〉20)抗ILR1肽的CTL應(yīng)答，7/15(47%)在IFN-7ELISPOT分析中有抗ILR2肽的應(yīng)答(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在所有測試的骨髓瘤患者肺瘤樣本中，8/14(57%)有顯著的(>20)抗ILR1肽的CTL應(yīng)答，6/14(43%)在IFN-yELISPOT分析中有抗ILR2肽的應(yīng)答(表5)。表5指示骨髓瘤患者#皮測試HLA-A*02為陽性elispot干擾素y(IFN-7)檢測肽氨基酸LLAARAIVAIALCNTDSPLGILGFVFTL序列肽命名ILRlILR2FluMl蛋白來源未成熟層粘連蛋未成熟層粘連蛋流感病毒基質(zhì)白受體蛋白白受體蛋白蛋白Ml患者名稱陽性染色點的數(shù)目0013000240003560004761005563006430007223008233400902701003401134012232301311211201411總之，來自O(shè)FA-ILRP的肽ILR1與ILR2引發(fā)抗癌癥細胞的細胞免疫應(yīng)答的潛力變得明顯可見，該癌癥細胞特別是來自白血病與淋巴瘤的。對所述肽特異的T細胞顯示效應(yīng)性功能(分泌干擾素力。表6:來自外周血的、對A2/RPS-001和A2/RPS-002特異的CD8+淋巴細胞的微球驅(qū)動擴展的四聚體分析的總結(jié)。如圖12，用微球刺激每個孔中的106個富集CD8+的外周血單核細胞，該樣i球連接有抗CD28以及高密度的腫瘤抗原A*0201/RPS-001或高密度的腫瘤抗原A*0201/RPS-002。表明的是可評估的HLA-A2+供者的數(shù)目、有至少一個明顯陽性反應(yīng)的可評估的供者數(shù)目、所有可評估的供者中可評估刺激的數(shù)目以及有至少一個明顯陽性反應(yīng)的可評估刺激的數(shù)目。RPS-001=LLAARAIVAI(SEQID-No.1);RPS-002=ALCNTDSPL(SEQID-No.2)表6抗原參數(shù)數(shù)值A(chǔ)2/RPS-001可評估的供者A2/RPS-001有明顯陽性T細胞應(yīng)答的可評估的供者A2/RPS-001所有可評估的供者中可評估的刺激53A2/RPS-001有明顯陽性T細胞應(yīng)答的可評估的刺激29A2/RPS-002可評估的供者A2/RPS-002有明顯陽性T細胞應(yīng)答的可評估的供者1A2/RPS-002所有可評估的供者中可評估的刺激54A2/RPS-002有明顯陽性T細胞應(yīng)答的可評估的刺1激關(guān)于ILRl(LLAARAIVAI)的進一步實驗用K562(人類前成紅細胞白血病細胞系，又稱為慢性髓性白血病(CML)細胞系，該細胞系因為有非常低水平的HLA，所以作為排除NK細胞作為效應(yīng)細胞的對照)、IM9(人類B'淋巴母細胞細胞系lymphoblastoidcellline),Karpas-422(人B細胞'淋巴瘤)、Balm-3(人非BurkittB細胞淋巴瘤細胞系)、U266(人多發(fā)性骨髓瘤)、REH(人B細胞前體白血病)、MEC-l(人慢性B細胞白血病)測試識別ILRl肽的T細胞。相同的T細胞被用于測試作為對照的來自健康供者的自體和同種異基因的PBMC。所有細胞系除不表達HLA-A*02等位基因的MEC-l與通常HLAI類基因表達有缺陷的K562夕卜，均可被ILRl特異的T細胞所識別(參見圖1)。來自健康供者的自體與同種異基因細胞均未^^皮識別，表明1.ILRl僅在腫瘤細胞中在肽水平上明顯表達，ja不在來自HLA匹配的健康供者的血液單核細胞中表達。2.該應(yīng)答并非針對同種異基因的主要或次要組織相容性復合體抗原。3.ILRl肽以HLA限制的方式^皮識別。4.該限制是等位基因特異的(對AW2特異)耙AML用來自AML患者(4個患者；AML-Ol、-02、-03、-06)的肺瘤細胞測試特異于HLA-A*02限制的ILRl的T細胞(圖4A)。來自A*02陽性患者(3/4)的細胞被識別，其在E:T比40:1時有范圍為25.9%至39.8%的最大溶解。來自A*02陰性患者AML-06的AML細胞未^皮識別。第二次用來自AML患者的肺瘤細胞測試特異于HLA-A*02限制的ILRl的T細胞以確認第一次實驗的結(jié)果(9個患者；AML-Ol、-02、-04、-05、-06、-07、-09、-10、-12)。來自A*02陽性患者(5/9)的細胞在所有情況下均被識別。來自A*02陰性患者(4/9;AML-Ol、-06、-07、-12)的細胞未被識別(4/4)(圖4B)。