專利名稱：抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系的構建方法、乙肝導向干擾素及其制備方法和應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
當前，生物工程抗體藥的發(fā)展迅猛，據(jù)2004年12月生物工程學報報導，世界生物工程藥銷售額前10位中生物工程抗體藥占40％。生物工程抗體藥增長勢頭強勁，抗體類藥物成為生物工程制藥領域極為重要的成員，有望2005年成為最大的一類生物制品，預計2007年其銷售額將突破200億美元，占整個生物制藥業(yè)的1/3，可見生物工程抗體藥發(fā)展前景之遠大。
目前，用于治療的生物工程抗體藥主要是由基因工程研制的人源化抗體，人源化抗體雖然比鼠源單克隆抗體(mMcAb)異種蛋白成分要少得多，但仍含有5～10％的鼠源蛋白，用于治療仍有引起人體不良反應的可能，當然用mMcAb治療危險性就更大了?，F(xiàn)基因工程研制人源化抗體或人源抗體有兩個瓶頸，就是工程細胞對抗體的表達力度不夠，抗體與抗體的靶子結合力太差，這是阻礙基因工程抗體發(fā)展的障礙，所以研制人源化單克隆抗體(McAb)廣泛應用還難以實現(xiàn)。
乙型肝炎(HB)在世界上，特別是東亞、東南亞、南亞及中東一帶，均有嚴重流行，我國是HB大國，無癥狀帶毒者1.3億，顯性HB患者3000萬，無癥狀帶毒者之中有些人遲早要發(fā)展為顯性HB。HB發(fā)病時間長，有慢性化傾向，相當部分的HB患者轉(zhuǎn)慢性肝炎、肝硬化，甚至轉(zhuǎn)為肝癌，80～90％的肝癌為HB后肝癌，對人類的健康威脅極大，有的患者不僅喪失了勞動力還要巨大花費進行治療，加上可能不良的預后反應，還影響到勞動就業(yè)，其精神壓力也是不可忽視的。
目前，市場出售種類繁多治療HB的藥物，但仍無治療效果理想的藥物，對HB的防治仍存在巨大的困難。奇怪的是，雖有HB工程疫苗的廣泛應用，但HB的流行仍未見有明顯的減少，便何況尚有20％的人群對HB疫苗的反應很差或無反應，可見對HB的防治在世界上仍是一個巨大的難題。如果有一種制劑能使HB的治愈率在普通IFN的基礎上提高40％，傳染率再降低40％，其社會效益和經(jīng)濟效益就是難以估量的。
干擾素(IFN)是國內(nèi)外學者公認的治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的較為有效的藥物。但它的HB的治愈率僅為30％左右。干擾素是由于干擾素誘生劑誘導生物細胞產(chǎn)生的一類多功能、具抗病毒活性的糖蛋白。IFN的治療機制就是它與染毒細胞接觸后激發(fā)染毒細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒核酸對病毒蛋白的合成，從而殺滅病毒。同時IFN還可調(diào)節(jié)機體的免疫機能，提高抗病毒能力。但目前干擾素劑型存在有“敵我不分”的缺點，不論是有病還是無病的組織、器官和細胞都同等地接受藥物作用，這樣IFN的有效治療量也接近了毒性量，干擾病毒復制的同時對人體正常細胞也有干擾作用，長期應用治療量的IFN，對人體會產(chǎn)生不良作用，如脫發(fā)、白細胞減少及發(fā)燒等。
那么能否有一種藥物能夠識別染毒區(qū)，從而在染毒區(qū)匯集較高的藥物濃度，使藥物充分發(fā)揮殺滅病毒的作用，藥效增大，把毒性作用降到最小，不波及無辜，這便是“導向干擾素”的思路。目前研究人員正在積極探索只作用于病毒感染細胞而無損于正常細胞的導向治療方法，導向治療是應用現(xiàn)代醫(yī)學生物技術把有效抗病毒藥物作彈頭，與一定靶向載體交聯(lián)，特異性把治療彈頭運送到靶器官或靶細胞，以達到治療目的，該法具有選擇性較強，特異性較好，藥物用量小，毒性低，能提高療效等優(yōu)點。其中療效最佳是感染細胞水平的導向治療方法，但該方法的設計還需要解決如下問題如何設計理想的藥物載體，提高藥物/載體分子化，如何提高載體的運轉(zhuǎn)率及載體分子的穩(wěn)定性、精確的靶向性，如何實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等。
申請?zhí)枮?3134618.9，發(fā)明名稱為分泌抗乙肝人單克隆抗體的異種雜交瘤細胞系的構建方法，采用異種雜交瘤細胞融合的工藝流程將抗-HBs陽性人脾淋巴細胞(SL)與鼠漿細胞瘤細胞系P3-X63/Ag8-653細胞融合，采用有限稀釋法克隆抗體陽性孔雜交瘤細胞，得到穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的分泌抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體的異種雜交瘤工程細胞系。利用抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體異種雜交瘤工程細胞系分泌的抗乙型肝炎病毒單克隆抗體，經(jīng)分離純化后與干擾素交聯(lián)，可制成治療乙型肝炎的“抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體交聯(lián)干擾素靶向制劑”和具有免疫作用的“乙肝被動免疫制劑”、“乙肝檢測試劑”。
