專利名稱：包含互補(bǔ)肽的人工抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用互補(bǔ)肽檢測(cè)靶位蛋白的方法，所述肽是用作天然抗體替代物的人工抗體，其利用設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)有結(jié)合親合力的互補(bǔ)肽的技術(shù)來(lái)制備，本發(fā)明也涉及分析靶位蛋白的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)遺傳算法(遺傳進(jìn)化法)來(lái)發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)肽的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)之一是疏水性值。疏水性值的平均值由肽每個(gè)位置上的氨基酸加上該位置之前和之后的氨基酸(該位置之前和之后的五個(gè)或幾個(gè)氨基酸；對(duì)于末端氨基酸，為0個(gè)氨基酸)來(lái)計(jì)算，而疏水性值通過(guò)具有平均值相反信號(hào)的值來(lái)評(píng)估。例如，當(dāng)平均值為+3.0時(shí)，將值-3.0評(píng)估作為那個(gè)氨基酸位置上疏水性值的滿分。第二個(gè)評(píng)估指數(shù)為在相應(yīng)位置上的氨基酸側(cè)鏈的相應(yīng)大小。評(píng)估相應(yīng)氨基酸的α氨基碳(與氨基酸側(cè)鏈相連的基團(tuán)的碳原子)是否具有不妨礙其他氨基酸接近到5 距離的側(cè)鏈大小。當(dāng)側(cè)鏈由于其大小而不妨礙其他側(cè)鏈靠近的時(shí)候，相應(yīng)值被評(píng)估作為滿分，并根據(jù)干擾程度來(lái)扣減，由此評(píng)估互補(bǔ)肽。第三個(gè)評(píng)估指數(shù)為肽骨架的主鏈排列的一致性，用主鏈排列的一致性來(lái)評(píng)估互補(bǔ)肽。設(shè)計(jì)給定數(shù)量的肽(如300個(gè)肽)使它們與靶肽有相同數(shù)量的氨基酸，將這些肽生成候選肽庫(kù)，評(píng)估它們針對(duì)靶肽的互補(bǔ)性，將評(píng)估值存入電腦存儲(chǔ)器。當(dāng)獲得了給定數(shù)量的評(píng)估肽庫(kù)時(shí)，在肽庫(kù)中選擇具有較高評(píng)估分值的2個(gè)較高等級(jí)的肽，通過(guò)打亂來(lái)修飾這些肽的氨基酸序列，或通過(guò)任意扣減氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)其他候選肽，由此產(chǎn)生下一代的肽庫(kù)。對(duì)每個(gè)肽評(píng)估針對(duì)靶肽的互補(bǔ)性，將評(píng)估值存入電腦存儲(chǔ)器，再選擇2個(gè)較高等級(jí)的肽，通過(guò)前述相同方法來(lái)產(chǎn)生接下來(lái)的一代肽庫(kù)。重復(fù)這些過(guò)程，理想地應(yīng)持續(xù)重復(fù)直至獲得所有肽都為滿分為止。按照更高等級(jí)來(lái)排序，排列出各個(gè)肽的評(píng)估記錄，由此產(chǎn)生列表，而具有較高等級(jí)的肽(如較高的300個(gè)肽)被存為記錄中的列表。該計(jì)算機(jī)程序軟件被稱為MIMETIC。合成滿分的或幾乎滿分的肽，評(píng)估其與含靶肽的蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性，從而將具有較高結(jié)合親和性的肽用作為人工抗體肽。
可選的，用抗原免疫鼠或兔，利用產(chǎn)生抗體的動(dòng)物的血清作為抗血清，可從血清中純化出抗體。通過(guò)用骨髓瘤細(xì)胞株融合淋巴細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生雜交瘤，所述淋巴細(xì)胞獲得自動(dòng)物(如用抗原免疫的鼠)的脾細(xì)胞，克隆所期望的產(chǎn)生抗體的雜交瘤，使之產(chǎn)生單克隆抗體?？墒牵瑑H在運(yùn)氣好時(shí)動(dòng)物才識(shí)別所期望的表位并產(chǎn)生抗體。用噬菌體展示方法來(lái)產(chǎn)生抗表位的反應(yīng)性抗體，所述表位不具有針對(duì)免疫動(dòng)物的抗原性，這是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的方法。