圖4B還顯示來自HLA-A*02陽性供者的CD34陽性的骨髓書亍生的祖細胞(CD34-01、-02)的數(shù)據(jù)，該細胞不被活化的ILR1特異T細胞所識別，該T細胞在體外已經(jīng)在白細胞介素2的存在下使用ILR1再刺激了7天。同樣，來自A*02陽性供者的骨髓細胞(BM-Ol、-02)未一皮這些T細力包所識別。圖2顯示進一步表征T細胞應(yīng)答特異性的抗體封閉實驗。在進行E:T比穩(wěn)定在40:1的"Cr-釋放實驗前，將封閉mAbs與人類B淋巴球母細胞細胞系IM-9—起培養(yǎng)，mAb的濃度按制造商的指示。此封閉試-驗表明對ILR1的識別是通過1.帶有T細胞受體(TCR)的細胞。2.在I類MHC(I類HLA)的存在下識別耙。3.通過依賴共受體CD8而非CD4的相互作用的機制。對不相關(guān)的、粘蛋白樣細胞表面蛋白MAM-6(也稱為CA15-3，DF3)和HMFG-1特異的對照mAbs對效應(yīng)T細胞識別IM-9細胞并無影響。在這些封閉實驗中使用PBS作為陰性對照?？傊?，這兩組實驗確認1.ILR1在100%(8/8)接受測試的A*02陽性(8A3)AML患者中是腫瘤相關(guān)抗原；2.ILR1被HLA-A*02限制；3.ILR1特異T細^^口、別腫瘤細月包上經(jīng)天然加工的ILR1,同時ILR1肽似乎并不存在于骨髓與CD34陽性祖細胞中。4.把與效應(yīng)細胞間的相互作用可被抗I類MHC、TCR或CD8的mAbs特異地抑制。耙CIX用來自CLL患者(5個患者；CLL-Ol、-02、-03、-05、-06)的腫瘤細胞測試特異于HLA-A*02限制的ILR1的T細胞。來自A*02陽性患者(3/5)的細胞在所有情況下全被識別(3/3)。來自A*02陰性患者的細胞在任何情況下均不被識別(0/2)(圖3B)。用另外8名患者重復實驗(圖3A),其中8人中有4人是A*02陽性(4/8)。來自4/4A*02陽性患者的細胞全被識別，然而0/4A*02陰性靶細胞被識別，這些另外的實驗確認前述結(jié)果?？偨Y(jié)1.ILR1在100%(7/7)A*02陽性CLL患者中是腫瘤相關(guān)抗原；2.ILR1被HLA-A*02限制。乾T2T2細胞的TAP表達是有缺陷的，TAP是"抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白"，該蛋白負責從細胞質(zhì)接運短肽至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，其中肽被負載至空的MHCI類分子上。因此，如果沒有肽的加入(外部負載)，則T2細胞的MHCI類分子保持空著。因此，在細胞表面表達空的HLA-A*02分子的T2細胞是建立HLA-A*02限制性T細胞的肽特異殺滅的滴度曲線的最佳目標。在此實—險中(圖5A)，用T2細胞測試ILR1特異的T細胞，該T2細胞經(jīng)已被詳細描述的來自HIV的T細胞表位、或ILR1肽LLAARAIVAI致每文。結(jié)果T細胞只識別用ILR1肽致壽文的T2纟田月包。用HIV肽致敏的T2細胞則不被識別。用ILR1肽致敏的T2耙細胞以劑量依賴方式被溶解。在測試的濃度范圍內(nèi)溶解未達到飽和。耙T2+ILR1進行冷靶抑制測定。為了檢測ILR1特異的T細胞是否特異地溶解用ILR1肽致壽文的T2細胞且在HLA-A^2存在下，如下進行冷靶抑制測定以10mg肽/106個T2細胞/mL的濃度用肽負載51Cr標記的T2細胞。然后向104個經(jīng)肽致敏的"Cr標記的T2細胞中加入體積為50ptLAIMV的總數(shù)2xl()S個未標記的T2細胞，該T2細胞用相同的肽或?qū)φ针牡攘控撦d。加入對ILR1特異的效應(yīng)T細胞并如上所述進行51Cr釋》文測定。該分析顯示與ILR1特異CTL不相關(guān)的肽(Survivin與ILR2)和未負載的T2細胞均不與負載有ILR1肽的靶細月包竟爭^皮ILR1特異的CTL溶解，該未負載的T2細胞在其細胞表面展現(xiàn)空的HLA-A*02分子。相反，一旦被合成ILR1肽或天然展示ILR1的AML腫瘤細胞致敏的耙細胞在HLA-A*02存在下被用作第二(冷)靶，那么這些會與初級耙細胞(熱，ILR1肽致敏的T2)竟爭被ILR1特異的CTL溶解(圖5B)。