申請?zhí)枮?3134617.0，發(fā)明名稱為抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體交聯(lián)干擾素靶向制劑的制備方法，其抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體以戊二醛作為交聯(lián)劑與α-干擾素相交聯(lián)，制備成“抗乙型肝炎病毒人單克隆抗體交聯(lián)干擾素靶向制劑”。
03134618.9和03134617.0專利申請中雜交細胞系的構建和交聯(lián)體的制備所獲得抗體陽性雜交瘤的機會少，抗體分泌量低，而且由于是抗體全分子與干擾素交聯(lián)，因而交聯(lián)體過大，不易在體液內(nèi)擴散達到染毒區(qū)(主要是肝臟)，降低了抗病毒效果。
因此目前不少研究人員致力于導向干擾素的研究開發(fā)，但重要的是構建的分泌抗-HBs hMcAb的雜交瘤細胞系是否穩(wěn)定，能否大量工業(yè)化生產(chǎn)，同時所獲得的抗乙肝病毒人單克隆抗體與干擾素的交聯(lián)體要求活性高，分子量小，易于擴散至染毒區(qū)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBshMcAb)的雜交瘤細胞系的構建方法，該方法采用EB病毒轉(zhuǎn)化技術和細胞雜交技術，構建分泌抗-HBs五聚體IgM hMcAb的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)雜交瘤細胞系，其易培養(yǎng)，融合率高，雜交細胞活力強，分泌抗體量大且穩(wěn)定。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種乙肝導向干擾素，由抗-HBs F(ab′)2與IFN交聯(lián)形成的交聯(lián)體分子量小，易于在體液中擴散達到染毒區(qū)，可大大提高“導向IFN”殺滅病毒的作用。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種乙肝導向干擾素的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種乙肝導向干擾素在制備治療慢性乙型肝炎、HB后肝癌等藥物中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBshMcAb)的雜交瘤細胞系的構建方法，包括如下步驟；先采用愛波斯坦-巴爾病毒(EBV)轉(zhuǎn)化人B淋巴細胞，獲得分泌抗乙肝表面抗體(抗-HBs)的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系；然后用轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞與鼠漿細胞瘤細胞系FO的細胞進行細胞融合，構建分泌抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBs hMcAb)的雜交瘤細胞系。
其中，EBV為愛波斯坦-巴爾病毒，一種皰疹病毒，引起傳染性單核細胞增多癥，對人的B淋巴細胞有良好的轉(zhuǎn)化作用。
具體地說，從抗HBs陽性健康人體收集外周血淋巴細胞(PBL)，與愛波斯坦-巴爾病毒(EBV)混合，并加入含1-2μg/ml頭孢菌素A的完全培養(yǎng)基(含10％～20％胎牛血清的RPMI1640)中進行培養(yǎng)；40天后將轉(zhuǎn)化B細胞以有限稀釋法加以克隆，獲得分泌抗-HBs hMcAb的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系(命名為5-D9)。
將EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞系的細胞與鼠漿細胞瘤細胞系FO的細胞行細胞融合，細胞融合后，分加含有飼養(yǎng)細胞(BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞、淋巴細胞或腹腔細胞等)的培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，待雜交細胞在培養(yǎng)基中生長增殖到6～8×103個細胞/孔，對其培養(yǎng)上清以ELISA間接法檢測抗-HBs的存在，對檢測孔抗-HBs陽性的雜交瘤細胞以有限稀釋法進行克隆，反復克隆8～10次，培養(yǎng)孔抗HBs陽性克隆可達100％，選出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的異種雜交瘤工程細胞系。
