專利名稱：神經(jīng)活性化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)活性化合物、它們的制備方法以及它們作為藥物或獸藥的用途，特別是用于治療神經(jīng)疾病，更具體地說用于治療神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病的用途。
背景技術(shù)：
在本說明書中引用的所有參考文獻，包括任何專利或?qū)＠暾?，都在此引入作為參考。不是承認(rèn)任何參考文獻構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。所述參考文獻的論述表明了它們的作者所主張的內(nèi)容，本申請人對所引用文獻的準(zhǔn)確性和相關(guān)性保留質(zhì)疑的權(quán)利?？梢郧宄乩斫猓m然在此參考了許多現(xiàn)有技術(shù)出版物，但是在澳大利亞或任何其它國家，這種參考并不等于承認(rèn)任何這些文獻構(gòu)成本領(lǐng)域公知常識的一部分。
對于每個物種來說，認(rèn)為在生物學(xué)上的壽命是固定的，而人的壽命是不確定的，可以長達120年。由于本世紀(jì)的壽命預(yù)期顯著地上升，所以老年人在我們的人群中所占比例不斷增加，他們的衛(wèi)生保健需求將持續(xù)數(shù)十年。
雖然自然老化的特征為人腦質(zhì)量和體積的適度減少，這可能是由于腦細(xì)胞的萎縮和/或死亡引起的，但是這些變化在神經(jīng)變性病癥對象的大腦中的意義是非常深遠(yuǎn)的。這些病癥中的大多數(shù)是間歇性的(即，不是由遺傳突變引起的)并且不知道原因，但是有顯示在許多基因中的成百上千種不同的突變造成幾種神經(jīng)變性病癥的家族性(遺傳)變種。在最近的十年中，在測定神經(jīng)變性病癥遺傳基礎(chǔ)的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)了成打或更多中的一些藏匿這些突變的基因。長時間的正常腦功能之后，由于特定腦部位的進行性退化(即，神經(jīng)細(xì)胞功能異常和死亡)，神經(jīng)變性病癥逐漸衍變。由于當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞損失超過由受影響腦部位執(zhí)行的依次地功能(例如，記憶、運動)的“闕值”時，出現(xiàn)疾病的癥狀表現(xiàn)，因此腦退化的實際發(fā)病可能要比臨床表現(xiàn)早許多年。
在造成癡呆的神經(jīng)疾病中，智力和高級綜合認(rèn)知能力逐漸受損并干擾日?；顒?。在老年人群中，癡呆的確切發(fā)病率是未知的，但是在65歲以上的老年人群中可能15％的人群患有癡呆，其中5％的人群情況嚴(yán)重，10％的人群患有輕度至中等的癡呆。在85年中，65年以上人群患嚴(yán)重癡呆的發(fā)病率從1％增加到了45％。有許多原因引起癡呆，但是阿爾茨海默氏病(AD)占了65歲以上癡呆患者的50％。
AD是大腦的原發(fā)性退行性疾病。它的特點在于認(rèn)知功能例如記憶、思考、理解、計算、語言、學(xué)習(xí)能力和判斷的進行性下降。當(dāng)這些下降足以損害到個人的日常生活時，被診斷為癡呆。AD表現(xiàn)出一種緩慢衰退的起病隱襲。這種疾病需要與和年齡有關(guān)的認(rèn)知功能的正常下降相區(qū)別。正常下降要更小地、更逐漸地引起更輕度的殘疾。盡管更早發(fā)病并不罕見，但是AD的發(fā)病通常在65歲以后。隨著年齡的增長，發(fā)病率也迅速增加(歲數(shù)每增加5歲，發(fā)病率約增加一倍)。在老年人群中，隨著壽命預(yù)期的增加，這種疾病與個體的總數(shù)之間存在明顯的關(guān)系。
AD癡呆的病原學(xué)還不清楚。大量證據(jù)表明某些形式的AD具有可遺傳素因(St George-Hyslop中的綜述，2000)，并且某些ApoE同工型的表達同樣與AD的更高風(fēng)險有關(guān)(Corder等人，1993；Czech等人1994)。鋁的毒性累積被認(rèn)為是AD的致病因素，雖然這種假設(shè)現(xiàn)在已經(jīng)基本上被廢棄。AD患者的大腦顯示出異常沉積，其中包括β-淀粉狀蛋白(Aβ)已知Aβ存在于某些神經(jīng)變性疾病患者的大腦中，但是不知道它是否是潛在原發(fā)疾病過程的癥狀，或者實際上涉及所述疾病的病原學(xué)。例如，一些作者相信Aβ沉積可以是正常腦防御機制的指示，其中大腦試圖隱退Aβ；這些沉積可以存在于正常個體的大腦中。存在神經(jīng)原纖維糾纏在一起的tau蛋白的突變，沒有淀粉狀斑塊存在于大腦中；這種病癥被稱為tauopathy。
有人提出治療AD的方法是抑制大腦中Aβ的產(chǎn)生。通過BACEl和γ-分泌酶進行的APP的蛋白水解裂解生成全長的Aβ，然后將其從細(xì)胞中釋放(Nunan和Small，2000)。因此，BACEl或γ-分泌酶的抑制劑可能具有治療價值。另外，許多研究表明膽固醇可以影響Aβ的釋放(Simons等人，1998；Hartmann，2001；Fassbender等人，2001；Frears等人，1999；Friedhoff等人，2001)。但是，對于降低膽固醇含量的數(shù)值，在本領(lǐng)域中存在一些爭論，一些工作者認(rèn)為膽固醇實際上是有益的。例如，Ji等人(2002)提出通過抑制它的低聚反應(yīng)Aβ與膽固醇的結(jié)合可以預(yù)防Aβ的毒性。
在一種可選方法中，已經(jīng)提出，通過舒展淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白酶解加工，其生成Aβ淀粉樣單體，許多潛在的治療靶標(biāo)是可能的(Shearman等人，2000；Sinha等人，1999)，并且這種方法處在臨床開發(fā)的早期。人們試圖通過Aβ免疫接種來清除腦部的Aβ，雖然在AD的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中是有效的(Schenk等人1999)，但是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這種方法具有顯著的副作用(Brower，2002)。
還有人提出，淀粉樣原纖維的沉積在其它神經(jīng)變性疾病中同樣是重要的。這些包括帕金森病、盧伊體(Lewy body)形成性癡呆、多系統(tǒng)萎縮癥、哈-斯氏病(Hallerboden-Spatz disease)和彌漫性盧伊體疾病。
AD病因?qū)W的一種競爭性理論是致病步驟位于Aβ淀粉樣蛋白質(zhì)的腦內(nèi)生源說和累積的途徑內(nèi)(參見Selkoe最近述評，2001；Beyreuther等人，2001；Bush，2001)。然而，到目前為止，還沒有以此途徑作為靶標(biāo)的藥物或試劑已經(jīng)表明在改變疾病的臨床表達上或在預(yù)防或改善與神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默氏病有關(guān)的認(rèn)知功能下降中具有一種持久作用。
另一種假說是AD是由Aβ淀粉狀蛋白的毒性累積引起的，部分原因是由于銅和鋅的過度結(jié)合，這些金屬離子在最受影響的區(qū)域中很豐富。此外，已經(jīng)提出，當(dāng)Zn2+和Cu2+離子與Aβ相互作用時，在原纖維和斑塊中出現(xiàn)Aβ的聚集(Atwood等人，1998)；這種情況已經(jīng)被從缺乏突觸Zn2+的動物中獲得的最新數(shù)據(jù)所證實(Lee等人，2002)。還已經(jīng)提出，氧化還原活性的Cu2+-Aβ相互作用可以由O2生成H2O2(Huang等人，1999)。Cu2+和Zn2+兩者都已經(jīng)表明影響Aβ-類脂膜的相互作用(Curtain等人，2001)。
腦是一個富集金屬離子的器官，最近的證據(jù)表明，金屬內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的破壞在各種與年齡有關(guān)的神經(jīng)變性疾病中起關(guān)鍵性的作用。這些疾病的共同特性包括錯折疊蛋白質(zhì)的沉積(每種疾病具有自己的特異性淀粉樣蛋白質(zhì))和由于氧化應(yīng)激引起的大量細(xì)胞損傷。的確，目前數(shù)據(jù)被快速累積，金屬化學(xué)反應(yīng)可以作為構(gòu)成致淀粉狀神經(jīng)障礙例如阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、朊病毒病(prion diseases)-包括克-雅二氏病(CJD)、傳遞性海綿狀腦病(TSE)、白內(nèi)障、線粒體病、帕金森病和亨廷頓舞蹈病的共同點。在這些情況中，通過生理環(huán)境(典型地存在過渡金屬和有用的還原劑)中的異常氧化還原活性，促進了特異性蛋白質(zhì)的病理性聚集。[Bush，2000(Curr OpinChem Biol.2000年4月；4(2)184-91)]。
使用氯碘喹啉(iodochlorohydroxyquinoline)-抗生素[也已知為氯碘羥喹(CQ)]治療AD的方法已經(jīng)在P.N.Geromylatos S.A的美國專利5,994,323和6,001,852以及Bush等人的美國專利申請No.09/972,913中公開并且被要求保護。1970年作為抗生素的CQ被取消，因為它與罕見的神經(jīng)綜合癥，亞急性脊髓視神經(jīng)病(SMON)有關(guān)，其僅僅在六十年代的日本被觀察到，在接受長時間藥物以及可能給予比建議劑量更高的劑量的病人中(Shiraki，1975)。但是，最新證據(jù)表明，SMON是由特別弱人群中與維生素B12不足有關(guān)的濫用引起的，因此在臨床情況中可以進行修復(fù)研究(Yassin等人，2000；Bush和Masters，2001)。
但是，在Geromylatos和Bush的專利中沒有提供動物模型或人的體內(nèi)結(jié)果。US5,994,323公開了一種包含CQ和維生素B12的組合物，及其治療“對CQ給藥起反應(yīng)的同時抑制有害副作用的疾病或障礙”的用途。這些疾病包括AD。美國6,001,852公開了一種使用CQ(優(yōu)選與維生素B12一起)治療AD的方法。美國專利5,994,323和美國專利6,001,852提出的劑量范圍是10-750mg每天；美國專利5,994,323建議如果進行長期治療，那么CQ應(yīng)該周期性地給予，給藥3周后，接著進行一個1-4周的“清除”階段。
在美國申請09/972,913中，CQ僅僅是指它解聚Aβ沉積的能力。沒有討論神經(jīng)毒性的其它機理。General Hospital公司申請的PCT/US599/05291公開了使用CQ與特定的銅和鋅螯合劑結(jié)合以促進淀粉樣蛋白斑的溶解以及抑制淀粉樣蛋白斑的形成和/或抑制由Aβ引起的ROS的產(chǎn)生。
美國專利6,001,852還提出了一種包含CQ和維生素B12的組合物，這種組合物可以在治療帕金森氏病中使用；然而，在美國專利6,001,852中提出，CQ主要是通過從黑質(zhì)(substantia nigra)中清除鐵起作用的。
CQ治療AD的效力取決于它進入CNS然后從各種Aβ實體中螯合過渡金屬Cu、Zn和Fe的能力，由此減少Aβ毒性并將Aβ釋放清除出去。由于CQ差的水溶性，這限制了它的口服生物利用度，因此它的效果受到限制。還已知，CQ進行大量的接合代謝(conjugative metabolism)，并且具有如上所述的毒性史。CQ是一種二齒金屬配體的事實使得捕獲每個金屬離子必須至少需要兩個分子。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療神經(jīng)疾病的方法，所述神經(jīng)疾病包括其特征為蛋白質(zhì)和金屬間異常反應(yīng)的那些。
國際專利公開WO2004/031161描述了具有兩個稠合的6-員環(huán)的雜環(huán)化合物，其中氮在1位上并且羥基或巰基基團在8位上并且至少一個環(huán)是芳香性的。這些化合物可以用作藥物或獸藥，特別是用于治療神經(jīng)病癥，更具體地是用于治療神經(jīng)變性病癥例如阿爾茨海默氏病。
現(xiàn)在，通過對下列一種或多種性質(zhì)進行綜合優(yōu)化，我們已經(jīng)開發(fā)出了具有兩個稠合的6-員雜環(huán)的化合物，其中氮原子在1位和3位上，羧基基團在4位上并且羥基基團在8位上并且兩個環(huán)是芳族的(a)金屬鰲合(如下文所定義)；(b)水溶性；(c)減少的細(xì)胞毒性；(d)淀粉分散性能；(e)適合于CNS滲透的膜滲透性；以及(f)代謝穩(wěn)定性。
這些化合物在國際專利公開WO2004/031161的總的范圍內(nèi)，但是并沒有在其中具體地公開并包括通過主動轉(zhuǎn)運它們集中在CNS中的藥物例子，除了它們的金屬鰲合的特性還含有抗氧化活性，其在一些情況中導(dǎo)致金屬鱉合的性質(zhì)增強并顯示出一種前藥策略，這種前藥策略掩蔽了8-羥基部分以有利于CNS滲透，并且利用保存在血腦屏障(BBB)內(nèi)表面上的已知酯酶活性。
盡管不希望被任何理論所限制，可以相信在2位和3位上的取代基的性質(zhì)對于提高斑的分解是很重要的。優(yōu)選這些取代基用3D上是平面的。在環(huán)結(jié)構(gòu)上的平面的取代基可以使游離的配體以及金屬螯合物更有效地與斑相互作用并且分解斑。
根據(jù)本發(fā)明，這里提供了一種式I的化合物
其中R2是H或CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基和任選地被取代的C3-6環(huán)烷基；R3是H、任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C1-4鏈烯基；任選地被取代的C3-6環(huán)烷基；任選地被取代的6-員芳基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到6的整數(shù)并且R6是任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基或任選地被取代的6-員芳基；NR8R9，其中R8和R9獨立地選自H、任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基或任選地被取代的6-員芳基；NHCOR10，其中R10是任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基或任選地被取代的6-員芳基；CH2CONR11R12，其中R11和R12獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基、任選地被取代的C2-6炔基和任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基稠合；和(CH2)mNHR13，其中R13選自任選地被取代的C1-6烷基和SO2R14，其中R14選自任選地被取代的C1-6烷基和任選地被取代的6-員芳基并且m是1到6；R5和R7獨立地選自H和鹵素；并且X是O或S，條件是(i)R2和R3中至少一個不是H；(ii)R5和R7中至少一個是鹵素；并且(iii)當(dāng)X是O時，R5和R7是Cl并且R2是H的時候，則R3不是環(huán)丙基，
其鹽、水合物、溶劑合物、衍生物、前藥、互變異構(gòu)體和/或異構(gòu)體。
本發(fā)明還提供了式I的化合物作為藥物的用途，優(yōu)選是神經(jīng)治療藥物或神經(jīng)保護藥物，更優(yōu)選是抗致淀粉樣變性藥物(antiamyloidogenic agent)。優(yōu)選地，所述神經(jīng)病癥是神經(jīng)變性病癥，更優(yōu)選是神經(jīng)變性淀粉樣變性病，例如阿爾茨海默氏病或帕金森病。
式I的化合物與藥用或獸用可接受的載體一起以藥物或獸藥組合物的形式有利地給藥。
因此，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或獸藥組合物，其含有式I的化合物和藥用或獸用可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明，這里還提供了一種治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的方法，該方法包括向需要治療的受治療患者給藥有效量的式I的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，這里還提供了式I的化合物在制備治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了式I的化合物在治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)疾病上的用途。
本發(fā)明還提供了用于治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)疾病的式I的化合物。
本發(fā)明還提供了一種制備上述定義的式I的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使任選地被保護的式V的化合物 其中R5和R7如上定義，與H2NR3反應(yīng)，其中R3如上定義，以形成任選地被保護的式VII的化合物
(b)還原式VII的化合物以形成任選地被保護的式VIII的化合物 (c)環(huán)化式VIII的化合物以形成任選地被保護的式I的化合物，其中R2是H；或者(d)在R2CHO、R2CO2H或R2C(ORX)的存在下環(huán)化式VIII的化合物，其中RX是任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。
本發(fā)明還提供了一種制備如上定義的式I的化合物的方法，其中R2是H，該方法包括以下步驟(a)氨基化任選地被保護的式VI的化合物 其中R5和R7如上定義，以形成任選地被保護的式IX的化合物
IX；和(b)將式IX的化合物與R3-L或R3OSO2RX反應(yīng)，其中L是離去基團并且RX如上所定義。
本發(fā)明還提供了一種制備如上定義的式I的化合物的方法，其中R2是H，該方法包括以下步驟(a)將如上定義的任選地被保護的式VI的化合物與甲酰化試劑反應(yīng)以形成任選地被保護的式X的化合物 X，或任選地被保護的式XI的化合物 (b)將式X或XI的化合物與含有R2的酰化劑反應(yīng)以形成任選地被保護的式XII的化合物
其中R2如上所定義或形成式XIII的化合物 XIII；和(c)將式XII或XIII的化合物與H2NR3反應(yīng)，其中R3如上所定義。
應(yīng)該意識到，當(dāng)存在保護基團時，可以在上面所描述的方法中的合適步驟中將其除去。
我們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以高產(chǎn)率地通過更簡單的方法來制備在下文中所描述的式V和VI的中間體的前體，當(dāng)其中R5和R7都是鹵素的時候。
于是，根據(jù)本發(fā)明，這里還提供了一種制備式IV的化合物的方法 其中R5和R7如上面的式I中所定義，該方法包括將式III的化合物重氮化的步驟
可以通過還原式II的化合物方便地制備式III的化合物 其中R5和R7如上面的式IV中所定義。
式IV的化合物是制備中間體V和VI的前體 其中R5和R7如上面的式IV中所定義，其可以用于制備式II的化合物。
于是，本發(fā)明還提供了一種制備如上定義的式V的化合物的方法，該方法包括以下步驟；(a)將如上定義的式III的化合物重氮化以形成如上定義的式IV的化合物；并且(b)硝化式IV的化合物。
于是，本發(fā)明還提供了一種制備如上定義的式VI的化合物的方法，該方法包括以下步驟；
(a)將如上定義的式IV的化合物重氮化以形成如上定義的式V的化合物；(b)硝化式VI的化合物以形成如上定義的式V的化合物；并且(c)還原式V的化合物。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的說明書中，除非上下文由于表達措詞或必要暗含之外，術(shù)語“包含”或其變體以包括的含義使用，即，是指存在所述的特征，但是并不排除本發(fā)明的各種實施方案中另外特征的存在或加入。
必須要指出，除非在上下文中清楚地指出為相反的意思，如在本發(fā)明的說明書中所用的，單數(shù)形式“一個”或“這個”包括復(fù)數(shù)方面。于是，例如，參考“一種化合物”包括單一化合物以及兩個或更多的化合物；等等。
