專利名稱：與t細(xì)胞表面共刺激分子cd137結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫功能的關(guān)鍵肽，具體地說，本發(fā)明涉及一組與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫應(yīng)答過程中T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)刺激。第一信號(hào)由T細(xì)胞上的抗原受體(TCR)與抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的特異性結(jié)合提供；第二信號(hào)(又稱為協(xié)同刺激信號(hào))則來自T細(xì)胞與APC表面協(xié)同刺激分子之間的相互結(jié)合。增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活化所需要的協(xié)同刺激信號(hào)是增強(qiáng)抗腫瘤免疫的重要方法。阻斷T細(xì)胞活化所需要的協(xié)同刺激信號(hào)是抑制T細(xì)胞活化、誘導(dǎo)T細(xì)胞處于失能狀態(tài)的有效方法，也是治療移植排斥反應(yīng)及自身免疫病的有效手段。CD137是繼CD28/B7之外新發(fā)現(xiàn)的另一重要的T細(xì)胞協(xié)同刺激分子，CD137與CD137配體在維持T細(xì)胞，尤其是CTL細(xì)胞的活化、增殖等方面具有重要的意義。
鑒于CD137-CD137L在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中所起的特殊作用，它們?cè)谀[瘤免疫、自身免疫病以及移植排斥中都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。刺激型抗-CD137單克隆抗體可通過活化T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，消除小鼠體內(nèi)的腫瘤。用抗CD137L的單抗阻斷CD137-CD137L途徑，可降低骨髓移植后移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)造成的損傷，特別是可延長移植后小鼠的存活期。CD137配體基因敲除鼠可導(dǎo)致針對(duì)主要組織相容性抗原和次要組織相容性抗原的皮膚移植排斥反應(yīng)延遲兩周。目前阻斷CD137-CD137L途徑的方法主要兩種，一是用特異性單克隆抗體封閉，如用抗CD137L的單抗阻斷CD137-CD137L途徑。但單抗多為鼠源性，用于人體治療有許多副作用。因此，迫切需要研發(fā)出更為廉價(jià)、有效的阻斷劑。但迄今為止，CD137與CD137L特異結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵序列還未明確。這就限制了對(duì)CD137、CD137L的功能及其作用機(jī)制的研究，闡明CD137與CD137L特異結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵序列對(duì)其功能和作用機(jī)制的深入研究有重要價(jià)值。
噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高效、快捷的分析蛋白分子間相互作用的工具。噬菌體展示肽文庫是將一段編碼外源短肽的寡核苷酸整合到噬菌體基因中，以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面，從而構(gòu)建成序列不同的特定長度的小肽集合。一般采用生物親合選擇系統(tǒng)淘選噬菌體肽庫。隨著此項(xiàng)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，噬菌體肽庫已被廣泛應(yīng)用于受體與配體特異結(jié)合位點(diǎn)、酶與底物作用位點(diǎn)、細(xì)胞因子與受體活性中心的作用、蛋白質(zhì)抗原表位研究等研究領(lǐng)域，為探索受體與配基、酶與底物及抗原與抗體的相互作用奠定了基礎(chǔ)。Marc等用噬菌體展示肽文庫技術(shù)得到與HIV膜蛋白gp120結(jié)合的特定多肽，此多肽能抑制gp120與CD4受體之間的相互作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)CD137與CD137L特異結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵序列還未明確的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一組與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽及其應(yīng)用，以促進(jìn)對(duì)CD137、CD137L的功能及其作用機(jī)制的研究。
本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.1Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe5本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.2Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu5本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.3Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe5本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.4Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr5上述與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽的制備是使用重組的CD137分子篩選肽文庫，以重組人CD137分子作為親和淘選的靶分子，從噬菌體隨機(jī)七肽庫中篩選得到。
本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在制備治療自身免疫病、腫瘤免疫以及移植排斥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
