專利名稱：子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及子宮內(nèi)膜異位(endometriosis)相關(guān)疾病的分子生物學(xué)的診斷方法。此外，本發(fā)明涉及利用了子宮內(nèi)膜異位的分子機(jī)制的該疾病的治療藥物以及治療方法。
背景技術(shù)：
子宮內(nèi)膜異位通常為婦科疾病，該疾病對10％處于生育年齡的女性群體有影響(非專利文獻(xiàn)1)。子宮內(nèi)膜異位的組織與正常的子宮內(nèi)膜一樣，經(jīng)歷周期性的增殖和破壞，導(dǎo)致了周期性的痛經(jīng)、性交疼痛癥、骨盆痛以及月經(jīng)時(shí)發(fā)生血尿。此外，據(jù)報(bào)道30～40％的不孕患者患有該疾病(非專利文獻(xiàn)2)。尚且不清楚在部分患者中出現(xiàn)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移、在其它位置增殖時(shí)的機(jī)制，不過炎癥細(xì)胞因子的脫離調(diào)控有可能導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜異位的發(fā)展(非專利文獻(xiàn)3、4)。事實(shí)上，單細(xì)胞的激活和向腹腔內(nèi)的移動(dòng)在子宮內(nèi)膜異位中是最常見報(bào)道的成為免疫學(xué)異常之一(非專利文獻(xiàn)5～8)。
二噁英(Dioxin)是擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)中的一種，其普遍存在于環(huán)境中。3，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxisin(TCDD，Dioxin)是在二噁英類之中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，其具有各種毒性效果(例如免疫毒性、血液毒性、致畸毒性以及致癌性等)(非專利文獻(xiàn)9、10)、TCDD以及相關(guān)化合物所誘導(dǎo)的基因表達(dá)的變化是從毒素與芳香烴受體(AhR)(Aryl hydrocarbon receptor)結(jié)合的時(shí)間點(diǎn)開始的，然后芳香烴受體與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子(aryl hydrocarbon receptornuclear trans1ocator，ARNT)形成二聚體，形成與含有XRE(異物應(yīng)答序列)基序的基因調(diào)控元件相互作用的復(fù)合體(非專利文獻(xiàn)11、12)。將猴子慢性暴露在TCDD中，劑量依賴性地發(fā)生了從輕度到重度的子宮內(nèi)膜異位(非專利文獻(xiàn)13)，對二噁英與子宮內(nèi)膜異位的相關(guān)性進(jìn)行了幾個(gè)研究(非專利文獻(xiàn)14～18)。不過，最近的報(bào)告指出了暴露于TCDD與子宮內(nèi)膜異位無關(guān)的結(jié)果(非專利文獻(xiàn)19、20)，導(dǎo)致暴露于二噁英與子宮內(nèi)膜異位的相關(guān)性至今不明。
本發(fā)明人等鑒定了含有IgE依賴性組胺釋放因子(HistamineReleasing FactorHRF)的TCDD目的基因(非專利文獻(xiàn)21～23)。不過，對于作為這種TCDD目的基因產(chǎn)物的HRF與子宮內(nèi)膜異位的關(guān)系一無所知。
非專利文獻(xiàn)1Wheeler J.M.J.Reprod Med.1989，34(1)41-6非專利文獻(xiàn)2Candiani G.B.et al，Obstct Gynecol.Surv.1991，46(6)374-82非專利文獻(xiàn)3Garcia-Velasco J.A.and Arici A.FertilSteril.1999，71(6)983-93非專利文獻(xiàn)4Barcz et al.Med.Sci.Monit.2000，6(5)1042-6非專利文獻(xiàn)5Jolicoeur C.et al.Am.J.Pathol.1998，152(1)125-33非專利文獻(xiàn)6Lebovic D.I.et al.Fertil Steril 2001，75(1)1-10非專利文獻(xiàn)7Hornung D.et al.Am.J.Pathol.2001，158(6)1949-54非專利文獻(xiàn)8Blumenthal R.D.et al.Am.J.Pathol.2000，156(5)1581-8非專利文獻(xiàn)9Chapman D.E.and Schiller C.M.Toxicol Appl.Pharmacol.1985，78(1)147-57非專利文獻(xiàn)10McGregor D.B.et al.Environ Health Perspect.1998，106 Suppl 2755-60非專利文獻(xiàn)11Sagawa K.and Fujii-Kuriyama T.J.Biochem.