專利名稱：用于診斷視網(wǎng)膜血管病的包含醛縮酶的組合物以及應(yīng)用它診斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷視網(wǎng)膜血管病的包含醛縮酶蛋白質(zhì)的組合物，包含所述蛋白質(zhì)的試劑盒，以及診斷視網(wǎng)膜血管病的方法，該方法包括，將血樣與醛縮酶蛋白質(zhì)接觸，并且定量分析形成的抗原-抗體復(fù)合物。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種在微血管系統(tǒng)中引起損傷的復(fù)雜的代謝病。該疾病造成全身組織寬范圍的障礙，而且是尤其影響眼睛的最重要的系統(tǒng)病(TH Lee和YG Choi，Diabetic Vascular Complications(糖尿病性血管并發(fā)癥)，1993，Korea Medical Book Publisher，Seoul，Korea)。其中，糖尿病性視網(wǎng)膜病是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，而且正隨著因生活標(biāo)準(zhǔn)的改善和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致的預(yù)期壽命的延長而變成日益重要的社會問題(Klein R.等，Arch Ophthalmol.，102，520-532，1984)。有兩類糖尿病性視網(wǎng)膜病非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病(NPDR)，其中，視網(wǎng)膜中由血管病引起的損傷都在視網(wǎng)膜內(nèi)；以及增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病(PDR)，其中，視網(wǎng)膜上生長的新血管滲透玻璃體(Green，見Spencer WH，ed.，Ophthalmic Pathologyanatlas and textbook.4thed.，PhiladelphiaWB Saunder；1124-1129，1996)。糖尿病性視網(wǎng)膜病視力缺損是由玻璃體出血和黃斑區(qū)中的牽引性視網(wǎng)膜脫離以及黃斑變性引起的，已知手術(shù)和激光治療是有效的(Diabetic RetinopathyStudy Report Number 14，Int Ophthalmol Clin.，27，239-253，1987)。當(dāng)在適當(dāng)時期進(jìn)行該處理時，能以最小的副作用預(yù)防視力喪失。因此，重要的是頻繁地進(jìn)行糖尿病性視網(wǎng)膜病的診斷以便確定外科手術(shù)的適當(dāng)時間。
糖尿病性視網(wǎng)膜病是通過眼底攝影術(shù)檢查眼底的特征性結(jié)構(gòu)變化而診斷的，這通常是在眼科醫(yī)院進(jìn)行的。對于患有糖尿病而沒有意識到視覺異?；蛘邲]有接受定期眼科檢查的患者診斷早期糖尿病性視網(wǎng)膜病是困難的。所以，當(dāng)病況進(jìn)展過度而不能預(yù)防時，糖尿病患者通常接受手術(shù)治療。
這樣，需要尋找一種在其早期準(zhǔn)確地診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法，但還沒有報(bào)導(dǎo)過合適的方法。
基于該背景，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，在糖尿病性視網(wǎng)膜病患者中由于視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)暴露于免疫系統(tǒng)中而形成了自身抗體，但在正常情況下由于眼血管中存在血眼屏障，視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)沒有暴露于免疫系統(tǒng)中。本發(fā)明人篩選了產(chǎn)生自身抗體的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了可通過檢測患者中醛縮酶蛋白質(zhì)的自身抗體以高可靠性診斷視網(wǎng)膜血管病。
發(fā)明公開因此，本發(fā)明一個目的是提供一種診斷視網(wǎng)膜血管病的組合物，它包含醛縮酶蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一個目的是提供一種用于視網(wǎng)膜血管病的診斷盒，它包含醛縮酶蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種診斷視網(wǎng)膜血管病的方法，它包括，將生物樣品與醛縮酶蛋白質(zhì)接觸，并且檢測形成的抗原-自身抗體復(fù)合物。
附圖簡述結(jié)合到本說明書中并且占本說明書一部分的附圖闡述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，而且可與下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述一起描述了本發(fā)明的原理。


圖1示出了應(yīng)用人視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的細(xì)胞溶膠部分和膜部分通過蛋白質(zhì)印跡分析，篩選從正常受試驗(yàn)者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者和患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者中獲得的血清樣品的結(jié)果。
圖2示出了人視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的二維(2-D)電泳結(jié)果。