關(guān)于ILR2(ALCNTDSPL)的進一步實驗用K562(人類前成紅細胞白血病細胞系，又稱為慢性髓性白血病(CML)細胞系，該細胞系因為有非常低水平的HLA,所以作為排除NK細胞作為效應(yīng)細胞的對照)、IM9(人類B淋巴母細胞細胞系),Karpas-422(人B細胞淋巴瘤)、Balm-3(人非BurkittB淋巴瘤細胞系)、U266(人多發(fā)性骨髓瘤)、REH(人B細胞前體白血病)、Ramos(也稱為RA1;人Burkitt淋巴瘤B淋巴母細胞)、MEC-1(人慢性B細胞白血病)測試識別ILR2肽的T細胞。同樣的T細胞被用于測試作為對照的來自健康供者的自體或同種異基因的外周血單核細胞。所有細胞系除不表達HLA-A*02等位基因的Ramos、MEC-1與HLAI類基因表達有缺陷的K562外，均被ILR2特異的T細胞所識別。來自健康供者的同種異基因細胞和自體細胞均不被識別，表明1.ILR2僅在腫瘤細胞中在肽水平上明顯表達，并不在來自HLA匹配的健康供者的血液單核細胞中表達。2.該應(yīng)答并非針對同種異基因的主要或次要組織相容性復合體抗原。3.ILR2肽以HLA限制的方式4皮識別。4.該限制是等位基因特異的(八*02特異的)把AML用來自AML患者(8名患者；樣品AML-Ol、-02、-04、-05、-06、-07、-10、-12)的肺瘤細胞測試特異于HLA-A*02限制性ILR2的T細胞。來自A*02陽性患者(4/8;AML-02、-04、-05、-IO)的細胞在所有情況下均被識別(4/4)。來自A*02陰性患者(4/8;AML-Ol、-06、-07、-12)的細胞則不被識別(4/4)(圖8A)。用來自未被測試過的患者的樣品進行第二次實驗。在此第二次實驗中，用來自AML患者(4名患者；AML-Ol、-02、-03、-06)的腫瘤細胞再次測試特異于HLA-A*02限制性ILR1的T細胞。來自A*02陽性患者(3/4)的細胞在所有情況下均被識別。來自A*02陰性患者的細胞則不被識別(0/l)(圖8B)。圖8A顯示來自HLA-A*02陽性供者的CD34陽性的骨髓衍生祖細胞(CD34-01、-02)的數(shù)據(jù)，該細胞不被活化的ILR2特異T細胞所識別，該T細胞在體外已經(jīng)在白細胞介素2的存在下使用ILR2再刺激了7天。同樣，來自HLA-A*02陽性供者的骨髓細胞(BM-Ol、-02)不被這些T細胞克隆所識別。圖7顯示抗體封閉實驗以進一步表征T細胞應(yīng)答的特異性。在進行E:T比穩(wěn)定在40:1的"Cr釋放實驗前，在40:1的不變E:T比例，將封閉mAbs抗體與人類B淋巴母細胞細胞系IM-9—起孵育，mAb的濃度按制造廠商的指示。封閉實驗表明對ILR2的識別是通過帶有T細胞受體(TCR)的細胞在I類MHC(I類HLA)存在下識別其靶介導的，通過依賴共受體CD8而非CD4的相互作用的機制。對不相關(guān)的、粘蛋白細胞表面蛋白MAM-6(又稱CA15-3,DF3)與HMFG-1特異的對照mAbs對效應(yīng)T細胞識別IM-9細胞并無影響。在這些封閉實驗中PBS被用作陰性對照?？傊?，這兩組實驗確認1.ILR2在100%(7/7)所測試的A*02陽性AML患者中是肺瘤相關(guān)抗原；2.ILR2被HLA-A*02限制；3.ILR1特異T細^^識別肺瘤細月包上經(jīng)天然加工的ILR1,同時ILR1肽似乎并不存在于骨髓與CD34陽性祖細胞中。4.耙與效應(yīng)細胞間的相互作用可被抗I類MHC、TCR或CD8的mAbs特異地抑制。靼CXL用來自CLL患者(8個患者；CLL-Ol、-02、-03、-04、-05、-06、-07、-08)的腫瘤細胞測試特異于HLA-A*02限制性ILR1的T細胞。來自A*02陽性患者(4/8)的細胞在所有情況下全^f皮識別(4/4)。來自A*02陰性患者的細胞在任何情況均不被識別(0/4)(圖3B)。用另外5名CLL患者重復該實驗(圖9B)，其中有3/5人是八*02陽性。因為來自3/3A*02陽性患者的CLL細胞全被識別，所以當0/2A*02陰性靶細胞被識別時，這些另外的結(jié)果確認前述結(jié)果。結(jié)論和概括1.ILR1在100%(7/7)A*02陽性CLL患者中是腫瘤相關(guān)抗原；2.ILR1被HLA-A*02限制。把T2T2細胞的TAP表達是有缺陷的，TAP是"抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白"，該蛋白負責從細胞質(zhì)接運短肽至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER),其中肽被負載至空的MHCI類分子上。因此，如果沒有肽的加入(外部負載)，貝'JT2細胞的MHCI類分子保持空著。