(Tokyo)1997，122(6)1075-9非專利文獻(xiàn)12Nebert D.W.Crit.Rev.Toxicol.1989，20(3)153-74非專利文獻(xiàn)13Rier S.E.et al.Fundam.Appl.Toxicol.1993，21(4)433-41非專利文獻(xiàn)14Gibbsons A.Science 1993，262(5183)1373非專利文獻(xiàn)15Obsteen K.G.and Sierra-Rivera E.Endocrinol.1997，15(3)301-8非專利文獻(xiàn)16Bruner-Tran K.L.et al.Gynecol.Obstet.Invest.1999，48 Suppl.145-56非專利文獻(xiàn)17Johson K.L.et al.Environ Health Perspect1997，105(7)750-5非專利文獻(xiàn)18Yang J.Z.and Foster W.G.Toxicol.Ind.Health1997，13(1)15-25非專利文獻(xiàn)19Igarashi T.et al.Endocr.J.1999，46(6)765-72非專利文獻(xiàn)20Pauwels A.et al.Hum.Reprod.2001，16(10)2050-5非專利文獻(xiàn)21Oikawa K.et al.Cancer Res.2001，61(15)5707-9非專利文獻(xiàn)22Oikawa K.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7非專利文獻(xiàn)23Ohbayashi et al.FEBS Lett.2001，508(3)341-4發(fā)明內(nèi)容以往除了用腹腔內(nèi)視鏡看血的方法診斷子宮內(nèi)膜異位之外，還沒有其他有效的方法。
一方面針對各種人類疾病，以該疾病特異的標(biāo)記物蛋白質(zhì)或者其基因表達(dá)為指標(biāo)的分子生物學(xué)診斷不斷普及。這種方法不需要太大的設(shè)備，對受檢者造成的負(fù)擔(dān)很少，即使對多數(shù)無自我感覺癥狀的受檢者也可以大范圍地實(shí)施。不過，對于子宮內(nèi)膜異位而言，尚且不知道用于進(jìn)行這種分子生物學(xué)的診斷方法的有效的標(biāo)記物蛋白質(zhì)或者其基因。
本發(fā)明鑒于上述情況，以提供利用了與子宮內(nèi)膜異位密切相關(guān)的標(biāo)記物的分子生物學(xué)的診斷/治療方法為課題。
此外，本發(fā)明還以提供用于該診斷/治療方法的各種材料為課題。
本申請作為解決上述的課題，提供了以下(1)～(17)的發(fā)明(1)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，測定受檢者機(jī)體試樣中組胺釋放因子(HRF蛋白質(zhì))的存在量，將HRF蛋白質(zhì)的量與正常機(jī)體試樣(或稱“生物試樣”)中的量相比較，與正常機(jī)體試樣相比而HRF蛋白質(zhì)的量表現(xiàn)出有意義地高的受檢者被判定為患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的患者或者具有患該疾病的高風(fēng)險(xiǎn)者。
(2)識(shí)別HRF蛋白質(zhì)的抗體。
(3)可與所述發(fā)明(2)的抗體不同的表位結(jié)合的抗體。
(4)上述發(fā)明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第90～130位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(5)上述發(fā)明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第1～95位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(6)上述發(fā)明(2)或者(3)的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第115～172位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
(7)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機(jī)體試樣與固定有上述發(fā)明(2)的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機(jī)體試樣接觸的載體的工序；(c)使標(biāo)記的上述發(fā)明(3)的抗體接觸經(jīng)過工序(b)的洗滌后的載體的工序；(d)測定載體上的結(jié)合標(biāo)記或者游離標(biāo)記的工序；(e)以在工序(d)中測定的標(biāo)記量作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序；以及，(f)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者該病的患病風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