將選出的工程細胞系擴大培養(yǎng)，將大部分細胞分裝安瓶凍存，做為原始細胞庫，部分細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，進一步檢定該細胞系的性狀。
經(jīng)ELISA間接法檢定，聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶標抗人IgM免疫印跡等方法證明，本發(fā)明的分泌抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBshMcAb)的雜交瘤細胞系(命名為6-A8)細胞分泌抗HBs五聚體IgMhMcAb，其分子量96×104(標準人IgM為五聚體，分子量為96×104)，對HBsAg(乙肝表面抗原)有強特異性，與其它乙肝標志及其它一些病毒無交叉反應，雜交瘤細胞系6-A8細胞分泌的抗體特異性是HBs Ag；是人IgM類抗體；雜交瘤細胞系6-A8培養(yǎng)上清抗體效價高達1×38；雜交瘤細胞系6-A8裸鼠實體瘤勻漿ELISA效價達106，雜交瘤細胞系6-A8細胞連續(xù)傳代生長穩(wěn)定好，因此本發(fā)明所述的異種雜交瘤工程細胞系為分泌抗-HBs五聚體IgM的人單克隆抗體(hMcAb)的異種雜交瘤細胞系。
本發(fā)明的抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBs hMcAb)的雜交瘤細胞系的構建方法，選擇了EBV轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系，其轉(zhuǎn)化作用強，與鼠漿瘤細胞系進行細胞雜交融合幾率大，構建分泌抗-HBs五聚體IgMhMcAb的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)雜交瘤細胞系易培養(yǎng)，融合率高，雜交細胞活力強，分泌抗體量大且穩(wěn)定。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的另一發(fā)明目的，本發(fā)明所述的乙肝導向干擾素，由以下方法制備而成先將本發(fā)明所述的分泌抗-HBs五聚體IgM的人單克隆抗體(hMcAb)的異種雜交瘤細胞系進行培養(yǎng)，獲得抗-HBshMcAb，并用胃蛋白酶消化法制備抗-HBs F(ab′)2片段；然后抗-HBs F(ab′)2片段與α-IFN交聯(lián)，制備F(ab′)2- α-IFN交聯(lián)體，即乙肝導向干擾素(BT-IFN)。
本發(fā)明由于抗-HBs hMcAb為五聚體結構，一個五聚體可分離出五個抗-HBs F(ab′)2片段，并用胃蛋白酶消化法將無作用的片段去除，獲得抗-HBs F(ab′)2片段，不是以抗體全分子與干擾素交聯(lián)，而是抗-HBsF(ab′)2片段與干擾素交聯(lián)，這樣所得交聯(lián)體分子量小，易于在體液中擴散達到染毒區(qū)，可大大提高“導向IFN”殺滅病毒的作用。
本發(fā)明所述的乙肝導向干擾素的制備方法，包括如下步驟(1)將分泌抗-HBs五聚體IgM的人單克隆抗體(hMcAb)的異種雜交瘤細胞系用動物法或培養(yǎng)法生產(chǎn)抗-HBs hMcAb；(2)用胃蛋酶消化抗-HBs五聚體IgM hMcAb制備抗HBsF(ab′)2片段；(3)用抗-HBs F(ab′)2片段與α-IFN交聯(lián)，制備F(ab′)2- α-IFN交聯(lián)體，即乙肝導向干擾素(BT-IFN)。
其中，步驟(1)中動物法為將分泌抗-HBs五聚體IgM hMcAb的6-A8細胞接種于用降植烷處理的裸鼠腹腔，細胞接種量為1×107個細胞/鼠，兩周后，開腹取實體瘤，將實體瘤剪碎，與0.01MPH7.4PBS按1∶3加入超聲波勻漿器中將實體瘤勻漿，將勻漿低溫高速離心，收上清，過Sepharose CL-4B柱層析，可得純度95％以上的抗-HBs五聚體IgM hMcAb，備用。
培養(yǎng)法為將分泌抗-HBs五聚體IgM hMcAb的6-A8細胞接種于生物反應器的完全培基(含10％～20％胎牛血清的RPMI1640)中，接種濃度為4-8×104個細胞/ml，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，低溫高速離心收上清，用硫酸銨沉淀，再低溫高速離心，去上清，沉積物用0.01MPH7.4PBS溶解上SepharosCL-4B柱層析，可得純度95％以上的抗-HBs五聚體IgMhMcAb備用。
