專利名稱：抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因、及其重組載體和表達(dá)產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一，能影響多種細(xì)胞如間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化及功能，在正常生理和病理過程中參與生長發(fā)育和組織損傷修復(fù)過程。
最近研究表明aFGF基因mRNA在膀胱移行細(xì)胞癌、卵巢癌及卵巢交界性腫瘤組織中均呈過度表達(dá)，與正常卵巢、卵巢瘤樣病變及卵巢良性腫瘤相比，有顯著差異。當(dāng)發(fā)生癌變時(shí)，由于致癌因素的作用，使卵巢癌組織細(xì)胞中aFGF基因活性增強(qiáng)，導(dǎo)致合成過量的aFGF，而aFGF又進(jìn)一步引起卵巢癌組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞及毛細(xì)血管的形成，從而加速了瘤細(xì)胞隨血液的轉(zhuǎn)移。
近年來關(guān)于aFGF表達(dá)的生物學(xué)意義已引起學(xué)者們關(guān)注，人們期望利用aFGF的拮抗劑抑制aFGF與其受體的結(jié)合作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的手段，針對(duì)aFGF的單克隆抗體能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。以單克隆抗體為載體的腫瘤導(dǎo)向治療的研究已有20年的歷史，目前采用的多是鼠源性抗體，當(dāng)應(yīng)用于體內(nèi)治療時(shí)可引起人抗鼠抗體(HAMA)，其干擾了抗體制劑在體內(nèi)的合理分布及效果。其次，由于抗體為大分子，腫瘤的間質(zhì)內(nèi)壓又高于正常組織，致使抗體或是偶合物在腫瘤靶部位的攝取過低。
基因工程抗體是運(yùn)用重組DNA技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造及重新裝配，經(jīng)適當(dāng)受體細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子。本發(fā)明提供的是有實(shí)際價(jià)值的單鏈抗體(single-chain Fv，ScFv)。ScFv是由一條連接肽將輕鏈(VL)和重鏈(VH)連在一起所形成的兩個(gè)可變區(qū)首尾相接的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個(gè)可變區(qū)由非共價(jià)鍵形成具有抗原結(jié)合功能的片段，ScFv分子量小僅為完整IgG的1/6，，易穿入固體組織及腫瘤內(nèi)部，具有親本抗體結(jié)合抗原的特性和功能，因此，ScFv是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的免疫治療制劑。
目前市場上的治療用單克隆抗體藥物(也叫“生物導(dǎo)彈”)多是鼠源性，當(dāng)用于人體可引起人抗鼠抗體(HAMA)，其干擾了抗體制劑在體內(nèi)的合理分布及效果。其次，由于抗體為大分子，腫瘤的間質(zhì)內(nèi)壓又高于正常組織，致使抗體或是偶合物在腫瘤靶部位的攝取過低。另外，特殊的細(xì)胞培養(yǎng)的方法使得單克隆抗體難以大規(guī)模生產(chǎn)，與相同規(guī)模的化學(xué)藥廠或微生物合成藥廠相比，單克隆抗體藥物在建廠和生產(chǎn)過程中消耗的資金很大。同時(shí)，單克隆抗體在高溫和強(qiáng)酸強(qiáng)堿的條件下會(huì)分解，必須在絕對(duì)零度下保存，否則就會(huì)在數(shù)周內(nèi)完全失去活性；抗體能被消化系統(tǒng)很快降解，從而阻止了其進(jìn)入大腦或一些腫瘤的外圍。許多疾病無法用單克隆抗體藥物治療，在很大程度上制約了單克隆抗體的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供編碼抗人aFGF-ScFv基因和由此推斷的氨基酸序列；提供含有所述的抗人aFGF-ScFv基因的表達(dá)載體和利用該載體轉(zhuǎn)化的工程菌；同時(shí)提供從所述工程菌制備重組抗人aFGF-ScFv的過程。
本發(fā)明的重組抗人aFGF-ScFv基因，是由連接肽連接抗體的VL和基因VH，建立一個(gè)抗人aFGF-ScFv基因，該基因由714個(gè)堿基組成。
這種人aFGF-ScFv基因的核苷酸序列為atg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc 48aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg tac 96cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc 144aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg 192acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc 240act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg ttc ggt gct 288ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt 336ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga 384ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 432gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg 480gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac 528acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 576aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag 624gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg 672ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 714
上述抗人aFGF-ScFv的氨基酸序列為Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr SerAsn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly AlaGly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly GlyGly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr ProGlu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser TyrThr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspAsn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala TrpPhe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *(*終止密碼子)抗人aFGF-ScFv基因的制備包括以下步驟第一步制備抗人aFGF的單克隆抗體。