(8)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，其中至少包括下述工序(a)對受檢者的機(jī)體試樣進(jìn)行組織固定化處理的工序；(b)將工序(a)中制備的組織固定化標(biāo)本制成切片的工序；(c)以上述發(fā)明(2)的抗體對在工序(b)中得到的切片組織進(jìn)行免疫組織染色的工序；(d)以在工序(c)中得到的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序；以及(e)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者該病的患病風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
(9)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病診斷試劑盒，其特征在于，含有至少標(biāo)記了的上述發(fā)明(2)的抗體。
(10)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病診斷試劑盒，其特征在于，其中至少含有下述要素(a)上述發(fā)明(2)的抗體；以及，(b)標(biāo)記了的上述發(fā)明(3)的抗體。
(11)子宮內(nèi)膜異位診斷試劑盒，其特征在于，其中至少含有下述要素(a)固定有上述發(fā)明(2)的抗體的載體；以及，(b)標(biāo)記了的上述發(fā)明(3)的抗體。
(12)一種抗體，其可識(shí)別HRF蛋白質(zhì)，并且可中和HRF蛋白質(zhì)的活性。
(13)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療藥物，其特征在于，其中含有權(quán)利要求12的抗體。
(14)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療方法，其特征在于向體內(nèi)給予權(quán)利要求12的抗體或者權(quán)利要求13的治療藥物。
即，本發(fā)明人等調(diào)查在子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜異位移植物中的TCDD目的基因(HRF，CYP1A1)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位的發(fā)展與HRF的表達(dá)水平之間具有很高的相關(guān)性關(guān)系，至此完成本發(fā)明。
在本發(fā)明中，“子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病”指的是子宮內(nèi)膜異位以及由于子宮內(nèi)膜異位導(dǎo)致的月經(jīng)困難癥、不孕癥以及子宮腺肌病等?！霸\斷”指的是對受檢者是否患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的判定、對是否存在將來患有子宮內(nèi)膜異位的危險(xiǎn)性的判定以及對是否存在在治療后子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病再復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性的判定。此外，在診斷中也包括對所患有的子宮內(nèi)膜異位或者其患病的危險(xiǎn)性達(dá)到何種程度的測定。
并且，在發(fā)明中，“HRF多聚寡核苷酸”指的是編碼HRF蛋白質(zhì)的多聚寡核苷酸(嘌呤或者嘧啶在糖上以β-N-糖苷鍵結(jié)合后形成的核苷酸的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或者dATP、dGTP、dCTP、dTTP))結(jié)合的分子。具體而言，是指編碼HRF蛋白質(zhì)的基因組DNA、從基因組DNA轉(zhuǎn)錄得到的mRNA、從mRNA合成的cDNA。此外，可以是雙鏈，也可以是單鏈。另外，還包括這些基因組DNA或者mRNA、cDNA的正義鏈以及反義鏈。此外，所說的“多聚寡核苷酸”指的是結(jié)合有不少于100個(gè)核苷酸的分子，“寡核苷酸”指的是連接有2～99個(gè)的分子。此外，“蛋白質(zhì)”和“肽”指的是由通過酰胺鍵(肽鍵)相互結(jié)合的多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的分子。特別是將具有2～33個(gè)氨基酸殘基的物質(zhì)稱為“寡肽”，將具有不少于34個(gè)氨基酸殘基的物質(zhì)稱為“多肽”。
此外還包括對序列表所示的堿基序列以及氨基酸序列進(jìn)行1個(gè)以上堿基的添加、缺失、向其他堿基的置換、或者以這些堿基突變?yōu)榛A(chǔ)的1個(gè)以上氨基酸殘基的添加、缺失以及向其它氨基酸的置換。
在發(fā)明的實(shí)施方式的說明或者在實(shí)施例中對在本發(fā)明中的其他的用語或者概念進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定。用語基本上以IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature為依據(jù)，或者以本領(lǐng)域中慣用的用語的含義為依據(jù)。此外，為了實(shí)施本發(fā)明而使用的各種技術(shù)，除了特別明示有出處的技術(shù)之外，均為根據(jù)公知的文獻(xiàn)等本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易并且確實(shí)地實(shí)施的技術(shù)?？