所述步驟(2)為將抗-HBs五聚體IgM hMcAb與胃蛋白酶混合，二者重量之比為20∶1，在37℃水浴中消化5小時，然后將消化液過SephacryLs-200柱層析，純化抗-HBs F(ab′)2片段，純度可達95％以上，備用。
所述步驟(3)為將所獲得純化的抗-HBs F(ab′)2片段按比例與α-IFN及戊二醛相混合，抗-HBsF ab′)2與α-IFN及戊二醛的分子數(shù)比為1～1.5∶1～1.2∶2～3，進行抗-HBs F (ab′)2與α-IFN相交聯(lián)，制備出抗-HBs F(ab′)2-α-IFN交聯(lián)體，即乙肝導向干擾素(BT-IFN)。
戊二醛作為乙肝導向干擾素制備的交聯(lián)劑，當然也可采用本領域常用的交聯(lián)劑。
具體的交聯(lián)過程為a.按上述比例取抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段及干擾素(α-IFN)，混合裝入透析袋中，用0.01MPH8.0的磷酸緩沖液(PB)透析平衡24小時，將平衡后的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F ab′)2與干擾素混合液在37℃溫浴中，邊攪拌邊滴加5～8％的戊二醛，攪拌均勻后在37℃溫浴中靜置30分鐘；b.將交聯(lián)液裝入透析袋中，4℃下對0.01MPH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析24小時，并用聚乙烯二醇6000(PEG6000)滲析濃縮結合物；c.將交聯(lián)物上SephadexG-75，除去未起作用的戊二醛；d.將收集的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2-干擾素交聯(lián)體進行除菌；e.最后向交聯(lián)體中加入5～10mg/ml的人血清白蛋白，進行凍干得成品。
本發(fā)明所述的乙肝導向干擾素在制備治療慢性乙型肝炎、HB后肝癌等藥物中的應用。
本發(fā)明的研究人員將抗-HBs F(ab′)2片段與IFN相交聯(lián)，形成抗-HBsF(ab′)2-α-IFN交聯(lián)體，利用抗-HBs F(ab′)2與染毒細胞的特異親和力，在人體內(nèi)尋找染毒靶細胞并與之結合，從而把IFN帶到染毒細胞上，在染毒區(qū)形成IFN的密集狀態(tài)，會更有效地殺滅HBV。換句話說，“導向干擾素”就是把抗-HBs F(ab′)2做為自動尋靶的“導彈”，而IFN就是裝在導彈上的彈頭，形成一種不殃及無辜專門轟擊病毒的強大治療HB的武器。“導向IFN”高效治療HB在醫(yī)療理論和實踐上都是有充分根據(jù)的。“導向IFN”中IFN的用量僅為普通用治療量IFN劑量的1/2～1/3，基本上無不良作用，這又是“導向IFN”的又一大優(yōu)點。
要開發(fā)“導向IFN”，首先要解決生產(chǎn)抗-HBs hMcAb的工具，本發(fā)明研究人員采用細胞工程構建分泌抗-HBs hMcAb的雜交瘤工程細胞系，分泌抗體的量可達到商業(yè)開發(fā)的水平，并能工業(yè)化地大量生產(chǎn)抗-HBs hMcAb，同時建立分離純化抗-HBs hMcAb、制備抗-HBs F(ab′)2片段及建立抗-HBs F(ab′)2片段與IFN交聯(lián)的工藝，由于抗-HBs hMcAb為五聚體結構，一個五聚體可分離出五個抗-HBs F(ab′)2片段，保證可大批量生產(chǎn)抗-HBs F(ab′)2-α-IFN并具有高活性。
之所以用抗-HBs F(ab′)2片段交聯(lián)IFN，是因為抗-HBs F(ab′)2與IFN交聯(lián)形成的交聯(lián)體分子量小，易于在體液中擴散達到染毒區(qū)，可大大提高“導向IFN”殺滅病毒的作用。
本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量的藥理學實驗表明，所述的乙肝導向干擾素無毒、無病毒、無支原體、無菌，用量是直接用普通IFN治療量的1/2～1/3，而且治愈率可達70％。
由于80～90％的肝癌是HB后肝癌，其肝癌細胞表面均有乙肝表面抗原(HBsAg)表達，所以抗-HBs可把IFN導向肝癌細胞，IFN可殺死肝癌細胞，因此，抗-HBs F(ab′)2-α-IFN亦是治療HB后肝癌的良藥。
而且，其間所獲得的抗-HBs五聚體IgM hMcAb還可用做乙肝高效免疫球蛋白被動免疫預防乙肝，優(yōu)于血源乙肝高效免疫球蛋白，因為可大量生產(chǎn)，免除傳染其它疾病的危險。


圖1為本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞與鼠漿細胞瘤細胞系FO的細胞的細胞融合工藝流程圖；圖2為CL-4B柱層析純化抗-HBs五聚體IgM hMcAb標本；1.4B80cm柱層析洗脫1峰組分，2.3同1(依次為1峰的1、2、3號管)4.標準參比蛋白(marker)，5.標準人IgM.