發(fā)明概要因此，本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)互補(bǔ)肽，利用計(jì)算機(jī)程序(如MIMETIC)預(yù)計(jì)其能與抗原蛋白的靶肽部分反應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)合成所期望的肽，使互補(bǔ)肽能用作人工抗體肽，從而確認(rèn)肽的特異結(jié)合親和力。
本發(fā)明提供了利用計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)與抗原蛋白靶肽部分的氨基酸序列互補(bǔ)的肽的方法。為了研究與靶位蛋白的特異結(jié)合親和力，本發(fā)明也提供了具有高特異結(jié)合親和力的人工抗體肽，使合成肽能與靶位蛋白反應(yīng)。
本發(fā)明中得到了結(jié)合任意蛋白靶位氨基酸序列的互補(bǔ)肽，所述肽用作人工抗體肽檢測(cè)抗原蛋白。設(shè)計(jì)程序軟件MIMETIC能用于設(shè)計(jì)互補(bǔ)肽。由于能自由地設(shè)計(jì)人工抗體肽，所述人工抗體肽與選作靶的蛋白質(zhì)任意位置反應(yīng)，因此不需要通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生抗體的方法了。另外，由于能迅速生產(chǎn)抗新蛋白質(zhì)的人工抗體肽，而且不要事先制備任何抗體，因此本發(fā)明的方法能容易地構(gòu)成為用于檢測(cè)新蛋白質(zhì)的方法。通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生抗體的方法幾乎不能預(yù)見(jiàn)可以生產(chǎn)出抗動(dòng)物物種間蛋白質(zhì)共有的位點(diǎn)的抗體。可是，由于本發(fā)明的產(chǎn)生人工抗體肽的方法能產(chǎn)生與動(dòng)物物種間共有位點(diǎn)反應(yīng)的肽，因此可以容易地構(gòu)成為檢測(cè)抗原蛋白的方法。當(dāng)構(gòu)建利用2個(gè)或更多抗體的檢測(cè)系統(tǒng)(如ELISA方法)和蛋白質(zhì)陣列方法時(shí)，本發(fā)明的方法相當(dāng)有用，因?yàn)槠淠軌蛟O(shè)計(jì)生產(chǎn)出抗靶分子各分離位點(diǎn)的人工抗體肽。
優(yōu)選的
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1利用分析程序(MIMETIC)自動(dòng)設(shè)計(jì)出互補(bǔ)肽，其抗AIDS病毒(人免疫缺陷病毒-1(HIV-1))反轉(zhuǎn)錄酶(本文以下簡(jiǎn)稱為RT)每個(gè)位置上的肽，設(shè)計(jì)的肽如表1所示。通過(guò)常規(guī)的固相方法，利用肽合成儀(商品名AMS 422多肽合成儀，其由ABiMED Co.生產(chǎn))將芴基甲酯基(Fmoc)氨基酸按順序連結(jié)，由此來(lái)合成設(shè)計(jì)的肽。通過(guò)常規(guī)方法將合成肽從固體支持物上釋放出來(lái)，并除去保護(hù)基團(tuán)。用乙醚沉淀來(lái)收獲所得的肽，并在干燥除去乙醚后用反相HPLC純化。感染了HIV-1的PLB細(xì)胞(公認(rèn)的人淋巴細(xì)胞株)培養(yǎng)物的上清液位于超離心管中65％和15％蔗糖溶液的分層的最上層，以26,500rpm超離心1小時(shí)來(lái)收獲HIV-1顆粒。病毒RNA通過(guò)異硫氰酸胍法(Chomezynski，P.和Sacchi，N.，RNA Isolationfrom Cultured cells，Analytical Biochemistry，162156-159，1987)來(lái)提取，提取物溶于5mM Tris緩沖液中(pH7.5)待用。包含在總RNA樣品中的全長(zhǎng)病毒基因組的量根據(jù)常規(guī)的核糖核酸酶保護(hù)法(Kaye，J.F.等，Cis-acting Sequences Involved in Human Immunodeficiency Virus Type 1RNA Packaging，J.Virol，696588-6592，1995；和Huang，Y.等，The Role ofNucleocapsid and U5 Stem/A rich Loop Sequence in tRNA(3Lys)GenomicPlacement and Initiation of Reverse Transcription in HumanImmunodeficiency Virus Type 1，J.Virol.，723907-3915，1997)來(lái)定量。病毒基因組結(jié)合于細(xì)胞中的tRNALys3上，其能用于測(cè)定RT活性。