專利名稱：功能性流感病毒樣顆粒(VLPs)的制作方法
背景技術(shù)：
流感病毒是正粘病毒科的一員(參見Murphy和Webster，1996)。具有被稱做A、B和C的三個流感病毒亞型。流感病毒粒子包含節(jié)段的負義RNA基因組。該流感病毒粒子包括如下蛋白血凝素(HA)、唾液酸苷酶(NA)、基質(zhì)(M1)、質(zhì)子離子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶堿性蛋白1(PB1)、聚合酶堿性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、和非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)蛋白。HA、NA、M1和M2與膜結(jié)合，而NP、PB1、PB2、PA和NS2是核殼結(jié)合蛋白。NS1是唯一的不與病毒體顆粒結(jié)合但對流感感染細胞具有專一性的非結(jié)構(gòu)蛋白。M1蛋白在流感病毒顆粒中是具最高豐度的蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，負責病毒附著和病毒顆粒侵入細胞，以及是病毒中和和保護性免疫的主要免疫優(yōu)勢表位的來源。HA和NA蛋白被認為是預(yù)防性流感疫苗最重要的成分。
流感病毒感染是由病毒體表面HA蛋白與含有唾液酸的細胞受體(糖蛋白和糖脂)附著引起的。NA蛋白介導唾液酸受體的加工，并且病毒侵入細胞取決于依賴HA的受體介導胞吞作用。在包含流感病毒粒子的內(nèi)化核內(nèi)體的酸性區(qū)域內(nèi)，HA2蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，導致病毒與細胞膜的融合以及病毒脫殼和M2介導的M1蛋白從核殼相關(guān)的核糖核蛋白(RNPs)釋放，所述M1蛋白移入細胞核用于病毒RNA合成。HA蛋白的抗體通過中和病毒的傳染性防止病毒感染，而NA蛋白的抗體調(diào)節(jié)它們對病毒復(fù)制早期步驟的影響。
現(xiàn)在，滅活的流感A和B病毒疫苗被許可用于腸胃外給予。這些三價體疫苗在受孕雞卵的尿囊腔中產(chǎn)生，通過速率區(qū)帶離心或柱層析純化，用福爾馬林或β丙酸內(nèi)酯滅活，并配制成在一個計算年的人群中傳播的流感病毒A型和B型兩種株系的混合物?？少徺I的流感疫苗是全病毒(WV)或亞病毒體(SV；分離或純化的表面抗原)病毒疫苗。該WV疫苗包含完整、滅活的病毒粒子。用例如三-正-丁基磷酸鹽的溶劑處理的SV疫苗(Flu-Shield，Wyeth-Lederle)包含幾乎所有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和一些病毒被膜。雖然有殘余量的其它病毒結(jié)構(gòu)蛋白存在，用Triton X-100溶解的SV疫苗(Fluzone，Connaught；Fluvirin，Evans)主要包含HA單體、NA和NP的聚合體。最近，F(xiàn)DA許可潛在的冷適應(yīng)活減毒流感病毒疫苗(FluMist，MedImmune)在市場上銷售，用做鼻內(nèi)給予的疫苗，指示用于自動免疫接種，預(yù)防在健康兒童和青少年(5-17歲)和18-49歲的健康成人中由流感A和B病毒引起的疾病。
已開發(fā)了一些重組產(chǎn)物作為重組流感疫苗候選物。這些方法集中于流感A型HA和NA蛋白的表達、生產(chǎn)和純化，包括使用桿狀病毒感染的昆蟲細胞的蛋白(Crawford等，1999；Johansson，1999；Treanor等，1996)、病毒載體(Pushko等，1997；Berglund等，1999)和DNA疫苗構(gòu)建物(Olsen等，1997)的表達。
Crawford等(1999)證明在感染桿狀病毒的昆蟲細胞中表達的流感HA能夠預(yù)防由禽H5和H7流感亞型引起的致死性流感。同時，另一組研究人員證實桿狀病毒表達的流感HA和NA蛋白誘導動物的免疫反應(yīng)超過那些由常規(guī)疫苗誘導的反應(yīng)(Johansson等，1999)。將桿狀病毒表達的馬流感病毒的血凝素的免疫原性和效能與同源DNA疫苗候選物相比(Olsen等，1997)。使用各種實驗方法和在不同的動物模型中，合起來看，數(shù)據(jù)表明用重組HA或NA蛋白可誘導對流感病毒侵襲的高度的保護作用。
Lakey等(1996)顯示來自桿狀病毒的流感HA疫苗在志愿人群中的階段I(Phase I)的劑量增加安全研究中具有很好的耐受性和免疫原性。然而，在用若干劑量包括HA和/或NA蛋白的流感疫苗接種的人類志愿者若干臨床位點中進行階段II研究的結(jié)果顯示，重組亞單位蛋白疫苗不產(chǎn)生保護性免疫[G.SM1th，Protein Sciences；M.Perdue，USDA，Personal Communications]。這些結(jié)果表明在傳染性病毒粒子的HA和NA包膜粒的表面顯示的構(gòu)象表位對于誘導中和抗體和保護性免疫很重要。
對于在重組流感疫苗候選物中包含的其它流感蛋白進行了大量的研究，包括僅含有流感核蛋白NP或NP與M1蛋白結(jié)合的試驗(Ulmer等，1993；Ulmer等，1998；Zhou等，1995；Tsui等，1998)。這些由準-不變內(nèi)病毒粒子蛋白組成的疫苗候選物誘導廣譜初級的細胞性(CD4和CD8+記憶T細胞)免疫。這些試驗涉及DNA或病毒基因載體的使用。由于用較低劑量的DNA進行的試驗顯示很少或無保護，因此需要注入相對大量的DNA(Chen等，1998)。因此，可能需要進一步的臨床前和臨床研究，以評估這種涉及流感NP和M1的以DNA為基礎(chǔ)的方法是否安全、有效和持久。
最近，為了開發(fā)更有效的流感疫苗，將顆粒蛋白用做流感M2蛋白表位的載體。開發(fā)以M2為基礎(chǔ)的疫苗的基本原理是在動物研究中由M2蛋白誘發(fā)針對流感的保護性免疫(Slepushkin等，1995)。Neirynck等(1999)使用23個氨基酸長度的M2跨膜結(jié)構(gòu)域作為具有乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的氨基末端融合配偶體，以在HBcAg衣殼樣顆粒的表面上露出M2表位。然而，盡管事實上全長M2蛋白和M2-HBcAg VLP在小鼠中都誘導可檢測的抗體和保護，不太可能今后的流感疫苗專一地基于M2蛋白，因為每個病毒粒子中M2蛋白以很低的拷貝數(shù)量存在，抗原性弱，不能誘導結(jié)合游離流感病毒粒子的抗體產(chǎn)生，且不能阻斷病毒與細胞受體的結(jié)合(即病毒中和)。
既然先前的研究顯示表面流感糖蛋白HA和NA是激發(fā)抗流感病毒的保護性免疫的基本靶位，并且M1提供了流感細胞免疫的保守靶位，一種新的疫苗候選物可包括這些病毒抗原作為蛋白大分子顆粒，例如病毒樣顆粒(VLPs)。此外，具有這些流感抗原的顆粒可顯示激發(fā)針對多株系流感病毒的中和抗體的構(gòu)象表位。
一些研究證實在細胞培養(yǎng)中使用哺乳動物表達質(zhì)粒或桿狀病毒載體，重組流感蛋白可自裝配進入VLPs(Gomez-Puertas等，1999；Neumann等，2000；Latham和Galarza，2001)。Gomez-Puertas等(1999)證實流感VLP的有效形成取決于病毒蛋白的表達水平。Neumann等(2000)建立了以哺乳動物表達質(zhì)粒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，用于完全從克隆cDNA生產(chǎn)感染性流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza(2001)報道在用共表達HA、NA、M1和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中流感VLP的形成。這些研究表明在真核細胞中流感病毒粒子蛋白可基于共表達自裝配。
發(fā)明綜述本發(fā)明提供了大分子蛋白結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括HA(GenBank入藏登記號AJ404626)、NA(GenBank入藏登記號AJ404629)、M1(GenBank入藏登記號AJ278646)、M2(GenBank入藏登記號AF255363)以及NP(GenBank入藏登記號AF255742)蛋白的禽流感A型病毒H9N2編碼序列，并包含HA(GenBank入藏登記號AJ311466)和NA(GenBank入藏登記號AJ291403)的人流感A型病毒H3N2編碼序列。編碼這些流感病毒基因的基因組RNA可從流感病毒隔離群或從感染流感的有機體的組織中分離。每一個來自相同或不同株系或類型的流感病毒編碼序列中的每一個在表達載體內(nèi)沿轉(zhuǎn)錄啟動子下游克隆并在細胞中表達。
