專利名稱：一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于涉及一種聚合血紅蛋白的制備方法，尤其是一種窄分 布的低平均分子量聚合血紅蛋白的制備方法。
(二) 背景技術(shù)-
雖然傳統(tǒng)的輸血方式在醫(yī)療救護(hù)方面發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)也 存在各種問(wèn)題，如血源短缺、病毒傳播、免疫反應(yīng)，以及過(guò)期血的處 理等。在各種臨床醫(yī)療和急救中，對(duì)輸血的質(zhì)和量的要求也越來(lái)越嚴(yán) 格，因而研發(fā)和使用血液代用品己普遍受到重視。
血紅蛋白由四個(gè)亞基(《,"2/ ,/ 2)組成，是紅細(xì)胞中一種負(fù)責(zé)氧氣 傳遞的蛋白。由于其獨(dú)特的氧結(jié)合特性、正常生理代謝途徑等原因， 以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品非常符合人體的生理需要。與紅細(xì)胞 不同，由于聚合血紅蛋白中沒(méi)有膜蛋白、可以巴氏消毒，所以解決了 輸血治療中存在的同種異體輸血免疫及相關(guān)傳染病等問(wèn)題。同時(shí)，聚 合血紅蛋白可以在室溫下長(zhǎng)時(shí)間保存，突破了人血保存和運(yùn)輸條件要 求較嚴(yán)，災(zāi)害和戰(zhàn)傷搶救輸血受到限制。然而，未經(jīng)修飾聚合的血紅 蛋白不能作為血液代用品直接使用，這主要是因?yàn)?1)未經(jīng)修飾的血 紅蛋白會(huì)失去2,3-二磷酸甘油酸的調(diào)節(jié)，使得血紅蛋白的氧親和力升 高，不能向組織有效供氧。(2)未經(jīng)聚合的血紅蛋白會(huì)使血漿的膠體 滲透壓升高。(3)未經(jīng)聚合的血紅蛋白四聚體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期只 有2 4小時(shí)，會(huì)迅速分解成二聚體和單體從腎臟濾過(guò)形成血尿。只進(jìn) 行分子內(nèi)聚合的四聚體會(huì)進(jìn)入血管的上皮細(xì)胞，與其中的NO結(jié)合引 發(fā)血壓升高、腹痛等副作用。
以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品的研究工作都主要集中于降低氧 親和力、穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)和延長(zhǎng)其循環(huán)半衰期。為了進(jìn)一步增加分子 量、提高穩(wěn)定性、降低滲透壓，通常需將修飾過(guò)的血紅蛋白用雙(多) 官能團(tuán)的交聯(lián)劑進(jìn)行分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)(合適的分子量為90 400kD)。目前，使用最多的交聯(lián)劑是戊二醛和開環(huán)棉子糖。國(guó)外的 Northfield生產(chǎn)的戊二醛聚合磷酸吡哆醛化的人血紅蛋白PolyHemeTM (US Patent No.6,552，173)和Biopure公司研制的戊二醛聚合牛血紅蛋
Hemopure (US Patent No.5，955，581)在美國(guó)已完成III期臨床，待FDA 批準(zhǔn)上市Biopure公司的產(chǎn)品在南非上市。此外，Hemosol公司研制 的開環(huán)棉子糖聚合人血紅蛋白Hemolink (US Patent No.5，770，727)進(jìn) 入II期臨床。
戊二醛是一種同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基可以分別和兩個(gè) 相同或不同的氨基生產(chǎn)希夫堿。通常，戊二醛交聯(lián)可以生成65-85%的 聚合血紅蛋白。但由于戊二醛的反應(yīng)活性高、無(wú)特異性反應(yīng)位點(diǎn)，所 以其聚合產(chǎn)物分子量分布寬、平均分子量較大。盡管這種聚合血紅蛋 白分子的分子量分布不會(huì)改變它的載氧特性，但會(huì)降低血漿的膠體滲 透壓并增加粘度，進(jìn)而影響其血液動(dòng)力學(xué)特性。因此，F(xiàn)DA在回復(fù) Biopure公司戊二醛聚合牛血紅蛋III期臨床批文中明確要求降低平均 分子量。此外，寬的分子量分布也會(huì)給后續(xù)的分離過(guò)程帶來(lái)很大麻煩。 因此，如何制備窄分布低分子量聚合血紅蛋白降低其粘度和流動(dòng)性就 成為了該領(lǐng)域的研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。-一種解決方法是用新型交聯(lián)劑， 如聚胺類交聯(lián)劑等來(lái)制備分子量分布較窄的聚合血紅蛋白。但是這些 交聯(lián)劑價(jià)格昂貴、分子量分布仍然較寬、需要進(jìn)行大量毒理學(xué)評(píng)價(jià)， 因而至今還沒(méi)有一種產(chǎn)品進(jìn)入臨床研究。中國(guó)科學(xué)院北京過(guò)程研究所 蘇志國(guó)、胡濤創(chuàng)造性地提出了另 一 種解決方法(中國(guó)專利 No.01136190.5)。其具體方法是將血紅蛋白在pH二7 9的環(huán)境下靜態(tài) 吸附于陰離子交換介質(zhì)上用200 500倍戊二醛進(jìn)行交聯(lián)。最終得到分 子量專一 (128kD)的血紅蛋白。但此方法也存在一些問(wèn)題如陰離子 交換介質(zhì)的利用率低(0.5-4mg血紅蛋白/ml固相)、使用高摩爾比的戊 二醛會(huì)使血紅蛋白過(guò)度修飾、使用不含氨基的HEPES緩沖體系價(jià)格昂