用人aFGF免疫8周齡的Balb/c小鼠，經(jīng)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合獲得穩(wěn)定分泌抗人aFGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
第二步克隆抗體可變區(qū)基因。
從雜交瘤細(xì)胞株中提取mRNA，用Promage公司抗體通用引物試劑盒提供的引物，通過RT-PCR法克隆出該單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。
第三步將獲得的基因片段分別克隆到商業(yè)化的T載體，進(jìn)行序列分析，經(jīng)同源對(duì)比分析，證實(shí)該基因片段為抗體可變區(qū)基因。
第四步連接抗體輕鏈、重鏈基因，以15個(gè)氨基酸的柔性連接子，連接抗體輕、重鏈可變區(qū)基因構(gòu)建ScFv基因第五步將ScFv基因克隆到商業(yè)化的pET28a載體上，在BL21宿主大腸桿菌中。獲得的轉(zhuǎn)化菌株為工程菌株BL21-ScFv。
第六步制備重組抗體。培養(yǎng)工程菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，表達(dá)效率達(dá)33％。經(jīng)過離心、沉淀等步驟可獲得該發(fā)明的分子量為3.0KD的重組單鏈抗體。附圖見附頁。
單鏈抗體具有兩個(gè)抗原結(jié)合臂，可以同時(shí)和T細(xì)胞及靶細(xì)胞結(jié)合，并激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷病變細(xì)胞。單鏈抗體分子量只相當(dāng)于完整抗體的1/6，在臨床應(yīng)用上比完整抗體優(yōu)越免疫原性弱，對(duì)實(shí)體瘤滲透能力強(qiáng)，可以用基因工程手段發(fā)酵生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的單克隆抗體藥物相比，其可以進(jìn)行大規(guī)模細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，且價(jià)格低廉，易于普及應(yīng)用，是一種極具應(yīng)用潛力的抗體形式。


附圖為抗人aFGF-ScFv基因工程菌表達(dá)分析圖。
其中1，低分子量標(biāo)準(zhǔn)；2，3，未誘導(dǎo)大腸桿菌總蛋白；4，IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)表達(dá)蛋白；5，IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)表達(dá)蛋白；6，IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)蛋白；7，IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)表達(dá)蛋白。經(jīng)蛋白掃描分析，IPTG誘導(dǎo)1-4小時(shí)scFv的表達(dá)量分別占菌體總蛋白的25％，29％，30％和32％，完全滿足工程菌表達(dá)蛋白的要求。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例包括以下內(nèi)容1.抗人aFGF雜交瘤細(xì)胞株的制備重組人aFGF蛋白30ug免疫8周齡雌性Balb/c小鼠，分別于第14天，35天以等量抗原免疫，第45天用間接ELISA法檢測(cè)鼠尾血，對(duì)免疫反應(yīng)好的鼠在第56天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后取其脾細(xì)胞進(jìn)行融合首次免疫使用弗氏完全佐劑，其余使用不完全佐劑。
將免疫鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1以5∶1混合，1500rpm離心5min，棄上清，置37℃水浴中。將1ml預(yù)熱的PEG緩慢加入，邊加邊輕搖，隨后用50ml預(yù)熱RPMI1640不完全培養(yǎng)基稀釋。800rpm離心5min，棄上清，加入足量的HAT培養(yǎng)基重新懸浮，分種于已制備飼養(yǎng)細(xì)胞的的96孔培養(yǎng)板，100ul/孔。隨后置入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后第7天，，第10天以新鮮的HAT培養(yǎng)基半量換液一次，，第12天改用HT培養(yǎng)基，第15天后改用完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞長至孔底約1/3時(shí)，用間接ELISA法對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)篩選。對(duì)陽性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆，直至所有克隆孔上清液中抗體陽性鋁為100％時(shí)，即可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，保存。
2.抗體可變區(qū)基因VL和VH的克隆從液氮罐中取出凍存的1C9雜交瘤細(xì)胞株，復(fù)蘇后用含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，1000rpm，離心5min收集5×106個(gè)細(xì)胞，然后按照Amersham Biosciences公司產(chǎn)品RNA分離和純化試劑盒提取雜交瘤細(xì)胞的總RNA并分離純化mRNA。使用同一公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。
擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因所用的引物來源于Amersham Biosciences公司的ScFv噬菌體抗體試劑盒。在兩個(gè)PCR小管中分別取上述合成的cDNA 33ul，在第一個(gè)管中加入VL引物混合物2ul，ddH2O 64ul。在第二個(gè)管中加入VH引物1，VH引物2各2ul，ddH2O 62ul，95℃預(yù)變性5min后，加入1ul Taq DNA聚合酶(3u/ul)。PCR反應(yīng)條件是94℃1min，55℃2min，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分析后回收目的片段，該目的片段與商業(yè)化的T載體連接進(jìn)行序列測(cè)定。
3.抗體基因VL、VH的連接肽和ScFv基因構(gòu)建根據(jù)序列測(cè)定獲得的氨基端和羧基端的VL和VH基因序列進(jìn)一步設(shè)計(jì)構(gòu)建連接肽和ScFv引物VL正義鏈引物為5’CCGGAA TTCGAC ATC CAG ATG ACC CAG(GAA TTC為EcoRI酶切位點(diǎn))。
VL反義鏈引物為5’-AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CCG TTT GAT TTC CAG CTTGGTVH正義鏈引物為5’-GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGA GGT GGC TCT CAG GTGAAG CTG CAG CVH反義鏈引物為5’-CCCAAG CTTCTA TGA GGA GAC GGT GAC(AAG CTT為HindIII酶切位點(diǎn))。