梢愿鶕?jù)下述中記載的方法或者其中引用的文獻(xiàn)記載的方法或者與之本質(zhì)上相同的方法或者其改良方法實(shí)施(其中的某些內(nèi)容可以作為參考也包括在本說明書的內(nèi)容中)例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEdition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中記載的藥劑的制備；J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，“MolecularCloningA Laboratory Manual(2ndedtion)”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Gloveret al.ed.，“DNA Cloning”2nded.，Vol 1 to 4，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995；日本生化學(xué)會(huì)編“續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座I、基因研究方法II”、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會(huì)編、“新生化實(shí)驗(yàn)講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))”、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wued.，“Methods in Enzymology”，Vol.100(Recombinant DNA，PartB)&101(Recombinant DNA，PartC)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E) & 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；J.H.Miller ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.204，AcademicPress，New York(1991)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.306，Academic Press，New York(1999)等中記載的基因工程學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)。
圖1表示調(diào)查來自正常組織子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜異位患者的正常子宮內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜異位移植物上的HRF與CYP1A1的表達(dá)的結(jié)果。(A)通過Northern印跡分析對HRF mRNA水平進(jìn)行調(diào)查。用人β肌動(dòng)蛋白探針進(jìn)行印跡的再次探測，測定總RNA水平。通過用于分析Sourthern印跡的定量RT-PCR來測定由Northern印跡所檢查的試樣中的CYP1A1的mRNBA水平。為了確認(rèn)定量的精度，將5倍不同濃度的cDNA試樣(1×以及5×)作為PCR的模板，以相同的配置進(jìn)行檢查。將β肌動(dòng)蛋白作為mRNA量的內(nèi)部對照。(B)展示的是同樣表示對應(yīng)于HRF以及CYP1A1的mRNA水平的圖。使用densintometry(MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad)將mRNA水平相對β肌動(dòng)蛋白信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。試樣11-2A表示HRF的mRNA水平，10-2A表示CYP1A1的mRNA水平，任意地設(shè)定為10。當(dāng)多個(gè)試樣來自一個(gè)人時(shí)，通過計(jì)算用平均值表示。誤差線(Error Bar)表示多個(gè)試樣的最大值。12-1、7-1、8-1以及6B為正常子宮內(nèi)膜組織，標(biāo)有星號(hào)的1C為子宮內(nèi)膜異位患者的正常部位的子宮內(nèi)膜。
圖2是調(diào)查子宮內(nèi)膜異位移植物中的HRF表達(dá)的結(jié)果。(A)是用Northern印跡分析正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜異位患者的正常部位的子宮內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜異位移植物中的HRF的表達(dá)的結(jié)果。在印跡中使用β肌動(dòng)蛋白探針進(jìn)行再探測，測定總的RNA水平。柱條上的N、Eu以及En分別表示正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜異位患者的正常部位的子宮內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜異位移植物。(B)表示的是對于圖1A以及圖2A中調(diào)查的試樣，通過Northern分析測定得到的表示HRF mRNA水平的柱圖。使用densintometry(MOLECULAR IMAGER，NipponBio-Rad)將HRF mRNA水平相對β肌動(dòng)蛋白信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。將試樣6B的mRNA水平任意設(shè)定為1。當(dāng)多個(gè)試樣來自1個(gè)人的時(shí)候，經(jīng)計(jì)算用平均值表示。誤差線表示多個(gè)試樣的最大值。