因此，本發(fā)明提供的大分子蛋白結(jié)構(gòu)包含(a)第一流感病毒M1蛋白和(b)附加結(jié)構(gòu)蛋白，所述附加結(jié)構(gòu)蛋白可包括第二或更多流感病毒M1蛋白；第一、第二或更多流感病毒HA蛋白；第一、第二或更多的流感病毒NA蛋白；以及第一、第二或更多流感病毒M2蛋白。如果附加結(jié)構(gòu)蛋白不是來自第二或更多流感病毒M1蛋白，則包括二者或該組的全部成員，例如第一和第二流感M2病毒蛋白。這樣，本發(fā)明提供了一種功能性流感蛋白結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括亞病毒顆粒、VLP或殼粒結(jié)構(gòu)、或其部分，基本上由通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的疫苗、多價疫苗及其混合物。在特別優(yōu)選的實施例中，流感大分子蛋白結(jié)構(gòu)包括流感病毒HA、NA和M1蛋白，它們是從野生型病毒作為合成片段克隆的流感病毒基因的表達產(chǎn)物。
大分子蛋白結(jié)構(gòu)還可包括附加結(jié)構(gòu)蛋白，例如核蛋白(NP)、來自非流感病毒(noninfluenza virus)以外的物種的膜蛋白以及非流感來源的膜蛋白，它們來源于鳥或哺乳動物，以及不同亞型的流感病毒，包括亞型A和B流感病毒。本發(fā)明可包括嵌合大分子蛋白結(jié)構(gòu)，它包含至少一個蛋白的一部分，該蛋白具有并非由流感病毒產(chǎn)生的部分。
預(yù)防流感可通過提供大分子蛋白結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)可在宿主細胞中從重組構(gòu)建物自組裝。本發(fā)明的大分子蛋白結(jié)構(gòu)具有自組裝成為同型(homotypic)或異型(heterotypic)病毒樣顆粒(VLP)的能力，該顆粒在HA和NA蛋白上顯示構(gòu)象表位，它誘導保護性的中和抗體的產(chǎn)生。該組合物可以是疫苗組合物，它還包含載體或稀釋劑和/或佐劑。功能性流感VLP誘導一種或多種流感病毒株系或類型的中和抗體的產(chǎn)生，取決于功能性流感VLP是否包含來自一種或多種病毒株系或類型的HA和/或NA蛋白。該疫苗可包括流感病毒蛋白，該蛋白是野生型流感病毒蛋白。較佳地，包含流感VLP或其部分的結(jié)構(gòu)蛋白可衍生自各種野生型流感病毒株系。流感疫苗可給予人或動物，以激發(fā)針對一種或多種株系或類型的流感病毒的保護性免疫。
本發(fā)明的大分子蛋白結(jié)構(gòu)可顯示血凝素活性和/或唾液酸苷酶活性。
本發(fā)明提供通過構(gòu)建編碼流感結(jié)構(gòu)基因的重組構(gòu)建物生產(chǎn)源自流感的VLP的方法，該流感結(jié)構(gòu)基因包括M1、HA，以及衍生自流感病毒的至少一個結(jié)構(gòu)蛋白。使用重組構(gòu)建物用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?。宿主細胞在允許M1、HA和至少一個源自流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白表達的條件下培養(yǎng)，并且VLP在宿主細胞中形成。收集含有功能性流感VLP的受感染的細胞培養(yǎng)基，并提純VLP。本發(fā)明還提供了用編碼第二流感蛋白的第二重組構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染、共感染或共轉(zhuǎn)化宿主細胞的補充步驟，從而在VLP中摻入第二流感蛋白。這種結(jié)構(gòu)蛋白可衍生自包括NA、M2和NP的流感病毒，且至少一種結(jié)構(gòu)蛋白衍生自鳥類或哺乳動物。該結(jié)構(gòu)蛋白可以是亞型A和B流感病毒。根據(jù)本發(fā)明，宿主細胞可以是真核細胞。另外，VLP可以是嵌合VLP。
本發(fā)明還提供了通過把編碼流感病毒基因的重組構(gòu)建物引入宿主細胞，并允許重組流感病毒蛋白在細胞中自裝配成為功能同型或異型的VLP來配制含有流感VLP的藥物物質(zhì)的方法。分離和純化流感VLP，并配制含有流感VLP的藥物物質(zhì)。該藥物物質(zhì)可進一步包含佐劑。另外，本發(fā)明提供通過將這種含有流感VLP的藥物物質(zhì)與脂小泡(即非離子型脂小泡)混合配制醫(yī)藥產(chǎn)品的方法。因此，功能性同型或異型VLP可從感染的細胞中出芽為被膜顆粒。出芽流感VLP可通過超速離心或柱層析分離和純化為藥物物質(zhì)，并單獨或與例如Novasomesg(Novavax，Inc的產(chǎn)品)等佐劑配制成為醫(yī)藥產(chǎn)品，例如疫苗。提供增強免疫效果的Novasomes進一步描述于美國專利No.4,911,928，該文獻引入本文作為參考。
通過提供包含有效抗體檢測量的具有流感病毒大分子結(jié)構(gòu)至少一個構(gòu)象表位的流感病毒蛋白的檢驗試劑，本發(fā)明提供了檢測脊椎動物流感病毒感染的體液免疫的方法。該檢驗試劑與被測定感染流感病毒的脊椎動物的體液樣品接觸。使樣品中包含的流感病毒特異性抗體與流感病毒大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。該復(fù)合物從未結(jié)合的復(fù)合物中分離，并與可檢測地標記了的免疫球蛋白結(jié)合試劑接觸。測定與復(fù)合物結(jié)合的可檢測地標記了的免疫球蛋白結(jié)合試劑的量。
可通過提供對流感病毒顆粒的至少一個構(gòu)象表位具有特異性的抗體，該抗體具有產(chǎn)生可檢測信號的標記或與可檢測的標記試劑附著，在懷疑感染了病毒的動物或人的樣品中可檢測到流感病毒。該樣品與抗體接觸，并使該抗體與流感病毒結(jié)合。通過可檢測標記的方法測定樣品中流感病毒的存在。
本發(fā)明提供通過給予脊椎動物有效量的本發(fā)明組合物，治療、預(yù)防和產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)的方法。
另外，流感VLP藥物物質(zhì)可配制為用于流感病毒結(jié)構(gòu)研究和臨床診斷分析的實驗試劑。本發(fā)明還提供了通過給予有效量的本發(fā)明組合物治療流感病毒的試劑盒和使用說明。
附圖的簡要說明

圖1描述禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒唾液酸苷酶(NA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2描述禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒血凝素(HA)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3描述禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒基質(zhì)蛋白M1(M1)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖4描述表達禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的重組桿狀病毒構(gòu)建物的轉(zhuǎn)移載體。圖4A描述表達個體基因的轉(zhuǎn)移載體，圖4B描述多表達基因的轉(zhuǎn)移載體。
圖5描述Sf-9S細胞中禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1蛋白的表達。
圖6描述使用蔗糖密度梯度方法純化禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)VLP。
圖7描述凝膠過濾層析檢測流感病毒蛋白。蛋白質(zhì)印跡分析使用的抗體如下(A)兔抗-H9N2；(B)鼠抗-M1mAb；和(C)鼠抗-BACgp64。
圖8描述使用電鏡檢術(shù)檢測包含亞病毒顆粒、VLP和VLP復(fù)合物的禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)蛋白。
圖9描述純化的禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)VLP的血凝集活性。
圖10描述純化的禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)VLP的唾液酸苷酶活性。
圖11描述小鼠中用于對具有純化的禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)VLP的重組流感病毒進行免疫原性研究的免疫和出血進程。
圖12描述在用重組流感H9N2VLP免疫的小鼠中免疫原性研究結(jié)果。圖12A顯示用包含A/H9N2/HongKong/1073/99型禽流感病毒的HA、NA和M1蛋白的重組VLP免疫的BALB/c小鼠的血清。圖12B描述用滅活的AH9N2型禽流感病毒免疫的新西蘭白兔血清與含有滅活的A H9N2型禽流感病毒(1和3泳道)或冷適應(yīng)性A H9N2型禽流感病毒(2和4泳道)的蛋白質(zhì)印跡進行反應(yīng)。