與本發(fā)明所述的肽序列相關(guān)的激活或阻斷CD137-CD137L通路的肽在腫瘤免疫、自身免疫病以及移植排斥反應(yīng)臨床治療中具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明制備的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽為制備其相關(guān)的藥物奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在制備激活或阻斷CD137-CD137L通路的藥物中的應(yīng)用。
對(duì)上述肽序列所做的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)顯示，所述的肽序列與CD137都有較強(qiáng)的親和性。
本發(fā)明涉及的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在研究或制備CD137-CD137L拮抗肽、類肽中的應(yīng)用。
對(duì)上述肽序列所做的功能實(shí)驗(yàn)顯示四個(gè)肽均能在體外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，并且還顯示其均能與細(xì)胞表面CD137結(jié)合從而阻斷抗CD137Ab的作用。
本發(fā)明所獲得的多肽序列對(duì)CD137-CD137L相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)的研究建立基礎(chǔ)。對(duì)與這些肽序列相關(guān)的激活或阻斷CD137-CD137L通路的肽在腫瘤、自身免疫病以及移植排斥反應(yīng)臨床治療中的應(yīng)用、激活或阻斷CD137-CD137L通路的藥物開發(fā)以及CD137-CD137L拮抗肽、類肽的研究提供條件。


圖1.23個(gè)淘選的噬菌體克隆ELISA值圖2.噬菌體展示肽體外抑制抗CD137抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)施方式
CD137是繼CD28/B7之外新發(fā)現(xiàn)的另一重要的T細(xì)胞協(xié)同刺激分子，為腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族成員。CD137由255個(gè)氨基酸組成，為跨膜蛋白，1-17為信號(hào)肽，18-186為胞外區(qū)，187-213為跨膜區(qū)，214-255氨基酸為胞內(nèi)區(qū)。CD137僅表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，而在靜止T細(xì)胞上不表達(dá)，其配體(CD137L)主要表達(dá)在活化的APC表面，包括巨噬細(xì)胞、成熟B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。
本發(fā)明以重組人CD137分子為靶，從噬菌體隨機(jī)七肽庫親和篩選人CD137特異性結(jié)合序列，經(jīng)五輪篩選，獲得一組與CD137特異性結(jié)合的肽序列。
實(shí)施例1從噬菌體隨機(jī)七肽庫篩選CD137結(jié)合肽材料、試劑隨機(jī)七肽噬菌體展示文庫(Ph.D.7TMPhage Display Peptide Library Kit)購自美國New England Biolabs公司，其中噬菌體的滴度為2.0×1013pfu/ml，復(fù)雜度為2.8×109轉(zhuǎn)化子，宿主菌為E.coli ER2738。
重組人CD137購自R&D公司。
IPTG、Xgal購自Takara公司。
PEG8000購自Promega。
測(cè)序引物5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’由上海博亞公司合成。
包被液0.1M pH 8.6的NaHCO3封閉液0.5％BSA-NaHCO3洗脫液0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA中和液1M Tris-HCl(pH 9.1)洗滌液0.1％ TBST、0.5％ TBST實(shí)驗(yàn)1.1噬菌體隨機(jī)七肽庫淘選以100μg/ml的靶分子(CD137)溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)，包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔150μl，4℃輕微震蕩，孵育過夜。每孔加滿封阻液，4℃作用2-3hr。TBST洗滌6次，加入10μl噬菌體七肽原始文庫和100μl TBS，室溫溫和搖動(dòng)60min。用TBST洗板10次。用100μl 0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA洗脫10min，洗脫液轉(zhuǎn)入離心管中。然后再用15μl 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脫液。測(cè)定洗脫物的滴度，并擴(kuò)增剩余洗脫物，測(cè)定擴(kuò)增后的滴度用于第二輪淘選。在第二、三輪淘選中分別加入前一輪擴(kuò)增產(chǎn)物2×1012PFU/ml，洗滌液改為0.5％ TBST，其余淘選、擴(kuò)增方法同前。第三輪洗脫，測(cè)定滴度，并在IPTG/Xgal平板上挑取5個(gè)噬菌斑進(jìn)行鑒定并測(cè)序。
第四及第五輪淘選，包被的CD137濃度分別降為50μg/ml和20μg/ml，并分別挑取6、12個(gè)噬菌斑進(jìn)行鑒定并測(cè)序。
根據(jù)每輪淘選前加入的噬菌體量與洗脫后的噬菌體量計(jì)算回收率，比較五輪淘選的噬菌體回收率，顯示第一輪至第五輪淘選所得的噬菌體回收率逐步提高，有一定的富集效果(見表1)。
表1 CD137對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫的淘選和富集