其中VL反義鏈引物和VH正義鏈引物中斜體部分為連接肽，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，斜體黑體部分為互補(bǔ)區(qū)域，為構(gòu)建ScFv而設(shè)計(jì)。
PCR反應(yīng)條件為94℃5min，然后94℃1min，60℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃5min。將延伸后的PCR產(chǎn)物電泳回收后，overlap PCR進(jìn)一步構(gòu)建ScFv基因。在PCR管中加入上述PCR產(chǎn)物、Taq酶和緩沖液，在不加入引物的情況下進(jìn)行7個(gè)循環(huán)94℃70s，55℃1min，72℃1min。在此過程中由于VL反義鏈引物和VH正義鏈引物的中的互補(bǔ)區(qū)域，VL和VH就可以相互配對(duì)，并且延伸，從而形成完整的VL-連接肽-VH。最后加入引物VL正義鏈引物和VH反義鏈引物進(jìn)行以下反應(yīng)94℃5min，94℃70s，60℃1min，72℃1min，然后72℃2min，25個(gè)循環(huán)，最終獲得ScFv基因。
4.構(gòu)建ScFv基因的重組表達(dá)載體
EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶處理商業(yè)化的pET28a(+)表達(dá)載體，按摩爾濃度1∶3比例混合載體DNA和ScFv基因，T4DNA連接酶連接載體和ScFv基因，獲得重組表達(dá)載體pET28a-抗FGF-ScFv。
5.表達(dá)ScFv重組蛋白將重組表達(dá)載體pET28a-抗FGF-ScFv轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)大腸桿菌，氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基篩選，雙酶切鑒定并進(jìn)行序列分析。同時(shí)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)大腸桿菌，37℃培養(yǎng)，OD600大約0.5，加入IPTG使其終濃度0.8mM誘導(dǎo)4小時(shí)，6000rpm 4℃離心10分鐘，15％SDS-PAGE分析重組抗體。
SEQUENCE LISTING<110>東北師范大學(xué)<120>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因<130>none<140>none<141>2005-11-07<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>714<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因<220>
<221>CDS<222>(1)..(714)<223>
<220>
<221>misc_recomb<222>(1)..(312)<223>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子抗體的輕鏈基因<220>
<221>misc_recomb<222>(313)..(357)<223>連接抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子抗體輕鏈和重鏈基因的連接子<220>
<221>misc_recomb<222>(358)..(714)<223>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子抗體的重鏈基因
<300>
<302>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因<308>none<309>2007-05-07<310>none<311>2005-11-07<312>2007-05-07<313>(1)..(714)<400>1atg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc 48Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val1 5 10 15aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg tac 96Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr20 25 30cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc 144Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser35 40 45aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg 192Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly50 55 60acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc 240Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala65 70 75 80act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg ttc ggt gct 288Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala85 90 95ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt 336Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga 384Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly115 120 125ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 432Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser130 135 140gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg 480Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro145 150 155 160gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac 528Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr165 170 175acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac 576Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp180 185 190aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag 624Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu195 200 205gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg 672Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala Trp210 215 220ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 714Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *225 230 235<210>2<211>238<212>PRT<213>Artificial Sequence