圖3是免疫組織化學(xué)分析HRF以及CD68的表達(dá)的結(jié)果。用茶色的染色使陽性部分可見。用蘇木素進(jìn)行逆染。檢測(A)以及(B)的正常子宮內(nèi)膜組織中的HRF蛋白質(zhì)(A增殖期，B分泌期，原圖放大倍率×200)。(C)檢測在卵巢子宮內(nèi)膜異位移植物內(nèi)部的HRF蛋白質(zhì)(原圖放大倍率×200)。(D)表示子宮內(nèi)膜異位移植物的形態(tài)的連續(xù)切片的H&E染色結(jié)果(原圖放大倍率×200)。(E)以更高倍率檢測與(C)相同視野的HRF蛋白質(zhì)(原圖放大倍率×400)。(F)在子宮內(nèi)膜異位移植物的連續(xù)切片上的CD68陽性巨噬細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析的局部圖(原圖放大倍率×400)。
圖4是移植分析的結(jié)果。(A)NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的HRF蛋白質(zhì)的western印跡分析的結(jié)果。wt親本NIH3T3細(xì)胞，HRF含有HRF的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染后穩(wěn)定表達(dá)HRF的細(xì)胞株(pMSCV-HRF-3T3)、vector用空載體感染的對照細(xì)胞(pMSCV-3T3)。(B)表示表現(xiàn)出HRF過表達(dá)的細(xì)胞在裸鼠中具有高的移植效率。縱軸上的標(biāo)記表示如下的狀態(tài)。+++觀察到無數(shù)的移植克隆的狀態(tài)；++觀察到數(shù)十個(gè)移植克隆的狀態(tài)；+觀察到幾個(gè)移植克隆的狀態(tài)；-未觀察到移植克隆的狀態(tài)。分別用白色圓形或黑色圓形表示用對照細(xì)胞或者HRF過表達(dá)細(xì)胞注射過的小鼠。
具體實(shí)施例方式
本申請發(fā)明(1)的診斷方法為測定在受檢者的機(jī)體試樣中的組胺釋放因子(HRF蛋白質(zhì))的存在量，將HRF蛋白質(zhì)的量作為指標(biāo)診斷子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的方法。即，將與正常機(jī)體試樣相比，HRF蛋白質(zhì)的量有意義地多的受檢者判定為患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的患者或者具有患該病風(fēng)險(xiǎn)的人。即，將HRF蛋白質(zhì)的存在量有意義地多的受檢者判定為患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的患者或者具有患有該病風(fēng)險(xiǎn)的人。因?yàn)橛蒆RF基因表達(dá)的HRF蛋白質(zhì)的存在量與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病具有密切關(guān)系，所以可以以受檢者的機(jī)體試樣(例如子宮內(nèi)膜組織等)中的HRF蛋白質(zhì)的量作為指標(biāo)，對子宮內(nèi)膜異位進(jìn)行診斷。此外，HR蛋白質(zhì)的量“有意義地多”指的是將受檢者的HRF蛋白質(zhì)的量與在正常機(jī)體試樣(即，健康的正常人的機(jī)體試樣)中測定的HRF蛋白質(zhì)的量相比較，其為10％以上，優(yōu)選30％以上，更優(yōu)選70％以上，最優(yōu)選100％以上的情況。此外，該“有意義地多”還指例如對于同一個(gè)受檢者的多個(gè)試樣的HRF多聚核苷酸表達(dá)量的平均值與多個(gè)在正常試樣中的相同的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的檢測的時(shí)候，前者比后者更有意義地多的情況。
如上所述的以HRF蛋白質(zhì)的量為指標(biāo)的發(fā)明(1)的診斷方法，可以按照公知的基因工程學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)，通過本領(lǐng)域用于測定檢驗(yàn)中特定的蛋白質(zhì)的量的已知方法，例如原位雜交、Western印跡、各種免疫組織學(xué)方法等檢驗(yàn)、測定HRF蛋白質(zhì)的量。利用這種技術(shù)的HRF蛋白質(zhì)的量測定體系、子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的檢測體系、子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)檢測體系、所述體系中利用的試劑、方法、工藝、解析程序等全部包括在本發(fā)明的技術(shù)以及利用該技術(shù)的系統(tǒng)中。