圖3a示出了已被分割成四片的圖2的2-D電泳凝膠的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，應(yīng)用健康男性受試驗(yàn)者的血清；圖3b示出了已被分割成四片的圖2的2-D電泳凝膠的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，應(yīng)用患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清；圖3c示出了已被分割成四片的圖2的2-D電泳凝膠的蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果，應(yīng)用患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清；圖4示出了應(yīng)用肌酸激酶B，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法分析來自正常受試驗(yàn)者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者和患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清而診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的結(jié)果；圖5示出了應(yīng)用醛縮酶，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法分析來自正常受試驗(yàn)者、糖尿病患者、患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者和患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清而診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的結(jié)果；以及圖6示出了應(yīng)用醛縮酶，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法分析來自例如通過外科手術(shù)成功地治療的糖尿病性視網(wǎng)膜病患者、以及患有進(jìn)行性糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清而診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式一方面，本發(fā)明提供了一種診斷視網(wǎng)膜血管病的組合物，它包含醛縮酶。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“診斷”表示檢測致病狀態(tài)的存在或性質(zhì)。就本發(fā)明的目的來說，“診斷”表示檢測視網(wǎng)膜血管病。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“視網(wǎng)膜血管病”表示其中視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)暴露于眼血管的所有疾病。視網(wǎng)膜血管病(其中，在血液內(nèi)產(chǎn)生針對視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的自身抗體)可通過檢測這類自身抗體的產(chǎn)生而診斷。在本發(fā)明中，視網(wǎng)膜血管病是通過檢測針對醛縮酶蛋白質(zhì)的自身抗體的形成來診斷的。所以，就本發(fā)明的目的來說，視網(wǎng)膜血管病包括產(chǎn)生針對醛縮酶的自身抗體的所有視網(wǎng)膜血管病。視網(wǎng)膜血管病的非限制性實(shí)例包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、與年齡相關(guān)的黃斑變性和視網(wǎng)膜水腫。最優(yōu)選的實(shí)例是糖尿病性視網(wǎng)膜病。抵抗醛縮酶C的自身抗體的檢測能有效地診斷非增生的和增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病這兩者。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“自身抗體”表示這種抗體與免疫系統(tǒng)內(nèi)抵抗外源性抗原而產(chǎn)生的抗體不同，它是抵抗內(nèi)源性或天然的底物而產(chǎn)生的。就本發(fā)明的目的來說，自身抗體表示視網(wǎng)膜血管病中抵抗暴露的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的自身抗體。下表2中描述了產(chǎn)生自身抗體的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)。這些自身抗體通常是不可檢測的或者至多以可忽視的水平在正常個體或糖尿病患者中檢測到，但在例如糖尿病性視網(wǎng)膜病這樣的視網(wǎng)膜血管疾病中增大到顯著的水平。
本發(fā)明人通過一維和二維蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)了，表2中列出的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)是發(fā)生諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病這樣的疾病時產(chǎn)生自身抗體的蛋白質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)了，可通過檢測針對這些蛋白質(zhì)的自身抗體而成功地診斷視網(wǎng)膜血管病。
當(dāng)應(yīng)用表2中列出的蛋白質(zhì)通過酶聯(lián)免疫吸附測定法分析糖尿病患者的血樣時，能通過檢測抗醛縮酶C的自身抗體有意義地診斷視網(wǎng)膜血管病。如本文應(yīng)用的術(shù)語“意義”表示這樣的診斷結(jié)果，它們具有得自準(zhǔn)確結(jié)果的高有效性，以及在重復(fù)測定時提供恒定結(jié)果的高可靠性。
將醛縮酶蛋白質(zhì)用作抗原以便檢測包括血漿、血清和血液的生物樣品中存在的抗醛縮酶C的自身抗體。
醛縮酶，本文應(yīng)用的作為本發(fā)明中與抗醛縮酶C的自身抗體的免疫復(fù)合物的抗原，包括醛縮酶A、醛縮酶B和醛縮酶C。
有三種醛縮酶同工酶，即，醛縮酶A、B和C，而且這些同工酶表現(xiàn)不同的組織分布。醛縮酶A主要在肌肉和紅細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)，醛縮酶B主要在肝、腎和小腸內(nèi)被表達(dá)，而醛縮酶C則主要在腦和神經(jīng)組織內(nèi)被表達(dá)。醛縮酶A、B和C之間的氨基酸序列存在很高的同源性，而且已知在它們的總體折疊和活性部位結(jié)構(gòu)中，同工酶A、B和C的結(jié)構(gòu)幾乎是相同的(Arakaki等，Protein Sci.，2004年12月，13(12)3077～3084)。還有，已知動物種類(例如人、大鼠、小鼠等)之間醛縮酶是高度同源的。考慮到所述復(fù)合物中的抗原和抗體之間的相互作用是通過由蛋白質(zhì)的氨基酸序列確定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來決定的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，醛縮酶A和B以及醛縮酶C都能與醛縮酶C的自身抗體結(jié)合。
