專利名稱：龍膽苦甙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域化合物的分離提取方法，具體的涉及植物天然生理活性物質(zhì)龍膽苦甙的制備方法。
背景技術(shù)：
龍膽苦甙(gentiopicroside)屬于植物中天然存在的裂環(huán)環(huán)烯醚萜甙類化合物，具有多方面的生理活性，例如保肝利膽、健胃、促進(jìn)腸胃消化功能(CN 1191132A)、抗氧化、抗炎、抗菌、升高血糖、以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用10，是我國傳統(tǒng)中藥材龍膽、秦艽、當(dāng)藥、獐芽菜等及其制成的中成藥的主要有效成分。龍膽苦甙為水溶性的配糖體類化合物，極性大，具有吸濕性，不穩(wěn)定，分離純化困難，迄今沒有工業(yè)化批量生產(chǎn)的制備工藝。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于龍膽苦甙為具有生理活性和醫(yī)療價(jià)值的植物天然產(chǎn)物，本發(fā)明旨在提供一種低成本、高純度、無污染、制備過程簡單易行、生產(chǎn)周期短，適宜于批量制備和工業(yè)化生產(chǎn)的龍膽苦甙制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案將植物原料烘干、粉碎，用低級(jí)醇加熱回流提取，過濾、合并濾液，減壓濃縮，回收溶劑，低級(jí)醇提取物以大孔吸附樹脂柱層析分離，用含水低級(jí)醇梯度洗脫，同時(shí)用薄層層析法檢測指導(dǎo)分離，收集富含龍膽苦甙的洗脫液，濃縮，富集龍膽苦甙的洗脫物經(jīng)離子交換樹脂柱層析純化，低級(jí)醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到龍膽苦甙。
上述技術(shù)方案中用于提取龍膽苦甙的植物原料為龍膽屬(Gentiana)植物，如堅(jiān)龍膽(G.rigescens Franch.ex.Hemsl)、條葉龍膽(G.manshurica Kitg.)、龍膽(G.scabra Bunge)、三花龍膽(G.triflora Pall.)、秦艽(G.macrophylla Pall.)、粗莖秦艽(G.crassicaulis Duthie)、麻花秦艽(G.straminea Maxim.)、小秦艽(G.dahurica Fisch)；獐芽菜屬(Swertia)植物，如川西獐芽菜(S.davidi Franeh.)、金沙獐芽菜(S.patens)、西南獐芽菜(S.cincta)、祁連獐芽菜(S.przewalskii)、四數(shù)獐芽菜(S.tetraptera)、抱莖獐芽菜(S.franchetiana)等。
上述技術(shù)方案中用于提取和柱層析洗脫的有機(jī)溶劑為低級(jí)醇，即為工業(yè)用乙醇或甲醇。
上述技術(shù)方案中用于柱層析分離的大孔吸附樹脂為聚苯乙烯型大孔吸附樹脂。如Diaion，XAD-2，D-101，KB-8等。提取物與大孔吸附樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶10-15。以含水低級(jí)醇梯度洗脫。
上述技術(shù)方案中用于柱層析純化的離子交換樹脂填充劑為弱堿型大孔陰離子交換樹脂，包括不同廠家生產(chǎn)的所有弱堿型大孔陰離子交換樹脂的產(chǎn)品型號(hào)與規(guī)格，包括但不限于D900，Diaion WA20，Amberlite IRA-93等。
上述技術(shù)方案中用于檢測和指導(dǎo)柱層析分離的薄層層析法是以7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水為展開劑，10％硫酸乙醇液為顯色劑。
上述技術(shù)方案中龍膽苦甙的干燥方法可以是加熱干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
上述技術(shù)方案中龍膽苦甙的純度檢測應(yīng)用高壓液相色譜法進(jìn)行。
經(jīng)過上述制備工藝分離得到的龍膽苦甙收率高，純度大于95％，無有機(jī)溶劑的殘留，可直接用作為制藥的天然原料或作為標(biāo)準(zhǔn)對照品使用。
本發(fā)明制備龍膽苦甙的具體步驟如下(1)植物原料去雜、洗凈、烘干、粉碎成粗粉(過20-40目篩)。
(2)將該植物原料粗粉用工業(yè)乙醇(或甲醇)加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，過濾、減壓濃縮，回收溶劑，干燥，得醇提取物。
(3)用少量水將醇提取物溶解，過濾，緩緩傾入大孔吸附樹脂(如DiaionHP20SS，D-101，KB-8等)層析柱的上端。醇提取物與大孔吸附樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶15-20。以不同濃度的醇梯度洗脫，同時(shí)用薄層層析法檢測指導(dǎo)洗脫。薄層層析的條件為氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)為展開劑，10％硫酸乙醇液為顯色劑。富集含有龍膽苦甙的洗脫液，合并。
(4)將富集龍膽苦甙的洗脫液緩緩傾入弱堿型大孔陰離子交換樹脂(如D900，Diaion WA20，Amberlite IRA-93等)層析柱的上端，用50％的低級(jí)醇洗脫，收集洗脫液。
(5)將上述洗脫液減壓濃縮，干燥，得到淡黃色粉末，即為龍膽苦甙。
(6)上述方法中龍膽苦甙的干燥方法除加熱干燥法，也可采用冷凍干燥、噴霧干燥等。