作為用于上述發(fā)明(1)的診斷方法中使用的材料，本申請?zhí)貏e提供了下述發(fā)明(2)和(3)的抗體。
發(fā)明(2)的抗體是能夠特異性識(shí)別HRF蛋白質(zhì)的抗體(抗HRF抗體)。并且此處所說的“抗體”既可以是在廣義含義下使用的抗體，也可以是針對目的HRF多肽以及相關(guān)肽片斷的單克隆抗體的單一物質(zhì)或者是具有針對各種表位的特異性的抗體組合物，此外，也包括一價(jià)抗體或者多價(jià)抗體以及多克隆抗體和單克隆抗體，而且，還包含完整(intact)分子、其片段以及其衍生物，所謂的F(ab′)2、Fab′以及Fab片段，此外，還包括至少具有2個(gè)抗原或者表位(epitope)結(jié)合部位的嵌和抗體或者雜和抗體，此外，還包含例如四聚物(quadrome)、三聚物(Triome)等雙特異型的重組抗體、種間雜和抗體、抗獨(dú)特型抗體，以及經(jīng)過化學(xué)修飾或者加工等的這些抗體的衍生物，可以是應(yīng)用公知的細(xì)胞融合或者雜交瘤技術(shù)或者抗體工程，或使用合成或者半合成技術(shù)得到的抗體，從生成抗體的角度出發(fā)，可以是采用公知的以往技術(shù)或者使用DNA重組技術(shù)制備的抗體，具有對本說明書中記載并且定義的目的抗原物質(zhì)或者目的表位的中和特性的抗體或者結(jié)合特性的抗體。特別優(yōu)選的抗體為完整的能特異地識(shí)別HRF蛋白質(zhì)(多肽)的抗體，例如上述發(fā)明(4)～(6)的抗體等。
即，發(fā)明(4)～(6)的抗體分別為用序列號(hào)2的氨基酸序列組成的HRF蛋白質(zhì)的部分肽作為抗原制備得到的抗體，分別為識(shí)別HRF蛋白質(zhì)的不同部位的抗體。例如使用肽合成儀諸如以Fmoc-bop法合成用于制備這種抗體的HRF肽。也可以在HRF肽的N末端導(dǎo)入組氨酸?？梢酝ㄟ^使用μBondasphere、C18柱(Waters)等高效液相層析柱等進(jìn)行純化，作為免疫抗原使用。
發(fā)明(3)的抗體為結(jié)合到與上述發(fā)明(2)的抗體不同的表位的抗體。這種抗體是通過將與用于制備上述發(fā)明(2)的抗體的寡肽不同的片斷作為免疫原制備得到的。例如上述發(fā)明(4)～(6)的抗體中的任何一個(gè)均可以作為發(fā)明(2)的抗體，其他可以作為發(fā)明(3)的抗體。
當(dāng)這種抗體例如為多克隆抗體時(shí)，可用HRF蛋白質(zhì)或者其片斷(寡肽)作為免疫原免疫動(dòng)物然后，從血清得到?；蛘咄ㄟ^注射HRF蛋白質(zhì)多核苷酸的重組載體或者通過基因槍將其導(dǎo)入到動(dòng)物的肌肉或者皮膚然后，通過獲取血清的方法進(jìn)行制備。作為動(dòng)物可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊、牛、馬、豬、狗、貓、猴、雞等。此外，優(yōu)選考慮到與用于適合于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的動(dòng)物。
將致敏抗原免疫動(dòng)物時(shí)，可以按照公知的方法例如村松繁等編、試驗(yàn)生物學(xué)講座14、免疫生物學(xué)、丸善株式會(huì)社、昭和60年，日本生化學(xué)會(huì)編、續(xù)生化學(xué)試驗(yàn)講座5、免疫生化學(xué)研究法、東京化學(xué)同人、1986年，日本生化學(xué)會(huì)編、新生化學(xué)試驗(yàn)講座12、分子免疫學(xué)III、抗原/抗體/補(bǔ)體，東京化學(xué)同人，1992年等中記載的方法進(jìn)行。例如作為常規(guī)的方法，通過將致敏抗原向哺乳動(dòng)物等的腹腔內(nèi)或者皮下注射等。此外，也可以在致敏抗原免疫時(shí)使用適當(dāng)?shù)妮d體?？梢酝ㄟ^將用于免疫的制劑(根據(jù)需要可以和佐劑一起)一次或者多次注射到哺乳動(dòng)物中進(jìn)行免疫。代表性的有將該用于免疫的制劑以及/或者佐劑向哺乳動(dòng)物中進(jìn)行多次皮下注射或者腹腔內(nèi)注射。用于免疫的制劑例如可以是含有上述抗原肽或者其相關(guān)肽片斷。用于免疫的制劑，也可以使用與已知在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如上述載體蛋白質(zhì)類等)形成的偶聯(lián)物。作為佐劑，可以列舉弗氏完全佐劑、Ribi佐劑、百日咳疫苗、BCG、脂質(zhì)A、脂質(zhì)體、氫氧化鋁、二氧化硅等。
將免疫后的動(dòng)物飼養(yǎng)一定的時(shí)間后，可以從由該動(dòng)物獲取的血液中制備含有多克隆抗體的血清。確認(rèn)所得到的抗血清能識(shí)別HRF后，就可以將其作為本發(fā)明特定的活性成分。