因此，可用作本發(fā)明的自身抗體檢測用抗原的醛縮酶蛋白質(zhì)可以是醛縮酶A、醛縮酶B或醛縮酶C，它來源于包括人、山羊、母牛、猴、綿羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠的動物，只要它與自身抗體結(jié)合并形成抗原-自身抗體復(fù)合物即可。由于針對醛縮酶A和B的自身抗體不在視網(wǎng)膜血管病中形成，所以當(dāng)醛縮酶A或醛縮酶B被用作檢測抗原時，交叉反應(yīng)性不是關(guān)注的原因。在下文將描述的實(shí)施例4和5中，當(dāng)將從兔肌肉分離的醛縮酶(Sigma，A2714)用作檢測自身抗體的抗原時，將患有增生的和非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者與正常受試驗(yàn)者和僅僅患有糖尿病的患者區(qū)別開來。
此外，本文用作抗原的醛縮酶包括醛縮酶變體，它們的實(shí)例是氨基酸序列變體。如本文應(yīng)用的術(shù)語“氨基酸序列變體”表示具有一條包含一個或多個與天然氨基酸序列不同的氨基酸殘基的序列，而且可能是天然產(chǎn)生的或人工產(chǎn)生的。氨基酸序列的改變包括通過缺失、插入、保守的或非保守的置換或其組合產(chǎn)生的變體。優(yōu)選的是具有70％或更高的同源性的變體。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“同源性”表示與野生型氨基酸序列相比的序列相似性的程度?？赏ㄟ^手工或應(yīng)用可商購的程序進(jìn)行同源性評價。應(yīng)用可商購的計(jì)算機(jī)程序，兩條或更多條序列之間的同源性可以百分?jǐn)?shù)(％)表示。本發(fā)明包括具有與編碼野生型醛縮酶的氨基酸序列的70％或更高、更優(yōu)選具有80％或更高、甚至更優(yōu)選90％或更高的同源性的氨基酸序列。
醛縮酶變體是一種發(fā)揮與天然蛋白質(zhì)相同的生物活性的功能等同物，或者優(yōu)選是對自身抗體具有增強(qiáng)的結(jié)合親和性或結(jié)合特異性的變體。
此外，用作針對醛縮酶C的自身抗體(抗-醛縮酶C自身抗體)的抗原的醛縮酶包括前述醛縮酶的抗原片段。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“抗原片段”表示含有一個或多個能特異性地與抗體(具體是抗-醛縮酶C自身抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的表位的片段。詳細(xì)說來，抗原片段是醛縮酶A、醛縮酶B、醛縮酶C或其變體的片段，它包括一個或多個表位。對片段的長度沒有特別限制，只要它充當(dāng)特異性地結(jié)合自身抗體的抗原即可。
醛縮酶可通過本領(lǐng)域普遍已知的各種方法獲得，包括從天然源提取和純化，應(yīng)用固相肽合成技術(shù)的化學(xué)合成，以及無細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。還有，可利用基因重組技術(shù)從動物細(xì)胞或微生物分離和純化重組蛋白質(zhì)。當(dāng)應(yīng)用基因重組技術(shù)時，可通過下列方法獲得醛縮酶將編碼醛縮酶蛋白質(zhì)的核酸插入合適的表達(dá)載體，用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而表達(dá)醛縮酶，然后從所述宿主細(xì)胞回收表達(dá)的醛縮酶?？赏ㄟ^一般的生化分離技術(shù)來分離和純化醛縮酶，例如，用蛋白質(zhì)沉淀劑處理(鹽析)，離心，超聲處理，超濾，透析，各種色譜技術(shù)，包括分子篩色譜法(凝膠過濾)、吸收色譜法、離子交換色譜法和親和色譜法。通常，利用兩種或多種組合的技術(shù)以便分離高度純化的蛋白質(zhì)。
用作本發(fā)明的抗-醛縮酶C自身抗體的抗原的醛縮酶的詳細(xì)實(shí)例包括具有序列號1的氨基酸序列的人醛縮酶A(基因庫NP_908932，NP_908930)、具有序列號2的氨基酸序列的人醛縮酶B(基因庫NP_000026，CAI14615)和具有序列號3的氨基酸序列的人醛縮酶C(基因庫AAP35652，NP_00515)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷視網(wǎng)膜血管病的試劑盒，它包含醛縮酶。
用來通過測定生物樣品中抗-醛縮酶C自身抗體的水平而診斷視網(wǎng)膜血管病的試劑盒，包含用作與抗-醛縮酶C自身抗體反應(yīng)的抗原的醛縮酶蛋白質(zhì)。
抗原-抗體復(fù)合物形成可通過免疫技術(shù)檢測，例如蛋白質(zhì)印跡法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、放射免疫擴(kuò)散、奧脫洛尼免疫擴(kuò)散(ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫電泳、組織免疫染色、免疫沉淀分析、補(bǔ)體結(jié)合分析、免疫熒光法、FACS和蛋白質(zhì)碎片，但本發(fā)明不限于這些實(shí)例。
除了與自身抗體特異性地結(jié)合的醛縮酶以外，本發(fā)明用于診斷視網(wǎng)膜血管病的試劑盒還可包括常用于免疫分析領(lǐng)域中的工具、試劑等。這些工具/試劑包括但不限于合適的載體、能產(chǎn)生可檢測到的信號的標(biāo)記物質(zhì)、加溶劑、洗滌劑、緩沖劑和穩(wěn)定劑。當(dāng)所述標(biāo)記物質(zhì)是酶時，所述試劑盒可含有能測定酶活性的底物和反應(yīng)終止劑。本發(fā)明的診斷盒可呈微量培養(yǎng)板、浸量尺器具(dip-stick device)、免疫層析檢測條、徑向分配免疫測定裝置、流通式裝置等的型式。另外，本發(fā)明的診斷盒可含有正性和負(fù)性標(biāo)準(zhǔn)對比物。
優(yōu)選地，所述診斷盒是一種酶聯(lián)免疫吸附測定診斷盒。酶聯(lián)免疫吸附測定包括多種酶聯(lián)免疫吸附測定法，包括一種酶聯(lián)免疫吸附測定法，它利用識別與固定在固態(tài)載體上的抗原形成復(fù)合物的捕捉抗體的次級標(biāo)記抗體；以及夾心式酶聯(lián)免疫吸附測定法，其中，這樣檢測與固定在固態(tài)載體上的抗體結(jié)合的捕捉抗原，即，首先添加一種抗原特異性抗體，然后添加結(jié)合該抗原特異性抗體的次級標(biāo)記抗體。更優(yōu)選地，抗原-抗體復(fù)合物形成是通過這種酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測的其中，使血清樣品與固定在固態(tài)載體上的抗體反應(yīng)，再通過添加與抗原特異性抗體結(jié)合的次級標(biāo)記抗體而檢測形成的抗原-抗體復(fù)合物，接著酶促展開。