優(yōu)選的式I的化合物是式IA的化合物 其中R5、R7和X如上面的式I所定義；并且R3A是任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C1-4鏈烯基；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到3并且R6是任選地被取代的C3-6環(huán)烷基或任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基；NR8R9，其中R8是H并且R9是H或任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基；NHCOR10，其中R10是任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。
優(yōu)選R5和R7都是鹵素，更優(yōu)選是氯。
式IA的化合物的列舉性例子顯示在下面。



在式IA的化合物的列舉性例子中，化合物1076、1077、1082、1083、1084、1085、1087、1088、1089、1091、1092、1093、1097、1098、1099、1100、1101、1107、1108、1109、1110、1112、1115和1126具有在3位上的平面的取代基，如任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C1-4鏈烯基；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到3并且R6是任選地被取代的C3-6環(huán)烷基或任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基；和NR8R9，其中R8是H并且R9是H或任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。在這些式IA的平面化合物中，化合物1100和1101也具有非常好的分解性(disaggregation)。
另一種優(yōu)選的式I的化合物是式IB的化合物
其中R2、R5、R7和X如上面的式I所定義。
優(yōu)選的R2是CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基和任選地被取代的C3-6環(huán)烷基。
優(yōu)選R5和R7都是鹵素，更優(yōu)選是氯。
式IB的化合物的列舉性例子顯示在下面。
式IB的化合物的兩個列舉性例子都在2位具有平面的取代基，如CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自任選地被取代的C1-6烷基?；衔?128也具有非常好的分解性。
另一種優(yōu)選的式I的化合物是式IC的化合物 其中R5、R7和X如上面的式I所定義；并且R1c是CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H和任選地被取代的C1-6烷基；并且R3c是任選地被取代的C1-4烷基。
優(yōu)選R5和R7都是鹵素，更優(yōu)選是氯。
式IC的化合物的列舉性例子顯示在下面。
在式I的化合物上的8-羥基基團可以被封閉以形成前藥，特別是酯前藥。8-羥基基團代表式I的化合物代謝的主要位置葡萄糖醛酸或硫酸鹽結(jié)合得到準(zhǔn)備被排泄的親水種類。這種結(jié)合可能不通過血腦屏障。酯前藥可以保護式I的化合物不結(jié)合。然后對于血腦屏障所必須的酯酶可以釋放C8-羥基通過屏障轉(zhuǎn)送來活化該化合物在CNS中的作用。
雖然不希望被理論所限制，可以相信在本發(fā)明的化合物的螯合特性中，取代基R3和R5通常具有有限的電效應(yīng)或空間效應(yīng)。因此可以用取代基來調(diào)節(jié)其他參數(shù)如細(xì)胞毒性和物理化學(xué)特性，其包括氫鍵供體和受體的數(shù)目、親脂性(ClogP，ElogP和LogD)、溶解性和極性表面積。調(diào)節(jié)這些參數(shù)有助于優(yōu)化這些化合物的藥物動力學(xué)特征?？梢哉J(rèn)為，如果該取代基提供鰲合特性時，取代基R2和R7除了調(diào)節(jié)毒性和物理化學(xué)特性還影響活性。
單獨使用或在組合的詞如“任選地被取代的C1-4烷基”中的術(shù)語“C1-6烷基”或“C1-4烷基”是指分別具有1到6個和1到4個碳原子的直鏈或支鏈的烴基團。上述烷基基團的列舉是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基或己基，優(yōu)選甲基、乙基或丙基。
在此所用的術(shù)語“(CH2)n”或“(CH2)m”包括直鏈或支鏈。
單獨使用或在組合的詞如“任選地被取代的C2-6炔基”中的術(shù)語“C1-6炔基”是指具有2到6個碳原子并且還具有一個三鍵的直鏈或支鏈的烴基團。上述基團的列舉是乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。
單獨使用或在組合的詞如“任選地被取代的C3-6環(huán)烷基”中的術(shù)語“C3-6環(huán)烷基”是指具有3到6個碳原子的飽和碳環(huán)基團。上述基團的列舉是環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基，優(yōu)選環(huán)丙基。
單獨使用或在組合的詞如“任選地與任選地被取代的6-員芳基稠合的任選地被取代的不飽和或飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基”中的術(shù)語“任選地與任選地被取代的6-員芳基稠合的不飽和或飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基”是指具有至少一個氮原子和任選地選自硫和氧的其他雜原子的單環(huán)或多環(huán)的雜環(huán)基團。
合適的雜環(huán)基團包括含氮雜環(huán)基基團如含有1到4個氮原子的不飽和的5-或6-員雜單環(huán)基團，例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡啶烷基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三唑基或四唑基；含有1到4個氮原子的飽和5-或6-員雜單環(huán)基團，例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基或哌嗪基；含有1到5個氮原子的不飽和的稠合雜環(huán)基團，例如吲哚基、異吲哚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并三唑基或四唑并噠嗪基；含有1到2個氧原子和1到3個氮原子的不飽和5-或6-員雜單環(huán)基團，例如噁唑基、異噁唑基或噁二唑基；含有1到2個氧原子和1到3個氮原子的飽和5-或6-員雜單環(huán)基團，例如嗎啉基；含有1到2個硫原子和1到3個氮原子的不飽和5-或6-員雜單環(huán)基團，例如噻唑或噻二唑基；和含有1到2個硫原子和1到3個氮原子的不飽和3到6-員雜單環(huán)基團，例如噻唑烷基。
優(yōu)選的雜環(huán)是含有1到3個氮原子的不飽和5-或6-員雜單環(huán)基團例如吡唑基、吡啶基或嘧啶基；含有1到4個氮原子的飽和的5或6-員雜單環(huán)基團，例如吡咯烷基或哌嗪基；含有1到5個氮原子的不飽和的稠合雜環(huán)基團例如苯并咪唑基；含有1到2個氧原子和1到3個氮原子的飽和的5或6-員雜氮環(huán)基團如嗎啉基；或含有1到2個硫原子和1到3個氧原子的不飽和5-到6-員雜單環(huán)基團，例如噻唑基。
單獨使用或在組合的詞如“任選地被取代的6-員芳基”中的術(shù)語“6-員芳基”是指6-員碳環(huán)芳香基團。上述基團的列舉是苯基。優(yōu)選的芳基是任選被取代的苯基如4-鹵代苯基，更優(yōu)選4-氟代苯基。
單獨使用或在組合的詞如“任選地被取代的6-員雜芳基”中的術(shù)語“6-員雜芳基”是指含有1個或多個雜原子的6-員芳香雜環(huán)。例子包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和噠嗪基，其中的每個可以任選地被甲基或甲氧基取代。
術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟、碘或氯，更優(yōu)選氯。
術(shù)語“任選取代的”是指基團可能或沒有進一步被一個或多個選自以下的基團所取代烷基、鏈烯基、炔基、芳基、醛、鹵素、鹵代烷基、鹵代鏈烯基、鹵代炔基、鹵代芳基、羥基、烷氧基、鏈烯氧基、芳氧基、芐氧基、鹵代烷氧基、鹵代鏈烯氧基、鹵代芳氧基、硝基、硝基烷基、硝基鏈烯基、硝基炔基、硝基芳基、硝基雜環(huán)基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯基氨基、炔基氨基、芳氨基、二芳基氨基、芐基氨基、二芐基氨基、酰基、鏈烯基?；?、炔基?；?、芳基?；?、酰胺基、二?；被?、酰氧基、烷基磺酰氧基、芳基亞磺酰氧基(arylsulphonyloxy)、雜環(huán)基、雜環(huán)氧基、雜環(huán)氨基、鹵代雜環(huán)基、烷基亞磺?；⒎蓟鶃喕酋；?、烷氧羰基(carboalkoxy)、芳氧羰基(carboaryloxy)、巰基、烷硫基、苯甲硫基、酰硫基、含磷基團等。優(yōu)選地，所述的任選取代基是C1-4烷基、羥基、氟、C1-4烷氧基或C1-4?；?br> 術(shù)語“保護基團”是指一種引入的官能團，其使特定的官能基團如羥基、氨基、羰基或羧基基團在選定的條件下不反應(yīng)并且可以之后被任選地除去來露出官能基團。羥基保護基團是可以暫時地使羥基基團的不反應(yīng)。羥基保護基團是指被羥基保護基團暫時地提供不反應(yīng)的羥基基團。被保護的苯基基團是其中所連接的反應(yīng)性的基團如OH、NH2被保護基團保護。合適的保護基團對于它們的結(jié)合和除去在本領(lǐng)域是已知的并且在ProtectiveGroups in Organic Synthesis第三版，T.W.Greene和P.G.White，John Wiley &Sons，Inc.，1999(其內(nèi)容在此通過引用被結(jié)合)中被描述?？梢杂脕肀Ｗo羥基基團的保護基團的例子包括但不限于甲硅烷基基團(如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)、芐基基團(如芐基、甲氧基芐基、硝基芐基)、烷基基團(如甲基、乙基、正丙基和異丙基和正丁基、仲丁基和叔丁基)和酰基基團(如乙?；捅郊柞；?。
離去基團可以是任何合適的已知的類型例如那些在J.March的“Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms and Structure”第四版，352-357頁，John Wiley & Sons，New York，1992中公開的，其內(nèi)容這里引入作為參考。優(yōu)選離去基團是鹵素。
在此使用的術(shù)語“金屬螯合劑”具有其最廣泛的含義并且是指具有兩個或多個能與金屬原子優(yōu)選Cu、Zn或Fe結(jié)合的供體原子的化合物，其中供體原子中的至少兩個能與該金屬原子同時結(jié)合，所得的金屬絡(luò)合物大于或等于金屬離子生物配體絡(luò)合物的熱力學(xué)穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，使用金屬螯合劑用于治療神經(jīng)障礙不同于先前已知的“螯合療法”的概念?！膀席煼ā笔且粋€與臨床上除去大量金屬有關(guān)的術(shù)語，例如在威爾遜病、β-地中海貧血和血色素沉著癥中。在這些疾病中，金屬體內(nèi)平衡的破壞被認(rèn)為是災(zāi)難性的事情，非常像引起大批問題的金屬涌入的潰壩。這些化合物的作用機理是大量金屬被螯合劑所螯合并通過排泄被清除。通過比較，與本發(fā)明神經(jīng)病癥有關(guān)的金屬體內(nèi)平衡破壞更像水龍頭的恒定滴漏，如果其保持足夠長的時間，在長時間內(nèi)最終將引起局部損傷。本發(fā)明的“金屬螯合劑”的目的是破壞異常金屬-蛋白質(zhì)的相互作用以獲得金屬的微妙再分配，以及隨后正?；慕饘俜植嫉哪康脑谟谝坏┒拘匝h(huán)是短循環(huán)的，內(nèi)源性清除過程可以更有效地處理累積的致淀粉狀蛋白。
式I化合物的鹽優(yōu)選是藥用可接受的，但是可以理解，非藥用可接受的鹽同樣屬于本發(fā)明的范圍，因為這些非藥用可接受的鹽在制備藥用可接受的鹽的過程中可以作為有用的中間體。藥用可接受的鹽的實例包括藥用可接受的陽離子例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨的鹽；藥用可接受的無機酸例如鹽酸、磷酸、硫酸、正磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸的酸加成鹽；或藥用可接受的有機酸例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來酸、羥基馬來酸、富馬酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、三鹵代甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹寧酸、抗壞血酸和戊酸的鹽。
此外，本發(fā)明的一些化合物可以與水或常見的有機溶劑形成溶劑合物。這些溶劑合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，衍生物是可藥用衍生物?！八幱每山邮艿难苌铩笔侵溉魏嗡幱每山邮艿柠}、水合物、酯、醚、酰胺、活性代謝物、類似物、殘基或沒有生物學(xué)上相反的不希望的作用并引起所需的藥理學(xué)和/或生理作用的任何其它化合物。
在此使用的術(shù)語“前藥”具有廣泛的含義并且包括在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為式I化合物的那些化合物。使用前藥策略優(yōu)化了藥物向其作用部位例如腦的輸送。一方面，所述術(shù)語是指C1-6烷基或芳基酯部分的存在被設(shè)計用來阻止前藥越過BBB前的水解，其中BBB內(nèi)表面上的酯酶對該酯進行水解并釋放出式I化合物的C8羥基。第二方面，所述的術(shù)語是指在2位附著抗氧化基團，特別是3，4，5-三甲氧基苯基部分或其衍生物。然后，將腦暴露于前氧化環(huán)境中將導(dǎo)致3，4，5-三甲氧基苯基的羥基化，得到2-羥基-3，4，5-三甲氧基苯基取代基，其中的羥基基團將增強式I化合物的螯合性質(zhì)。
在此使用的術(shù)語“抗氧化劑”具有其最廣泛的含義并且是指能夠與反應(yīng)性的氧類例如羥基基團以生成無毒性產(chǎn)物的方式反應(yīng)的基團。實例包括酚，例如3，4，5-三甲氧基苯基和3，5-二叔丁基-4-羥基苯基、吲哚胺例如褪黑激素和黃酮類。其它實例可以在下面的文獻(Wright，2001；Karbownik，2001；Gilgun-Sherki，2001)中找到。
在此使用的術(shù)語“互變異構(gòu)體”具有廣泛的含義并包括能夠以兩種異構(gòu)形式平衡態(tài)存在的式I的化合物。這些化合物可能在連接兩個原子或基團的鍵方面有差異以及化合物中這些原子或基團的位置上存在差異。
在此使用的術(shù)語“異構(gòu)體”具有廣泛的含義并包括結(jié)構(gòu)上的、幾何上的和立體的異構(gòu)體。由于式I的化合物可以具有一個或多個手性中心，因此它能夠以對映體的形式存在。
本發(fā)明的組合物包含至少一種式I的化合物以及一種或多種藥用可接受的載體以及任選其它的治療劑。每種載體、稀釋劑、佐劑和/或賦形劑必須是藥用“可接受的”，即與組合物的其它組分相容并且對給藥患者是無害的。組合物包括適合口服、直腸、鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮內(nèi))給藥的那些。該組合物可能方便地以單位劑型存在并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法進行制備。這些方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種助劑的載體混合在一起。通常，通過將活性成分與液體載體、稀釋劑、佐劑和/或賦形劑或精細(xì)粉碎的固體載體或兩者均勻和緊密地混合在一起，然后如果需要，對產(chǎn)品進行成形，這樣可以制得所述的組合物。
在此使用的術(shù)語“神經(jīng)病癥(neurologyicai condition)”具有廣泛的含義并且是指其中神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞類型產(chǎn)生變性和/或由于神經(jīng)變性疾病或損傷或暴露造成損傷的病癥。特別地，式I的化合物可以用于治療產(chǎn)生的病癥，其中由于外科手術(shù)、感染、暴露于毒性劑、腫瘤、營養(yǎng)缺乏或代謝失調(diào)所引起的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞受損。此外，式I的化合物可以用于治療神經(jīng)變性疾病的后遺癥，例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮性例索硬化癥、癲癇癥、藥物濫用或藥物成癮(酒精、可卡因、海洛因、苯丙胺等等)、脊髓障礙和/或損傷、營養(yǎng)不良或神經(jīng)視網(wǎng)膜退化(視網(wǎng)膜病)和外周神經(jīng)病，例如糖尿病性神經(jīng)病和/或由毒素引起的外周神經(jīng)病。
在此使用的術(shù)語“神經(jīng)變性疾病(neurodegenerative disorder)”是指神經(jīng)元完整性受到威脅的異常。當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出降低的存活率時或當(dāng)神經(jīng)元不再能傳播信號時，神經(jīng)元的完整性可能受到了威脅。
可以用本發(fā)明的化合物進行治療的神經(jīng)障礙包括急性間歇性血紫質(zhì)??；阿霉素引起的心肌?。籄IDS癡呆和HIV-1引起的神經(jīng)毒性；阿爾茨海默氏??；肌萎縮性側(cè)索硬化；動脈粥樣硬化；白內(nèi)障；腦缺血；腦性麻痹；大腦瘤；化療引起的器官損傷；順鉑所引起的腎毒性；冠狀動脈旁路術(shù)；克雅氏病及其與“瘋?！辈∮嘘P(guān)的新變體；糖尿病性神經(jīng)病變；唐氏綜合癥；淹溺；癲癇癥和外傷后癲癇；家族性遺傳性共濟失調(diào)；額顳性癡呆；青光眼；腎小球??；血色素沉著癥；血液透析；溶血；溶血性尿毒性綜合癥(外氏病)；出血性中風(fēng)；哈-斯氏?。恍呐K病發(fā)作和再灌注損傷；亨廷頓舞蹈??；盧伊體?。婚g歇性跛行；缺血性中風(fēng)；炎性腸??；黃斑變性；瘧疾；甲醇引起的中毒；腦膜炎(無菌的和結(jié)節(jié)狀的)；運動神經(jīng)元?。欢喟l(fā)性硬化；多系統(tǒng)萎縮癥；心肌局部缺血；腫瘤形成；帕金森氏??；圍產(chǎn)期窒息；皮克氏病；進行性核上性麻痹；放射療法引起的器官損傷；血管成形術(shù)后再狹窄；視網(wǎng)膜?。焕夏晷园V呆；精神分裂癥；膿毒癥；膿毒性休克；海綿狀腦病；subharrachnoid haemorrage/腦血管痙攣；硬膜下血腫；手術(shù)創(chuàng)傷，包括神經(jīng)外科；地中海貧血；短暫性缺血發(fā)作(TIA)；外傷性腦損傷(TBI)；外傷性脊椎傷損；移植；血管性癡；病毒性腦膜炎；以及病毒性腦炎。
此外，本發(fā)明的化合物還可以用來增強其它治療的作用，例如增強腦源性神經(jīng)生長因子的神經(jīng)保護作用。
本發(fā)明特別是涉及引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化性損傷的病癥，包括急性和慢性神經(jīng)障礙例如外傷性腦損傷、脊髓損傷、腦缺血、中風(fēng)(缺血性和出血性)、subharrachnoid haemorrage/腦血管痙攣、大腦瘤、阿爾茨海默氏病、克雅氏病及其與“瘋?！辈∮嘘P(guān)的新變體、亨廷頓舞蹈病、帕金森氏病、家族性遺傳性共濟失調(diào)、白內(nèi)障、盧伊體形成癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-斯氏病、彌漫性盧伊體疾病(diffuse Lewy body disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、運動神經(jīng)元病(motor neuron disease)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、致命性家族性失眠癥(fatal familial insomnia)、格-斯-斯氏病(Gertsmann StrausslerSheinker disease)和荷蘭型伴淀粉樣變-遺傳性腦出血(hereditary cerebralhacmorrhage with amyloidosis-Dutch type)。