在該發(fā)明中，作為抗HRF抗體，也可以使用作為來自哺乳動(dòng)物的單克隆抗體而獲得的抗體，可以使用任何方法使培養(yǎng)的一系列細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子。修飾語“單克隆抗體”指的是從實(shí)質(zhì)上為均質(zhì)的抗體的團(tuán)體中得到的具有其抗體特性的抗體。只要是能使該抗體產(chǎn)生所需要的，可以采用任何特定的方法，沒有限制。多種單克隆抗體可以是自然產(chǎn)生的，也以可以是僅以少量存在的突變體，除此之外，可以含有相同抗體的集合。單克隆抗體具有高特異性，其針對的是具有單一的抗原性的位點(diǎn)。與常規(guī)的典型地含有針對不同抗原決定簇(表位)的多種抗體的抗體制備物相比較，各單克隆抗體針對的是該抗原上的單一的抗原決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體是通過培養(yǎng)的雜交瘤合成的，具有在不夾雜有或者少夾雜其他免疫球蛋白類方面的優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體包括雜交瘤抗體以及重組抗體。這些抗體只要具有所期望的生物活性，不限制其來源或者免疫球蛋白的類型或者亞型的種類，可以用恒定區(qū)置換可變區(qū)或者用重鏈置換輕鏈，用其他種類的鏈置換某種的鏈，或者使之與異種蛋白質(zhì)融合得到的抗體(例如美國專利4816567號(hào)Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987等)。
此外，單克隆抗體可以按照公知的單克隆抗體的制備方法(《單克隆抗體》、長宗香明、寺田弘共著，廣川書店，1990年，“MonoclonalAntibody”James W.Goding，third edition，Academic Press，1996)。
用于制備這種抗體的HRF蛋白質(zhì)或者HRF肽可以是例如使用含有HRF多聚核苷酸的重組表達(dá)載體的公知的體外轉(zhuǎn)錄、翻譯方法或者適當(dāng)?shù)乃拗?大腸桿菌、枯草桿菌等原核細(xì)胞、或者酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞等(例如也包括蠶等昆蟲))-載體系統(tǒng)(例如也包括桿狀病毒載體系統(tǒng))通過基因重組技術(shù)得到的。例如根據(jù)序列表序列號(hào)1的HRF基因/氨基酸序列，將編碼具有HRF或者其一部分的區(qū)域、HRF的部分蛋白質(zhì)或者多肽片段、相當(dāng)于HRF的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽的核酸序列插入到公知的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞后，用公知的方法從該宿主細(xì)胞或者其培養(yǎng)上清中純化具有目的HRF蛋白質(zhì)或者其一部分的區(qū)域的蛋白質(zhì)、HRF的一部分的蛋白質(zhì)或者多肽片段、相當(dāng)于HRF氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽。此外，特別是可以用固相法等公知的方法通過化學(xué)合成的方法合成寡肽。
并且，HRF多核苷酸已知各種突變體(例如GenBank/XM_294045、XM_038391、XM_293291、XM_209741、XM_210566、XM_066706、XM_066675、XM_071321等)，作為優(yōu)選例，可列舉SEQ ID1(堿基序列)所示的HRF cDNA(或者TPT-1GenBank/NM_003295)。這種多肽可以通過各種公知的方法簡單地得到。例如為cDNA的情況下，可以使用公知的方法(Mol.Cell Biol.2，161-170，1982；J.Gene25，263-269，1983；Gene，150，243-250，1994)合成cDNA，使用分別以公知的堿基序列為基準(zhǔn)而制備的探針DNA，通過分離各cDNA的方法得到cDNA?？梢詫⒌玫降腸DNA通過例如PCR(Polymerase ChainReaction)法、NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法以及SDA(Strand Displacement Amplification)法等常規(guī)的基因擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增。此外，使用根據(jù)本發(fā)明提供的引物組，以從人的細(xì)胞中分離的mRNA為模板，通過RT-PCR法得到必要量的各cDNA。
此外，可以通過用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖袛嗌鲜龅亩嗪塑账?cDNA)，得到編碼特定的HRF肽的HRF多核苷酸。或者根據(jù)Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic AcidRes.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.68109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；美國專利4458066號(hào)中記載的公知的化學(xué)合成技術(shù)，在體外進(jìn)行合成。
發(fā)明(2)和(3)的抗體根據(jù)需要可以以從其中純化后的形態(tài)供給使用。作為純化、分離抗體的方法，可以使用公知的方法，例如硫酸銨沉淀法等鹽析、葡聚糖等凝膠過濾法、離子交換層析法、電泳法、透析、超濾法、親和層析法、高效液相層析法等進(jìn)行純化后使用。優(yōu)選將含有抗血清、單克隆抗體的腹水等經(jīng)過硫銨分級(jí)后，用諸如DEAE-瓊脂糖的陰離子交換凝膠以及諸如蛋白A柱的親和柱等處理，進(jìn)行純化分離。特別優(yōu)選的可列舉固定有抗原或者抗原片斷(例如合成肽、重組抗體蛋白質(zhì)或者肽、抗體特異性識(shí)別的部位等)的親和層析、固定有蛋白A的親和層析、羥基磷灰石層析等。