前述酶聯(lián)免疫吸附測定診斷盒可能包括一種次級抗體結(jié)合，它與醛縮酶C的自身抗體結(jié)合。用檢測標(biāo)記標(biāo)記的次級抗體優(yōu)選是抗-人免疫球蛋白G或抗-人免疫球蛋白M抗體。所述次級抗體起檢測抗體的作用。由于次級抗體具有一個檢測標(biāo)記，自身抗體的量可通過測定所述檢測標(biāo)記的信號大小來確定。
所述檢測標(biāo)記可選自下組物質(zhì)酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒、氧化還原分子和放射性同位素，但本發(fā)明不限于這些實(shí)例?？勺鳛闄z測標(biāo)記得到的酶的實(shí)例包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、過氧化物酶或堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖氧化酶、己糖激酶和鳥苷二磷酸酶(GDPase)、RNA酶(RNase)、葡糖氧化酶和熒光素酶、果糖磷酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶和β-內(nèi)酰胺酶(β-latamase)。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于熒光生、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛(o-phthaldehyde)和熒光胺(fluorescamin)。配體的實(shí)例包括但不限于生物素衍生物。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于吖啶酯、熒光素和熒光素酶。微粒的實(shí)例包括但不限于膠態(tài)金和有色膠乳。氧化還原分子的實(shí)例包括但不限于二茂鐵、釕絡(luò)合物、viologen、醌、Ti離子、Cs離子、二酰亞胺、1，4-苯醌、氫醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+和[MO(CN)8]4-。放射性同位素的實(shí)例包括但不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及一種診斷視網(wǎng)膜血管病的方法，它包括，使生物樣品與醛縮酶接觸，并且檢測形成的抗原-自身抗體復(fù)合物。
利用該方法，可以診斷懷疑患有視網(wǎng)膜血管病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者，從而通過將該患者的樣品中抗原-自身抗體復(fù)合物的水平與對照者中的那些比較來確定該患者實(shí)際上是否患有所述疾病。
其中檢測抗-醛縮酶自身抗體的生物樣品包括但不限于血液、血清和血漿。
如本文應(yīng)用的術(shù)語“抗原-自身抗體復(fù)合物”表示抗-醛縮酶C自身抗體和醛縮酶抗原的結(jié)合產(chǎn)物。形成的抗原-抗體復(fù)合物的量可利用與自身抗體反應(yīng)的次級抗體來定量地測定。
例如，診斷視網(wǎng)膜血管病的方法包括下列步驟1)使生物樣品與醛縮酶接觸而形成抗原-自身抗體復(fù)合物；2)將該復(fù)合物與針對自身抗體的次級標(biāo)記抗體一起保溫；以及3)測定所述次級標(biāo)記抗體的信號大小。
這里，可通過評價絕對的(例如μg/ml)或相對的(例如信號的相對強(qiáng)度)差異來診斷視網(wǎng)膜血管病以確定對比物和目標(biāo)樣品之間是否存在形成的抗原-自身抗體復(fù)合物的水平的顯著差異。
用來形成抗原-自身抗體復(fù)合物的抗原可包括前述醛縮酶同工酶，其變體或片段及其抗獨(dú)特型抗體。如本文應(yīng)用的術(shù)語“抗獨(dú)特型抗體”表示識別可變區(qū)(即，抗體的獨(dú)特型區(qū))的抗體。就本發(fā)明的目的來說，抗獨(dú)特型抗體是針對抗-醛縮酶C自身抗體的抗體。
通過如下實(shí)施例可獲得對本發(fā)明的更好理解，給出這些實(shí)施例是為了闡述而不能認(rèn)為是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法對針對人視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的自身抗體的分析人視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的分離從人眼(由Shinchon Severance Hospital，Seoul，Korea提供)切除視網(wǎng)膜并用生理鹽水漂洗數(shù)次。利用ProteoPrep UniversalExtraction Kit(Sigma S2813)獲得彼此分離的細(xì)胞溶膠部分和膜部分，并且應(yīng)用Pierce BCA Protein Assay Kit 23227(Pierce，USA)測定兩部分的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)濃度。
應(yīng)用視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡分析篩選來自正常受試驗(yàn)者和患者的血清如下述通過蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)抗-視網(wǎng)膜自身抗體的存在。將30μg總的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)在12％丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳操作，再轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。將所述印跡與來自正常受試驗(yàn)者、糖尿病患者(DM)、患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病(NPDR)的患者和患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病(PDR)的患者的血清樣品(由Shinchon SeveranceHospital，Seoul，Korea提供)中所含的抗體一起保溫，然后與作為次級抗體的用過氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)標(biāo)記的抗-人免疫球蛋白G(IgG)抗體一起保溫。將結(jié)果歸納于下表1中，還給出于圖1中。
表1