更特別地，本發(fā)明涉及神經(jīng)變性淀粉樣變性病的治療。神經(jīng)變性淀粉樣變性病可以是其中神經(jīng)學(xué)損傷由淀粉狀蛋白沉積引起的任何病癥。淀粉狀蛋白可以由各種蛋白質(zhì)或多肽前體形成，包括，但不局限于Aβ、結(jié)瘢、亨廷頓或朊病毒蛋白。
因此，所述的病癥優(yōu)選選自偶發(fā)性或家族性阿爾茨海默氏病(sporadic orfamilial Alzheimer’s disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)、運動神經(jīng)元病、白內(nèi)障(cataract)、帕金森病、克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob)及其與”瘋牛”病有關(guān)的新變體、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease)、伴有盧伊體形成的癡呆(dementia with Lewy bodyformation)、多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy)、哈-斯氏病和彌散性盧伊體病。
更優(yōu)選地，所述的神經(jīng)變性淀粉樣變性病是與Aβ-有關(guān)的病癥，例如阿爾茨海默氏病或與唐綜合癥有關(guān)的癡呆或幾種類型的常染色體顯性形式的家族性阿爾茨海默氏病之一(在St George-Hyslop，2000中被評論)。最優(yōu)選地，與Aβ有關(guān)的病癥是阿爾茨海默氏病。
在本發(fā)明所有方面的特別優(yōu)選的實施方案中，在治療前，患者患有中等或嚴(yán)重受損的認(rèn)知功能，其由阿爾茨海默氏病評分(ADAS)-cog測定法進行評估，例如ADAS-cog值為25或更大。
除了減緩或阻止患者認(rèn)知下降外，本發(fā)明的方法和化合物還可以適于在治療或預(yù)防神經(jīng)變性病癥中使用，或者可以適于在減緩神經(jīng)變性病癥癥狀中使用。所述化合物能夠?qū)加姓J(rèn)知下降的患者提供至少部分逆轉(zhuǎn)。如果對已經(jīng)確認(rèn)具有趨向于患神經(jīng)變性病癥不斷增加風(fēng)險的患者給藥，或者對在臨床表現(xiàn)前表現(xiàn)出認(rèn)知下降的患者給藥，例如輕度認(rèn)知損傷或最小進行性認(rèn)知損傷，除減緩或降低認(rèn)知下降速度的作用外，這些方法和化合物能夠阻止或推遲臨床癥狀的發(fā)病。
目前，阿爾茨海默氏病以及其它癡呆通常不能被診斷，直到出現(xiàn)一種或多種警告癥狀為止。這些癥狀構(gòu)成被稱為輕度認(rèn)知缺損(MCI)的綜合癥，其最近由美國神經(jīng)學(xué)會(the American Academy of Neurology)定義，并且是指患有記憶缺陷的個體的臨床陳述，但是功能良好以及不滿足癡呆臨床標(biāo)準(zhǔn)的那些人除外(Petersen等人，2001)。MCI的癥狀包括(1)影響職業(yè)技能的記憶喪失(2)執(zhí)行熟悉任務(wù)時有困難(3)語言有問題(4)對時間和地點迷惑(迷失)(5)糟糕的或降低的判斷力(6)抽象思維有問題(7)錯放東西(8)情緒或行為的改變(9)個性改變(10)不主動MCI可以使用常規(guī)認(rèn)知篩選試驗法進行測定，例如小型精神狀態(tài)測驗法、記憶缺陷篩選法和神經(jīng)心理學(xué)篩選試驗法。
在此使用的術(shù)語“患者(受試者)”是指具有需要用藥物活性劑進行治療的疾病或病癥的任何動物。所述的患者可以是哺乳動物，優(yōu)選是人，或者可以是家畜或伙伴動物。雖然本發(fā)明的化合物特別考慮用于人的治療，但是也適于獸醫(yī)治療，包括對伙伴動物例如狗和貓，家畜例如馬、矮馬、驢、騾、駱駝、羊駝、豬、牛和羊，或動物園動物例如靈長類、貓科、犬科、牛族和有蹄動物進行治療。
合適的哺乳動物包括靈長目、嚙齒目、兔形目、鯨目、食肉目、奇蹄目和偶蹄目。由于奇蹄目和偶蹄目具有相似的生物學(xué)和重要的經(jīng)濟價值，因此奇蹄目和偶蹄目是特別優(yōu)選的。
例如，偶蹄目包括約150種分布在九個科的活物種豬(豬科)、野豬(Tayassuidae)、河馬(河馬科)、駱駝(駱駝科)、麝香鹿(Tragulidae)、長頸鹿和okapi(長頸鹿科)、鹿(鹿科)、叉角羚(叉角羚科)和牛、羊、山羊和羚羊(?？?。這些動物中的許多在各個國家被用于喂養(yǎng)。更重要地，許多具有重要經(jīng)濟價值的動物例如山羊、綿羊、牛和豬具有非常相似的生物學(xué)并且享有高度的基因組同源性。
奇蹄目包括馬和驢，這兩種動物都具有重要的經(jīng)濟價值并且是密切相關(guān)的。的確，馬和驢進行雜種繁殖是公知的。
如在此使用的，術(shù)語“治療有效量”是指為了有效地獲得所需的治療反應(yīng)例如為了治療、改善或預(yù)防神經(jīng)病癥，所需的本發(fā)明化合物的數(shù)量。
顯然，具體的“治療有效量”將隨這些因素而改變，例如待治療的具體病癥、患者的身體狀況、待治療患者的類型、治療的持續(xù)時間、聯(lián)合治療的性質(zhì)(如果有的話)以及所使用的具體制劑和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。
此外，本發(fā)明的化合物可以與其他的藥物一起提供有效的組合?？梢园ㄋ幬锘钚詣┑娜魏位瘜W(xué)上相容的組合，只要該組合沒有消除式I或II化合物的活性就可以。應(yīng)當(dāng)意識到，本發(fā)明的化合物和其他的藥物可以分開給藥、依次給藥或同時給藥。
其他的藥物可以包括，例如，其中所述病癥是與β-淀粉狀蛋白有關(guān)的病癥，特別是阿爾茨海默氏病，乙酰膽堿酯酶活性部位的抑制劑，例如phenserine、加蘭他敏(galantamine)或他克林(tacrine)；抗氧化劑，例如維生素E或維生素C；消炎藥例如氟比洛芬或布洛芬，任選改性以釋放氧化一氮(例如NCX-2216，由NicOx生產(chǎn))，或雌激素藥例如17-β-雌二醇。
用于制備藥物組合物的方法和藥物載體在本領(lǐng)域中是公知的，如在教科書例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，Williams &Wilkins，Pennsylvania，USA中所述的。
如在此使用的，“藥物載體”是藥用可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑，用于將式I的化合物給予所述的患者。所述的載體可以是液體或固體并且根據(jù)所考慮的給藥方式進行選擇。每種載體必須是藥用“可接受的”，即與組合物的其它組分相容并且對患者是無害的。
式I的化合物可以口服、局部或胃腸外以含常規(guī)的無毒藥用可接受的載體、佐劑和賦形劑的劑量單位制劑形式給藥。如在此使用的，術(shù)語腸胃外包括皮下注射、給予肺或鼻腔的氣溶膠、靜脈、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、注射或輸液方法。
本發(fā)明還提供合適的局部、口服和腸胃外藥物制劑，供本發(fā)明新的治療方法中使用。本發(fā)明的化合物可以以片劑、含水或含油懸浮液、糖錠、錠劑、粉劑、粒劑、乳劑、膠囊、糖漿劑或酏劑的形式口服給藥?？诜M合物可以含有一種或多種選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以便制備藥用精致的和可口的制劑。合適的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、黃原膠、膨潤土、褐藻酸或瓊脂。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、甜橙或覆盆子調(diào)味劑。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α生育酚、抗壞血酸、羥苯甲酸甲醋、對羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石粉。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述的片劑含有與無毒藥用可接受的適合于制備片劑的賦形劑混合的活性成分。
這些賦形劑例如可以是，(1)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；(2)造粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或褐藻酸；(3)粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及(4)潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。這些片劑可以是未包衣的或者用已知技術(shù)進行包衣以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，并因此在較長時間內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，可以使用延時材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。還可以使用在美國專利4,256,108；4,160,452和4,265,874中所述的技術(shù)進行包衣，以形成用于控制釋放的滲透性治療片劑。
對于體內(nèi)應(yīng)用來說，式I的化合物以及在本發(fā)明中使用的藥學(xué)活性劑可以通過胃腸外注射給藥或通過隨時間獨立地或一起逐漸灌注給藥。給藥可以是靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、經(jīng)皮或例如通過滲透泵輸注。對于體外研究來說，可以將藥劑加入或溶于一種合適的生物學(xué)上可接受的緩沖液中，然后將其加入到細(xì)胞或組織中。
腸胃外給藥制劑包括無菌水或非水溶液、懸浮液以及乳濁液。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、以及可注射有機酯例如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液、乳濁液或懸浮液，包括鹽水和緩沖培養(yǎng)基。腸胃外賦形劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營養(yǎng)素補充劑、電解質(zhì)補充劑(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。還可能存在防腐劑以及其它添加劑，例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、生長因子和惰性氣體等等。
一般地，在此使用的術(shù)語“治療”是指作用于患者、組織或細(xì)胞，以獲得一種所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)作用。該作用可以是預(yù)防性的，用來完全或部分預(yù)防一種疾病或其病征或癥狀，和/或可以是治療性的，用來部分或完成治療一種疾病。如在此所使用的“治療”包括對脊椎動物、哺乳動物特別是人的疾病進行任何治療或預(yù)防，并且包括(a)預(yù)防易感染疾病但還沒有被診斷患有該疾病的患者發(fā)生該疾??；(b)抑制該疾病，即阻止它的發(fā)展；或(c)減輕或改善該疾病的影響，即引起該疾病影響的衰退。
本發(fā)明包括各種用于改善疾病的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明一種實施方案的藥物組合物通過使用載體、賦形劑和添加劑或助劑，將式I的化合物或其類似物、衍生物或鹽，或者將式I化合物與一種或多種藥學(xué)活性劑的混合物制備成適合患者給藥的形式。通常使用的載體或助劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露糖醇以及其它糖、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動植物油、聚乙二醇及溶劑例如無菌水、醇、甘油和多元醇。靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營養(yǎng)素補充劑。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其它藥用可接受的載體包括如Remington’sPharmaceutical Sciences，第2版Williams和Wilkins(2000)和The BritishNational Formulary第43版(British Medical Association and RoyalPharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)中所述的水溶液，無毒賦形劑，包括鹽，防腐劑，緩沖液等等，其內(nèi)容在此整個引入作為參考。藥物組合物的pH值和各組分的準(zhǔn)確濃度根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行調(diào)節(jié)。參見Goodman和Gilman的The PhamacologicalBasis for Therapeutics(第7版，1985)。
優(yōu)選以劑量單位的形式制備和給予所述的藥物組合物。固體劑量單位可以是片劑、膠囊和栓劑。對于患者的治療，根據(jù)化合物的活性、給藥方式、疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及患者的年齡和體重，可以使用不同的日劑量。但是，在某些情況下，更高或更低的日劑量也許是合適的。日劑量的給藥可以通過兩種方式進行以單個劑量單位的形式單一給藥，或者在特定時間間隔給予若干較小劑量單位和多次給予分劑量。
可以以治療有效劑量局部或全身給予本發(fā)明的藥物組合物。當(dāng)然，有效劑量將取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者的體重和一般情況。典型地，體外用劑量可以給藥物組合物的原位給藥用量提供有用的指導(dǎo)，并且可以使用動物模型來確定治療細(xì)胞毒性副作用的有效劑量。各種考慮事項例如描述在Langer，Science，2491527，(1990)中?？诜苿┛梢砸杂材z囊的形式使用，其中活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合在一起。它們還可以以軟膠囊的形式使用，其中活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合在一起。
水混懸液通常含有與適于制備水混懸液的賦形劑混合在一起的活性物質(zhì)。這些賦形劑可以是(1)懸浮劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠；(2)分散劑或潤濕劑其可以是(a)天然存在的磷脂例如卵磷脂；(b)環(huán)氧烷與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如十七乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethylenoxycetanol)；(d)環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇的偏酯形成的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或(e)環(huán)氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇酸酐形成的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。
所述的藥物組合物可以以無菌可注射含水懸浮液或含油懸浮液的形式存在?？梢愿鶕?jù)已知的方法使用合適的分散劑或潤濕劑以及上述懸浮劑配制這種懸浮液。無菌可注射制劑還可以是在無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的賦形劑和溶劑當(dāng)中，可以使用的是水、林格溶液以及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌固定油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用任何溫和的固定油包括合成的甘油一酯和甘油二酯。此外，可以在可注射的制劑中使用脂肪酸例如油酸。
式I化合物還可以以脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)(liposome delivey systems)的形式給予，例如小型單層水泡(vesicles)、大型單層水泡和多層水泡。脂質(zhì)體可以由各種磷脂制備，例如膽固醇、硬脂酰胺或卵磷脂。
式I的化合物還可以作為獸用組合物使用，獸用組合物例如可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法進行制備。這些獸用組合物的例子包括(a)口服給藥，外用，例如灌服(例如水溶液或非水溶液或懸浮液)；片劑或丸劑；粉劑、粒劑或與飼料摻合在一起的小藥丸；用于舌頭的糊劑；
(b)腸胃外給藥例如以無菌溶液或懸浮液的形式進行皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射；或者(合適時)通過乳房內(nèi)注射，其中通過乳頭將懸浮液或溶液引入到乳房中。
(c)局部施用，例如以乳劑、膏劑或噴霧劑的形式施加到皮膚上；或者(d)陰道內(nèi)，例如以陰道栓劑、乳劑或泡沫的形式施用。
本發(fā)明式I化合物的劑量水平為約0.5mg到約20mg每公斤體重的數(shù)量級，優(yōu)選的劑量范圍在約0.5mg到約10mg每公斤體重每天之間(約0.5gms到約3gms每位患者每天)?？梢耘c賦形劑或載體材料混合制備單一劑型的活性成分的數(shù)量將隨所治療的主體和具體的給藥方式而改變。例如，人口服制劑可以含有約5mg到1g的活性化合物以及合適和方便數(shù)量的載體物質(zhì)，其中載體物質(zhì)可以占總組合物的約5-95％。劑量單位形式通常含有約5mg到500mg的活性成分。
任選地，本發(fā)明的化合物以分劑量給藥方案給予，這樣在整個給藥方案中至少存在兩次給藥。給藥優(yōu)選至少每兩小時多至每四小時或更長時間給予；例如可以每一小時或每半小時給予化合物。在一種優(yōu)選實施方案中，分劑量給藥方案包括在第一次給藥后足夠長的時間間隔后(第一次給藥后血液中活性化合物的濃度降為高峰時的約5-30％)第二次給予本發(fā)明的化合物，這樣在血液中保持有效劑的有效含量。任選地，在前次給藥的相應(yīng)時間間隔后，進行一次或多次給藥，優(yōu)選當(dāng)血漿濃度降至峰值的約l0-50％時再次給藥。
然而，可以理解，任何特定患者的特定劑量水平將取決于各種因素包括所使用具體化合物的活性、患者的年齡、體重、一般健康、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度、藥物聯(lián)用以及所治療具體疾病的嚴(yán)重程度。
實施例將只通過參考下面的非限制性實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述。
為了清楚，本發(fā)明的化合物將利用數(shù)字表示，例如1-4和2-3。所參考的實施例化合物的結(jié)構(gòu)在表1-10中給出。
在例1-6中，參考下列條目1、Dondoni，A.等，Synthesis，1996，641和1987，998。
2、Goldstein，H.和Schaaf，E.，Helv.Chim.Acta，1957，57(23)，132.