蟲絡(luò) 貝寺。

發(fā)明內(nèi)容-
本發(fā)明的目的是提供--種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的 制備方法，它可以在陽(yáng)離子交換色譜柱上聚合獲得低粘度的窄分布的 低平均分子量聚合血紅蛋白。
本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白 的制備方法，其特征在于它的包括以下步驟
①將血紅蛋白用泵加入凝膠阻滯色譜中平衡，然后分布加入雙功 能交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為0 3(TC， pH值為5.0 7.0，反
應(yīng)時(shí)間為3 10小時(shí)；經(jīng)過(guò)修飾的血紅蛋白溶液濃度為卜-100mg/ml， 血紅蛋白與雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為1:10 1:5 0;
② 用緩沖溶液將歩驟①生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集；收集液用氨 基酸中止反應(yīng)，雙功能交聯(lián)劑與氨基酸的摩爾比為2 3:1:最后超濾 濃縮
③ 采用硼氫化鈉對(duì)得到的聚合血紅蛋白進(jìn)行還原處理后，再用超 濾、層析方法對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到窄分布，且平均分子量在 250kD以下的聚合血紅蛋白。
l二述所說(shuō)的歩驟①中聚合反應(yīng)的步驟包括
(1) 取修飾后的血紅蛋白溶液通氮，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)；
(2) 加入雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，進(jìn)行預(yù)聚合；
(3) 裝填O)1.6x30價(jià)CM-52陽(yáng)離子交換柱，用脫氧后的緩沖溶液
平衡；
(4) 將血紅蛋白溶液泵入色譜柱中循環(huán)；
(5) 0.5 2小時(shí)后，每隔0.5 1小時(shí)，加入戊二醛。 匕述所說(shuō)的血紅蛋白可以為哺乳動(dòng)物血紅蛋白或重組血紅蛋白，
包括人血紅蛋白、牛血紅蛋白。
i二述所說(shuō)的修飾的血紅蛋白溶液為天然修飾的血紅蛋白溶液或
化學(xué)修飾的血紅蛋白溶液。
卜述所說(shuō)的雙功能交聯(lián)劑可以選用戊二醛、乙二醛或乙醇醛。 上述所說(shuō)的緩沖溶液可以選用PBS、 Bis-tris或Tris-HCl。 上述所說(shuō)的歩驟②中的氨基酸可以是甘氨酸或賴氨酸。 本發(fā)明的優(yōu)越性在于i、本發(fā)明所制備的聚合血紅蛋白為窄分
布低分子量聚合血紅蛋白，平均分子量小于200kD; 2、克服r傳統(tǒng)
的戊二醛制備方法中聚合產(chǎn)物均一性差的缺陷；3、該聚合血紅蛋白
很容易與未聚合的單體血紅蛋白分離，由于減少了蛋白膠體的數(shù)量而 使膠體滲透壓降低，粘度卻無(wú)顯著變化。


圖1為本發(fā)明所涉一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的
制備方法所用裝置不意圖2為本發(fā)明所涉 -種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的 制備方法中的聚合血紅蛋白樣品的SEC-HPLC色譜圖。
其中，1為色譜柱，2為泵，3為儲(chǔ)液器。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例取5g濃度為75mg/ml的PLP修飾后的人血紅蛋白溶液 (pH:6.3)在2(TC通氮2小時(shí)，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)；加入2.8ml 2% 戊二醛反應(yīng)3小時(shí)進(jìn)行預(yù)聚合；裝填O1.6x30，CM-52陽(yáng)離子交換柱， 用脫氧后的10mM PBS(pH-6.3)緩沖液平衡(裝置圖見圖1);將血紅蛋 白溶液泵入色譜柱中循環(huán)，并使儲(chǔ)液器中溶液最終體積為40ml; 1小 時(shí)后，分12次每隔0.5小時(shí)，向儲(chǔ)液器中加入4.4ml戊二醛；繼續(xù)反 應(yīng)2小時(shí)。最后用10mMPBS緩沖液(pH7.4)洗脫；收集物超濾濃縮 后，用硼氫化鈉還原；超濾濃縮；收集物用TSK3000sw凝膠過(guò)濾柱， 流動(dòng)相為1/15MPBS + 0.1MNaCl (pH7.2)，流速為0.50ml/min，洗脫 物在280nm紫外光下檢測(cè)；可檢測(cè)到3個(gè)洗脫峰(見圖2);根據(jù)洗脫 時(shí)間，可確定前兩個(gè)洗脫峰的為所需的產(chǎn)品；第三個(gè)為未反應(yīng)的血紅 蛋白。