圖3為聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫印跡；1道為實體瘤勻漿鹽析標本；2道標準人IgM圖4為抗-HBs五聚體IgM hMcAb的ELISA間接法反應模式圖；圖5為6-A8裸鼠實體瘤勻漿ELISA反應曲線圖；圖6為6-A8細胞生長與抗體分泌動力學；圖7為6-A8產(chǎn)抗體穩(wěn)定性觀察；圖8為6-A8細胞核型；箭頭所指為人染色體圖9為6-A8細胞系遺傳穩(wěn)定性觀察；圖10為動物法生產(chǎn)抗-HBs五聚體IgM hMcAb的過程圖11為抗-HBs F(ab′)2片段的制備過程；圖12為抗-HBs F(ab′)2與α-IFN交聯(lián)制備工藝過程。
具體實施例方式
下面由具體實施例詳加說明，以便更容易了解本發(fā)明的目的、技術內(nèi)容、特點及其所達成的功效。
實施例1本實施例為抗乙肝病毒人單克隆抗體(抗-HBs hMcAb)的雜交瘤細胞系的構建方法。
一、EBV轉(zhuǎn)化法建立分泌抗-HBs hMcAb的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系1.EBV的準備①將B95-8細胞(淋巴瘤細胞系，可產(chǎn)生EB病毒)以2×105/ml的濃度懸入含20％胎牛血清的RPMI1640(完全培養(yǎng)基)中；②將此細胞液置37℃孵箱中培養(yǎng)7天；③將培養(yǎng)好的B95-8細胞液3000rpm離心10分鐘；④取B95-8上清液5ml備用。
2.抗-HBs陽性青年女性PBL(外周血淋巴細胞)的準備①取抗-HBs陽性青年女性外周血5ml；②將此5ml外周血密度梯度離心分離PBL；③收集PBL，用10ml無血清RPMI1640培基離心冼二次；④取2×106個PBL備用；3.EBV轉(zhuǎn)化①將2×106個PBL懸入5ml B95-8上清液中；②將PBL懸液放入37℃，CO2孵箱孵育3小時；③將PBL懸液離心去上清；④將PBL用無血清RPMI1640培養(yǎng)基離心洗2次；⑤將洗過的PBL 2×106個細胞懸入100ml含20％胎牛血清及1μg/ml環(huán)孢菌素A的RPMI1640培養(yǎng)基中；⑥將PBL分加5塊96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)，從第8天起每周換培養(yǎng)液一次；⑦40天后培養(yǎng)孔中出現(xiàn)轉(zhuǎn)化B細胞克隆，以ELISA間接法篩選抗-HBs陽性孔；⑧將抗-HBs陽性孔中的轉(zhuǎn)化B細胞以有限稀釋法加以克隆，連續(xù)克隆3次，陽性孔達100％，選出了分泌抗-HBs五聚體IgM hMcAb的轉(zhuǎn)化克隆5-D9；
⑨將5-D9細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)備用。
二、構建分泌抗-HBs hMcAb的雜交瘤細胞系(一)各種細胞的準備1.將5-D9細胞擴大培養(yǎng)，待細胞達到足夠數(shù)量，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基離心洗2次，錐蘭排斥法計數(shù)細胞，取3×108個轉(zhuǎn)化B細胞備用；2.將鼠漿細胞瘤細胞系FO的細胞(購自北京公安醫(yī)院)擴大培養(yǎng)至足夠數(shù)量，錐蘭排斥法計數(shù)細胞，取1.5×108瘤細胞備用；3.小鼠腹腔巨噬細胞的制備取10個BALB/C小鼠腹腔細胞，懸入完全培養(yǎng)基(含20％胎牛血清的RPMI1640)中，分加10個平皿中，放入37℃的CO2孵箱孵育半小時傾去培基及未粘附的細胞。加入平皿新鮮完全培養(yǎng)基(含20％胎牛血清的RPMI1640)3ml，用滴管將粘附細胞沖洗起來，制備1×107個小鼠腹腔巨噬細胞，懸入100ml含HAT及Ouabain(毒毛旋花甙)的完全培養(yǎng)基中，分加10塊96孔培養(yǎng)板，每孔1×104個巨噬細胞，備用。
(二)細胞融合有關參數(shù)的確定轉(zhuǎn)化B淋巴細胞數(shù)∶FO細胞數(shù)＝3×108∶1.5×108聚乙二醇PEG分子量＝6000配液濃度＝45％(用無血清培基溶解，0.22μm的微孔濾膜濾過)一次細胞融合用量1ml10塊96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml選擇培基(含20％胎牛血清的完全培基，此培基含HAT及Ouabain)；融合后以轉(zhuǎn)化細胞為準，每孔3×105個細胞；飼養(yǎng)細胞為BALB/C小鼠腹腔巨細胞1×104個細胞/孔，融合當時用含20％胎牛血清的完全培基，此培基含HAT及Ouabain，用以懸浮融合細胞。
(三)細胞融合實驗按細胞融合工藝流程圖1所示工藝流程進行細胞融合。具體為將生長旺盛的FO細胞收集在50ml的塑料離心管中，采用錐蘭排斥法計數(shù)細胞，取1.5×108個FO細胞；將生長旺盛的5-D9細胞收集在50ml塑料離心管中，采用錐蘭排斥法計數(shù)細胞，取3×108個5-D9細胞，將兩種細胞收集在1個50ml錐形底塑料離心管中，離心去上清再用10ml無血清培基離心洗1次，去上清，得壓積細胞，并將壓積細胞旋搖呈糊狀，在37℃溫浴下，向細胞中滴加45％濃度的PEG60001ml，用吸管尖輕攪10秒，1000rpm離心10分鐘壓積細胞，然后均勻滴加37℃溫浴的無血清培基10ml，搖勻，1000rpm，離心10分鐘，去上清，將融合細胞懸于100ml含20％胎牛血清，HAT及Ouabain的RPMI1640培基中搖勻，將融合細胞液分加96孔培養(yǎng)板(10塊)，每孔0.1ml，(培養(yǎng)板已預加小鼠腹腔巨噬細胞1×104/孔0.1ml)，最后將融合細胞放入37℃ CO2孵箱進行培養(yǎng)。3天后開始有雜交瘤細胞生長，培養(yǎng)6-7天后，未雜交的FO細胞及轉(zhuǎn)化B細胞全部死亡，約2周后雜交瘤細胞長到每孔6～8×103左右，可對培養(yǎng)上清以ELISA間接法篩選抗HBs陽性雜交克隆。