發(fā)明詳述如本文所使用的，術(shù)語“桿狀病毒(baculovius)”通常也稱做桿狀病毒科(baculoviridae)，是指節(jié)肢動物的被膜DNA病毒科，其成員可用做在昆蟲細胞培養(yǎng)中生產(chǎn)重組蛋白的表達載體。該病毒粒子包含一個或多個具有環(huán)形超螺旋雙鏈DNA(Mr 54×106-154×106)分子的桿狀核殼。用做載體的病毒通常是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(NVP)。引入基因的表達在強啟動子的控制下，該強啟動子通常調(diào)節(jié)大核包涵體的多角體蛋白成分的表達，其中病毒包埋于感染的細胞中。
如本文所使用的，術(shù)語“衍生自”指起源或來源，可包括自然發(fā)生、重組、未純化或純化的分子。本發(fā)明的蛋白和分子可衍生自流感或非流感分子。
如本文所使用的術(shù)語“第一”流感病毒蛋白，即第一流感病毒M1蛋白，是指例如M1、HA、NA和M2等蛋白，它們衍生自流感病毒的特殊株系。第一流感病毒的株系或類型不同于第二流感病毒蛋白的株系或類型。因此，“第二”流感病毒蛋白，即第二流感病毒M1蛋白是指衍生自流感病毒第二株系的例如M1、HA、NA和M2等蛋白，該株系與第一流感病毒蛋白的株系或類型不同。
如本文所使用的，術(shù)語“血凝素活性”是指含HA的蛋白、VLP或其部分與紅細胞結(jié)合和聚集的能力。
如本文所使用的，術(shù)語“唾液酸苷酶活性”是指含NA的蛋白、VLP或其部分從包含例如胎球蛋白等蛋白的基質(zhì)中酶切唾液酸殘基的酶活。
如本文所使用的，術(shù)語“異型的”是指一種或多種不同類型或株系的病毒。
如本文所使用的，術(shù)語“同型的”是指一種類型或株系的病毒。
如本文所使用的，術(shù)語“大分子蛋白結(jié)構(gòu)”是指一個或多個蛋白的構(gòu)成或排列。
如本文所使用的，術(shù)語“多價”疫苗是指針對多種類型或株系的流感病毒的疫苗。
如本文所使用的，術(shù)語“非流感”是指不是衍生自流感病毒的蛋白或分子。
如本文所使用的，術(shù)語“疫苗”是指死的或弱化的病原體或衍生的抗原決定子的制劑，它用于誘導抗體的形成或?qū)Σ≡w的免疫。假定一種疫苗提供對例如由流感病毒引起的流感疾病的免疫。本發(fā)明提供具有免疫原性并提供保護的疫苗組合物。
盡管可以獲得最適條件下有效性為60-80％的特異性滅活病毒疫苗，流感仍然是廣泛存在的公共健康問題。當這些疫苗有效時，常常通過預(yù)防病毒感染而避免生病?？乖町惖姆e累的結(jié)果(抗原轉(zhuǎn)變(antigenic shift)和抗原漂移(antigenic drift))疫苗可發(fā)生無效。
例如，A型禽流感病毒H9N2與豬體內(nèi)的A型人流感病毒Sydney/97H3N2共循環(huán)，導致基因重排列，并出現(xiàn)具有廣泛流行可能性的人流感病毒新株系(Peiris等，2001)。如果發(fā)生這種抗原轉(zhuǎn)變，當前的疫苗不可能提供充分的保護。
缺乏流感疫苗程序的另一個原因是由當前疫苗引起的免疫持續(xù)性相對較短。由于在兒童、老人和對雞蛋成分過敏的人群中疫苗的反應(yīng)原性和副作用，流感控制手段的進一步不足反映出當前疫苗的使用受到限制，該疫苗用于生產(chǎn)商業(yè)許可的滅活病毒流感疫苗。
另外，滅活的流感病毒疫苗常常缺乏或包含改變的HA和NA構(gòu)象表位，該表位引發(fā)中和抗體并在針對疾病的保護中起主要作用。因此，滅活的病毒疫苗以及一些重組單體流感亞基蛋白疫苗僅給予不充分的保護。另一方面，例如殼粒、亞病毒顆粒、和/或VLP等大分子蛋白結(jié)構(gòu)包含顯示構(gòu)象表位的多拷貝的天然蛋白，這對最佳的疫苗免疫原性有利。
本發(fā)明描述了在感染桿狀病毒的昆蟲細胞中，單獨或先后克隆禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因進入單一桿狀病毒表達載體，并生產(chǎn)包含重組流感結(jié)構(gòu)蛋白的流感疫苗候選物或試劑，該結(jié)構(gòu)蛋白自裝配進入包括亞病毒流感顆粒和流感VLP的功能性和免疫原性同型大分子蛋白結(jié)構(gòu)物。
本發(fā)明進一步描述了在感染桿狀病毒的昆蟲細胞中，克隆人流感A/Sydney/5/94(H3N2)病毒HA、NA、M1、M2和NP基因進入桿狀病毒表達載體，并生產(chǎn)包含流感結(jié)構(gòu)蛋白的流感疫苗候選物或試劑，該結(jié)構(gòu)蛋白自裝配進入包括亞病毒流感顆粒和流感VLP的功能性和免疫原性同型大分子蛋白結(jié)構(gòu)物。
此外，本發(fā)明描述了在感染桿狀病毒的昆蟲細胞中，克隆人流感A/Sydney/5/94(H3N2)病毒的HA基因和禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)的HA、NA和M1基因先后進入單一桿狀病毒表達載體，并生產(chǎn)包含流感結(jié)構(gòu)蛋白的流感疫苗候選物或試劑，該結(jié)構(gòu)蛋白自裝配進入包括亞病毒流感顆粒和流感VLP的功能性和免疫原性的異型大分子蛋白結(jié)構(gòu)物。
本發(fā)明通過下面的實施例進行進一步描述，這些實施例不作為限制。本說明書中引用的所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內(nèi)容，以及附圖和序列列表引入本文作為參考。
具體的實施例實施例1材料和方法使用桿狀病毒桿粒表達系統(tǒng)在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf-9S細胞系；ATCC PTA-4047)中表達禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因。使用分離自禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒的RNA通過反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成HA、NA和M1基因(圖1、2和3)。對于反轉(zhuǎn)錄和PCR，使用對禽流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因具有特異性的寡核苷酸引物(表1)。這些基因的cDNA拷貝最初被克隆進入細菌的亞克隆載體，pCR2.1TOPO。從獲得的3個基于pCR2.1TOPO的質(zhì)粒，HA、NA和M1基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl(InVitrogen)中AcMNPV多角體蛋白啟動子的下游，獲得3個基于pFastBacl的質(zhì)粒分別表達這些流感病毒基因的pHA、pNA和pM1。然后，構(gòu)建單個的基于pFastBacl的質(zhì)粒pHAM，該質(zhì)粒編碼各個位于分離的多角體蛋白啟動子下游的HA和M1基因(圖4)。測定pNA質(zhì)粒中具有相鄰的5’-和3’-區(qū)域的NA基因的核苷酸序列(SEQID NO1)(圖1)。同時，使用pHAM質(zhì)粒也測定了具有相鄰區(qū)域的HA和M1基因的核苷酸序列(SEQ ID NOS2和3)(圖2和3)。
最后，編碼HA和M1表達盒的來自pHAM質(zhì)粒的限制性DNA片段被克隆進入pNA質(zhì)粒。這樣獲得編碼禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1基因的質(zhì)粒pNAHAM(圖4)。
質(zhì)粒pNAHAM用于構(gòu)建重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒包含整合進入基因組的流感病毒NA、HA和M1基因，每個位于分離的桿狀病毒多角體啟動子下游。用獲得的重組桿狀病毒感染許可性Sf-9S昆蟲細胞，導致在用這種重組桿狀病毒感染的各個Sf-9S細胞中3個流感基因的共表達。
結(jié)果使用HA和M1-特異性抗體，通過SDS-PAGE分析、考馬斯藍蛋白染色、和蛋白質(zhì)印跡分析，表征感染72小時后感染的Sf-9S細胞中的表達產(chǎn)物(圖5)。使用針對流感病毒A/Hong Kong/1073/99型(H9N2)產(chǎn)生的兔抗體(CDC，Atlanta，Georgia，USA)，或流感M1蛋白的小鼠單克隆抗體(Serotec，UK)進行蛋白質(zhì)印跡分析。具有預(yù)期分子量(分別為64kd、60kd和31kd)的HA、NA和M1蛋白通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測。與分析中檢測到的HA蛋白的量相比，NA蛋白與兔血清顯示對流感A/Hong Kong/1073/99型(H9N2)病毒較低的反應(yīng)性。對可檢測的NA蛋白量的解釋包括與HA蛋白相比，取自用重組桿狀病毒感染的Sf-9S細胞的NA蛋白的表達水平較低，在蛋白質(zhì)印跡分析中，變性條件下NA與這種血清的反應(yīng)性較低(由于在膜結(jié)合的凝膠電泳過程中重要的NA表位消失)，NA-抗體親和力與HA-抗體相比較低，或血清中NA-抗體豐度較低。