戊二醛和血紅蛋白的賴氨酸上的氨基發(fā)生反應(yīng) 2 Hb-NH2 + HOC-CH2-CHrCOH — Hb-N=CH-CH2CH2CH-N=Hb
權(quán)利要求
1、一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于它的包括以下步驟①將血紅蛋白用泵加入凝膠阻滯色譜中平衡，然后分布加入雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為0～30℃，pH值為5.0～7.0，反應(yīng)時(shí)間為3～10小時(shí)；經(jīng)過(guò)修飾的血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml，血紅蛋白與雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為1∶10～1∶50；②用緩沖溶液將步驟①生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集；收集液用氨基酸中止反應(yīng)，雙功能交聯(lián)劑與氨基酸的摩爾比為2～3∶1；最后超濾濃縮；③采用硼氫化鈉對(duì)得到的聚合血紅蛋白進(jìn)行還原處理后，再用超濾、層析方法對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到窄分布，且平均分子量在250kD以下的聚合血紅蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋 白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的步驟①中聚合反應(yīng)的步驟包括(1) 取修飾后的血紅蛋白溶液通氮，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)；(2) 加入雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，進(jìn)行預(yù)聚合；(3) 裝填①1.6x30，CM-52陽(yáng)離子交換柱，用脫氧后的緩沖溶液平衡；(4) 將血紅蛋白溶液泵入色譜柱中循環(huán)；(5) 0.5 2小時(shí)后，每隔0.5 1小時(shí)，加入戊二醛。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所說(shuō)的一種窄分布的低平均分子量聚合血 紅蛋白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的血紅蛋白可以為哺乳動(dòng)物血紅 蛋白或重組血紅蛋白，包括人血紅蛋白、牛血紅蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所說(shuō)的一種窄分布的低平均分子量聚合血 紅蛋白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的修飾的血紅蛋白溶液為天然修 飾的血紅蛋白溶液或化學(xué)修飾的血紅蛋白溶液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所說(shuō)的一種窮分布的低平均分子量聚合血 紅蛋白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的雙功能交聯(lián)劑可以選用戊二醛、 乙二醛或乙醇醛。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋 白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的緩沖溶液可以選用PBS、 Bis-tris或Tris-HCl。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋 白的制備方法，其特征在于所說(shuō)的步驟②中的氨基酸可以是甘氨酸或賴氨酸。
全文摘要
一種窄分布的低平均分子量聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于它的包括以下步驟①將血紅蛋白用泵加入凝膠阻滯色譜中平衡，然后分布加入雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)；②用緩沖溶液將步驟①生成的聚合產(chǎn)物洗脫、收集；收集液用氨基酸中止反應(yīng)；最后超濾濃縮；③采用硼氫化鈉對(duì)得到的聚合血紅蛋白進(jìn)行還原處理后，再用超濾、層析方法對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。其優(yōu)越性在于1.本發(fā)明所制備的聚合血紅蛋白為窄分布低分子量聚合血紅蛋白，平均分子量小于200kD；2.克服了傳統(tǒng)的戊二醛制備方法中聚合產(chǎn)物均一性差的缺陷；3.該聚合血紅蛋白很容易與未聚合的單體血紅蛋白分離，由于減少了蛋白膠體的數(shù)量而使膠體滲透壓降低，粘度卻無(wú)顯著變化。
文檔編號(hào)C07K14/805GK101200499SQ200610130360
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者張鴻輝, 燊 李, 李洪英, 楊成民, 梁偉光, 翔 王, 許麗麗, 磊 黃 申請(qǐng)人:天津協(xié)和生物科技發(fā)展有限公司