(四)抗-HBs陽性雜交細胞的克隆將強陽性抗-HBs孔中的雜交瘤細胞取出，以有限稀釋法進行克隆，第一次克隆平均每孔6個細胞，第二次克隆平均每孔3個細胞，從第三次克隆開始平均每孔1個細胞，克隆8～10次后，達全部生長陽性孔抗-HBs均為陽性孔，此時再克隆1次，平均每孔0.5個細胞，這時可獲得單克隆的雜交瘤細胞克隆。最后，我們獲得1株高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)雜交瘤工程細胞系，命名為6-A8。
將6-A8細胞采用常用的方法進行擴大培養(yǎng)，一部分液氮凍存，同時進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，對6-A8細胞系進行進一步的檢定。
實施例2本實施例是抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系(6-A8細胞系)的系統(tǒng)檢定。
1.用ELISA間接法，聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶標抗人IgM免疫印跡等方法證明，6-A8細胞分泌抗HBs五聚體IgM hMcAb，其分子量96×104(標準人IgM為五聚體，分子量為96×104)，對HBsAg(乙肝表面抗原)有強特異性，與其它乙肝標志及其它一些病毒無交叉反應。見圖2、3、4、5及表1、2。
表1 6-A8培養(yǎng)上清ELISA間接法檢測結果

陰性對照OD3＝0.05，OD3為3個數(shù)值的平均值表26-A8裸鼠實體瘤勻漿ELISA效價

陰性對照OD值0.05P/N陽性OD值與陰性對照OD值之比。
OD為3個數(shù)值的平均值稀釋度數(shù)字為10的指數(shù)ELISA間接法反應程序為HBs Ag包板，在4℃過夜，洗板3′×3(3次每次3分鐘)，加入6-A8培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時洗板3′×3，加入酶標抗人IgM，37℃孵育1小時，洗板3′×3，加入磷苯二胺酶底物，37℃孵育30分鐘，加反應終止液，測OD值。
6-A8培養(yǎng)上清ELISA間接法檢測結果明確，說明1.6-A8細胞分泌的抗體特異性是HBs Ag；2.6-A8分泌的是人IgM類抗體；3.6-A8培養(yǎng)上清抗體效價高達1×38；4.6-A8裸鼠實體瘤勻漿ELISA效價達106。
2. 6-A8細胞連續(xù)傳代生長穩(wěn)定，現(xiàn)已連續(xù)傳了100多代，提供的數(shù)據(jù)反映了6-A8細胞傳代生長的穩(wěn)定性，見表3。
表3. 6-A8細胞系的生長穩(wěn)定性

6-A8細胞傳代接種濃度4×104/ml；連續(xù)培養(yǎng)4天(第三天換液)。
3. 6-A8細胞生長與抗體的分泌動力學表明有明顯的正相關性，見圖6。
4. 6-A8產(chǎn)抗體的穩(wěn)定性對6-A8連續(xù)傳代培養(yǎng)，間斷性地測定其培養(yǎng)上清抗體ELISA OD值及陰性對照OD值，連續(xù)5個多月的觀察表明6-A8產(chǎn)抗體是穩(wěn)定的，P/N值波動在60上下，見圖7。
5. 6-A8核型6-A8核型為異核型，含有鼠和人雙親的染色體，細胞含平均62～64條染色體，含人染色體10～12條，其中含有人14和22號染色體，見核染色體照片，見圖8。
6. 6-A8細胞的遺傳穩(wěn)定性所謂遺傳穩(wěn)定性是以6-A8抗體陽性細胞保持100％陽性克隆的時間表示的，按國家規(guī)定，100％陽性克隆保持3個月以上適為遺傳穩(wěn)定。6-A8100％抗體陽生克隆已保持5個多月，肯定是遺傳穩(wěn)定性的細胞系，見圖9。
7. 6-A8細胞系經(jīng)國家檢定，完全符合國家標準，可以在產(chǎn)業(yè)化中應用。
8. 6-A8細胞經(jīng)多次凍存(用液氮)復蘇性能穩(wěn)定，已建成原始庫，種子庫和生產(chǎn)庫。
實施例3本實施例為抗-HBs五聚體IgM hMcAb的生產(chǎn)過程。
1.動物法生產(chǎn)抗-HBs五聚體IgM hMcAb，程序如下用旋轉(zhuǎn)玻璃培養(yǎng)瓶培養(yǎng)足夠的6-A8細胞，向每只裸鼠腹腔注射降植烷0.5ml，向注射降植烷1周后的裸鼠腹腔注射6-A8細胞1×107個，連續(xù)飼養(yǎng)注射細胞的裸鼠2周，待裸鼠腹腔極度膨隆，處死裸鼠，開腹摘取6-A8細胞實體瘤，-40℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；然后進行抗-HBs五聚體IgM hMcAb的分離純化取實體瘤1克，剪碎、研磨，加入3ml0.01M PH7.4 PBS，超聲波勻漿15分鐘，10000rpm低溫離心25分鐘，收上清，加入40ml 10mM PH7.4的PBS稀釋，再在12000rpm低溫離心25分鐘，收上清，向所收上清液中加入等體積的飽和硫酸銨，4℃靜置3小時，12000rpm低溫離心25分鐘，去上清，并用6ml 0.1M PH7.4 PBS溶解，將溶解液裝透析袋，對10mM PH7.4PBS，4℃下透析過夜，0.45μm濾膜濾過，濾液上Sepharose Cl-4B柱層析，經(jīng)Sepharose cl-4B層析后獲得抗HBs五聚體IgM hMcAb純度達95％以上，-30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 2.