在37℃，將約5×107個(gè)分子的RNA基因組與50ng HIV-RT、10單位的RNase和dNTP(脫氧核酸)在20μl RT緩沖液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、60mM KCl、3mM MgCl2和10mM DTT)中反應(yīng)15分鐘。分子末端的序列包含CTGCTA這六個(gè)堿基。用帶有5μCi放射性的32P-dCTP將一個(gè)堿基加入到tRNALys3中，進(jìn)一步將六個(gè)堿基加入，使0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、5μCi32P-dCTP和0.05mM ddATP反應(yīng)。乙醇沉淀來(lái)收獲延伸的引物，并在包含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝膠上用自動(dòng)放射線照相術(shù)分析。將用于研究抗RT活性的測(cè)試肽加入到RT反應(yīng)系統(tǒng)，并且測(cè)定加入的堿基序列的量。結(jié)果顯示，約20μM濃度的TLMA2993、PSTW1594和ESLA2340這3個(gè)肽能抑制RT活性50％。其余7個(gè)肽中沒(méi)有觀察到抑制活性，30％的設(shè)計(jì)出的肽顯示出了抑制活性。該結(jié)果顯示，能以相當(dāng)高的概率設(shè)計(jì)出具有所期望活性的肽。表1中總結(jié)了這些結(jié)果。表1顯示了被認(rèn)為涉及反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的各種位置上的氨基酸序列和用MIMETIC對(duì)這些位置而自動(dòng)設(shè)計(jì)出的肽的氨基酸序列。10個(gè)肽中，3個(gè)肽抑制了RT活性。
表1

對(duì)于ESLA2340來(lái)說(shuō)，抗RT的50％抑制濃度為17μM，對(duì)于TLMA2993為15μM，對(duì)于PSTW1594為15μM。在其他互補(bǔ)肽中沒(méi)有觀察到抗RT的抑制活性。
以下將利用ESLA2340和TLMA2993來(lái)檢測(cè)HIV反轉(zhuǎn)錄酶(HIV-RT)，確認(rèn)抑制反轉(zhuǎn)錄酶的活性，并利用這些互補(bǔ)肽來(lái)作為人工抗體肽。96孔板的孔事先用ESLA2340覆蓋。每個(gè)孔中加入稀釋的HIV-RT溶液并使該板于4℃靜置過(guò)夜，之后洗板并往每個(gè)孔加入生物素標(biāo)記的TLMA2993。讓該板在室溫靜置1小時(shí)。再次洗板，之后將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白加入其中，在室溫反應(yīng)1小時(shí)。洗板以去除未反應(yīng)的抗生物素蛋白，之后用常規(guī)方法，通過(guò)加入過(guò)氧化物酶的顯色劑在室溫進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯示的顏色由HIV-RT濃度而定，其顯示出人工肽抗體能應(yīng)用于夾心ELISA法。
實(shí)施例2用胰蛋白酶樣酶，如凝血酶和血纖維蛋白溶酶，截去從氨基末端到精氨酸92的序列，這樣，羧肽酶原R(以下本文中簡(jiǎn)稱為ProCPR)轉(zhuǎn)化成有活性的羧肽酶R(以下本文中簡(jiǎn)稱為CPR)。互補(bǔ)肽利用本發(fā)明的分析程序MIMETIC來(lái)自動(dòng)設(shè)計(jì)，所述肽相應(yīng)氨基酸序列包括從ProCPR氨基末端算起的氨基酸87開(kāi)始的30、24、20、15或11個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)的肽如表2所示。用包含上述互補(bǔ)肽的20個(gè)和15個(gè)氨基酸的肽(所述肽列為表2的標(biāo)注(1)和(2))，來(lái)分析由凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物(以下本文中簡(jiǎn)稱為T(mén)/TM)處理ProCPR的活化反應(yīng)。通過(guò)常規(guī)的固相方法，利用肽合成儀(商品名AMS 422多肽合成儀，其由ABiMED Co.生產(chǎn))將芴基甲酯基(Fmoc)氨基酸按順序連結(jié)，由此來(lái)合成設(shè)計(jì)的肽。通過(guò)常規(guī)方法將合成肽釋放出來(lái)，并除去保護(hù)基團(tuán)。用乙醚沉淀來(lái)收獲所得的肽，并在干燥除去乙醚后用反相HPLC純化。將包含20個(gè)和15個(gè)氨基酸的純化的肽與ProCPR在室溫反應(yīng)10分鐘，接著同T/TM復(fù)合物反應(yīng)。加入馬尿酰-L-精氨酸(CPR底物)在37℃反應(yīng)45分鐘，根據(jù)報(bào)道的方法(Komura，H.