還探測了取自用表達A/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的重組桿狀病毒感染的Sf-9S細胞的培養(yǎng)基的流感蛋白。將澄清的培養(yǎng)上清在27,000rpm下超離心，以濃縮流感病毒的高分子蛋白復(fù)合物，例如亞病毒顆粒、VLP、VLP復(fù)合物，以及其它可能的包含流感HA、NA和M1蛋白的自裝配粒子。沉淀的蛋白產(chǎn)物在磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.2)中重懸浮，并在不連續(xù)的20-60％的蔗糖梯度下通過超離心進一步純化。收集從蔗糖梯度中獲得的級分，并通過SDS-PAGE分析、蛋白質(zhì)印跡分析和電子顯微鏡術(shù)測定。
通過考馬斯藍染色和蛋白質(zhì)印跡分析檢測多個蔗糖密度梯度級分中具有預(yù)期分子量的流感HA和M1蛋白(圖6)。這顯示取自感染的Sf-9S細胞的流感病毒蛋白聚集成高分子量的復(fù)合物，例如殼粒、亞病毒顆粒、VLP和/或VLP復(fù)合物。盡管可能由于在蛋白質(zhì)印跡分析中兔抗-流感血清不能識別變性的NA蛋白，所以通過考馬斯藍染色和蛋白質(zhì)印跡分析檢測NA蛋白不一致，但在唾液酸苷酶活性分析中檢測是一致的(圖10)。
通過凝膠過濾層析證實高分子VLP的存在。將一等份包含流感病毒蛋白的蔗糖密度梯度級分上樣到Sepharose CL-4B柱上，以根據(jù)質(zhì)量分級分離。該層析柱用分別具有表觀分子量為2,000,000、20,000和1,357道爾頓的葡聚糖藍2000、葡聚糖黃和維生素B12(Amersham Pharmacia)校準，并測定層析柱的孔隙體積。如所預(yù)期的，將高分子流感病毒蛋白移入柱的孔隙體積中，這是例如病毒顆粒等大分子蛋白的特征。通過蛋白質(zhì)印跡分析分析分離的級分，以檢測流感和桿狀病毒蛋白。例如，在空隙體積級分中檢測到M1蛋白，它也含有桿狀病毒蛋白(圖7)。
流感VLP和蔗糖梯度級分中蛋白的形態(tài)學通過電子顯微鏡術(shù)闡明。對于負染色電子顯微鏡術(shù)，取自兩個蔗糖密度梯度級分的流感蛋白在pH7.2的PBS中用2％的戊二醛固定。
用電子顯微鏡測定負染色樣品顯示兩個級分中都有大分子蛋白復(fù)合物或VLP存在。這些VLP顯示具有直徑為約60和80nm的不同大小和形態(tài)學(球型)。還檢測了兩類顆粒中較大的復(fù)合物，以及桿狀顆粒(圖8)。所有觀察到的大分子結(jié)構(gòu)物在其表面都具有突起(包膜粒)，這是流感病毒的特征。由于80nm顆粒的大小和外觀與野生型流感病毒顆粒相似，這些結(jié)構(gòu)物可能代表VLP，VLP與野生型流感病毒粒子具有明顯的相似性，包括相似的粒子幾何學、結(jié)構(gòu)、三角測量數(shù)量、對稱性和其它特征。約60nm的較小粒子可代表在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上不同于VLP的亞病毒顆粒。對于其它病毒，也報道了具有不同大小和形態(tài)學的重組大分子蛋白的類似現(xiàn)象。例如，乙肝病毒重組核心抗原(HBcAg)形成不同大小的粒子，它們分別具有不同結(jié)構(gòu)和三角測量數(shù)量T＝4和T＝3(Crowther等，1994)。
為了表征純化的流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)VLP的功能特性，在血凝素測定(圖9)和唾液酸苷酶測定(圖10)中檢驗樣品。對于血凝素測定，2倍稀釋的純化流感VLP與0.6％的豚鼠紅細胞混合并在4℃培養(yǎng)1或16小時。血細胞凝集的程度肉眼可見，還測定并記錄了能夠聚集紅細胞的重組流感蛋白的最大稀釋度(圖9)。此外，蔗糖密度梯度的許多級分顯示了血細胞凝集活性，表明多個大分子和單體型的流感蛋白存在。檢測到的最高滴度為1∶4000。在對照試驗中，野生型流感A/Shandong病毒顯示1∶2000的滴度。血細胞凝集測定揭示了由流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒HA、NA和M1蛋白組成的重組VLP具有功能上的活性。這說明HA亞基蛋白在VLP內(nèi)的裝配、構(gòu)象和折疊與野生型流感病毒相似或一致。
另外，對純化的H9N2 VLP樣品進行唾液酸苷酶測定。使用胎球蛋白作為底物測定蔗糖密度梯度級分中唾液酸苷酶活性量。唾液酸苷酶測定中，唾液酸苷酶從底物分子中切掉唾液酸以釋放唾液酸用于測定。加入亞砷酸鹽試劑使酶活性停止。用硫代巴比妥酸化學測定釋出的唾液酸的量，硫代巴比妥酸產(chǎn)生的粉紅色與游離唾液酸的量成比例。顏色(發(fā)色團)的量用分光光度計在波長為549nm處測定。使用這種方法，證明在含有流感VLP的蔗糖梯度級分中具有唾液酸苷酶的活性(圖10)。如所預(yù)期的，在幾個級分中觀察到該活性，有兩個峰值級分。使用野生型流感病毒作為陽性對照。與純化的流感VLP相比較，野生型流感病毒顯示可比的唾液酸苷酶活性。這些發(fā)現(xiàn)證實了有關(guān)蛋白構(gòu)象的HA結(jié)果，并表明流感A/HongKong/1073/99(H9N2)病毒的純化VLP功能上與野生型流感病毒相似。
從上述分析和測定獲得的結(jié)果顯示，流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA、NA和M1蛋白的表達對于感染桿狀病毒的昆蟲細胞中功能性VLP的自裝配和轉(zhuǎn)運是足夠的。既然這些流感VLP代表自裝配的流感結(jié)構(gòu)蛋白，并證實其功能和生化特性與野生型流感病毒相似，那么這些流感VLP保存重要的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，包括有效流感疫苗所必需的表面表位。
實施例2RT-PCR克隆禽流感A/Hong Kong/1073/99病毒基因本發(fā)明的目的是提供能夠指導重組流感病毒蛋白生產(chǎn)的合成的核酸序列。使用分離自病毒的流感病毒天然基因組RNA，通過反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法獲得這種合成的核酸序列。為了本申請的目的，核酸序列是指RNA、DNA、cDNA或者編碼蛋白的它們的任何合成變體。
禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒由K.Subbarao博士提供(疾病防治中心(Center for Disease Control)，Atlanta，GA，USA)。在CDC使用Trizol LS試劑(Invitrogen，Carlsbad，CAUSA)在Biosafety Level 3(BSL3)防范條件下通過酸苯酚RNA提取法分離病毒基因組RNA。通過使用MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(InVitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄和使用HA、NA和M1蛋白的特異性寡核苷酸引物和Taq I DNA聚合酶(InVitrogen)進行PCR獲得病毒RNA的cDNA分子(表1)。將PCR片段克隆進入細菌亞克隆載體pCR2.1TOPO(InVitrogen)的Eco RI位點之間，產(chǎn)生含有HA、NA和M1cDNA克隆的三個重組質(zhì)粒。
實施例3RT-PCR克隆人流感A/Sydney/5/94(H3N2)病毒基因流感A/Sydney/5/94(H3N2)病毒從M.Massare博士處獲得(NovavaxInc.，Rockville，MD)。在Novavax Inc.使用Trizol LS試劑(Invitrogen)，在BSL2防范條件下通過RNA酸苯酚提取法分離病毒基因組RNA。通過反轉(zhuǎn)錄和使用HA、NA、M1、M2和NP蛋白的特異性寡核苷酸引物進行PCR獲得病毒RNA的cDNA分子(表2)。將PCR片段克隆進入細菌亞克隆載體pCR2.1TOPO的Eco RI位點之間，產(chǎn)生含有HA、NA、M1、M2和NP cDNA克隆的五個重組質(zhì)粒。