(7)龍膽苦甙的高壓液相色譜(HPLC)定量分析按以下的方法進(jìn)行
儀器與試劑HPLC儀器為Alliance高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器，PDA二級(jí)管陣列可變波長檢測器。乙腈為色譜純，水為超純水，其余溶劑均為分析純。
色譜條件及檢測波長的選擇用十八烷基硅膠為填充劑(如AgilentZORBAX C18酸性柱，4.6×150mm)；乙腈∶水(0.2％醋酸)(5∶95至90∶10，線形梯度)為流動(dòng)相；柱溫40□；流速1ml/min；波長254nm。
實(shí)驗(yàn)材料精密稱取龍膽苦苷1mg，加1ml甲醇充分振蕩溶解后，即得對照品溶液。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(0.2％醋酸)溶液(5-90％，60min)為流動(dòng)相；檢測波長為254nm。柱溫40℃。理論板數(shù)按龍膽苦甙峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。
2.用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(0.2％醋酸)溶液(0-95％，30min)為流動(dòng)相；檢測波長為254nm。柱溫40℃。理論板數(shù)按龍膽苦甙峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。
3.用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-水(0.2％醋酸)溶液(8-50％，20min)，線性梯度洗脫；檢測波長為254nm。柱溫40℃。理論板數(shù)按龍膽苦甙峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。
系統(tǒng)精密度考察以龍膽苦甙峰面積為指標(biāo)，RSD為0.1％，系統(tǒng)精密度良好。(表1)重現(xiàn)性考察以龍膽苦甙峰面積為指標(biāo)，RSD為1.9％，重現(xiàn)性良好(表2)。
穩(wěn)定性考察以龍膽苦甙峰面積為指標(biāo)，考察24小時(shí)，RSD為0.2％，龍膽苦甙穩(wěn)定性良好(表3)。
含量測定由上述工藝制備的龍膽苦甙的含量為95％以上。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有下述的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明以龍膽科龍膽屬和獐芽菜屬植物的任何一種含龍膽苦甙的植物為原料制備龍膽苦甙。
2、按本發(fā)明的技術(shù)方案生產(chǎn)制備的龍膽苦甙收率高，產(chǎn)品的純度大于95％，無有機(jī)溶劑的殘留，可直接作為制藥工業(yè)的天然原料。
表1系統(tǒng)精密度考察

表2重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

3、本發(fā)明使用的柱層析填充劑為聚苯乙烯型大孔吸附樹脂和弱堿型大孔離子交換樹脂填充劑材料可以重復(fù)使用。
4、本發(fā)明僅使用低級(jí)醇和水提取分離龍膽苦甙，操作簡便易行，生產(chǎn)成本低。如選擇乙醇進(jìn)行生產(chǎn)，則無毒，無三廢污染。
具體實(shí)施例方式下面以本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1從中藥材堅(jiān)龍膽(G.rigescens Franch.ex.Hemsl)中制備龍膽苦甙。
(1)堅(jiān)龍膽原料去雜、洗凈、烘干、粉碎成過30目篩的粗粉。
(2)堅(jiān)龍膽粗粉5kg用工業(yè)乙醇加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間2小時(shí)，過濾、合并濾液、減壓濃縮、回收溶劑、干燥，得堅(jiān)龍膽乙醇提取物。回收溶劑可用于反復(fù)提取。
(3)用少量水將乙醇提取物溶解，緩緩傾入D101大孔吸附樹脂層析柱的上端，乙醇提取物與大孔吸附樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶15-20，以不同濃度的乙醇梯度洗脫。同時(shí)，用薄層層析法檢測指導(dǎo)洗脫，薄層層析的條件為氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)為展開劑，10％硫酸乙醇液為顯色劑。收集含有龍膽苦甙的洗脫液。
(4)將富集龍膽苦甙的洗脫液緩緩傾入離子交換樹脂層析柱的上端，用50％乙醇洗脫，收集洗脫液。
(5)合并上述乙醇洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到的淡黃色粉末180g，即為龍膽苦甙，得率為3.6％。
(6)應(yīng)用HPLC定量分析方法，對分離制備得到的龍膽苦甙進(jìn)行純度檢測，含量為95％以上。
實(shí)施例2從中藥材龍膽(G.scabra Bunge)中提取制備龍膽苦甙(1)龍膽原料清雜、洗凈、烘干、粉碎成粗粉。
(2)將龍膽粗粉2kg，工業(yè)甲醇加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間為2小時(shí)，然后經(jīng)過濾、濃縮、干燥，得龍膽甲醇提取物。