在表1中，“DM”表示糖尿病患者，“NPDR”表示患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者，而“PDR”表示患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者。符號“+”表示蛋白質(zhì)印跡中出現(xiàn)一個正帶，而該符號的數(shù)量表示該帶的強(qiáng)度。
實(shí)施例2人視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的2-D凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡2-D凝膠電泳應(yīng)用二維(2-D)電泳，即一種利用蛋白質(zhì)的兩個不同性質(zhì)的逐步分離方法來分離視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)。首先，通過對蛋白質(zhì)施加電刺激使蛋白質(zhì)按pH(pH 3～10梯度)遷移。其次，使蛋白質(zhì)按分子量在丙烯酰胺凝膠(8～18％梯度)上遷移。以50mA/凝膠的電流進(jìn)行第一維凝膠電泳(按pH的蛋白質(zhì)遷移)達(dá)12小時，再在聚丙烯酰胺凝膠上以50mA/凝膠的電流進(jìn)行第二維凝膠電泳(按分子量的蛋白質(zhì)遷移)達(dá)6小時。用染料考馬斯亮藍(lán)-250將這樣遷移的蛋白質(zhì)染色，還通過銀染色分析。根據(jù)上述方法制備了總計(jì)四塊凝膠。對凝膠之一估測了蛋白質(zhì)分布，正常受試驗(yàn)者具有在2-D凝膠上的該蛋白質(zhì)分布，結(jié)果給出于圖2中。圖2中的數(shù)字表示下表2的斑點(diǎn)號。將余下的三塊凝膠分別切割成四片并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析。
蛋白質(zhì)印跡法對2-D電泳凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析以鑒定抗-視網(wǎng)膜自身抗體。根據(jù)與實(shí)施例1中相同的方法，應(yīng)用正常受試驗(yàn)者、患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者和患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析。結(jié)果給出于圖3a、3b和3c中。
為了研究正常受試驗(yàn)者和患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者之間血清抗體的差異，利用圖像分析軟件Phoretix(Nonlinear dynamics，Great Britain)分析2-D凝膠圖像。利用MALDI-TOF質(zhì)譜分析法，通過比較所述兩組分析了從2-D電泳凝膠獲得的斑點(diǎn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者血清中存在針對下表2中列出的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的自身抗體。將關(guān)于患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者中出現(xiàn)的自身抗體的抗原性蛋白質(zhì)歸納于下表2中。
表2

實(shí)施例3應(yīng)用肌酸激酶B通過酶聯(lián)免疫吸附測定法診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病考查應(yīng)用肌酸激酶B的酶聯(lián)免疫吸附測定法以確定它是否有效地區(qū)分來自患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清與來自正常受試驗(yàn)者和只患有糖尿病的患者的血清。
應(yīng)用來自三名正常受試驗(yàn)者、十名沒有患糖尿病性視網(wǎng)膜病的糖尿病患者和二十名患糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清(由ShinchonSeverance Hospital，Seoul，Korea提供)進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測定。
首先，在室溫下用100μl以10μg/ml溶于涂布緩沖液(50mMNaHCO3，pH 9.0)的肌酸激酶B(Sigma，C6638)涂布96孔EIA板的每個孔(每孔1μg蛋白質(zhì))達(dá)1hr。用400μl PBST(磷酸鹽緩沖鹽水，0.05％Tween 20)洗滌板的每個孔兩次(每次洗滌10min)后，用封閉液1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液處理。然后，往每孔添加100μl用PBST稀釋的患者血清，接著保溫1hr。用PBS洗滌五次后，使每孔與100μl用過氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)標(biāo)記的抗-人IgG抗體稀溶液反應(yīng)1hr。用PBS洗滌三次后，使每孔與100μl的含1mg/ml OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽)和0.03％H2O2的0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH 4.9)在室溫下反應(yīng)30min。用100μl 3M硫酸終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫吸附測定讀出器測定了450nm處的吸光度。圖4中給出了結(jié)果。
結(jié)果，對正常受試驗(yàn)者來說平均吸光度值是0.04，對只患糖尿病的患者是0.05，對患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者是0.08，以及對患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者是0.08。
患有非增生的和增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清中抗-肌酸激酶B自身抗體的水平高于正常受試驗(yàn)者和只患糖尿病的患者的水平，而且利用肌酸激酶B作為抗原有效地檢測了抗-肌酸激酶B自身抗體。
實(shí)施例4應(yīng)用醛縮酶通過酶聯(lián)免疫吸附測定法診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病應(yīng)用醛縮酶作為抗原通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測針對醛縮酶C的自身抗體而診斷了糖尿病性視網(wǎng)膜病。該實(shí)施例中應(yīng)用的醛縮酶抗原是可商購的，而且得自兔肌肉。