實施例4克隆禽流感A/Hong Kong/1073/99病毒cDNA進入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體從以pCR2.1 TOPO為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，在多角體座位和Tn7 att位點以及桿狀病毒多角體蛋白啟動子下游和聚腺苷酸化信號序列上游之間，HA、NA或M1基因被亞克隆進入pFastBacl桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體(In Vitrogen)。該病毒基因以T4DNA連接酶連接。對于HA基因，將來自pCR2.1 TOPO-HA的BamHI-Kpn I DNA片段插入BamHI-Kpn I消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于NA基因，將來自pCR2.1 TOPO-NA的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于M1基因，將來自pCR2.1 TOPO-M1的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。用這些DNA連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a細菌(In Vitrogen)，獲得轉(zhuǎn)化的菌落，并將細菌克隆分離。獲得的以pFastBacl為基礎(chǔ)的質(zhì)粒、pFastBacl-HA、pFastBacl-NA和pFastBacl-M1通過在瓊脂糖凝膠上限制酶切作圖表征(圖4A)。圖1-3顯示的克隆基因的核苷酸序列通過自動DNA測序測定。DNA序列分析顯示克隆的流感HA、NA和M1基因與以前公開的流感A/HongKong/1073/99(H9N2)的NA、HA和M1基因(GenBank入藏登記號分別為AJ404629、AJ404626和AJ278646)相同。
實施例5克隆人流感A/Sydney/5/94病毒cDNA進入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體從以pCR2.1 TOPO為基礎(chǔ)的質(zhì)粒，在多角體座位和Tn7 att位點以及桿狀病毒多角體蛋白啟動子下游和聚腺苷酸化信號序列上游之間，將HA、NA、M1、M2和NP基因亞克隆進入pFastBacl桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。該病毒基因與T4 DNA連接酶連接。對于HA基因，將來自pCR2.1 TOPO-hHA3的BamHI-Kpn I DNA片段插入BamHI-Kpn I消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于NA基因，將來自pCR2.1 TOPO-hNA的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于M1基因，將來自pCR2.1 TOPO-hM1的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于M2基因，將來自pCR2.1 TOPO-hM2的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。對于NP基因，將來自pCR2.1 TOPO-hNP的Eco RI DNA片段插入Eco RI消化的pFastBacl質(zhì)粒DNA。用這些DNA連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a細菌，獲得轉(zhuǎn)化的菌落，并將細菌克隆分離。獲得的以pFastBacl為基礎(chǔ)的質(zhì)粒、pFastBacl-hHA3、pFastBacl-hNA2和pFastBacl-hM1、pFASTBACI-hM2和pFASTBACI-hNP在瓊脂糖凝膠上通過限制酶切作圖表征(圖4A)。克隆基因的核苷酸序列通過自動DNA測序測定。DNA序列分析顯示克隆的流感HA、NA、M1、M2和NP基因與以前公開的這些基因的核苷酸序列相同。
實施例6編碼多禽流感A/Hong Kong/1073/99病毒基因的多基因桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建為了構(gòu)建表達多流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)病毒基因的以pFastBacl為基礎(chǔ)的桿粒轉(zhuǎn)移載體，首先將來自pFastBacl-M1質(zhì)粒包含M1基因的Sna BI-Hpa I DNA片段克隆進入pFastBacl-HA的Hpa I位點。這樣獲得在獨立表達盒內(nèi)編碼HA和M1基因的pFastBacl-HAM質(zhì)粒，并在分離的多角體蛋白啟動子的控制下表達。
最后，包含HA和M1表達盒的pFastBacl-HAM的SnaBI-Avr II DNA片段轉(zhuǎn)移到Hpa I-Avr II消化的pFastBacl-NA質(zhì)粒DNA。這樣獲得編碼表達流感HA、NA和M1基因的三個獨立表達盒的質(zhì)粒pFastBacl-NAHAM，并在分離的多角體蛋白啟動子的控制下表達(圖4B)。
在另一個實施例中，將來自pFASTCI-hHA3的H3基因(見實施例5)克隆進入pFASTBACI-NAHAM，作為表達和生產(chǎn)異型流感VLP的第四個流感病毒基因。
實施例7在昆蟲細胞中生產(chǎn)編碼禽流感A/Hong Kong/1073/99病毒的NA、HA和M1基因的多基因重組桿狀病毒獲得的多基因桿粒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-NAHAM用于生產(chǎn)多基因重組桿狀病毒，該桿狀病毒編碼用于在昆蟲細胞中表達的禽流感A/Hong Kong/1073/99(HN2)HA、NA和M1基因。通過附著在感受態(tài)E.coliDH10BAC細胞(In Vitrogen)中的pFastBacl-NAHAM DNA和AcMNPC桿狀病毒基因組之間的多角體蛋白和Tn7 att DNA序列上的位點特異性重組生產(chǎn)重組桿粒DNA(圖4B)。通過小量制備質(zhì)粒DNA的方法分離重組桿粒DNA，并使用陽離子脂類CELLFECTIN(In Vitrogen)轉(zhuǎn)染進入Sf-9s細胞。轉(zhuǎn)染后，在Sf-9S昆蟲細胞中將重組桿狀病毒分離、噬斑純化和擴增。在Sf-9S昆蟲細胞中制備病毒原料，并表征以用于表達禽流感病毒HA、NA和M1基因產(chǎn)物。將獲得的重組桿狀病毒稱為bNAHAM-H9N2。
實施例8昆蟲細胞中重組禽流感A/Hong Kong/1073/99蛋白的表達在搖瓶中，28℃的無血清培養(yǎng)基(HYQ SFM，HyClone，Ogden，UT)中保存為懸浮培養(yǎng)物的Sf-9S昆蟲細胞，在2×106細胞/毫升的細胞密度下，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為3pfu/細胞的重組桿狀病毒bNAHAM-H9N2感染。病毒感染進行72小時，以使流感蛋白表達。感染的昆蟲細胞中禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA和M1蛋白的表達通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析得到證實。SDS-PAGE分析在4-12％線性梯度NuPAGE凝膠(Invitrogen)上在退化和變性條件下進行。蛋白質(zhì)印跡分析中的第一抗體是從CDC獲得的針對禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)產(chǎn)生的多克隆兔抗血清和流感M1蛋白的單克隆鼠抗血清(Serotec，UK)。蛋白質(zhì)印跡分析的第二抗體是針對兔或小鼠IgG(H+L)產(chǎn)生的堿性磷酸酶接合山羊IgG抗血清(Kirkegaard和Perry實驗室，Gaithersburg，MD，USA)。這些分析結(jié)果(圖5)表明HA和M1蛋白在桿狀病毒感染的昆蟲細胞中表達。
實施例9重組禽流感H9N2病毒樣顆粒和大分子蛋白復(fù)合物的純化取自用表達禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA、NA和M1基因產(chǎn)物的重組桿狀病毒bNAHAM-H9N2感染的Sf-9S昆蟲細胞的培養(yǎng)上清(200ml)通過低速離心收集。通過使用GS-3轉(zhuǎn)頭，以10,000×g在4℃下，在SorvalRC-5B超速離心機中離心1小時澄清培養(yǎng)上清。通過使用SorvalTH-641吊桶式轉(zhuǎn)頭，以27,000rpm在4℃下，在Sorval OTD-65超速離心機中離心3小時，從澄清的培養(yǎng)上清中分離病毒和VLP。病毒沉淀在1ml的PBS(pH 7.2)中重懸浮，裝載到20-60％(w/v)的不連續(xù)蔗糖階段梯度上，并通過使用Sorval TH-641轉(zhuǎn)頭，以27,000rpm在4℃下，在Sorval OTD-65超速離心機中離心16小時分離。從蔗糖梯度的頂部收集級分(0.5ml)。
使用上文實施例6中描述的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析方法分析蔗糖梯度級分中的流感蛋白。如使用蛋白質(zhì)印跡分析所顯示的，在相同的蔗糖梯度級分中發(fā)現(xiàn)HA和M1蛋白(圖6)，表明HA和M1蛋白結(jié)合為大分子蛋白復(fù)合物。
在全部蔗糖梯度的級分中也發(fā)現(xiàn)了HA和M1蛋白，這表明這些重組病毒蛋白與不同密度的大分子蛋白復(fù)合物和組合物結(jié)合。