3、March，J.在“Advanced Organic Chemistry，reactions，mechanismsand structure”，第三版，John Wiley & Sons，1985，601頁和其參考文獻；對于更具體的反應(yīng)條件，參見實施例Giencke，A.和Lackner，H.Liebigs Ann.Chem.，1990，569；Brown，L.L.等，J.Med.Chem.，2002，45，2841；Koch，V.和Schnatterer，S.Synthesis，1990，499；4、Linderberg，M.等，Eur.J.Med.Chem.，1999，34，729。
5、T.W.Greene和P.G.M.Wuts(Eds)在“Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley & Sons，U.S.A.(1999)。
6、Follope，M.P.等，Eur.J.Med.Chem.，1992，27，291；Giencke，A.等，Liebigs Ann.Chem.，1990，569。
7、Bavetsias，V.等，J.Med.Chem.，2002，45，3692。
總的實驗詳述從Aldrich購買2，4-二氯代苯甲酸(1-1)和2，4-二氯-6-硝基苯酚(2-1B)。除非另外說明，所有的試劑/反應(yīng)物都來源于Aldrich。從Lancaster購買4-氨基-1，3，5-三甲基吡唑、2-氨基-4，6-二羥基嘧啶、4-氯甲基-3，5-二甲基異噁唑和2-氯-4-甲基噻唑鹽酸鹽。根據(jù)文獻1制備(2-氨基甲基)噻唑。溶劑是分析純等級并且按照供應(yīng)的使用。在氬氣下從鈉和二苯甲酮中蒸餾THF。除非另外說明，在Varian Inova 400分光計上記錄1H NMR光譜(δ，相對于TMS)；以赫茲給出H-值。在Micromass Quattro II質(zhì)譜儀上記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
在方案1A中顯示了4，6-二氯-3-羥基-2-硝基苯甲酸(1-6)的實際的和簡要的合成，其中的4，6-二氯-3-羥基-2-硝基苯甲酸(1-6)是用于制備一系列8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮的關(guān)鍵中間體，并且特別地用于合成5，7-二氯-取代的衍生物。因此，根據(jù)Goldstein和Schaaf2，方案1A 將市售的2，4-二氯代苯甲酸(1-1)硝化來得到2，4-二氯-5-硝基苯甲酸(1-2)。將化合物1-2經(jīng)過胺1-3和乙酰胺1-4轉(zhuǎn)化為3-乙酰胺基-4，6-二氯-2-硝基苯甲酸(1-5)。在用酸處理之后，接著堿水解1-5得到2-硝基苯甲酸1-6。所有的步驟以高產(chǎn)率(大約90％)進行并且可以被修改來大規(guī)模地進行?？梢愿鶕?jù)在方案1B中顯示的路線制備化合物1-6。于是，通過標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)的條件3重氮化1-3來得到醇1-7。然后根據(jù)之前在文獻4中所描述的條件硝化化合物1-7來得到1-6。在制備1-6的方案1A和1B中所顯示的合成路線代表了對文獻4方法的改進，其中所顯示的全部步驟得到很好的產(chǎn)率。用鐵粉在HOAc中在80℃將1-6還原45-50分鐘，在標(biāo)準(zhǔn)處理之后，以94％的產(chǎn)率得到相應(yīng)的胺1-8。值得注意的是通過催化氫化4還原1-5來以僅僅14％的產(chǎn)率得到胺1-8。
方案1B 根據(jù)在方案2A中用圖所顯示的路線合成一些新的本發(fā)明的8-羥基-3N-取代的喹啉-4-酮。
方案2A 在方法A(方案2A)中，可以通過2-1或2-2和2-3將2-硝基苯甲酸1-6首先轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸2-4。
在方案2B中顯示了用標(biāo)準(zhǔn)方法6合成2-4的另一種方法。于是根據(jù)在之前所描述的從1-6合成2-2的條件用硫酸二甲酯處理2，4-二氯-6-硝基苯甲酸(2-1B)得到2-2B。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，一般地用氯化錫(II)或鐵粉和冰乙酸/鹽酸，還原硝基化合物2-2B來得到鄰甲氧基苯胺2-3B。在羥基胺鹽酸鹽的存在下用水合氯醛處理鄰甲氧基苯胺2-3B，接著通過酸水解得到吲哚滿二酮中間體2-4B。然后在堿性條件下用過氧化氫處理2-4B來得到鄰氨基苯甲酸2-4。
方案2B 在高溫下一般地在150℃下用甲酰胺處理2-4來得到3H-喹唑啉-4-酮2-5。然后將化合物2-5與合適的烷基鹵化物在堿如碳酸鉀的存在下反應(yīng)來得到2-6?？梢杂迷诜椒–中的烷基鹵化物的例子包括但不限于2-(氯甲基)吡啶、(氯甲基)環(huán)丙烷、1-(2-氯乙基)吡咯烷、2-(2-氯乙基)-1-甲基吡咯烷、4-(2-氯乙基)嗎啉、2-氯甲基-4-甲基噻唑鹽酸鹽、2，6-二(氯甲基)吡啶、2-溴代丙烷、1-氯代丙烷、1-氯-2-甲基丙烷、2-氯乙基乙基醚、(2-二乙基氨基)乙基氯鹽酸鹽、1-氯代丁烷、2-氯代丁烷、巴豆基氯和4-氯甲基-3，5-二甲基異噁唑。將結(jié)果作成表格(表1)。接著合適地用三溴化硼或用溴化氫的水溶液在升高的溫度下從2-6中除脫保護基團來得到相應(yīng)的3-N-(取代的)-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮2-7。在乙醚衍生物2-6M的情況時，得到醇2-7M1的氫溴酸鹽(表2)。用溴化氫的水溶液處理烯2-6P使烯雙鍵氫溴化同時除去甲氧基保護基團來得到化合物2-7P1。
在方法B和C(方案2A)中，可以用乙酸甲酸酐處理鄰氨基苯甲酸1-8來得到甲酰胺基化合物2-8或苯并[d][1，3]惡嗪-4-酮2-9。然后在縮合劑如三氯化磷或原甲酸三乙基酯的存在下在升高的溫度下將化合物2-8(或2-9)與合適的胺反應(yīng)，一般地用甲苯或二甲苯在接近回流的溫度來得到8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮2-7?？梢杂糜诜椒˙和C中的胺的例子包括但不限于2-氨基-5-甲基噻唑、2-(2-氨基乙基)吡啶、3-氨基吡啶、4-氨基嗎啉、1-氨基-4-甲基哌嗪、1-氨基吡咯烷、4-(氨基甲基)哌啶、1-氨基哌嗪、5-氨基-1-乙基吡唑、5-氨基-2-甲氧基吡啶、4-氨基-1，3，5-三甲基吡唑、2-氨基-1-甲基苯甲酰胺、2-氨基-5-甲基吡啶、2-氨基-5-氯吡啶和4-氨基哌啶。將結(jié)果作成表(表3)。在表4中所顯示了可以根據(jù)這些方法制備的其他8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮。
在方法D(方案2A)中，可以在活化劑如CDI的存在下首先用合適的胺處理2-硝基苯甲酸1-6來得到合適的N-(取代的)苯甲酰胺2-10。接著還原硝基基團和偶合得到的胺2-11，一般地用甲酸在縮合劑如CDI或原甲酸三乙基酯的存在下或用甲酰胺來得到相應(yīng)的3-N-取代的衍生物2-7。
可以用被合適地O-保護的鄰氨基苯甲酸如2-4(方案3)來重復(fù)方案B和C(方案2A)。在這些情況中，除去O-保護的基團之后得到8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮2-7。
方案3 可以根據(jù)在方案4中所描述的路線制備2-取代的8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮。因此，根據(jù)方法E，用活化劑如亞硫酰氯處理鄰氨基苯甲酸1-6并且接著將中間體酰氯與氨水反應(yīng)來得到相應(yīng)的苯甲酰胺4-1。一般地用SnCl2或鐵粉/HOAc還原硝基化合物4-1，來得到相應(yīng)的胺4-2。可以依次將胺4-2用氯代乙?；宜峄?-氯-1，1，1-三甲氧基乙烷處理來得到5，7-二氯-2-氯甲基-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮(4-3A)?？梢酝ㄟ^方法F從甲氧基鄰氨基苯甲酸衍生物2-4制備2-氯甲基化合物。于是，在堿一般地為甲醇鈉的存在下用氯代乙腈處理72-4來得到4-3B。用一些胺對2-氯甲基衍生物4-3A(或4-3B)進行進一步的制備來得到許多新的2-取代的衍生物4-14A-4-16D，這些胺如，但不限于，二甲基胺、甲胺和乙胺。
可以根據(jù)如在方案4中所顯示的方法G通過酸2-1制備許多2，3-二取代的8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮4-9。因此，可以在活化劑的存在下用合適的胺處理2-1來得到相應(yīng)的苯甲酰胺4-5，然后一般地用SnCl2或鐵粉/HOAc將這些苯甲酰胺4-5還原為4-6。然后將化合物4-6轉(zhuǎn)化為2-氯甲基衍生物4-7，并且依次用類似于之前在方法E和F中所描述的反應(yīng)條件將其轉(zhuǎn)化為4-8。在脫保護之后，一般地在接近回流的溫度使用HBr的水溶液，4-8提供相應(yīng)的2，3-二取代的衍生物4-9。
也可以通過方法H和I(方案4)得到2，3-二取代的8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮4-9。在方法H中，可以用含NP的?；瘎┤?-疊氮乙酰氯、鄰苯二甲酰-氨基乙酰氯和[(苯基甲基)氨基]乙酰氯將鄰氨基苯甲酸1-8合適地酰化。相應(yīng)地，含NP基團的例子是疊氮、鄰苯二甲酰亞氨基和芐胺。接著在乙酸酐的存在下在升高的溫度下，一般地在接近回流溫度下縮合中間體4-10來提供苯并[d][1，3]惡嗪-4-酮4-11。在合適的胺(R1NH2)的存在下，4-11得到4-12；4-12依次通過縮合得到4-13。合適的縮合劑包括PCl3、原甲酸三乙基酯、CDI和Ac2O。將-NP部分轉(zhuǎn)化為氨基基團的條件將取決于特定的NP基團；對于上述的基團，它們分別是還原、二乙胺和催化氫解(可以在其他地方發(fā)現(xiàn)后面兩種轉(zhuǎn)化的條件的更多例子5)。在方法I中，用合適的胺(NR1R2)縮合鄰氨基苯甲酸1-8來得到胺4-14。隨后用氯代乙酰氯和胺依次地處理4-14來得到4-9。
方法4 根據(jù)在方案5中所顯示的路線制備3-氨基-5，7-二氯-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮(5-4)和一些3-(取代的)氨基-3H-喹唑啉-4-酮。N-甲酰化甲酯2-3來得到5-1，一般地用乙酸甲酸酐。另外地，用原酸酯如原甲酸三乙基酯處理2-3來得到亞胺酸酯5-2。當(dāng)用肼處理時，5-1或5-2得到3-氨基-3H-喹唑啉-4-酮5-3。一般地用HBr的水溶液在120℃除去在5-3中的保護基團來得到5-4。用合適的酰鹵進一步處理3-氨基化合物5-4來得到相應(yīng)的3-取代的酰化衍生物5-5A-5-5C。在脫保護之后，可以從5-2通過用合適地被取代的肼如4-氟代苯基肼、4-甲氧基苯基肼或2，4-二氟代苯基肼替代水合肼來得到衍生物如5-7A-5-7C。在脫保護之后，在一般地為乙醇的合適的溶劑中，用烷基鹵化物從5-3得到化合物5-7D-5-7G。另外地，也可以通過用合適的烷基化的肼如乙基肼、丙基肼和(環(huán)丙基)甲基肼處理5-2來制備化合物5-7D-5-7G。
方案5 通過用烷基鹵化物或酰化劑處理可以將胺2-7F2、2-7Q2、2-7R2、2-7X2和2-7X2制備成一系列衍生物如6-1-6-6。將6-1-6-6的數(shù)據(jù)制成表(表9)。
根據(jù)在方案6中所顯示的方法可以從相應(yīng)的3H-喹唑啉-4-酮2-6制備許多3-取代的3H-喹唑啉-4-酮7-2。于是用P4S10或Lawesson試劑處理2-6來得到硫酮7-1。接著合適地用BBr3除脫保護基團來得到所需要的3-取代的3H-喹唑啉-4-硫酮7-2。
方案6 將氯化錫(II)水合物(50克，0.29摩爾)加入到2，4-二氯-5硝基苯甲酸(1-2)2(10.0克，0.45摩爾)的EtOH(200毫升)的溶液中。在70℃攪拌混合物0.5小時，冷卻并且傾倒入冰中。將混合物的pH調(diào)至8(飽和的碳酸氫鈉)。在室溫下將懸浮液攪拌5小時并且再酸化至pH5(冰醋酸)。用乙酸乙酯依次地地萃取得到的白色懸浮液，合并萃取物，用鹽水洗滌，干燥并且濃縮來得到所需要的乳白色固體的胺(1-3)(8.8克，96％)。
5-氨基-2，4-二氯苯甲酸(1-3)1H NMR(CD3OD)δ7.30(s，1H)，7.27(s，1H)。
將乙酸酐(27毫升)加入到在冰醋酸(150毫升)中的5-氨基-2，4-二氯苯甲酸(1-3)中(8.0克，0.041毫升)。在室溫下保持?jǐn)嚢枞芤?.5小時并且濃縮來得到所需要的白色固體的乙酰胺(1-4)(9.6克，96％)。
5-乙酰氨基-2，4-二氯苯甲酸(1-4)1H NMR(CD3OD)δ8.32(s，1H)，7.62(s，1H)，2.19(s，3H)。
將5-乙酰氨基-2，4-二氯苯甲酸(1-4)(9.6克，0.039毫升)以少量在30分鐘內(nèi)加入到攪拌的冰冷的發(fā)煙硝酸(1.8毫升，0.043摩爾)和濃硫酸(120毫升)的溶液中。在加入完成之后，在30分鐘和60分鐘間隔時，加入更多的發(fā)煙硝酸(17毫升)和濃硫酸(80毫升)。然后將反應(yīng)混合物在0℃再保持?jǐn)嚢?.5小時，使其加熱到12-16℃并且在這個溫度下保持?jǐn)嚢柚钡胶谋M所有的原料(大約3小時)。將溶液傾倒入冰中并且用乙酸乙酯萃取(3x)。合并有機萃取物，用鹽水洗滌，干燥并且濃縮來得到橙色固體的3-乙酰氨基-4，6-二氯-2-硝基苯甲酸(1-5)(9.8克，86％)。
3-乙酰氨基-4，6-二氯-2-硝基苯甲酸(1-5)1HNMR(CD3OD)δ8.01(s，1H)，2.13(s，3H)。
將3-乙酰氨基-4，6-二氯-2-硝基苯甲酸(1-5)(9.7克，0.033摩爾)加入到KOH(18.7克，0.034摩爾)的水溶液中(85毫升)。將溶液在回流下加熱18小時并且冷卻至室溫。加入濃HCl將pH調(diào)節(jié)至0。用乙酸乙酯和水稀釋混合物并且在室溫下保持?jǐn)嚢?0分鐘。分層；用乙酸乙酯萃取水層(3x)，將萃取物與原有機層合并，用鹽水洗滌，干燥并且濃縮來得到暗紅色固體的4，6-二氯-3-羥基-2-硝基苯甲酸(1-6)(7.4克，89％)；m.p.188-189℃(文獻4m.p.186℃(分解))。
4，6-二氯-3-羥基-2-硝基苯甲酸(1-6)1HNMR(CD3OD)δ7.79(s，1H)；質(zhì)譜m/z250，252，254(M+-1，100％，66％，11％)。