因此，在細胞表面表達空的HLA-A*02分子的T2細胞是建立HLA-A*02限制性T細胞的肽特異殺滅的滴度曲線的最佳目標。在此實驗中，用T2細胞測試ILR2特異的T細胞，該T2細胞經(jīng)已被詳細描述的來自HIV的T細胞表位、或ILR2肽ALCNTDSPL致敏。結(jié)果T細胞只識別用ILR2肽致敏的T2細胞。用HIV肽致每丈的T2細胞則不被識別。用ILR2肽致每丈的T2耙細胞以劑量依賴方式被溶解。在測試的濃度范圍內(nèi)溶解未達到飽和(圖IOA)。耙T2+ILR2按照上文"T2+ILR1"中的描述進行冷靶抑制測定。此實驗的結(jié)果確認與ILR2特異CTL不相關(guān)的肽(Survivin與ILR1)和未負載的T2細胞均不與負載有ILR2肽的靶細胞竟爭^皮ILR2特異的CTL溶解，該未負載的T2細胞在其細胞表面展現(xiàn)空的HLA-A*02分子。相反，一旦^皮合成ILR2肽或天然展示ILR2的AML腫瘤細胞致，敏的耙細胞在HLA-A*02存在下^皮用作第二(冷)靶，那么這些會與初級靶細胞(熱，ILR2肽致敏的T2)竟爭被ILR2特異的CTL溶解(圖IOB)?？傊?，本發(fā)明的來自ILR的兩個肽均是開發(fā)以肽為基礎(chǔ)的用于一般癌癥患者的治療性疫苗的候選肽。權(quán)利要求1.腫瘤相關(guān)肽，該肽選自至少在序列上包含任一的SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或其變體的肽，條件是所述肽不是完整的人腫瘤相關(guān)多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤相關(guān)肽，其中所述肽基本上由任一的氨基酸序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或其變體組成。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腫瘤相關(guān)肽，其中所述肽的總長度介于9至30個氨基酸之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽，其由任一的氨基酸序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2組成。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽，其能夠與人類主要組織相容性復合體I類分子結(jié)合，特別是與HLA-A*0201結(jié)合。6.才艮據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤相關(guān)肽，其中當與HLA-A*0201結(jié)合時，結(jié)合的肽能夠引起細胞毒性T細胞(CTL)的產(chǎn)生，所述T細胞識別表達含有給定氨基酸序列的多肽的細胞。7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的肺瘤相關(guān)肽，其能夠與人類主要組織相容性復合體(MHC)II類分子結(jié)合，特別是與HLA-DRBl。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽，其中所述肽包括非肽鍵。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽，其中所述肽是融合蛋白。10.核酸，其編碼權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的肽。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸，其是DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA或其組合。12.能夠表達權(quán)利要求10或11所述核酸的表達載體。13.包含權(quán)利要求10或11所述的核酸或權(quán)利要求12所述的表達載體的宿主細胞。14.生產(chǎn)權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽的方法，所述方法包含培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的宿主細胞以及從宿主細胞或其培養(yǎng)基中分離所述肽。15.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽、權(quán)利要求10或11所述的核酸或權(quán)利要求12所述的表達載體以及藥物可接受的載體。