用培養(yǎng)法制備抗-HBs五聚體IgM hMcAb將6-A8細胞接種旋轉(zhuǎn)玻璃培養(yǎng)瓶完全培基中，細胞接種濃度4×104/ml，放入CO2孵箱連續(xù)37℃培養(yǎng)5天，收回細胞液，6000RPm低溫離心，收上清，(NH4)2So4沉淀，按從實體瘤勻漿中分離純化抗-HBs五聚體IgM的工藝進行。
實施例4本實施例為抗-HBs F(ab)2片段的制備過程。
將20mg抗-HBs五聚體IgM hMcAb(在4ml PH7.2 0.01MPBS中)裝入透析袋，對PH4.5 0.03M醋酸鈉緩沖鹽水4℃下透析過夜平衡，將抗體濃度調(diào)至5mg/ml，放入10ml塑料離心管中，加入0.4ml胃蛋白酶溶液(PH4.5 0.03M醋酸鈉緩沖鹽水，1mg/ml)混勻，放入37℃水浴中消化5小時，再用1M NaHCO3中和反應物至PH7.4，終止胃蛋白酶消化，用30％飽和度(NH4)2SO4沉淀未消化的IgM(4℃下4小時)，10000rpm低溫離心20分鐘，取上清，另將沉積物用PH7.2 0.1M PBS溶解至原體積，從上清用60％飽和度(NH4)2SO4沉淀F(ab′)2片段(4℃下4小時)，10000rpm低溫離心20分鐘，將沉積物溶于PH7.2 0.1MPBS中(4ml)，裝入透析袋，4℃下對PH7.2 0.01MPBS透析24小時，最后將抗-HBs F(ab′)2液上Sephacryl s-200柱層析，純化抗-HBs F(ab′)2備用。
實施例5本實施例為抗-HBs F(ab′)與α-IFN交聯(lián)制取HB導向IFN的過程。
1.交聯(lián)制備工藝如下取20mg α-IFN(比活性108U./mg，20ml)和150mg抗HBs F(ab′)2(30ml)，共為170mg，50ml，并裝入透析袋，對0.1MPH6.8的PB透析，4℃下平衡24小時，從透析袋中移出放入500ml燒杯中，用0.1M PH6.8的PB將總體積補足至85ml，在37℃溫浴中邊攪拌邊滴加5％的戊二醛6.5ml，37℃溫浴中連續(xù)攪拌30分鐘，形成抗HBsF(ab′)2-α-IFN結合物，然后將結合物裝透析袋，對0.01M PH7.4 PBS透析，4℃下24小時，在4℃下用PEG6000滲析將結合物濃縮至10ml左右，將結合物過G-75柱層析，將收集的結合物用生理鹽水稀釋至500ml，用0.22μm微孔濾膜濾過除菌，向濾液中加入20克人血清白蛋白，再補加生理鹽水至2000ml，將結合物1ml分裝小瓶，采用常規(guī)方法進行凍干，得乙肝導向IFN成品。
2.交聯(lián)后對制成品的評價抗HBs F(ab′)2與α-IFN的交聯(lián)率在35％左右，抗-HBs F(ab′)2與HBsAg的結合力及α-IFN的活性均無明顯改變。交聯(lián)液澄清透明，微顯黃綠色，有乳光、無毒、無病毒、無支原體、無菌、無熱原。凍干品用生理鹽水溶解性狀良好，無混濁、無沉淀。成品4℃下保存1年性質(zhì)無改變。
權利要求
1.一種抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟先采用愛波斯坦-巴爾病毒轉(zhuǎn)化人B淋巴細胞，獲得分泌抗乙肝表面抗體的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系；然后用轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞與鼠漿細胞瘤細胞系的細胞進行細胞融合，構建分泌抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟從抗乙肝表面抗體陽性健康人體收集外周血淋巴細胞，與愛波斯坦-巴爾病毒混合，并加入含1～2μg/ml頭孢菌素A的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；40天后將轉(zhuǎn)化B細胞以有限稀釋法加以克隆，獲得分泌抗乙肝表面抗體的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系；將愛波斯坦-巴爾病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞系的細胞與鼠漿細胞瘤細胞系的細胞進行細胞融合，細胞融合后，分加含有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，待雜交細胞在培養(yǎng)基中生長增殖到6～8×103個細胞/孔，對其培養(yǎng)上清以ELISA間接法檢測抗乙肝表面抗體的存在，對檢測孔抗乙肝表面抗體陽性的雜交瘤細胞以有限稀釋法進行克隆，反復克隆8～10次，選出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的異種雜交瘤工程細胞系。