5，7-二氯-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(2-5)的制備 將硫酸二甲酯(40毫升)加入到正在攪拌的1-6(15.0克，0.059摩爾)、碳酸鉀(66克，0.5摩爾)和DMF(300毫升)的混合物中。將得到的混合物在60℃保持?jǐn)嚢柽^夜并且然后在120℃攪拌2小時。真空濃縮反應(yīng)混合物。將得到的微紅棕色的殘余物用水洗滌并且干燥。得到橙色固體的2-2(14.6克，88％)。-1HNMR(CDCl3)δ7.65(s，1H)，4.01(s，3H)，3.92(s，3H)。
將鐵粉(18.2克，0.33摩爾)加入到2-2(13.3克，0.048摩爾)在乙酸(120毫升)中的溶液中。在55℃攪拌混合物1.5小時并且然后趁熱通過硅藻土(乙酸乙酯)過濾。濃縮濾液，加入乙酸乙酯和飽和的碳酸鈉，并且過濾混合物(硅藻土)。分離有機層，用水洗滌，干燥(K2CO3)并且濃縮來得到乳白色固體的2-3(11.6克，97％)。-1HNMR(CDCl3)δ6.71(s，1H)，3.89(s，3H)，3.79(s，3H)。
向正在攪拌的2-3(11.5克，0.046摩爾)在甲醇(250毫升)和水(70毫升)中的溶液中加入2M NaOH(25毫升)。將反應(yīng)混合物在回流下加熱1小時，再加入2M NaOH(25毫升)，并且將反應(yīng)混合物在回流下再加熱1小時。冷卻溶液并且濃縮來除去甲醇。將濃縮物溶解在水中，用乙酸乙酯萃取，并且將pH調(diào)節(jié)至1-2(濃HCl)。用乙酸乙酯萃取乳白色的懸浮液(3x)。將合并的萃取物用鹽水清洗、干燥并且濃縮來得到淺棕色固體的2-4(10.4克，95％)。-1H NMR(CD3OD)δ6.70(s，1H)，3.80(s，3H)。
在150℃加熱正在攪拌的2-4(16.9克，0.072摩爾)和甲酰胺(150毫升)的懸浮液8小時并且然后將其冷卻至室溫。加入水，通過過濾分離得到的沉淀，用水清洗并且真空干燥來得到淺棕色固體的2-5(13.0克，73％)。-1HNMR(CD3OD)δ8.08(s，1H)，7.60(s，1H)，3.98(s，3H)。
實施例1-通過將5，7-二氯-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(2-5)烷基化并且然后脫保護來制備化合物2-7A2-2-7R2 將正在攪拌的2-5(1.5克，6.1毫摩爾)和氯化物(7.3毫摩爾)在無水DMF(30毫升)中的溶液中加入K2CO3(9.3毫摩爾)并且將得到的混合物在95℃加熱16小時，冷卻并且濃縮。用乙酸乙酯或二氯甲烷(3x)萃取殘余物，合并萃取物并且用水和鹽水依次地地清洗，并且干燥。接著通過用合適的溶劑研磨、重結(jié)晶或SiO2-硅膠色譜純化來得到相應(yīng)的3-取代-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(2-6)。
所用的氯化物的例子1-(2-氯乙基)吡咯烷得到2-6A、2-(氯甲基)環(huán)丙烷得到2-6B、2-(2-氯乙基)-1-甲基吡咯烷得到2-6C、2-(氯甲基)吡啶得到2-6D、4-(2-氯乙基)嗎啉得到2-6E、2-氯甲基-4-甲基噻唑鹽酸鹽得到2-6F、4-氯甲基-3，5-二甲基異噁唑得到2-6G、2-溴代丙烷得到2-6H、1-氯代丙烷得到2-6I、1-氯-2-甲基丙烷得到2-6J、1-氯代丁烷得到2-6K、2-氯代丁烷得到2-6L、2-氯乙基乙基醚得到2-6M、(2-二乙基氨基)乙基氯鹽酸鹽得到2-6N、2-氯甲基-3-甲基吡啶鹽酸鹽得到2-6O、巴豆基氯得到2-6P、2，6-二(氯甲基)吡啶得到2-6Q和1-氯代乙烷得到2-6R。在1-(2-氯乙基)吡咯烷鹽酸鹽、2-氯甲基-3-甲基吡啶鹽酸鹽和2-氯甲基-4-甲基噻唑的鹽酸鹽的情況中，使用2.2當(dāng)量的K2CO3。
2-(氯甲基)-3-甲基吡啶鹽酸鹽的制備在0℃向正在攪拌的2，3-二甲基吡啶(5.00克，46.7毫摩爾)在氯仿(100毫升)中的溶液中在5分鐘內(nèi)分部分地加入m-氯過苯甲酸(12.0克至多77％的試劑)。將反應(yīng)混合物在0℃再攪拌30分鐘并且然后將其加熱到室溫。在16小時之后，將反應(yīng)混合物濃縮至干，加入水(20毫升)并且將混合物的pH調(diào)節(jié)至8(飽和的NaHCO3)。濃縮混合物并且用二氯甲烷/甲醇(4∶1)萃取殘余物。將萃取物濃縮為白色固體。然后柱純化(SiO2；二氯甲烷/甲醇，9∶1)來得到白色固體的2，3-二甲基吡啶-N-氧化物(4.80克，83％)。
將攪拌的2，3-二甲基吡啶-N-氧化物(4.80克，39.0毫摩爾)在乙酸酐(50毫升)中的溶液在回流下加熱過夜，冷卻并且濃縮至干來得到棕色油狀的(2-乙酸基甲基)-3-甲基吡啶(6.34克)。在室溫下攪拌粗品的(2-乙酸基甲基)-3-甲基吡啶和K2CO3(10.0克，72.4毫摩爾)、甲醇(60毫升)和水(30毫升)的混合物過夜。將固體過濾掉并且將濾液濃縮至干。在柱色譜(SiO2；二氯甲烷/甲醇，9∶1)純化之后，得到淺棕色油狀的(2-羥基甲基)-3-甲基吡啶(2.86克，2步總為59％)。
(2-羥基甲基)-3-甲基吡啶1H NMR(CDCl3)δ8.41(d，J＝4.9，1H)，7.48(d，J＝7.5，1H)，7.16(dd，J＝4.9和7.5，1H)，4.69(s，2H)，4.00(br，1H)，2.22(s，3H)。
在10分鐘內(nèi)向冰冷的(2-羥基甲基)-3-甲基吡啶(1.00克，8.1毫摩爾)在二氯甲烷(30毫升)中的溶液中逐滴地加入亞硫酰氯(2.5毫升)在二氯甲烷(6毫升)中的溶液。除去冰浴，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時，濃縮，并且然后用乙醚清洗。得到淺黃色固體的(2-氯甲基)-3-甲基吡啶鹽酸鹽(1.44克，99％)。
(2-氯甲基)-3-甲基吡啶鹽酸鹽1H NMR(CD3OD)δ8.72(d，J＝5.9，1H)，8.54(d，J＝8.1，1H)，8.00(dd，J＝5.9和8.1，1H)，5.05(s，2H)，2.64(s，3H)。
所制備的化合物2-6A-2-6R的產(chǎn)率和色譜數(shù)據(jù)列在表1中。
脫保護方琺A向正在攪拌的8-甲氧基衍生物2-6(1.9克，5.6毫摩爾)在二氯甲烷(15毫升)中的冰冷的溶液中加入BBr3(12毫升1M的二氯甲烷溶液，12毫摩爾)。然后在45℃攪拌溶液18小時，冷卻，并且加入甲醇(20毫升)。濃縮混合物。通過重復(fù)地加入甲醇和蒸發(fā)來除去過量的硼化物。用乙醚清洗(3x)粗產(chǎn)品氫溴酸鹽。分離一些作為游離堿的化合物于是加入飽和的Na2CO3(20毫升)并且用二氯甲烷萃取混合物(5x)。用水清洗合并的萃取物，干燥并且濃縮。通過用合適的溶劑簡單地清洗、重結(jié)晶或SiO2-柱色譜純化殘余物來得到相應(yīng)的8-羥基衍生物2-7。
方琺B在氬氣氛下將3-取代-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(2-6)(5.0毫摩爾)在48％的氫溴酸(25毫升)中的溶液在回流下加熱16-18小時，并且使其冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物濃縮至干或通過過濾分離其形成的沉淀。然后用乙醚、二氯甲烷和乙腈依次地地清洗粗產(chǎn)品固體來得到相應(yīng)的作為氫溴酸鹽的8-羥基化合物(2-7)。分離一些作為游離堿的化合物(條件參見上面的方法A)。
方法C將8-甲氧基化合物2-6(4.46毫摩爾)和48％的氫溴酸(23毫升)的溶液在120℃加熱2-10小時并且使其冷卻至室溫。加入水(30毫升)并且將pH調(diào)節(jié)至5(NaOH粒)。通過過濾分離得到的沉淀，用水清洗并且真空干燥。
當(dāng)乙醚衍生物2-6M的情況中，得到醇2-7M1的氫溴酸鹽(表2)。根據(jù)方法A用BBr3處理烯2-6P來得到2-7S1。根據(jù)方法B通過用HBr水溶液處理2-6P來得到2-7P1。
化合物2-7A1-2-7S1的產(chǎn)率和色譜數(shù)據(jù)列在表2中。
表1根據(jù)實施例1制備的化合物2-6A-2-6R
表2根據(jù)實施例1從2～6制備的化合物2-7A1-2-7R1
#8-OH和HBr(其中可使用)的化學(xué)位移并沒有包括在歸屬中制備2-氨基-4，6-二氯-3-羥基苯甲酸(1-8)
在80℃加熱4，6-二氯-3-羥基-2-硝基苯甲酸(1-6)(700毫克，2.78毫摩爾)、鐵粉(400毫克，7.16毫摩爾)和冰乙酸(13毫升)的混合物50分鐘，冷卻，并且過濾掉固體。將濾液濃縮至棕色的固體。接著SiO2-硅膠柱色譜(乙酸乙酯/HOAc，100∶1-100∶3)得到淺棕色固體的2-氨基-4，6-二氯-3-羥基苯甲酸(1-8)(582毫克，94％)。-1H NMR(DMSO-d6)δ6.68(s)；它符合文獻4。
4，6-二氯-2-甲酰氨基-3-羥基苯甲酸(2-8)的制備
在50-60℃加熱甲酸(1.04毫升90％的溶液)和乙酸酐(2毫升)的溶液2小時并且冷卻。然后在室溫下分部分將2-氨基-4，6-二氯-3-羥基苯甲酸(1-8)(425毫克，1.91毫摩爾)加入到正在攪拌的乙酸甲酸酐中。在2.5小時之后，將反應(yīng)混合物傾倒在冰和水的混合物上；通過過濾分離固體。提供了橙色固體的4，6-二氯-2-甲酰氨基-3-羥基苯甲酸(2-8)(320毫克，67％)。-1H NMR(DMSO-d6)δ8.76(s，1H)，8.29(s，1H)，8.13(s，1H)；質(zhì)譜m/z 248，250，252(M+-1，100％，66％，11％)。
實施例2-PCl3-介導(dǎo)的用胺縮合4,6-二氯-2-甲酰氨基-3-羥基苯甲酸(2-8)
在2分鐘內(nèi)向正在攪拌的4，6-二氯-2-甲酰氨基-3-羥基苯甲酸(2-8)(200毫克，0.80毫摩爾)、胺(0.88毫摩爾)和甲苯(5毫升)的混合物中逐滴地加入PCl3(0.12毫升，1.38毫摩爾)的甲苯(1毫升)溶液。將得到的懸浮液在回流下加熱4-16小時，并且冷卻。加入飽和的NaHCO3使pH為9。然后將混合物的pH再調(diào)節(jié)到7(5N HCl)并且用二氯甲烷萃取(3x)，并且合并萃取物并且干燥(Na2SO4)。除去揮發(fā)物來得到5，7-二氯-8-羥基-3-(取代的)-3H-喹唑啉-4-酮(2-7)。在一些情況中，通過用合適的溶劑清洗或SiO2-硅膠柱色譜或重結(jié)晶來純化粗產(chǎn)品，合適的溶劑一般地為乙醚或5％甲醇的乙醚溶液；化合物2-7A2和2-7M2的特征數(shù)據(jù)顯示在表3中。根據(jù)實施例2從2-8制備的其他化合物2-7顯示在表4中。
在實施例2中所用的胺的例子(C-噻唑-2-基)甲胺得到2-7A2、2-(2-氨基乙基)吡啶得到2-7B2、3-氨基吡啶得到2-7C2、4-氨基嗎啉得到2-7D2、1-氨基-4-甲基哌嗪得到2-7E2、4-(氨基甲基)哌啶得到2-7F2、5-氨基-l-乙基吡唑得到2-7G2、5-氨基-2-甲氧基吡啶得到2-7H2、2-氨基-1-甲基苯并咪唑得到2-7I2、2-氨基-5-甲基吡啶得到2-7J2、2-氨基-5-氯吡啶得到2-7K2、1-氨基哌啶得到2-7L2并且1-氨基吡咯烷得到2-7M2。當(dāng)使用胺鹽酸鹽時，將合適當(dāng)量的堿如三乙胺加入到反應(yīng)混合物中。根據(jù)實施例2制備的其他化合物是2-7O2-2-7AE2(表4)。
表3根據(jù)實施例2從2-8制備的化合物2-7
#8-OH的化學(xué)位移并沒有包括在歸屬中表4根據(jù)實施例2從2-8制備的其他2-7N2-2-7AE2
表5根據(jù)實施例1和2所制備的其他化合物
實施例32，3-二取代的-3H-喹唑啉-4-酮(4-9)的制備
步驟1在氬氣氛下向酸1-8(1.00克，4.50毫摩爾)在無水苯(8.3毫升)中的溶液中逐滴地加入亞硫酰氯(2.09克，17.6毫摩爾)。將混合物在回流下加熱5小時，之后通過蒸發(fā)除去過量的亞硫酰氯和苯。將殘余物溶解在無水的二氯甲烷(8.3毫升)中，冷卻至0℃，并且用正-丙胺(798毫克，13.5毫摩爾)處理。在0℃攪拌混合物15分鐘，然后加熱至室溫并且再攪拌16小時。蒸發(fā)并且用柱色譜(乙酸乙酯/石油醚，3∶7-1∶1)純化粗殘余物來得到橙色固體的苯甲酰胺，2-氨基-4，6-二氯-3-羥基-N-(正丙基)苯甲酰胺(4-14，R1＝正丙基)(550毫克，46％)。
2-氨基-4，6-二氯-3-羥基-N-丙基苯甲酰胺1H NMR(DMSO-d6)δ8.39(t，J＝5.6，1H)，6.67(s，1H，)，4.94(br，1H)，3.16(m，2H)，2.44(m，2H)，1.50(m，2H)，0.88(m，3H)。
步驟2在氬氣氛下向2-氨基-4，6-二氯-3-羥基-N-丙基苯甲酰胺(1.00克，4.50毫摩爾)在冰乙酸(5.5毫升)中的溶液中逐滴地加入氯代乙酰氯(718毫克，6.36毫摩爾)。將混合物在回流下加熱2小時并且然后在室溫下攪拌1小時。真空蒸發(fā)反應(yīng)混合物并且用2M的NaOH中和殘余物。通過過濾分離沉淀，用水洗滌并且真空干燥。
向得到的殘余物中加入二氯甲烷(10毫升)并且過濾掉不溶解的物質(zhì)。濃縮濾液來得到橙色固體的氯化物，2-氯甲基-5，7-二氯-8-羥基-3-正丙基-3H-喹唑啉-4-酮(4-15，R1＝正丙基)(600毫克，89％)。
2-氯甲基-5，7-二氯-8-羥基-3-正丙基-3H-喹唑啉-4-酮1H NMR(DMSO-d6)δ7.86(s，1H，)，5.15(s，2H)，4.27(s，2H)，1.52(m，2H)，0.93(m，3H)；質(zhì)譜m/z 323，325，327(M++1，100％，66％，11％)。
步驟3在氬氣氛下向2-氯甲基-5，7-二氯-8-羥基-3-正丙基-3H-喹唑啉-4-酮(285毫克，0.886毫摩爾)在無水的THF(1.3毫升)中的溶液中逐滴地加入甲胺的乙醇溶液(7.5毫升的8.0M的溶液，60毫摩爾)。在室溫下攪拌混合物18小時，然后濃縮，并且向得到的殘余物中加入2M的HCl(5毫毫升)。蒸發(fā)混合物并且再加入2M的HCl(5毫升)。蒸發(fā)殘余物并且再重復(fù)該步驟兩次。用二氯甲烷研磨混合物并且真空干燥來得到黃色固體的5，7-二氯-8-羥基-2-甲基氨基甲基-3-正丙基-3H-喹唑啉-4-酮鹽酸鹽(4-9A)(157毫克，50％)(表6)。
在表6中給出了通過用合適的胺取代在實施例3中的正丙基胺(步驟1)和甲胺(步驟3)制備的其他2，3-二取代的-3H-喹唑啉-4-酮(4-9B-4-9E)。
表6根據(jù)實施例3制備的化合物4-9A-4-9E
實施例4-2-取代的-3H-喹唑啉-4-酮(4-16A-4-16D)的制備
在氬氣氛下向甲醇鈉在甲醇(2.8毫升的0.32M的溶液，0.89毫摩爾)的冰冷的溶液中逐滴地加入氯代乙腈(0.25毫升，3.90毫摩爾)7。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘并且然后冷卻至0℃，之后加入2-4(0.80克，3.39毫摩爾)的無水甲醇溶液(14毫升)。在室溫下將溶液保持?jǐn)嚢?0小時并且再加熱回流20小時。蒸發(fā)并且用柱色譜(乙酸乙酯/石油醚，3∶7)純化得到的殘余物來得到白色固體的氯化物4-3B(225毫克，23％)。