注產(chǎn)率＝產(chǎn)出/投入％1.2陽性噬菌斑的擴(kuò)增將ER2738過夜培養(yǎng)物按1∶100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分1ml到培養(yǎng)管中。每個(gè)要鑒定的克隆一管，挑一藍(lán)色噬菌斑到上述1ml培養(yǎng)管中，37℃搖床培養(yǎng)4.5-5hrs。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，離心30sec。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中，再離心。將80％的上清轉(zhuǎn)入新鮮離心管，此即為擴(kuò)增噬菌體，用于測(cè)序模板的純化和ELISA檢測(cè)。
1.3測(cè)序模板純化和DNA序列測(cè)定第三、四、五輪淘選后，分別隨機(jī)挑選5、6、12個(gè)克隆擴(kuò)增并測(cè)序。
將500μl含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管，加200μl PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10min。離心10min，棄上清液。沉淀物重懸于100μl碘化物緩沖液中，加入250μl乙醇。室溫溫育10min。離心，棄上清。用70％的乙醇洗沉淀。沉淀重懸于20μl TE中，此即為純化的測(cè)序模板。
取10μl的模板溶液，以5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’ 為測(cè)序引物，委托上海博亞公司在ABI 377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，共測(cè)23個(gè)克隆。(見表2)表2 23個(gè)噬菌體克隆的氨基酸序列


實(shí)施例2ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肽與CD137的親和力材料、試劑辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗M13噬菌體單抗(HRP/anti-M13)為Pharmacia產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)2.1夾心ELISA檢測(cè)淘選的噬菌體展示多肽對(duì)靶分子的結(jié)合在擴(kuò)增上述噬菌斑進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，將所剩余的含噬菌斑上清4℃保存。對(duì)每一個(gè)要鑒定的噬菌斑克隆，接種一管宿主菌ER2738于20ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至稍微渾濁。于每管ER2738培養(yǎng)液中加入5μl噬菌體上清，37℃培養(yǎng)4.5hrs。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，離心10min。上清移入新鮮離心管，再離心。取80％上清于新鮮離心管中，加1/6體積的PEG/NaCl。4℃沉淀過夜。離心，棄上清。沉淀重懸于1ml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管，PEG/NaCl再沉淀。冰上作用60min。離心，棄上清。沉淀重懸于50μlTBS中，測(cè)定噬菌體滴度。
用150μl 50μg/ml的CD137(溶于0.1M pH 8.6 NaHCO3中)包被ELISA板，4℃過夜，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。以封阻液封閉1h，0.5％ TBST洗板6次，按所測(cè)定的噬菌體滴度每孔加入1×1012個(gè)噬菌體，以空載體噬菌體克隆pComb3H為無關(guān)噬菌體陰性對(duì)照，37℃作用2h，0.5％ TBST洗板6次，每孔加200μl 1∶5000稀釋的HRP/抗-M13單抗，室溫作用1hr。TBST洗板6次，加OPD底物顯色5min，2M硫酸終止反應(yīng)，490nm測(cè)定吸光值(見表3、4)。
結(jié)果顯示大多數(shù)淘選到的噬菌體克隆所展示的多肽與CD137都有較高的結(jié)合力，空白對(duì)照OD值為0.01、陰性對(duì)照未顯色，說明淘選過程有良好效果(見圖1)。
表3 淘選到的第一組高度相似序列和其與CD137的親和力

表4 淘選到的第二組相似序列和其與CD137的親和力

在ELISA檢測(cè)中，也有某些克隆顯示高OD值(見表5)。
表5.ELISA檢測(cè)與CD137高親和力結(jié)合的噬菌體展示多肽序列

根據(jù)上述結(jié)果，我們選擇有高度相似性、重復(fù)性且在ELISA實(shí)驗(yàn)中顯示高親和力的四個(gè)克隆，即7號(hào)、8號(hào)、15號(hào)和13號(hào)克隆，并對(duì)其生物學(xué)作用進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。這些克隆所展示的肽序列即為SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，即Arg ProThr Gln Gly Ala Phe；Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu；Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe和Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr。
實(shí)施例3噬菌體展示多肽體外抑制抗CD137抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖材料、試劑PHA購自科睿生物技術(shù)公司3H-TdR購自中國原子能科學(xué)研究院抗CD137Ab購自R&D公司。
實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選到的含共有序列噬菌體克隆，分別取1×1012噬菌體，加入96孔板，紫外照射三小時(shí)以使噬菌體失去感染性和活力，但仍保持其所展示的多肽。體外檢測(cè)每一噬菌體展示多肽對(duì)PHA和抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)影響。同時(shí)，以無關(guān)噬菌體VCSM13做對(duì)照。