應(yīng)用來自三名正常受試驗(yàn)者、十名沒有患糖尿病性視網(wǎng)膜病的糖尿病患者和二十名患糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清(由ShinchonSeverance Hospital，Seoul，Korea提供)進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測定。首先，在室溫下用100μl以10μg/ml溶于涂布緩沖液(50mM NaHCO3，pH 9.0)的醛縮酶(Sigma，A2714)涂布96孔EIA板的每個孔(每孔1μg蛋白質(zhì))達(dá)1hr。用400μl PBST洗滌板的每個孔兩次(每次洗滌10min)后，用封閉液1％BSA的PBS溶液處理。然后，往每孔添加100μl用PBST稀釋的患者血清，接著保溫1hr。用PBS洗滌五次后，使每孔與100μl用過氧化物酶(KOMA Biotech Inc.，Korea)標(biāo)記的抗-人IgG抗體稀溶液反應(yīng)1hr。用PBS洗滌三次后，使每孔與100μl的含1mg/ml OPD和0.03％H2O2的0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH 4.9)在室溫下反應(yīng)30min。用100μl 3M硫酸終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫吸附測定讀出器測定450nm處的吸光度。圖5中給出了結(jié)果。
結(jié)果，對正常受試驗(yàn)者來說平均吸光度值是0.78，對只患糖尿病的患者是0.84，對患有非增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者是0.98，而且對患有增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者是1.0。利用正常受試驗(yàn)者的血清作空白，與來自只患糖尿病的患者和正常受試驗(yàn)者的血清樣品相比，來自患有糖尿病性視網(wǎng)膜病(增生的和非增生的)的患者的血清樣品表現(xiàn)出大于約3的增大的吸光度差異。
這些結(jié)果說明了，可應(yīng)用醛縮酶作為抗原通過檢測針對醛縮酶C的自身抗體的血清水平的增大來診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病。
實(shí)施例5應(yīng)用醛縮酶通過酶聯(lián)免疫吸附測定法評估治療后的糖尿病性視網(wǎng)膜病通過酶聯(lián)免疫吸附測定法評估了已接受了諸如外科手術(shù)這樣的治療的糖尿病性視網(wǎng)膜病患者的治療后結(jié)果。應(yīng)用來自六名患進(jìn)行性糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者和十一名已經(jīng)治療(例如通過外科手術(shù))過糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的血清(由Shinchon Severance Hospital，Seoul，Korea提供)進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測定。
根據(jù)與實(shí)施例4中相同的方法進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附測定。測定了450nm處的吸光度，圖6中給出了結(jié)果。結(jié)果，對于通過例如外科手術(shù)成功地治療后的糖尿病性視網(wǎng)膜病患者來說，平均吸光度值是0.112，而對于盡管治療過仍在發(fā)展糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者是0.451，所以顯示大于約3的吸光度差異。
發(fā)現(xiàn)了成功地治療后的糖尿病性視網(wǎng)膜病患者中抗-醛縮酶C自身抗體的血清水平降低了。這些結(jié)果表明，針對醛縮酶C的自身抗體的檢測導(dǎo)致有效地分析患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的治療后結(jié)果。
由于本說明書中公開的實(shí)施例和附圖中示出的結(jié)構(gòu)不代表本發(fā)明的全部技術(shù)實(shí)質(zhì)而只是本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，在申請本發(fā)明之時，能替代它們的各種等同物和修飾都是可能的。
工業(yè)適用性本發(fā)明的診斷視網(wǎng)膜血管病的組合物、含有它的試劑盒和應(yīng)用它的分析方法能簡單而迅速地診斷視網(wǎng)膜血管病。此外，由于本方法應(yīng)用了免疫技術(shù)，它提供了與常規(guī)試驗(yàn)方法相比優(yōu)異的準(zhǔn)確性和精確性，而且是非常節(jié)省成本的。
序列表<110>KUHNIL PHARM.CO.，LTD<120>用于診斷視網(wǎng)膜血管病的包含醛縮酶的組合物以及應(yīng)用它診斷的方法<150>KR10-2004-0052385<151>2004-07-06<160>3<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>364<212>PRT<213>人<400>1Met Pro Tyr Gln Tyr Pro Ala Leu Thr Pro Glu Gln Lys Lys Glu Leu1 5 10 15Ser Asp Ile Ala His Arg Ile Val Ala Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala20 25 30Ala Asp Glu Ser Thr Gly Ser Ile Ala Lys Arg Leu Gln Ser Ile Gly35 40 45Thr Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg Arg Phe Tyr Arg Gln Leu Leu Leu50 55 60Thr Ala Asp Asp Arg Val Asn Pro Cys Ile Gly Gly Val Ile Leu Phe65 70 75 80His Glu Thr Leu Tyr Gln Lys Ala Asp Asp Gly Arg Pro Phe Pro Gln85 90 95Val Ile Lys Ser Lys Gly Gly Val Val Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly100 105 110Val Val Pro Leu Ala Gly Thr Asn Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu115 120 125Asp Gly Leu Ser Glu Arg Cys Ala Gln Tyr Lys Lys Asp Gly Ala Asp130 135 140