接著用合適的胺根據(jù)如實施例3的步驟3中的條件處理4-3B來得到2-取代的-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮乙胺得到4-4A，1-丙基胺得到4-4B，二乙胺得到4-4C并且二甲胺得到4-4D。接著根據(jù)一般的脫保護方法(實施例1，方法A)各自除去8-甲氧基保護基團來得到4-16A-4-16D(表7)。
表7根據(jù)實施例4制備的化合物4-4A-4-4D和4-16A-4-16D
3-氨基-5，7-二氯-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮氫溴酸鹽(5-4或PB 1099)的制備
將2-氨基-4，6-二氯-3-甲氧基苯甲酸甲酯(2-3)(6.35克，25.4毫摩爾)和原甲酸三乙基酯(60毫升，361毫摩爾)加熱回流5天。將溶液冷卻至室溫并且在減壓下蒸發(fā)來得到棕色油狀的亞胺酸酯，4，6-二氯-2-乙氧基亞甲基氨基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(5-2)，和起始原料(7.80克)；5-2∶2-3～9∶1。
4，6-二氯-2-乙氧基亞甲基氨基-3-甲氧基苯甲酸甲酯(5-2)1H NMR(DMSO-d6)δ7.99(s，1H)，7.48(s，1H)，4.22(q，2H)，3.79(s，3H)，3.62(s，3H)，1.28(t，J＝7.2，3H)。
在氬氣氛下向亞胺酸酯5-2(400毫克，1.31毫摩爾)在乙醇(12毫升)的冰冷的溶液中加入水合肼(1.8毫升，57.8毫摩爾)。在15分鐘之后，將溶液加熱至室溫并且再攪拌2小時。用乙醇稀釋濃稠的懸浮液并且過濾。用冷的乙醇洗滌固體并真空干燥來得到白色絨毛似的固體的3-氨基-5，7-二氯-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(5-3)(289毫克，85％)。
3-氨基-5，7-二氯-8-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮(5-3)1H NMR(DMSO-d6)δ8.48(s，1H)，7.74(s，1H)，5.85(s，2H)，3.94(s，3H)；質(zhì)譜m/z 260，262，264(M++1，100％，66％，11％)。
將5-3(60毫克，0.231毫摩爾)和48％的氫溴酸的水溶液(2毫升)的溶液在120℃加熱2小時。將溶液冷卻至室溫并且通過過濾分離沉淀，用二氯甲烷和乙醚依次地地洗滌，并且真空干燥來得到白色固體的3-氨基-5，7-二氯-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮氫溴酸鹽(5-4)(44毫克，58％)。
3-氨基-5，7-二氯-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮氫溴酸鹽(5-4)1H NMR(DMSO-d6)δ8.44(s，1H)，7.60(s，1H)；m/z 246，248，250(M++1，100％，66％，11％)。
實施例5-3-(取代的)氨基-5，7-二氯-8-羥基-3H-喹唑啉-4-酮的制備 在氬氣氛下向被取代的苯基肼鹽酸鹽(1.61毫摩爾)的乙醇(4毫升)的冰冷的溶液中加入三乙胺(185毫克，1.83毫摩爾)。在0℃攪拌混合物15分鐘，之后加入亞胺酸酯5-2(180毫克，059毫摩爾)的乙醇(3毫升)溶液中。在0℃攪拌得到的混合物40分鐘，然后在室溫下攪拌4天。過濾懸浮液并且用冷的乙醇洗滌白色的固體并且真空干燥來得到8-甲氧基-3-(取代的)氨基化合物5-6。
所用的肼的例子2，4-二氟代苯基肼鹽酸鹽得到5-6A，4-甲氧基苯基肼鹽酸鹽得到5-6B并且4-氟代苯基肼鹽酸鹽得到5-6C。
將8-甲氧基化合物(5-6A、5-6B或5-6C)(0.133毫摩爾)和48％的氫溴酸的水溶液(3毫升)的溶液在120℃加熱6小時，并且將其冷卻至室溫。通過過濾分離固體，用二氯甲烷和乙醚洗滌，并且真空干燥來得到3-(取代的)氨基化合物(5-7A、5-7B或5-7C)(表8)。
表8根據(jù)實施例5制備的化合物
#8-OH和HBr(其中可使用)的化學(xué)位移并沒有包括在歸屬中表9根據(jù)在方案5中的方法制備的化合物
表10通過烷基化或?；?和2中的一些化合物所制備的化合物
實施例6-3-取代-3H-喹唑啉-4-酮(7-2)的制備
將3-取代-3H-喹唑啉-4-酮(0.70毫摩爾)、P4S10(0.93毫摩爾)和吡啶(5毫升)的混合物加熱回流。當(dāng)TLC分析顯示反應(yīng)完成之后，將混合物濃縮至干并且對得到的殘余物進行柱色譜(SiO2；用乙酸乙酯/甲醇，100∶1洗脫)來得到相應(yīng)的3H-喹唑啉-4-酮7-1。
根據(jù)在以上的實施例1中所描述的條件用BBr3處理3H-喹唑啉-4-硫酮7-1的混合物。用甲醇按照普通的處理方式來得到相應(yīng)的3H-喹唑啉-4-硫酮7-1(表11)。
表11根據(jù)實施例6制備的化合物
實施例7-評價式I的化合物以下測定用于評價式I的化合物在本發(fā)明的方法中使用的適用性。
測定1.熒光H2O2分析熒光測定用來分析測試化合物在基于二氯熒光素二乙酸酯(DCF；Molecular Probes，Eugene OR)在銅存在下抑制通過Aβ生成過氧化氫的能力。該DCF(5mM)在100％二甲基亞砜中的溶液(預(yù)先用氬氣在20℃下吹掃1小時)在0.025M NaOH存在下脫乙酰30分鐘，接著在pH7.4下中和至1mM的最終濃度。制備pH7.4的1μM的辣根過氧化物酶(HRP)儲備液。反應(yīng)在PBS、pH7.4、96孔板中進行(總體積＝250μL/孔)。所述的反應(yīng)溶液含有濃度在50nM至1μM之間的Aβ1-42，銅-甘氨酸螯合物(Cu-Gly)，如下制備以1∶6的比例將CuCl2加入到甘氨酸中，接著以比例2Cu-Gly∶1Aβ加入到Aβ中，還原劑包括多巴胺(5M)或抗壞血酸、脫乙酰的DCF 100μM以及HRP 0.1μM。1-10μM EDTA或另外的螯合劑也可以作為游離銅的參照物存在，但是不需要對測定起作用。反應(yīng)混合物在37℃培育60分鐘。在PBS中的pH7.4的H2O2(1-2.5μM)標(biāo)準(zhǔn)物和過氧化氫酶(4000單位/ml)可以作為陽性對照包括在內(nèi)。使用波長分別在485nm和530nm的激發(fā)和發(fā)射濾光器的板讀數(shù)器記錄熒光。通過比較熒光與H2O2標(biāo)準(zhǔn)物，可以確定H2O2的濃度。通過在測試孔中包含給定濃度的測試化合物，分析AβH2O2產(chǎn)生的抑制。
測定2.神經(jīng)毒性測定原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)如先前描述的(White等人，1998)制備皮層培養(yǎng)物。除去胚胎期第14天BL6Jxl29sv小鼠的皮層，切除腦膜(meninges)，并離解在0.025％(wt/vol)胰蛋白酶中。將離解細(xì)胞以2×106細(xì)胞/mL的密度鋪在48孔培養(yǎng)平板中，該平板中預(yù)先放有含25％(vol/vol)Fcs和5％(vol/vol)Hs的MEM，接著在37℃培育2小時。然后，用Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies)和B27補充劑(Invitrogen Life Technologies)替換培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37℃下保持在5％的CO2中。實驗前，用Neurobasal培養(yǎng)基和B27-無抗氧化劑(Invitrogen Life Technologies)替換該培養(yǎng)基。
原代小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)除去出生5-6天后(P5-6)的小鼠的小腦，切除腦膜，并將其離解在0.025％的胰蛋白酶中。將小腦顆粒神經(jīng)元(CGN)以350000細(xì)胞/cm2的密度鋪在24孔培養(yǎng)平板中，該平板中預(yù)先裝有補充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和25mM KCl的BME(Invitrogen Life Technologies)。將硫酸慶大霉素(100μg/mL)加入到所有平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物在37℃下保持在5％的CO2中。
測定3.細(xì)胞成活力測定(a)用于細(xì)胞成活力(cell via bility)的MTS測定使用MTS測定確定細(xì)胞的成活力。用新鮮的Neurobasal培養(yǎng)基加B27補充劑-抗氧化劑替換培養(yǎng)基。1/10體積的MTS溶液(Cell Titre 96 Aqueousone，Promega Corporation)并在37℃下培育2小時。用分光光度計在560nm測定200微升等分試樣。
(b)用于細(xì)胞成活力的LDH測定使用乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Boehringer Ingelheim)根據(jù)廠家的說明，從不含血清和細(xì)胞碎片的培養(yǎng)上清液中確定細(xì)胞死亡。
(c)Aβ神經(jīng)毒性和Aβ神經(jīng)保護測定神經(jīng)元皮層細(xì)胞按照測定2培養(yǎng)5天。第6天，用Neurobasal(NB)培養(yǎng)基和B27補充劑(沒有抗氧化劑)替換NB培養(yǎng)基(Invitrogen Life Technologies)和B27補充劑(Invitrogen Life Technologies)。第6天，將測試化合物分別加入到神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中將測試化合物溶于100％DMSO中，至2.5mM的濃度(10mM如果每管瓶稱出過量的化合物-那么稀釋至2.5mM)。將2.5mM儲備液以1∶10比例依次地稀釋，得到250uM、25uM、2.5uM的使用溶液。
Aβ制備
首先，將Aβ溶于20mM NaOH中，至1mM的濃度，接著超聲波處理5分鐘。然后，將該肽在H2O和10X PBS中稀釋至在1X PBS中200uM Aβ的最終濃度。所述肽再次用超聲波處理5分鐘，然后以14000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘，并將其移入到清潔管中。
將測試化合物溶于100％DMSO中，至2.5mM的濃度(10mM如果每管瓶稱出過量的化合物，那么稀釋至2.5mM)。將2.5mM儲備液以1∶10比例[在NB介質(zhì)和B27(沒有抗氧化劑)中]依次地稀釋，得到250uM、25uM、2.5uM的使用溶液。測試化合物不是直接加入到細(xì)胞中，相反，將它們加入到含如下物質(zhì)的48孔“藥物板”中“藥物板”的制備向48孔板中加入孔1515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)*+24ul 25uM測試化合物+60ul Aβ稀釋劑**孔2515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 250uM測試化合物+60ul Aβ稀釋劑孔3515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul測試化合物稀釋劑***+60ulAβ-42孔4515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 2.5uM測試化合物+60ulAβ-42孔5515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 25uM測試化合物+60ulAβ-42孔6515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 250uM測試化合物+60ulAβ-42稀釋劑孔7515ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul測試化合物稀釋劑+60ulAβ-42稀釋劑孔8600ul NB+B27(沒有抗氧化劑)N.B.60ul Aβ1-42等于20ul Aβ1-42每孔等于20uM Aβ1-42將所述的藥物板在37℃培育15分鐘。一式三份以200ul每孔加入到相應(yīng)的細(xì)胞板中。所述細(xì)胞板在37℃下培育4天。
*NB培養(yǎng)基+B27(沒有抗氧化劑)，**Aβ稀釋劑2mM NaOH，1X PBS
***PBT稀釋劑10％DMSO在NB+B27(沒有抗氧化劑)中完成測定處理細(xì)胞后第4天，通過向所述細(xì)胞中加入MTS完成測定。
(d)測試化合物細(xì)胞毒性的分析按照測定2，將神經(jīng)元皮層細(xì)胞在NB介質(zhì)和B27補充劑中培養(yǎng)5天。
第6天，將測試化合物加入到在NB培養(yǎng)基和B27補充劑減抗氧化劑中的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物中。
將測試化合物溶于100％DMSO中，至2.5mM的濃度(10mM如果每管瓶稱出過量的化合物-那么稀釋至2.5mM)。將2.5mM儲備液以1∶10比例依次地稀釋，得到250uM、25uM、2.5uM的使用溶液。測試化合物不是直接加入到細(xì)胞中，相反，將它們加入到含如下物質(zhì)的48孔‘藥物板’中“藥物板”的制備向48孔板中加入孔1576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)*+24ul 2.5uM測試化合物孔2576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 25uM測試化合物孔3576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 250uM測試化合物孔4576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 2.5uM測試化合物孔5576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 25uM測試化合物孔6576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul 250uM測試化合物孔7576ul NB+B27(沒有抗氧化劑)+24ul測試化合物稀釋劑**孔8600ul NB+B27(沒有抗氧化劑)將所述的藥物板在37℃培育15分鐘。一式三份以200ul每孔加入到相應(yīng)的細(xì)胞板中。所述的細(xì)胞板在37℃下培育4天，(在細(xì)胞的每個板上測試兩個化合物)。
*NB培養(yǎng)基和B27(沒有抗氧化劑)，**PBT稀釋劑10％DMSO在NB+B27(沒有抗氧化劑)中在完成測定時，將1/10體積的MTS加入到板的每個孔中(即25ul/250ul)。所述板在37℃培育2小時，然后在560nm下讀取吸光度。