3.一種乙肝導向干擾素，其特征在于，由以下方法制備而成先將所述的分泌抗乙肝病毒的人單克隆抗體的異種雜交瘤細胞系進行培養(yǎng)，獲得抗乙肝病毒的人單克隆抗體，并用胃蛋白酶消化法制備抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段；然后將其與干擾素交聯(lián)，得乙肝導向干擾素。
4.制備權利要求3所述的乙肝導向干擾素的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將分泌抗乙肝病毒的人單克隆抗體的異種雜交瘤細胞系用動物法或培養(yǎng)法生產(chǎn)抗乙肝病毒的人單克隆抗體；(2)用胃蛋酶消化抗乙肝病毒的人單克隆抗體制備抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段；(3)用抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段與干擾素交聯(lián)，制備乙肝導向干擾素。
5.根據(jù)權利要求4所述的乙肝導向干擾素的制備方法，其特征在于，步驟(1)中動物法為將分泌抗乙肝病毒的人單克隆抗體細胞接種于用降植烷處理的裸鼠腹腔，細胞接種量為1×107個細胞/鼠，兩周后，開腹取實體瘤，將實體瘤剪碎，與0.01MPH7.4PBS按1∶3加入超聲波勻漿器中將實體瘤勻漿，將勻漿低溫高速離心，收上清，過Sepharose CL-4B柱層析，可得純度95％以上的抗乙肝病毒的人單克隆抗體。
6.根據(jù)權利要求4所述的乙肝導向干擾素的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)法為將分泌抗乙肝病毒的人單克隆抗體細胞接種于完全培基中，接種濃度為4～8×104個細胞/ml，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，低溫高速離心收上清，用硫酸銨沉淀，再低溫高速離心，去上清，沉積物用0.01MPH7.4PBS溶解上SepharosCL-4B柱層析，可得純度95％以上的抗乙肝病毒的人單克隆抗體。
7.根據(jù)權利要求4所述的乙肝導向干擾素的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)為將抗乙肝病毒的人單克隆抗體與胃蛋白酶混合，二者重量之比為20∶1，在37℃水浴中消化5小時，然后將消化液過SephacryLs-200柱層析，純化得純度95％以上的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段。
8.根據(jù)權利要求4所述的乙肝導向干擾素的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)為將所獲得純化的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段按比例與干擾素及戊二醛相混合，三者的分子數(shù)比為1～1.5∶1～1.2∶2～3，進行抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2與干擾素相交聯(lián)，制備出乙肝導向干擾素。
9.根據(jù)權利要求8所述的乙肝導向干擾素的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)過程為a.按上述比例取抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2片段及干擾素，混合裝入透析袋中，用0.01MPH8.0的磷酸緩沖液透析平衡24小時，將平衡后的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2與干擾素混合液在37℃溫浴中，邊攪拌邊滴加5～8％的戊二醛，攪拌均勻后在37℃溫浴中靜置30分鐘；b.將交聯(lián)液裝入透析袋中，4℃下對0.01MPH7.2的磷酸鹽緩沖液透析24小時，并用聚乙烯二醇6000滲析濃縮結合物；c.將交聯(lián)物上SephadexG-75，除去未起作用的戊二醛；d.將收集的抗乙肝病毒的人單克隆抗體F(ab′)2-干擾素交聯(lián)體進行除菌；e.最后向交聯(lián)體中加入5～10mg/ml的人血清白蛋白，進行凍干得成品。
10.權利要求3所述的乙肝導向干擾素在制備治療慢性乙型肝炎、HB后肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗乙肝病毒人單克隆抗體的雜交瘤細胞系的構建方法，其先采用EBV轉(zhuǎn)化人B淋巴細胞，獲得分泌抗－HBs的轉(zhuǎn)化B淋巴細胞系；然后用轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞與鼠漿細胞瘤細胞系FO的細胞進行細胞融合，構建分泌抗－HBs hMcAb的雜交瘤細胞系；該方法采用EB病毒轉(zhuǎn)化技術和細胞雜交技術，構建分泌抗－HBs五聚體IgM hMcAb的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)雜交瘤細胞系，其易培養(yǎng)，融合率高，雜交細胞活力強，分泌抗體量大且穩(wěn)定，同時還公開了乙肝導向干擾素及制備方法和應用，由抗－HBs F(ab′)
文檔編號C07K16/00GK1831121SQ20051010815
公開日2006年9月13日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權日2005年9月29日
發(fā)明者張永忠 申請人:張永忠