Phe Ala Lys Trp Arg Cys Val Leu Lys Ile Gly Glu His Thr Pro Ser145 150 155 160Ala Leu Ala Ile Met Glu Asn Ala Asn Val Leu Ala Arg Tyr Ala Ser165 170 175Ile Cys Gln Gln Asn Gly Ile Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu180 185 190Pro Asp Gly Asp His Asp Leu Lys Arg Cys Gln Tyr Val Thr Glu Lys195 200 205Val Leu Ala Ala Val Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Ile Tyr Leu210 215 220Glu Gly Thr Leu Leu Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly His Ala Cys225 230 235 240Thr Gln Lys Phe Ser His Glu Glu Ile Ala Met Ala Thr Val Thr Ala245 250 255Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Ala Val Thr Gly Ile Thr Phe Leu Ser260 265 270Gly Gly Gln Ser Glu Glu Glu Ala Ser Ile Asn Leu Asn Ala Ile Asn275 280 285Lys Cys Pro Leu Leu Lys Pro Trp Ala Leu Thr Phe Ser Tyr Gly Arg290 295 300Ala Leu Gln Ala Ser Ala Leu Lys Ala Trp Gly Gly Lys Lys Glu Asn305 310 315 320Leu Lys Ala Ala Gln Glu Glu Tyr Val Lys Arg Ala Leu Ala Asn Ser325 330 335Leu Ala Cys Gln Gly Lys Tyr Thr Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala340 345 350Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser Asn His Ala Tyr355 360
<210>2<211>364<212>PRT<213>人<400>2Met Ala His Arg Phe Pro Ala Leu Thr Gln Glu Gln Lys Lys Glu Leu1 5 10 15Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Val Ala Asn Gly Lys Gly Ile Leu Ala20 25 30Ala Asp Glu Ser Val Gly Thr Met Gly Asn Arg Leu Gln Arg Ile Lys35 40 45Val Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg Arg Gln Phe Arg Glu Ile Leu Phe50 55 60Ser Val Asp Ser Ser Ile Asn Gln Ser Ile Gly Gly Val Ile Leu Phe65 70 75 80His Glu Thr Leu Tyr Gln Lys Asp Ser Gln Gly Lys Leu Phe Arg Asn85 90 95Ile Leu Lys Glu Lys Gly Ile Val Val Gly Ile Lys Leu Asp Gln Gly100 105 110Gly Ala Pro Leu Ala Gly Thr Asn Lys Glu Thr Thr Ile Gln Gly Leu115 120 125Asp Gly Leu Ser Glu Arg Cys Ala Gln Tyr Lys Lys Asp Gly Val Asp130 135 140Phe Gly Lys Trp Arg Ala Val Leu Arg Ile Ala Asp Gln Cys Pro Ser145 150 155 160Ser Leu Ala Ile Gln Glu Asn Ala Asn Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Ser165 170 175Ile Cys Gln Gln Asn Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Val Ile180 185 190Pro Asp Gly Asp His Asp Leu Glu His Cys Gln Tyr Val Thr Glu Lys195 200 205
Val Leu Ala Ala Val Tyr Lys Ala Leu Asn Asp His His Val Tyr Leu210 215 220Glu Gly Thr Leu Leu Lys Pro Asn Met Val Thr Ala Gly His Ala Cys225 230 235 240Thr Lys Lys Tyr Thr Pro Glu Gln Val Ala Met Ala Thr Val Thr Ala245 250 255Leu His Arg Thr Val Pro Ala Ala Val Pro Gly Ile Cys Phe Leu Ser260 265 270Gly Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Thr Leu Asn Leu Asn Ala Ile Asn275 280 285Leu Cys Pro Leu Pro Lys Pro Trp Lys Leu Ser Phe Ser Tyr Gly Arg290 295 300Ala Leu Gln Ala Ser Ala Leu Ala Ala Trp Gly Gly Lys Ala Ala Asn305 310 315 320Lys Glu Ala Thr Gln Glu Ala Phe Met Lys Arg Ala Met Ala Asn Cys325 330 335Gln Ala Ala Lys Gly Gln Tyr Val His Thr Gly Ser Ser Gly Ala Ala340 345 350Ser Thr Gln Ser Leu Phe Thr Ala Cys Tyr Thr Tyr355 360<210>3<211>364<212>PRT<213>人<400>3Met Pro His Ser Tyr Pro Ala Leu Ser Ala Glu Gln Lys Lys Glu Leu1 5 10 15Ser Asp Ile Ala Leu Arg Ile Val Ala Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala20 25 30