測定4.胱冬蛋白酶(caspase)測定為了測定神經(jīng)元培養(yǎng)物中胱冬蛋白酶的活性，除去生長培養(yǎng)基，用對照鹽溶液(pH7.4)洗滌細(xì)胞兩次，接著將冰冷的細(xì)胞萃取緩沖液直接加入到該培養(yǎng)物中。萃取緩沖液由20mM Tris(pH7.4)、1mM蔗糖、0.25mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.5mM PMSF、1％Triton X-100(Tx-100)和1μg/mL胃酶抑素和抑肽酶組成。在冰上培育15分鐘后，除去萃取緩沖液，在4℃在微量離心機中離心5分鐘，接著向96孔板的每個孔中加入100μL上清液。將100μL 200μM的底物(對于胱冬蛋白酶3、6和8，分別是DEVD-pNA、VEID-pNA或IETD-pNA)加入到每個孔中，得到100μM的底物最終濃度。板在37℃下培育2、4、6或24小時，在415nm的波長處測定吸光度(Abs415)。該吸光度讀數(shù)與已知標(biāo)準(zhǔn)的單獨pNA進行比較。
測定5.膜聯(lián)蛋白(annexin)V測定為了測定與細(xì)胞結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V的含量，用對照鹽溶液(pH7.4)洗滌培養(yǎng)物兩次，接著加入在對照鹽溶液(pH7.4)中的濃度約0.5μg/mL的膜聯(lián)蛋白V-FITC。同時還向培養(yǎng)物中加入碘化丙錠(propidium iodide)(10μg/mL)。細(xì)胞在黑暗中在環(huán)境溫度下培育30分鐘，隨后用新鮮的對照鹽溶液洗滌三次。使用萊卡(Leica)DMIRB顯微鏡分析確定FITC熒光(激發(fā)488nm，發(fā)射510nm)。用萊卡MPS60照像附加使用ASA400彩色膠片進行拍照，底片用Adobe Photoshop v2.0.1軟件掃描。
測定6.脂蛋白氧化測定可以使用兩種不同的方法測定金屬介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用。第一種測定法涉及測定金屬化蛋白質(zhì)的氧化作用。這種測定法如下進行將透析金屬化蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)(在指定濃度下)與0.5mg/mL的LDL混合24小時(37℃)。使用脂質(zhì)過氧化作用分析試劑盒(LPO486，Oxis International Inc.Portland，OR)按照試劑盒教導(dǎo)測定脂質(zhì)過氧化作用(LPO)。通過吸光度(486nm)與單獨LDL(100％LPO)進行比較，確定LPO的水平。第二種測定法用來測定天然蛋白質(zhì)在游離的、非蛋白質(zhì)結(jié)合的Cu存在下的LPO活性。這涉及到將非金屬化的肽(140μM)加入到0.5mg/mL的LDL和20μM Cu-gly中，接著對金屬化蛋白質(zhì)進行LPO測定。通過吸光度(486nm)與LDL+Cu-gly(100％LPO)進行比較，確定LPO的水平。作為陰性對照，LDL還暴露于透析的Cu-gly溶液中，以與Cu-金屬化蛋白質(zhì)所使用的那些進行比較。
測定7.由Cu-金屬化蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性在與蛋白質(zhì)為等摩爾濃度或兩倍摩爾濃度下，將蛋白質(zhì)或合成肽與金屬-甘氨酸溶液混合。金屬-蛋白質(zhì)混合物在37℃培育過夜，然后使用3,500千道爾頓阻流(cut-off)的微型滲析杯(mini-dialysisc cups)(Pierce，Rockford，IL)進行充分透析(24小時，在室溫下對dH2O(3L/變化)的兩次變化)。蛋白質(zhì)對PBS pH7.4的透析產(chǎn)生與dH2O透析具有相同活性的金屬化蛋白質(zhì)。
為了測定它們的神經(jīng)毒害作用，將金屬化蛋白、天然蛋白或肽加入到兩天齡的原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)物中。培養(yǎng)物同時還暴露于Cu-gly(5或10μM)或LDL中。陽性對照培養(yǎng)物用Cu-gly+LDL或LPO產(chǎn)物，4-羥基-壬烯醇(HNE，Sigma Chemicals)處理。用乳酸脫氫酶(LDH)分析試劑盒(RocheMolecular Biochemicals，Nunawading，Australia)根據(jù)廠商的說明，測定培養(yǎng)物中的細(xì)胞死亡。
測定8.對溶酶體酸化的Aβ-介導(dǎo)損失進行吖啶橙分析經(jīng)培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元用Aβ1-42(20μM)處理16h，然后用5mg/ml吖啶橙(AO)在37℃下染色5分鐘。在37℃下15分鐘。用熒光顯微鏡上的紅色濾光器測定AO-誘導(dǎo)的熒光。AO是溶酶體向性弱堿，累積在胞內(nèi)體/溶酶體室中，并在培養(yǎng)期間顯示出橙色熒光。只要溶酶體膜內(nèi)存在大量的質(zhì)子梯度，AO就在溶酶體內(nèi)被螯合。用Aβ1-42處理細(xì)胞破壞了溶酶體膜的質(zhì)子梯度，并且將AO重新定位到胞質(zhì)溶膠中，根據(jù)16-24小時內(nèi)橙色熒光的損失表示。
測定9.人腦淀粉狀蛋白增溶作用測定這種測定法是評價測試化合物在死后人AD腦的組織萃取物中將Aβ從不溶相轉(zhuǎn)化為可溶相的能力。
高達0.5g的沒有腦膜的帶斑塊的皮層在高達2ml的冰冷磷酸緩沖鹽溶液pH7.4中使用DIAX900均化器(Heudolph and Co，Kelheim，Germany)或其它合適的裝置全速均化三個30-秒周期。為了獲得磷酸緩沖鹽溶液-可提取部分，將均漿在100,000xg下離心30分鐘，接著除去上清液?；蛘?，將所述組織冷凍干燥，然后磨碎形成粉末，接著將所述粉末稱成等分試樣，進行如上所述的提取。離心后移去10μl上清液的等分試樣，將其與等體積的2×Tris-Ticene SDS樣品緩沖液(pH8.3，含8％SDS，10％2-巰基乙醇)混合。然后，樣品在90℃下加熱10分鐘，接著通過凝膠電泳分離。將初始粒狀樣品再懸浮在1ml磷酸緩沖鹽溶液中，獲得皮層樣品的不溶部分。然后，將這種懸浮液的50-μL等分試樣在200ml上述樣品緩沖液中煮沸。
將合適稀釋的樣品裝載到10％-20％梯度凝膠(Novex，San Diego，CA)上，進行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著轉(zhuǎn)移到0.2-μm硝化纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。使用單克隆抗體W02檢測Aβ，其檢測與辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的免抗-小鼠IgG(Dako，Denmark)結(jié)合的殘基5-8、17(或其它合適的抗體)，并通過使用增強化學(xué)發(fā)光(例如ECL；Amersham LifeScience，Buckinghamshire，UK)進行觀察。每種凝膠包括三條含0.5、1和2ng合成Aβ40的道(Keck Laboratory，Yale University，New Haven，CT)作為參考標(biāo)準(zhǔn)。
使用合適的軟件，例如Multigauge并且使用合適的成像系統(tǒng)例如FujiLAS3000和密度測定法對斑點膜進行讀取。用于單一和二聚Aβ帶光密度分析的信號強度的線性范圍利用已知的Aβ標(biāo)準(zhǔn)建立。在表13中計算的百分比表示從治療小鼠組中獲得的相對于溶媒處理小鼠組的平均讀數(shù)。
所有的樣品分析數(shù)次，并且調(diào)節(jié)膠負(fù)載以及稀釋以使其落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可定量范圍之內(nèi)。不溶性Aβ含有來源于上述皮層樣品中的不溶性淀粉狀蛋白斑塊的可粒化部分，以及包含單體的和/或寡聚的可溶性Aβ的可溶部分。
每一測試化合物與包括在每種膠凝上的PBS對照一起，進行幾個凝膠運行。每種膠凝含有不同濃度的測試化合物。使用stuendent’s“t”檢驗，通過由測試化合物對于每種膠凝在任何濃度下獲得的最高值的平均值與由多種膠凝中獲得的PBS值的平均值進行比較。因此，可以進行判定，由任何測試化合物獲得的溶解度的平均增加值是否與單獨PBS獲得的溶解度平均增加值具有可比性。獲得(+)評分的測試化合物是這樣的化合物，其相對于單獨PBS，在斑塊溶解方面獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。獲得(-)評分的測試化合物是這樣的化合物，其相對于單獨PBS，在斑塊溶解度方面沒有獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。
測定10.金屬分配為了測定各種金屬包括鋅和銅的分配作用，在測試化合物存在下提取腦組織后，如用于淀粉狀蛋白溶解度測定的方法，從人腦組織的提取物中制得可溶性和不溶性部分。由感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜分析兩部分中的金屬，如果必要的話，用硝酸和/或過氧化氫進行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。
測定11.在轉(zhuǎn)基因動物中給予測試化合物對Aβ沉積的影響轉(zhuǎn)基因小鼠模型對許多神經(jīng)障礙是可以得到的，包括阿爾茨海默氏病(Games等人，1995；Hsiao等人，1996)；帕金森病(Masliah等人，2000)；家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(ALs)(Gumey等人，1994)；亨廷頓舞蹈病(Reddy等人，1998)和克-雅二氏病(CJD)(Telling等人，1994)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)基因模型之一，APP2576轉(zhuǎn)基因小鼠(Hsiao等人，1996)還具有白內(nèi)障的高發(fā)病率。這些動物模型適合于測試的本發(fā)明的方法。
使用APP2576品系的轉(zhuǎn)基因小鼠(Hsiao等人1996)。選擇8-9個月大的雌性小鼠，并將其分成治療組。
每隔一段時間殺死小鼠，檢查它們的腦，以確定測試化合物的治療是否降低了腦淀粉狀蛋白的生成，并確定出最有效的給藥方案。使用校準(zhǔn)的Wcstern印跡法，按照測定9所述的方法，測定腦和血清中可溶性和不溶性Aβ的水平。腦淀粉狀蛋白增溶作用測定。
使用Morris水迷宮，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在長達8個月的時間內(nèi)，對每組中其它小鼠的認(rèn)知性能進行測定。同時，由不知情的操作員每天測定動物的總體健康和福利，使用5分整數(shù)在主觀上對綜合特征進行評價，包括運動活動、警覺性和總體健康體征。
測定12.物理化學(xué)性質(zhì)極表面積計算(PSA)使用基于萬維網(wǎng)，通過“Molinspiration”(一種計算分子性質(zhì)的程序包)，計算極表面積值。
比濁法溶解度測定在pH2.0和pH6.5時測定溶解度估計值。這在沿人近側(cè)胃腸道可預(yù)測的pH范圍范圍內(nèi)。
將化合物溶于DMSO中至合適的濃度，然后加入到0.01M HCl(約pH＝2.0)或pH6.5等滲磷酸鹽緩沖液中，最終DMSO濃度是1％。然后，通過比濁法分析樣品，確定溶解度范圍。[根據(jù)D.Bevan和R.S.Lloyd，Anal.Chem.2000，72，1781-1787]。
cLog P值理論Log P值使用ACD Log P軟件進行確定。所標(biāo)出的值由未經(jīng)訓(xùn)練的數(shù)據(jù)庫計算，并且是指未離子化的物質(zhì)。
測定13.血腦屏障滲透將測試化合物溶于DMSO中，接著加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，獲得濃度為50μM的在含1.25-2.5％DMSO的PBS中的溶液。為了評價每一灌注期間血腦屏障(BBB)的完整性，以及為了評價腦組織樣品中剩余血管空間(RVS)的體積(即每一灌注結(jié)束時血管腔內(nèi)剩余液體的體積)，將痕量14C-蔗糖加入到每種儲備輸液溶液(約0.01μCi/mL)中起B(yǎng)BB不可滲透標(biāo)志物。
以1.0mL/100g體重的劑量腹膜內(nèi)注射烏拉坦(Urethane)(25％wv)，將成年雄性Spague Dawley大鼠(180-190g)麻醉。通過手術(shù)割開右頸總動脈，插管進行大腦循環(huán)灌注。然后，在與右頸總動脈分叉的末端處結(jié)扎右頸外動脈(其供應(yīng)顱骨外的組織)，這樣所有的輸液溶液將通過剩余的右側(cè)內(nèi)頸動脈進入腦內(nèi)。然后，暴露心臟，橫切，立即開始輸液。輸液的速度由泵組控制，以3.2mL/分鐘的量給予(對于這種大小的大鼠，約為85％的正常腦部血液供應(yīng))。該輸液套管最初含有0.5mL預(yù)先洗滌的肝素化PBS(10IU/ml)，用于沖洗血管和預(yù)防血液凝結(jié)和阻塞小血管。
1.5分鐘后，自動停止輸液泵，將套管從頸動脈中取出，然后從輸液套管的端頭處收集輸液溶液的樣品(1-1.5mL)。然后，將腦解剖，分成3部分；右半球和右中腦、左半球和左中腦、以及后腦(小腦、腦橋和腦干)。僅僅使用腦的右部進行隨后的測定，因為通過右側(cè)內(nèi)頸動脈的灌注優(yōu)先供應(yīng)右腦半球和右中腦(左腦半球和后腦接受可變的并行灌注)。將每只動物的腦組織樣品在-30℃下冷凍，均化，稱重后的等分試樣通過LC-MS分析確定總腦濃度。使用Micromass Triple Quad儀進行分析。流動相由乙腈/水梯度(含0.05％甲酸)組成，柱子是Phenomenex Luna CN。
由液體閃爍計數(shù)確定14C-蔗糖的含量以分析每個腦組織樣品的小等分試樣和相應(yīng)的輸液溶液。通過腦組織中蔗糖的實測濃度(dpm/mg)除以相應(yīng)輸液溶液中蔗糖的濃度(dpm/μL)，計算每個腦組織樣品中剩余的血管空間(RVS)。這是每次灌注結(jié)束時留在血管內(nèi)的液體的體積。RVS乘以輸液溶液中測試化合物的濃度，得到每個腦組織樣品中存在于血管內(nèi)的測試化合物的總剩余量(即沒有越過BBB的那些)。總腦濃度減去每個腦組織樣品中存在于血管內(nèi)的測試化合物的總剩余量，得到每個腦組織樣品中存在于血管外的藥物的數(shù)量(即越過BBB的那些)。除以RVS校正的腦濃度，得到腦攝取率(方程式1)。
方程式1.