16.權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的肺瘤相關(guān)肽、權(quán)利要求10或11所述的核酸或權(quán)利要求12所述的表達載體在醫(yī)藥中的用途。17.癌癥疫苗，其包含權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的腫瘤相關(guān)肽、權(quán)利要求10或11所述的核酸或權(quán)利要求12所述的表達載體。18.權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的胂瘤相關(guān)肽、權(quán)利要求10或11所述的核酸或權(quán)利要求12所述的表達載體在制備用于殺滅患者中的靶細胞的藥物中的用途，所述靶細胞表達包含權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所給出的氨基酸序列的多肽。19.制備活化的細胞毒性T細胞(CTL)的體外方法，所述方法包含在體外將CTL與負載有抗原的、在適合的抗原提呈細胞的表面上表達的人MHCI類和II類分子接觸一段時間，所述時間足以以抗原特異方式活化所述CTL,其中所述抗原為權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的肽。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中通過將足量的所述抗原與抗原提呈細胞接觸將所述抗原負載于在適合的抗原提呈細胞的表面上表達的MHCI類和II類分子上。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗原提呈細胞包含權(quán)利要求12所述的表達載體。22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述MHCI類分子是HLA-A*0201。23.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述MHCII類分子是HLA-DRBl。24.通過權(quán)利要求19-23中任一權(quán)利要求所述的方法產(chǎn)生的活化的細胞毒性T細胞(CTL)，其選擇性識別表達含有權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所給出的氨基酸序列的多肽的細胞。25.T細胞受體(TCR)，其識別表達含有權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所給出的氨基酸序列的多肽的細胞，所述TCR能夠從權(quán)利要求24的細胞毒性T細胞(CTL)得到，或為TCR的功能相價分子。26.編碼權(quán)利要求25所述的T細胞受體(TCR)的核酸。27.能夠表達權(quán)利要求26所述的T細胞受體(TCR)編碼核酸的表達載體。28.權(quán)利要求24所定義的細胞毒性T細胞在制備用于殺滅患者中的耙細胞的藥物中的用途，所述輩巴細胞表達含有權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所給出的氨基酸序列的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及免疫治療方法，以及用于免疫治療方法的分子與細胞。具體地，本發(fā)明涉及癌癥的免疫治療，尤其是包含血液腫瘤在內(nèi)的若干腫瘤病種。本發(fā)明還涉及腫瘤相關(guān)的T輔助細胞肽表位，其單獨地或與其它腫瘤相關(guān)肽一起作為刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答的疫苗組合物的活性藥物成分。具體地，本發(fā)明涉及兩種新的衍生自人癌胚胎抗原未成熟層粘連蛋白受體(OFA/iLR)的HLAI類或II類分子的肽序列，即LLAARAIVAI和ALCNTDSPL，其能夠被用在疫苗組合物中以引起抗腫瘤免疫應(yīng)答。文檔編號C07K14/435GK101166759SQ200680014160公開日2008年4月23日申請日期2006年4月26日優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日發(fā)明者馬蒂亞斯·蔡斯申請人:伊瑪提克斯生物技術(shù)有限公司