<220>
<223>抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因<400>2Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val1 5 10 15Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr20 25 30Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser35 40 45Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly50 55 60Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala65 70 75 80Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala85 90 95Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly100 105 110Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly115 120 125Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser130 135 140Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro145 150 155 160Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr165 170 175Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp180 185 190Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu195 200 205
Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Ash Tyr Ala Trp210 215 220Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *225 230 23權(quán)利要求
1.抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因，其特征是由連接肽連接抗體的VL和基因VH建立，該基因由714個(gè)堿基組成該基因的核苷酸序列為atg acc cag tct cca gca atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc 48aca atg act tgc agg gcc agc tca agt gta agt tac atg cac tgg tac 96cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc144aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg192acc tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc240act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg ttc ggt gct288ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt336ggc tct ggc gga ggt ggc tct cag gtg aag ctg cag cag tca ggg gga384ggc tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct432gga ttc gct ttc agt agc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act ccg480gag aag agg ctg gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac528acc tac tat cca gac agt gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac576aat gcc agg aac acc ctg tac ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag624gac acg gcc ttg tat tac tgt gca aga cga ggt ggt aac tac gcc tgg672ttt gct tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca714該基因的氨基酸序列為Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys ValThr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp TyrGln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr SerAsn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly AlaGly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly GlyGly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr ProGlu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser TyrThr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspAsn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala TrpPhe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser *。(*終止密碼子)
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及抗人酸性成纖維細(xì)胞生長因子的單鏈抗體基因、及其重組載體和表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明提供的是有實(shí)用價(jià)值的單鏈抗體(single－chain Fv，ScFv)。ScFv是由一條連接肽將輕鏈(VL)和重鏈(VH)連在一起所形成的兩個(gè)可變區(qū)首尾相接的單一肽鏈，通過正確折疊，兩個(gè)可變區(qū)由非共價(jià)鍵形成具有抗原結(jié)合功能的片段，ScFv分子量小僅為完整IgG的1/6，易穿入固體組織及腫瘤內(nèi)部，具有親本抗體結(jié)合抗原的特性和功能，因此，ScFv是具有應(yīng)用價(jià)值的免疫治療制劑。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1800394SQ20051011904
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者朱筱娟, 王興智, 楊濤 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)