常規(guī)分離人外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/ml，按每孔200ul量加入96孔培養(yǎng)板。對(duì)每一噬菌體展示多肽分三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)PHA組；PHA+CD137Ab組；PHA+CD137Ab+噬菌體展示多肽組，并設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照，每組三個(gè)復(fù)孔。每孔PHA終濃度為50ug/ml，抗CD137抗體終濃度為5ug/ml，置37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56h。每孔加1μCi3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。用多頭細(xì)胞收集器將每孔培養(yǎng)物分別吸到49型玻璃纖維濾紙上，將濾紙置80℃烘干1h后，分別將每片濾紙放閃爍杯中，每杯加5mL閃爍液。在β-液體閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定每杯樣品的cpm。
4個(gè)克隆的肽序列分別為RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY。PHA+CD137Ab組的cpm值雖高于PHA+CD137Ab+VCSM13組，但二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
PHA+CD137Ab組與4個(gè)克隆的PHA+CD137Ab+噬菌體展示多肽組相比有顯著性差異(P＜0.05)。4個(gè)PHA+CD137Ab+噬菌體展示多肽組各組間無顯著性差異(P＞0.05)(見圖2)。
淋巴細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)顯示四個(gè)肽，肽序列即為SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，均能在體外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，并且還顯示其均能與細(xì)胞表面CD137結(jié)合從而阻斷抗CD137Ab的作用。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽及其應(yīng)用<141>2005-10-13<160>4<210>1<211>7<212>PRT<221>與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽<222>(1)…(7)<400>1Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe5SEQ ID NO.2<210>2<211>7<212>PRT<221>與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽<222>(1)…(7)<400>2Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu5SEQ ID NO.3<210>3<211>7<212>PRT<221>與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽<222>(1)…(7)<400>3
Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe5SEQ ID NO.4<210>4<211>7<212>PRT<221>與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽<222>(1)…(7)<400>4Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr權(quán)利要求
1.一種與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.1Arg Pro Thr Gln Gly Ala Phe。5
2.一種與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.2Arg Pro Thr Gln Val Ala Leu。5
3.一種與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.3Arg Pro Thr Gln Val Ala Phe。5
4.一種與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長度7氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.4Ser Arg Ser Arg Val Arg Tyr。5
5.權(quán)利要求1、2、3或4所述的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在制備治療自身免疫病、腫瘤免疫以及移植排斥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1、2、3或4所述的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在制備激活或阻斷CD137-CD137L通路的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1、2、3或4所述的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在研究或制備CD137-CD137L拮抗肽、類肽中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽，它們具有SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；本發(fā)明還公開了所述的與T細(xì)胞表面共刺激分子CD137結(jié)合的多肽在制備治療自身免疫病、腫瘤以及移植排斥反應(yīng)的藥物、制備激活或阻斷CD137－CD137L通路的藥物以及在研究或制備CD137－CD137L拮抗肽、類肽中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K7/00GK1749270SQ200510104308
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日
發(fā)明者張利寧, 李娜, 王群 申請(qǐng)人:山東大學(xué)