，等，Effect of Anticoagulants in Colorimetric Assay forBasic Carboxypeptidase，Microbiol.Immunol.，46115-117，2002)測(cè)定游離的馬尿酸。加入二十肽和十五肽時(shí)，T/TM復(fù)合物將ProCPR轉(zhuǎn)化為CPR的活性分別被加入的1μM肽所抑制。所研究觀察到的2個(gè)肽對(duì)作為靶位的ProCPR的抑制效應(yīng)似乎顯示出了我們命名為MIMETIC的互補(bǔ)肽設(shè)計(jì)程序軟件的高效率。用彈性蛋白酶和胰蛋白酶活化ProCPR時(shí)，這些肽僅僅抑制由T/TM復(fù)合物產(chǎn)生的活化，不抑制彈性蛋白酶和胰蛋白酶產(chǎn)生的活化。針對(duì)所設(shè)計(jì)的ProCPR的互補(bǔ)肽如表2所示。表2顯示了由MIMETIC自動(dòng)設(shè)計(jì)的模擬肽，其針對(duì)ProCPR氨基酸87下游的11、15、20、24或30個(gè)氨基酸。由于糖鏈據(jù)推測(cè)連接于精氨酸86，因此省略該氨基酸，包含氨基酸87及其后的肽作為靶肽。由于羧基一側(cè)的精氨酸92位于凝血酶的裂解位點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)模擬肽以跳過(guò)精氨酸92。選擇包含20個(gè)和15個(gè)氨基酸的肽，用以研究肽對(duì)ProCPR與T/TM復(fù)合物活性的作用，發(fā)現(xiàn)了1μM濃度的2個(gè)肽都顯示出了抑制效應(yīng)。
表2


(標(biāo)注1)和(標(biāo)注2)是用實(shí)際合成的肽確證了能抑制ProCPR活化的肽。
包含20個(gè)氨基酸的VGGRRTRARRVLLLVLTETH(以下本文中簡(jiǎn)稱為VGG)被確證能抑制ProCPR活化，利用表面胞質(zhì)團(tuán)共振分析儀(由Biacore Co.生產(chǎn))確認(rèn)其能與ProCPR反應(yīng)。用VGG覆蓋平板并洗板，然后將包含ProCPR的稀釋的人血漿加到板上，讓它們?cè)谑覝胤磻?yīng)1小時(shí)。洗板除去過(guò)量的血漿，然后添加抗生物素標(biāo)記的ProCPR的單克隆抗體10G1，接著讓其在室溫反應(yīng)1小時(shí)。洗板除去過(guò)量的10G1抗體，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白使剩下的10G1抗體反應(yīng)。洗滌去除未反應(yīng)的抗生物素蛋白，然后通過(guò)常規(guī)方法，加入過(guò)氧化物酶顯色劑，根據(jù)過(guò)氧化物酶酶反應(yīng)強(qiáng)度使反應(yīng)溶液顯色，用平板讀數(shù)裝置測(cè)定顏色強(qiáng)度。由于顯出的顏色由包含ProCPR的血漿的濃度而定，因此能確認(rèn)覆蓋在板上的VGG能夠用作為人工肽抗體。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)抗原的方法，其利用與靶蛋白反應(yīng)的互補(bǔ)肽作為人工抗體。
2.權(quán)利要求1所述的與靶蛋白反應(yīng)的互補(bǔ)肽，其用酶、放射性同位素、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記。
3.包括互補(bǔ)肽的試劑盒，其利用權(quán)利要求1和2所述的抗相同抗原的至少2種互補(bǔ)肽，其中一種互補(bǔ)肽固定在固相上，而且與所述互補(bǔ)肽反應(yīng)的抗原或與所述抗原反應(yīng)的另一種互補(bǔ)肽用酶、放射性同位素或生物素標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3所述的試劑盒，其包括互補(bǔ)肽和天然抗體識(shí)別的抗原。
全文摘要
本發(fā)明要設(shè)計(jì)合成一種與抗原蛋白靶位互補(bǔ)的肽，確證了其能與靶位結(jié)合，并由此提供了一種用于檢測(cè)抗原蛋白的人工肽。也就是說(shuō)，為了確認(rèn)能提供針對(duì)靶位的人工抗體肽，通過(guò)利用諸如設(shè)計(jì)程序MIMETIC來(lái)構(gòu)建具有互補(bǔ)肽特異結(jié)合性的人工抗體肽，所述程序用于自動(dòng)設(shè)計(jì)與肽靶位氨基酸序列相互補(bǔ)的肽。
文檔編號(hào)C07K14/00GK1871515SQ200480030678
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月29日
發(fā)明者岡田秀親, 岡田則子 申請(qǐng)人:岡田 秀親, 岡田 則子