Ala Asp Glu Ser Val Gly Ser Met Ala Lys Arg Leu Ser Gln Ile Gly35 40 45Val Glu Asn Thr Glu Glu Asn Arg Arg Leu Tyr Arg Gln Val Leu Phe50 55 60Ser Ala Asp Asp Arg Val Lys Lys Cys Ile Gly Gly Val Ile Phe Phe65 70 75 80His Glu Thr Leu Tyr Gln Lys Asp Asp Asn Gly Val Pro Phe Val Arg85 90 95Thr Ile Gln Asp Lys Gly Ile Val Val Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly100 105 110Val Val Pro Leu Ala Gly Thr Asp Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu115 120 125Asp Gly Leu Ser Glu Arg Cys Ala Gln Tyr Lys Lys Asp Gly Ala Asp130 135 140Phe Ala Lys Trp Arg Cys Val Leu Lys Ile Ser Glu Arg Thr Pro Ser145 150 155 160Ala Leu Ala Ile Leu Glu Asn Ala Asn Val Leu Ala Arg Tyr Ala Ser165 170 175Ile Cys Gln Gln Asn Gly Ile Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu180 185 190Pro Asp Gly Asp His Asp Leu Lys Arg Cys Gln Tyr Val Thr Glu Lys195 200 205Val Leu Ala Ala Val Tyr Lys Ala Leu Ser Asp His His Val Tyr Leu210 215 220Glu Gly Thr Leu Leu Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly His Ala Cys225 230 235 240Pro Ile Lys Tyr Thr Pro Glu Glu Ile Ala Met Ala Thr Val Thr Ala245 250 255Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Ala Val Pro Gly Val Thr Phe Leu Ser260 265 270
Gly Gly Gln Ser Glu Glu Glu Ala Ser Phe Asn Leu Asn Ala Ile Asn275 280 285Arg Cys Pro Leu Pro Arg Pro Trp Ala Leu Thr Phe Ser Tyr Gly Arg290 295 300Ala Leu Gln Ala Ser Ala Leu Asn Ala Trp Arg Gly Gln Arg Asp Asn305 310 315 320Ala Gly Ala Ala Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Ala Glu Val Asn Gly325 330 335Leu Ala Ala Gln Gly Lys Tyr Glu Gly Ser Gly Glu Asp Gly Gly Ala340 345 350Ala Ala Gln Ser Leu Tyr Ile Ala Asn His Ala Tyr355 360
權(quán)利要求
1.一種診斷視網(wǎng)膜血管病的組合物，它包含醛縮酶。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中，所述醛縮酶是醛縮酶A、醛縮酶B、醛縮酶C、它的70％同源變體或其抗原片段。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中，所述視網(wǎng)膜血管病選自下組疾病糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜水腫以及與年齡相關(guān)的黃斑變性。
4.一種診斷視網(wǎng)膜血管病的試劑盒，它包含醛縮酶。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中，所述醛縮酶是醛縮酶A、醛縮酶B、醛縮酶C、它的70％同源變體或其抗原片段。
6.權(quán)利要求5的試劑盒，它進(jìn)一步包含標(biāo)記的抗-人免疫球蛋白G或M抗體蛋白質(zhì)。
7.一種診斷視網(wǎng)膜血管病的方法，它包括，將生物樣品與醛縮酶接觸，并且檢測形成的抗原-自身抗體復(fù)合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，所述醛縮酶是醛縮酶A、醛縮酶B、醛縮酶C、它的70％同源變體或其抗原片段。
9.權(quán)利要求7的方法，其中，所述生物樣品是血液、血漿或血清。
10.權(quán)利要求7的方法，它進(jìn)一步包括，添加一種標(biāo)記的抗-人免疫球蛋白G或M抗體蛋白質(zhì)。
全文摘要
公開了一種用于診斷視網(wǎng)膜血管病的包含醛縮酶蛋白質(zhì)的組合物。此外，本發(fā)明還公開了一種用于診斷視網(wǎng)膜血管病的包含所述蛋白質(zhì)的試劑盒，以及一種診斷視網(wǎng)膜血管病的方法，它包括，將血樣與醛縮酶蛋白質(zhì)接觸，并且定量分析形成的抗原－抗體復(fù)合物。
文檔編號C07H21/02GK1839319SQ200580000021
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月6日
發(fā)明者趙良濟(jì), 安寶暎, 俞元一, 權(quán)五雄 申請人:健一藥品株式會社