實施例10通過凝膠過濾層析分析重組禽流感H9N2VLP和蛋白質(zhì)蛋白大分子例如VLP和單體蛋白根據(jù)它們的質(zhì)量大小和形狀分別移到凝膠過濾或大小排組層析柱上。為了確定來自蔗糖梯度部分的重組流感蛋白是單體蛋白或是大分子蛋白復(fù)合物例如VLP，制備具有14ml的SepharoseCL-4B(Amersham)的樹脂柱床體積的層析柱(7mm×140mm)。大小排組層析柱用PBS平衡，并用表觀分子量分別為2,000,000、20,000和1,357的葡聚糖藍2000、葡聚糖黃和維生素B12(Amersham Pharmacia)校準，以確定層析柱的孔隙體積。
在孔隙體積(6ml級分)中從柱中洗脫葡聚糖藍2000。如所預(yù)期的，重組流感蛋白復(fù)合物也從層析柱的孔隙體積(6ml級分)中洗脫。這一結(jié)果是高分子量大分子蛋白復(fù)合物例如VLP的特征。層析柱級分中的病毒蛋白用上文實施例6中描達的蛋白質(zhì)免疫印跡分析檢測。在孔隙體積級分中檢測到M1蛋白(圖7)。如所預(yù)期的，桿狀病毒蛋白也存在于孔隙體積中。
實施例11重組流感VLP的電子顯微鏡術(shù)為了確定在蔗糖梯度上分離出的并包含重組禽流感蛋白的大分子蛋白復(fù)合物是否具有與流感病毒粒子相似的形態(tài)學，進行負染色樣品的電子顯微鏡測定。將重組禽流感A/Hong Kong/1073/99(H9N2)蛋白復(fù)合物濃縮，并通過如實施例7所描達的在不連續(xù)蔗糖梯度上超離心從培養(yǎng)上清中純化。蔗糖梯度級分的等分部分用含2％戊二醛的PBS(pH 7.2)處理，吸附在新近放電的塑料/碳-包被的格柵上，并用蒸餾水洗滌。該樣品用2％、pH6.5的磷鎢酸鈉染色，并使用透射電鏡(Philips)觀察。取自兩種蔗糖梯度級分的重組禽流感H9N2蛋白復(fù)合物的負染色樣品的電子顯微照片顯示來自兩種蔗糖梯度級分的球形和桿形顆粒(圖8)。這些顆粒具有不同的大小(60和80nm)和形態(tài)。還檢測到兩種類型顆粒的較大的復(fù)合物，以及桿形顆粒(圖8)。所有觀察到的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示刺突樣表面突起，該突起與流感病毒HA和NA包膜粒相似。既然80nm顆粒的大小和外觀與野生型流感病毒顆粒的大小和外觀相似，這些結(jié)構(gòu)可能代表被膜流感VLP。約60nm的較小顆?？赡艽碓谛螒B(tài)上和結(jié)構(gòu)上都不同于上述VLP的亞病毒顆粒。
實施例12通過血細胞凝集分析流感蛋白的功能特征為了確定純化的流感VLP和蛋白質(zhì)是否具有功能活性，例如血細胞凝集和唾液酸苷酶活性(這是流感病毒的特征)，純化的流感VLP和蛋白質(zhì)在血細胞凝集和唾液酸苷酶分析中檢驗。
對于血細胞凝集分析，制備一系列含有流感VLP或正對照野生A型流感病毒的2倍稀釋的蔗糖梯度級分。然后將它們與含0.6％豚鼠紅細胞的PBS(pH 7.2)混合，并在4℃培育1-16小時。使用PBS作為負對照。血細胞凝集的程度通過視覺確定，并確定能夠凝集豚鼠紅細胞的級分的最高稀釋度(圖9)。對于純化的流感VLP和蛋白質(zhì)，觀察到的最高血細胞凝集效價是1∶4000，這比由野生型流感對照顯示的效價高，野生型流感對照的效價是1∶2000。
實施例13通過唾液酸苷酶測定分析流感蛋白的功能特征在含有流感VLP的蔗糖梯度級分中唾液酸苷酶活性的量通過唾液酸苷酶分析確定。在這一分析中，NA(一種酶)作用于基質(zhì)(胎球蛋白)并釋放唾液酸。加入亞砷酸鹽試劑以使酶活停止。用硫代巴比妥酸化學測定釋出的唾液酸的量，硫代巴比妥酸產(chǎn)生的粉紅色與游離唾液酸的量成比例。顏色(發(fā)色團)的量用分光光度計在波長為549nm處測定。如圖8所描述的，該數(shù)據(jù)顯示由含有VLP的蔗糖梯度級分產(chǎn)生顯著量的唾液酸，并且這些級分相應(yīng)于顯示血細胞凝集活性的那些級分。
實施例13用功能同型的重組流感H9N2 VLP免疫BALB/c小鼠重組流感VLP的免疫原性通過免疫小鼠，隨后進行免疫血清的蛋白質(zhì)印跡分析確定。在第0天和第28天，將包含來自禽流感病毒A/HongKong/1073/99型的病毒HA、NA和M1蛋白并在蔗糖梯度上純化的重組VLP(1μg/注射)皮下接種到10只雌性BALB/c小鼠的三角肌區(qū)(圖11)。作為負對照，將PBS(pH 7.2)同樣施與5只小鼠。在第一天(采血前)、第27天(第一次采血)和第54天(第二次采血)從小鼠的眶上腔采血。過夜凝固和離心后從血液樣品中收集血清。
對于蛋白質(zhì)印跡分析，將200ng滅活的禽流感病毒A H9N2型或冷適應(yīng)的禽流感病毒A H9N2型，以及See Blue Plus 2預(yù)染色蛋白標準物(InVitrogen)變性(95℃，5分鐘)，并使之在172伏特電壓下，在MES緩沖液中含有4-12％的聚丙烯酰胺梯度的NuPAGE凝膠(InVitrogen)上，還原條件下(10mM的8-巰基乙醇)電泳，直到溴酚藍行跡染料消失。對于蛋白質(zhì)凝膠，經(jīng)電泳的蛋白通過用膠體考馬斯藍試劑(InVitrogen)染色可見。通過標準蛋白質(zhì)印跡方法，在甲醇中將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將VLP免疫小鼠和用滅活的禽流感病毒H9N2免疫的兔(正對照血清)的血清分別以1∶25和1∶100在PBS溶液中(pH 7.2)稀釋，并用做第一抗體。用5％的酪蛋白阻斷的與蛋白質(zhì)結(jié)合的膜在室溫下經(jīng)持續(xù)搖動與第一抗血清反應(yīng)60分鐘。用含有Tween 20的磷酸鹽緩沖溶液洗滌第一抗體膜后，第二抗血清[山羊抗-鼠IgG-堿性磷酸酶接合物(1∶10,000)或山羊抗-兔IgG-堿性磷酸酶接合物(1∶10,000)]與膜反應(yīng)60分鐘。用含有Tween20的磷酸鹽緩沖溶液洗滌第二抗體膜后，膜上的抗體-結(jié)合蛋白用例如NBT/BCIP(InVitrogen)等產(chǎn)色基質(zhì)顯色可見。
蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果(圖12)是具有與病毒HA和M1蛋白相似的分子量(分別為75和30kd)的蛋白質(zhì)與正對照血清(圖12B)和用重組流感H9N2 VLP免疫的小鼠的血清(圖12A)結(jié)合。這些結(jié)果表明通過這一途徑給予的小鼠中，僅僅給予重組流感H9N2 VLP即具有免疫原性。
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其它實施方案本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將認識到，或能夠僅僅使用常規(guī)試驗確定本發(fā)明描述的具體實施例的許多等價物。這種等價物意欲包含于下列權(quán)利要求書中
表1
表2
序列表<110>諾瓦瓦克斯股份有限公司(Novavax，Inc.)Robinson，Robin A.
Pushko，Peter M.
<120>功能性流感病毒樣顆粒(VLPS)<130>19065/2028<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1404<212>DNA<213>鳥類(Avian)<400>1atgaatccaa atcaaaagat aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata 60tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt 120accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata 180acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca 240gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag 300gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta 360tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac 420aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag 480ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc 540tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact 600gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc 660ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact 720gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt 780gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc 840cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg 900ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgctc aggacttgtt 960ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac 1020gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg 1080ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt 1140tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac 1200tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcatcaa caggtgtttt 1260tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc 1320atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg 1380aatatcaatt tcatgtctat ataa1404<210>2<211>1683<212>DNA<213>鳥類(Avian)
<400>2atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagcaagcaa tgcagataaa 60atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc 120aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg aatgctgtgt 180gcaacaagcc tgggacatcc cctcattcta gacacatgca ctattgaagg actagtctat 240ggcaaccctt cttgtgacct gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaaga 300tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag aaaacctaga ggaactcagg 360acacttttta gttccgctag ttcctaccaa agaatccaaa tcttcccaga cacaacctgg 420aatgtgactt acactggaac aagcagagca tgttcaggtt cattctacag gagtatgaga 480tggctgactc aaaagagcgg tttttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataacagg 540ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccacctatac cgagcaaaca 600aatttgtaca taagaaacga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagattt gaataggacc 660ttcaaaccag tgatagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattgattat 720tattggtcgg tactaaaacc aggccaaaca ttgcgagtac gatccaatgg gaatctaatt 780gctccatggt atggacacgt tctttcagga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat 840ttaaaaggtg gtaattgtgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggtggctt aaacagtaca 900ttgccattcc acaatatcag taaatatgca tttggaacct gccccaaata tgtaagagtt 960aatagtctca aactggcagt cggtctgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020tttggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggctggtat 1080ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtatggctg cagataggga ttcaactcaa 1140aaggcaattg ataaaataac atccaaggtg aataatatag tcgacaagat gaacaagcaa 1200tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gactcaatat gatcaataat 1260aagattgatg accaaataca agacgtatgg gcatataatg cagaattgct agtactactt 1320gaaaatcaaa aaacactcga tgagcatgat gcgaacgtga acaatctata taacaaggtg 1380aagagggcac tgggctccaa tgctatggaa gatgggaaag gctgtttcga gctataccat 1440aaatgtgatg atcagtgcat ggaaacaatt cggaacggga cctataatag gagaaagtat 1500agagaggaat caagactaga aaggcagaaa atagaggggg ttaagctgga atctgaggga 1560acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaatgggg 1620tttgctgcct tcctgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680taa 1683<210>3<211>759<212>DNA<213>鳥類(Avian)<400>3atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccatc aggccccctc 60aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacac agatcttgag 120gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgatttgtc 240caaaatgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt taaactatac 300aagaagctga agagggaaat gacattccat ggagcaaagg aagttgcact cagttactca 360actggtgcgc ttgccagttg catgggtctc atatacaacc ggatgggaac agtgaccaca 420gaagtggctc ttggcctagt atgtgccact tgtgaacaga ttgctgatgc ccaacatcgg 480tcccacaggc agatggcgac taccaccaac ccactaatca ggcatgagaa cagaatggta 540ctagccagca ctacggctaa ggccatggag cagatggctg gatcaagtga gcaggcagca 600gaagccatgg aagtcgcaag tcaggctagg caaatggtgc aggctatgag gacaattggg 660actcacccta gttccagtgc aggtctaaaa gatgatctta ttgaaaattt gcaggcttac 720
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權(quán)利要求
1.一種大分子蛋白結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包括(a)第一流感病毒M1蛋白和(b)附加結(jié)構(gòu)蛋白，所述蛋白選自(i)第二流感病毒M1蛋白；(ii)(a)第一流感病毒HA蛋白，(b)第二流感病毒HA蛋白；(iii)(a)第一流感病毒NA蛋白，(b)第二流感病毒NA蛋白；或(iv)(a)第一流感病毒M2蛋白，(b)第二流感病毒M2蛋白；并且其中如果所述附加結(jié)構(gòu)蛋白并非來自亞組(i)，則亞組(ii)、(iii)和(iv)中的至少一組的兩鐘成分都被包括在內(nèi)。