每一種測試化合物進行5-6次腦灌流實驗，計算平均腦攝取率。
比值大于50％表示化合物非常迅速地進入腦內(nèi)；比值在10至50％之間表示化合物較好的進入腦內(nèi)，比值小于10％(沒有觀察到)表示化合物非常慢地進入腦內(nèi)并且不適合于治療給藥；比值小于1％(沒有觀察到)表示化合物有效地從腦中排出。
測定14.轉(zhuǎn)基因小鼠腦免疫組織化學(xué)在本測定中使用如測定11中所指的APP 2576轉(zhuǎn)基因小鼠(Hsiao等人，1996)。對側(cè)的福爾馬林-固定的小鼠腦組織被沿頭顱切割。從相應(yīng)的部位取得切片(10μm)并用80％甲酸處理以回收抗原。所使用的第一抗體是單克隆抗體1E8，其識別Aβ殘基18和22之間的表位(SmithKline Beecham，UK)。免疫反應(yīng)性利用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體(使用3，39-二氨基聯(lián)苯胺發(fā)色團)(Dako)和堿性磷酸酯酶(使用5-溴-4-氯3-吲哚基磷酸酯和氮藍(lán)四唑氯化物發(fā)色團)(Dako)而顯色。每個切片的斑塊豐度(Plaque abundance)由兩個操作員根據(jù)下列等級盲目進行評價0＝?jīng)]有看見斑塊1＝斑塊存在但是非常稀少2＝存在幾個斑塊3＝在限制范圍內(nèi)出現(xiàn)許多可見的斑塊4＝斑塊很豐富并且不限于任何特定的區(qū)域。
如果合適的話，給予中間值例如2.5。
Stendent’s t檢驗被用于各組之間的比較。
測定15.藥物動力學(xué)特性(pharmacokinetic profile)·靜脈內(nèi)輸注測試化合物；2mg/Kg在合適的賦形劑中，給予2只大鼠，對動脈血進行取樣直到24小時。
·口服給藥測試化合物；30mg/Kg在合適的賦形劑中，通過口服管飼法給予2只大鼠，對動脈血進行取樣直到24小時。
·通過合適的分析方法確定測試化合物的血漿濃度。
計算CLtotal=DoseIVAUCIV]]>Vdβ=CLtotalβ]]>BA(%)=AUCoral*DoseIVAUCIV*Doseoral]]>CLtotal＝IV給藥后的總血漿清除率Vdβ＝IV給藥后消除相期間的分布體積BA＝口服生物利用度AUCIV＝IV給藥后從零時到無窮，血漿濃度對時間分布下的面積AUCoral＝口服給藥后，從零時到無窮，血漿濃度對時間分布下的面積β＝IV給藥后最終消除速度常數(shù)測定16.測試化合物的小鼠血漿水平的確定PB1075以30毫克/千克的劑量口服給予PB1075，在Na-羧甲基纖維素(CMC)中以懸浮液的形式通過口服管飼法給予四只小鼠。給藥后30分鐘，處死兩只小鼠，給藥后60分鐘處死另兩只小鼠。通過心臟穿刺獲得血液，然后通過離心分離血漿。
由LC/MS使用triple quadrupole儀測定PBT1075的濃度。流動相由乙腈(ACN)/水梯度(含0.05％的甲酸)組成，柱子是Phenomenex Lunea 5μmC8(50×2mm)柱。
用ACN進行蛋白質(zhì)沉淀后，將提供的急性毒性小鼠血漿樣品直接注入。血漿中的分析方法在10-10,000ng/ml范圍內(nèi)是線性的(R2＝0.9994)。從血漿中回收的PB1075是～100％。
小鼠血漿中的PB1075濃度在表12中給出。
表12.以30毫克/千克口服給藥后，小鼠血漿中PB1075的濃度
PB 1076以30毫克/千克的劑量口服給予PB 1076，在Na-羧甲基纖維素(CMC)中以懸浮液的形式通過口服管飼法給予四只小鼠，給藥30分鐘之后，處死兩只小鼠，給藥60分鐘之后處死兩只小鼠，通過心臟穿刺獲得血液，然后通過離心分離血漿。
由LC/MS使用triple quadrupole儀測定PB 1076的濃度。流動相由乙腈(ACN)/水梯度(含0.05％的甲酸)組成，柱子是Phenomenex Lunea 5μm C8(50×2mm)柱。
用ACN進行蛋白質(zhì)沉淀之后，將小鼠的血漿樣品直接注入。血漿中的分析方法在500-10,000ng/ml的范圍為線性(R2＝0.994)。從血漿中回收的PB1076是～85％。
以30毫克/千克的劑量口服給藥之后，小鼠血漿中的PB 1076的濃度在表13中給出。
表13.以30毫克/千克的劑量口服給藥之后，小鼠血漿中的PB 1076的濃度
PB 1077以30毫克/千克的劑量口服給予PB 1077，在Na-羧甲基纖維素(CMC)中以懸浮液的形式通過口服管伺法給予四只小鼠，給藥30分鐘之后，處死兩只小鼠，給藥60分鐘之后處死兩只小鼠，通過心臟穿刺獲得血液，然后通過離心分離血漿。
由LC/MS使用triple quadrupole儀測定PB 1077的濃度。流動相由乙腈(ACN)/水梯度(含0.05％的甲酸)組成，柱子是Phenomenex Lunea 5μm C8(50×2mm)柱。
用ACN進行蛋白質(zhì)沉淀之后，將小鼠的血漿樣品直接注入。血漿中的分析方法在5-5,000ng/ml的范圍內(nèi)為線性(R2＝0.999)。從血漿中回收的PB1077是～92％。
以30毫克/千克的劑量口服給藥之后，小鼠血漿中的PB 1077的濃度在表14中給出。
表14.以30毫克/千克的劑量口服給藥之后，小鼠血漿中的PB 1077的濃度
測定17.測試合成淀粉斑的分解作用本測試測量了試驗化合物溶解合成的阿爾茨海默氏A-β42殘余蛋白的凝集物的能力，該凝集物是用鋅沉淀形成的。
該合成的斑凝集物的測試是基于硫黃素T(thioflavin T)熒光的測試，該測試測量了試驗化合物分解合成的凝集物的能力，該凝集物是通過在鋅存在下培育阿爾茨海默氏淀粉A-β蛋白(Aβ)形成的。
通過加入鋅鹽可以使在阿爾茨海默氏淀粉斑中最普遍形成的41殘余蛋白沉淀以形成β層狀構(gòu)造的凝集物，該凝集物在物理化學(xué)上適合于晶體的淀粉斑的核。硫黃素T是一種嵌插在β層狀結(jié)構(gòu)中時會顯示出特別的熒光的試劑，在凝集過程中將硫黃素T結(jié)合在Aβ/Zn凝集物中。試驗化合物所結(jié)合的金屬連接的凝集物的溶解會由于失去層狀構(gòu)造產(chǎn)生熒光的減低。在本測試中的化合物的活性結(jié)合了其金屬螯合特性、溶解性、疏水性和結(jié)構(gòu)元素，它們影響了與淀粉團的相互作用。
本測試作為一種斑分解的體外模型，模擬了如下的過程，試驗化合物或者通過與Aβ競爭結(jié)合的金屬或通過在金屬結(jié)合位點上競爭地結(jié)合來替換金屬，從而使鋅造成的Aβ沉淀溶解。
測試試劑為了方便，制備合成的Aβ蛋白的等分試樣。將Aβ溶解在蒸餾水中并且通過在214nm處的吸收對照有效的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定蛋白的濃度。只有溶劑(DMSO)和參照載體(PBS)存在下的Aβ/Zn凝集物作為陰性對照也包括在每個測試中。
將試驗化合物溶解在DMSO中達到濃度為5mM。在DMSO中稀釋到的100倍來合適地得到所需要的最終的濃度并且將其立刻加入到Aβ凝集物中。
方法在轉(zhuǎn)輪中在37度，在PBS pH6.6下以摩爾比(1∶2∶2)將Aβ1-42與二氯化鋅和硫黃素T(ThT)培育24小時。培育之后，在旋轉(zhuǎn)下在37度用試驗的藥物再培育凝集物2小時。每個試驗中包括PBS空白、未處理的凝集物和DMSO參照物。在培育2小時之后，在試管中用LS55(Perkin Elmer)熒光計測量試樣的ThT熒光。
用FL Winlab軟件(Perkin Elmer)得到數(shù)據(jù)并且用GraphPad Prism v4.0軟件分析。數(shù)據(jù)為多次讀數(shù)的平均值。
結(jié)果以表格的形式表示結(jié)果，其中得到分解50％處的濃度(IC50)和在5μM的分解的百分?jǐn)?shù)(以5/％減少表示)。這兩個值一起提供測量分解的效率。
如果化合物不能在試驗的濃度范圍內(nèi)得到50％的分解，則將結(jié)果記錄為＞20μM，相應(yīng)于被試驗的化合物的最大濃度。這個結(jié)果表示該試驗化合物在分解Aβ1-42凝集物上能力比較低。能夠得到小于20μM的IC50并且在5μM得到超過20％的分解的試驗化合物被認(rèn)為“良好”。能夠得到小于20μM的IC50并且在5μM得到超過40％的分解的試驗化合物被認(rèn)為“非常良好”。
在說明書和實施例中所引用參考文獻列在下面的頁中，并且這里引入作為參考。
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對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說很明顯，盡管出于清楚和理解的目的，詳細(xì)描述了本發(fā)明的某些細(xì)節(jié)，但是可以對在此所述的技術(shù)方案和方法作出多種修改和變化，而不偏離本說明書所公開的發(fā)明概念的范圍。
權(quán)利要求
1.式I的化合物 其中R2是H或CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基和任選地被取代的C3-6環(huán)烷基；R3是H、任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C1-4鏈烯基；任選地被取代的C3-6環(huán)烷基；任選地被取代的6-員芳基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到6的整數(shù)并且R6是任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基或任選地被取代的6-員芳基；NR8R9，其中R8和R9獨立地選自H、任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基和任選地被取代的6-員芳基；NHCOR10，其中R10是任選地被取代的C1-4烷基、任選地被取代的C3-6環(huán)烷基、任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基或任選地被取代的6-員芳基；CH2CONR11R12，其中R11和R12獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基、任選地被取代的C2-6炔基和任選地被取代的5或6-員含氮雜環(huán)基，所述的雜環(huán)基任選地與任選地被取代的6-員芳基稠合；和(CH2)mNH13，其中R13選自任選地被取代的C1-6烷基和SO2R14，其中R14任選地選自被取代的C1-6烷基和任選地被取代的6-員芳基并且m是1到6；R5和R7獨立地選自H和鹵素；并且X是O或S，條件是(i)R2和R3中至少一個不是H；(ii)R5和R7中至少一個是鹵素；并且(iii)當(dāng)X是O，R5和R5是Cl并且R2是H的時候，則R3不是環(huán)丙基，或其鹽、水合物、溶劑合物、衍生物、前藥、互變異構(gòu)體和/或異構(gòu)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是式IA的化合物 其中R5和R7和X如權(quán)利要求1中所定義；并且R3是任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C1-4鏈烯基；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到3并且R6是任選地被取代的C3-6環(huán)烷基或任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基；NR8R9，其中R8是H并且R9是H或任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基；NHCOR10，其中R10是任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R3是任選地被取代的C1-4烷基；任選地被取代的C2-4鏈烯基；任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基，其任選地與任選地被取代的6-員芳基或雜芳基稠合；(CH2)nR6，其中n是1到3并且R6是任選地被取代的C3-6環(huán)烷基或任選地被取代的飽和或不飽和的5-或6-員含氮雜環(huán)基；NR8R9，其中R8是H并且R9是H或任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項的化合物，其是如下的化合物
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是式IB的化合物 其中R2、R5、R7和X如權(quán)利要求1中定義。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中R2是CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H、任選地被取代的C1-6烷基和任選地被取代的C3-6環(huán)烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5或6中任一項的化合物，其是如下的化合物
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是式1C的化合物 其中R5、R7和X如權(quán)利要求1中定義；和R2c是CH2NR1R4，其中R1和R4獨立地選自H和任選地被取代的C1-6烷基；并且R3c是任選地被取代的C1-4烷基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的化合物，其是如下的化合物
10.根據(jù)前面的任一項權(quán)利要求的化合物，其中R5和R7都是鹵素。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的化合物，其中R5和R7都是氯。
12.權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物作為藥物的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述的藥物是神經(jīng)治療劑或神經(jīng)保護劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的用途，其中所述的藥物是抗致淀粉樣變性藥物。
15.一種藥物組合物或獸藥組合物，其含有權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物和藥用或獸藥用可接受的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其還包括其他藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中所述的其他藥物是乙酰膽堿酯酶活性位點的抑制劑、抗氧化劑、消炎藥或雌激素劑。
18.一種治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)病癥的方法，包括給予需要的患者有效量的權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的神經(jīng)病癥是神經(jīng)變性疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的神經(jīng)變性疾病是神經(jīng)變性淀粉樣變性病。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述的神經(jīng)變性疾病是散發(fā)性或家族性阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、白內(nèi)障、帕金森病、克雅氏病及其與“瘋?！辈∮嘘P(guān)的新變種、亨廷頓舞蹈病、伴隨盧伊體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮癥、哈-斯氏病、彌漫性盧伊體疾病、致命性家族性失眠癥、格-斯-斯氏病、荷蘭型伴淀粉樣變-遺傳性腦出血、多發(fā)性硬化癥、Tauopathies、運動神經(jīng)元病或朊病毒病。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的神經(jīng)變性疾病是帕金森病。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項的方法，其中所述的神經(jīng)變性疾病是與Aβ相關(guān)的病癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中與Aβ相關(guān)的病癥是阿爾茨海默氏病，或者是與唐綜合癥或家族性阿爾茨海默氏病的若干常染色體顯性形式之一有關(guān)的癡呆。
25.根據(jù)權(quán)利要求18到24中任一項的方法，其減緩、減輕或阻止患者的認(rèn)知衰退。
26.根據(jù)權(quán)利要求18到25中任一項的方法，其進一步包括單獨、依次或同時給予其他的藥物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的其他的藥物是乙酰膽堿酯酶活性位點的抑制劑、抗氧化劑、消炎藥或雌激素劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求18到27中任一項的方法，其中式I的化合物經(jīng)口服、局部或胃腸外給藥。
29.權(quán)利要求1到11的任一項所定義的式I的化合物在制備用于治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)病癥的藥物中的用途。
30.權(quán)利要求1到11的任一項所定義的式I的化合物在用于治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)病癥中的用途。
31.一種用于治療、改善和/或預(yù)防神經(jīng)病癥的在權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物。
32.一種制備權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物的方法，該方法包括以下的步驟(a)使任選地被保護的式V的化合物 其中R5和R7如權(quán)利要求1中所定義，與H2NR9反應(yīng)，其中R3如權(quán)利要求1中所定義，以形成任選地被保護的式VII的化合物 (b)還原式VII的化合物以形成任選地被保護的式VIII的化合物 (c)環(huán)化式VIII的化合物以形成任選地被保護的式I的化合物，其中R2是H；或者(d)在R2CHO、R2CO2H或R2C(ORX)3的存在下環(huán)化式VIII的化合物，其中RX是任選地被取代的C1-4烷基或任選地被取代的6-員芳基。
33.一種制備權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物的方法，其中R2是H，該方法包括以下步驟(a)氨基化任選地被保護的式VI的化合物 其中R5和R7如權(quán)利要求1中所定義，以形成任選地被保護的式IX的化合物 IX；和(b)將式IX的化合物與R3-L或R3OSO2RX反應(yīng)，其中L是離去基團并且Rx如權(quán)利要求32中所定義。
34.一種制備權(quán)利要求1到11中任一項所定義的式I的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)將如權(quán)利要求33中定義的任選地被保護的式VI的化合物與甲?；噭┓磻?yīng)以形成任選地被保護的式X的化合物 X；或任選地被保護的式XI的化合物 (b)將式X或XI的化合物與含有R2的酰化劑反應(yīng)以形成任選地被保護的式XII的化合物 其中R2如權(quán)利要求1中所定義，或形成式XIII的化合物 XIII；和(c)將式XII或XIII的化合物與H2NR3反應(yīng)，其中R3如權(quán)利要求中1所定義。
35.一種制備式IV的化合物的方法， 其中R5和R7如權(quán)利要求1中所定義，該方法包括將式III的化合物重氮化的步驟
36.一種制備如權(quán)利要求32中所定義的式V的化合物的方法，該方法包括以下步驟；(a)將如權(quán)利要求35中所定義的式III的化合物重氮化以形成如權(quán)利要求35中所定義的式IV的化合物；并且(b)硝化式IV的化合物。
37.一種制備如權(quán)利要求33所定義的式VI的化合物的方法，該方法包括以下步驟；(a)將如權(quán)利要求3 5中所定義的式IV的化合物重氮化以形成如權(quán)利要求32中所定義的式V的化合物；(b)硝化式VI的化合物以形成式V的化合物；并且(c)還原式V的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)活性化合物，它們是具有兩個稠合的6－員環(huán)的雜環(huán)化合物，其中在1和3位具有氮原子，在4位具有羧基并且在8位具有羥基，其中兩個環(huán)都是芳香性的。也公開了這些化合物的制備方法以及它們作為藥物或獸藥的用途，特別是用于治療神經(jīng)病癥，更具體地是用于治療神經(jīng)變性病癥例如阿爾茨海默氏病。
文檔編號C07D401/14GK101018772SQ200580018043
公開日2007年8月15日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者蓋克·B·科克, 布倫達·K·Y·勒恩格 申請人:普拉納生物技術(shù)有限公司