(3)用少量水將甲醇提取物溶解，緩緩傾入D101大孔吸附樹脂層析柱的上端，甲醇提取物與大孔吸附樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶15-20，以不同濃度的乙醇梯度洗脫。同時(shí)，用薄層層析法檢測指導(dǎo)洗脫，薄層層析的條件為氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)為展開劑，10％硫酸乙醇液為顯色劑。收集含有龍膽苦甙的洗脫液。
(4)將富集龍膽苦甙的洗脫液緩緩傾入離子交換樹脂層析柱的上端，用50％甲醇洗脫，收集洗脫液。
(5)將50％甲醇洗脫液濃縮，噴霧干燥，得到的淡黃色粉末85g。即為龍膽苦甙，得率為4.25％。
應(yīng)用HPLC定量分析方法，對分離制備得到的龍膽苦甙進(jìn)行純度檢測。含量為95％以上。
由上述工藝制備的龍膽苦甙的物理常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)分子式C16H20O9分子量356結(jié)構(gòu)式 性狀淡黃色粉末；易溶于甲醇、乙醇、水。
紅外光譜vmax(KBr)3500，2900，1710，1619cm-1紫外光譜λmax(EtOH)268，252，244nm
質(zhì)譜(FAB--MS)355[M-H]1H NMR譜(CD3OD，125MHz)δ5.66(1H，d，J＝2.5Hz，H-1)，7.46(1H，s，H-3)，5.75(m，H-6)，5.05(m，H-7)，5.70(1H，m，H-8)，3.72(m，H-9)，5.21(m，H-10)，4.64(1H，d，J＝8.6Hz，glu-1′)。
13C NMR譜(CD3OD，125MHz)δ98.5(d，C-1)，150.7(d，C-3)，104.7(s，C-4)，126.5(s，C-5)，117.4(d，C-6)，71.0(t，C-7)，134.6(d，C-8)，46.3(d，C-9)，118.8(t，C-10)，166.8(s，C-11)；glu 104.7(d，C-1)，74.2(d，C-2)，78.0(d，C-3)，71.2(d，C-4)，77.5(d，C-5)，62.4(t，C-6)。
權(quán)利要求
1.龍膽苦甙的制備方法，其特征在于取龍膽屬植物和獐芽菜屬植物中的任何一種含有龍膽苦甙的植物，烘干、粉碎，用低級(jí)醇加熱回流提取，經(jīng)過濾、濃縮、干燥得醇提取物，然后經(jīng)柱層析分離，在薄層層析的檢測指導(dǎo)下，用不同濃度的含水低級(jí)醇進(jìn)行梯度洗脫，收集含龍膽苦甙的洗脫液，減壓濃縮，洗脫物經(jīng)柱層析純化，用低級(jí)醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得龍膽苦甙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的植物是龍膽屬植物，包括但不限于堅(jiān)龍膽、條葉龍膽、龍膽、三花龍膽、秦艽、粗莖秦艽、麻花秦艽、小秦艽；或獐芽菜屬植物，包括但不限于川西獐芽菜、金沙獐芽菜、西南獐芽菜、祁連獐芽菜、四數(shù)獐芽菜、抱莖獐芽菜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的低級(jí)醇為乙醇和甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于柱層析分離用的大孔吸附樹脂填充劑為聚苯乙烯型的大孔吸附樹脂，包括但不限于XAD-2，XAD-4，Diaion，D-101，KB-8，提取物與大孔吸附樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶10-15。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于柱層析純化用的離子交換樹脂填充劑為弱堿型大孔陰離子交換樹脂，包括但不限于D900，Diaion WA20，Amberlite IRA-93，提取物與離子交換樹脂的重量比為1∶8-15，柱徑高比為1∶10-15。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，用于檢測和指導(dǎo)柱層析分離的薄層層析法是以7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水為展開劑，10％硫酸乙醇液為顯色劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于龍膽苦甙的干燥方法可采用加熱干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于應(yīng)用高壓液相色譜法進(jìn)行龍膽苦甙的純度檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從植物中提取制備龍膽苦甙(gentiopicroside)的方法。植物原料的低級(jí)醇提取物，經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析分離，富集龍膽苦甙部位，減壓濃縮，再經(jīng)弱堿型大孔陰離子交換樹脂柱柱層析純化，得到龍膽苦甙，純度大于95％。該方法龍膽苦甙得率高，且純度高，制備過程簡單易行，生產(chǎn)周期短，易于批量制備和工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H1/08GK1757647SQ20051001092
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者許敏, 張穎君, 王東, 張香蘭, 楊崇仁 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所