2.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述大分子蛋白結(jié)構(gòu)選自亞病毒顆粒、病毒樣顆粒(VLP)、殼粒結(jié)構(gòu)或其一部分、疫苗、多價疫苗或其混合物。
3.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述附加結(jié)構(gòu)蛋白選自非流感病毒以外的物種的核蛋白(NP)或膜蛋白。
4.權(quán)利要求3所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述附加結(jié)構(gòu)蛋白是非流感來源的膜蛋白。
5.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述蛋白結(jié)構(gòu)在宿主細胞中從重組構(gòu)建物自裝配。
6.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中至少一個結(jié)構(gòu)蛋白衍生自鳥或哺乳動物來源。
7.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白衍生自不同亞型的流感病毒。
8.權(quán)利要求7所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒亞型選自亞型A或B流感病毒。
9.權(quán)利要求7所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述流感病毒包含野生型流感病毒。
10.權(quán)利要求1所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述大分子蛋白結(jié)構(gòu)包含至少一個結(jié)構(gòu)蛋白，該結(jié)構(gòu)蛋白具有自裝配為異型病毒樣顆粒(VLPs)的能力。
11.權(quán)利要求2所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述至少一個蛋白的一部分包括嵌合蛋白結(jié)構(gòu)，該嵌合蛋白結(jié)構(gòu)具有并非由流感病毒產(chǎn)生的部分。
12.一種包含權(quán)利要求2所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)以及載體或稀釋劑的組合物。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，還包含佐劑。
14.權(quán)利要求2所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)選自顯示血凝素活性的組合物。
15.權(quán)利要求2所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)選自顯示唾液酸苷酶活性的組合物。
16.權(quán)利要求2所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)，包括誘導流感病毒中和抗體的流感VLP的構(gòu)象表位。
17.一種含有權(quán)利要求16所述的大分子蛋白結(jié)構(gòu)以及載體或稀釋劑的疫苗組合物。
18.一種生產(chǎn)源自流感的VLP的方法，所述方法包括(a)構(gòu)建編碼流感結(jié)構(gòu)基因的重組構(gòu)建物，其中重組桿狀病毒編碼衍生自流感病毒的M1、HA和至少一個第一結(jié)構(gòu)蛋白；(b)用所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，并在允許衍生自流感病毒的M1、HA和至少一個結(jié)構(gòu)蛋白表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞；(c)使VLP在所述的宿主細胞中形成；(d)收集含有功能性流感VLP的感染的細胞培養(yǎng)基；并(e)純化VLP。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述衍生自流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白選自NA、M2或NP。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中至少一個結(jié)構(gòu)蛋白衍生自鳥或哺乳動物來源。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)蛋白選自亞型A或B流感病毒。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞。
23.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述VLP包含嵌合VLP。
24.權(quán)利要求18所述的方法，進一步包括如下步驟(a)用編碼第二流感蛋白的第二重組構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染、共感染或共轉(zhuǎn)化宿主細胞，由此將所述第二流感蛋白摻入VLP。
25.配制包含流感VLP的藥物物質(zhì)的方法，所述方法包括(a)引導編碼流感病毒基因的重組構(gòu)建物進入宿主細胞；(b)使重組流感病毒蛋白自裝配入細胞中的功能性同型或異型VLP；(c)分離和純化流感VLP；和(d)配制含有流感VLP的藥物物質(zhì)。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述藥物物質(zhì)進一步包含佐劑。
27.一種配制藥品產(chǎn)品的方法，所述方法包括將含有流感VLP的權(quán)利要求25所述的藥物物質(zhì)與脂小泡混合的步驟。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述脂小泡是非離子型脂小泡。
29.一種在脊椎動物中檢測針對流感病毒感染的體液免疫的方法，所述方法包括(a)提供檢測試劑，該試劑包括有效抗體檢測量的流感病毒蛋白，該流感病毒蛋白具有流感病毒大分子結(jié)構(gòu)的至少一個構(gòu)象表位；(b)將檢測試劑與用于檢測流感病毒感染的脊椎動物的體液樣品接觸；(c)使包含于所述樣品中的流感病毒特異性抗體與所述流感病毒大分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位結(jié)合，以形成抗原-抗體復(fù)合物。(d)將所述復(fù)合物與未結(jié)合的復(fù)合物分離；(e)將該復(fù)合物與可檢測地標記了的免疫球蛋白-結(jié)合試劑接觸；和(f)測定與所述復(fù)合物結(jié)合的可檢測地標記了的免疫球蛋白結(jié)合試劑的量。
30.一種在取自懷疑感染流感病毒的動物或人的樣品中檢測流感病毒的方法，所述方法包括(a)提供對所述流感病毒顆粒的至少一個構(gòu)象表位具有特異性的抗體，其中所述抗體具有可檢測的信號產(chǎn)生標記，或與可檢測地標記了的試劑附著；(b)將樣品與所述抗體接觸；(c)使抗體與流感病毒結(jié)合；和(d)通過可檢測的標記的方法測定存在于樣品中的流感病毒的存在。
31.一種治療方法，所述方法包括給予脊椎動物有效量的權(quán)利要求13所述的組合物。
32.一種預(yù)防流感的方法，所述方法包括給予脊椎動物有效量的權(quán)利要求17所述的疫苗制劑。
33.一種提供保護性免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求13所述的組合物。
全文摘要
包括流感殼粒、亞病毒顆粒、病毒樣顆粒(VLP)、VLP復(fù)合體、和/或其任一部分的重組流感病毒蛋白被用做流感病毒疫苗。本發(fā)明基于兩種疫苗技術(shù)的組合(1)內(nèi)在安全的重組疫苗技術(shù)，和(2)包埋于質(zhì)膜中的高度免疫原性的、自裝配蛋白大分子，并包含多拷貝的流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白，該結(jié)構(gòu)蛋白在天然構(gòu)象中顯示中和表位。更具體地，本發(fā)明涉及設(shè)計和生產(chǎn)功能同型和異型重組流感病毒樣顆粒(VLPs)，它包含桿狀病毒感染的昆蟲細胞中的A/Sydney/5/94型人流感病毒(H3N2)和/或A/Hong Kong/1073/99型禽流感病毒的重組結(jié)構(gòu)蛋白，以及它們在預(yù)防流感傳染中作為疫苗和作為病毒結(jié)構(gòu)研究和臨床診斷的實驗試劑的應(yīng)用。
文檔編號C07H21/04GK1849134SQ200480026152
公開日2006年10月18日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者羅賓·A·魯濱遜, 彼得·M·普什科 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司