也可以使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶處理這些抗體，根據(jù)情況經(jīng)過還原后得到的所謂Fab、Fab′、F(ab′)2的抗體片斷?？梢允褂靡阎娜我獾臋z測方法、例如競爭性結(jié)合測定、直接以及間接夾心測定以及免疫沉降測定對抗體進(jìn)行檢測(Zola，MonoclonalAntibodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987))。
可以使用本領(lǐng)域中已知的各種方法向抗體上偶聯(lián)各種可以檢測的原子團(tuán)，例如David et al.，Biochemistry，13卷，1014-1021頁(1974)；Pain et al，J.Immunol.Meth.，40pp.219-231(1981)；以及“Methods in Enzymology”，Vol.184，pp.138-163(1990)中記載的方法。作為添加了標(biāo)記物的抗體，可以使用IgG級(jí)分，此外，可以使用胃蛋白酶消化還原后得到的特異結(jié)合部Fab′。
已知有很多能夠固定抗原或者抗體的載體，在本發(fā)明中，可以從中適當(dāng)加以選擇。作為載體，已知有多種用于抗原抗體反應(yīng)等的載體，在本發(fā)明中當(dāng)然也可以使用選自這些公知的載體。作為特別適合的載體，例如玻璃，例如氨基烷基硅烷玻璃等活化玻璃、多孔玻璃、硅膠、二氧化硅-氧化鋁、氧化鋁、磁化鐵、磁化合金等無機(jī)材料、聚乙烯(Polyethylene)、聚丙烯、聚氯化乙烯、聚偏氟乙烯、聚乙烯(polyvinyl)、聚醋酸乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚丙烯酰胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯、聚縮水甘油甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇丙烯酸二酯共聚物等、交聯(lián)的白蛋白、膠原、明膠、糊精、瓊脂、交聯(lián)瓊脂、纖維素、結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素、纖維素乙酸酯等天然或者合成的纖維素、交聯(lián)糊精、尼龍等聚酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚環(huán)氧樹脂等有機(jī)高分子物質(zhì)，此外，將其乳化聚合得到物質(zhì)，硅橡膠等、細(xì)胞、紅細(xì)胞等根據(jù)需要，通過硅烷偶合劑等導(dǎo)入官能基團(tuán)。
作為載體，可列舉粒子、微粒、微小粒子、膜、濾紙、珠子、試管、管子、試驗(yàn)容器的內(nèi)壁，例如試管、滴定板(titer plate)、滴度孔、微孔、玻璃池、合成樹脂的小池等由合成材料構(gòu)成的小池、玻璃棒、由合成材料構(gòu)成的棒、使末端加粗或者變細(xì)的棒、使末端具有圓形突起或者具有扁平突起的棒、制成平板狀的棒等的固體物質(zhì)(物體)的表面等。
可以通過使用吸附等物理方法或者縮合劑等、或采用活化后的物質(zhì)等的化學(xué)性方法、以及利用相互的化學(xué)性結(jié)合反應(yīng)的方法等向這些載體上結(jié)合HRF抗體。
發(fā)明(2)和(3)的抗體中還包括通過分別以標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的抗體。作為標(biāo)記，可列舉酶、酶底物、酶抑制劑、輔因子類、輔酶、酶前體、輔基酶蛋白、熒光物質(zhì)、色素物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光化合物、發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色物質(zhì)、磁物質(zhì)、金屬粒子，例如金膠體等、非金屬元素粒子、例如膠體銀等、放射性物質(zhì)等。優(yōu)選的標(biāo)記物質(zhì)可以使用包括酶、放射性同位素或者熒光色素的化學(xué)物質(zhì)。酶只要能夠滿足單位時(shí)間內(nèi)每摩爾酶所能催化的基質(zhì)數(shù)(turn over number)越大，與抗體結(jié)合越穩(wěn)定，可使基質(zhì)特異性地著色等的條件即可，沒有特別的限制，可以使用通常在EIA中使用的酶。作為酶，有脫氫酶、還原酶、氧化酶等氧化還原酶，例如催化氨基酸、羰基、甲基、?；?、磷酸基等轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移酶，例如水解酯鍵、糖鍵、醚鍵、肽鍵等的水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶等。可以將多個(gè)酶聯(lián)合使用進(jìn)行檢測。例如可以利用酶循環(huán)。酶標(biāo)記等可以置換成生物素標(biāo)記物和親和酶標(biāo)親和素(鏈霉親和素)。這樣，使用生物素-親和素系統(tǒng)，或者使用針對抗HRF抗體的抗體等的二抗等，可以適當(dāng)采用本領(lǐng)域內(nèi)公知的能增加敏感度的方法?？梢允褂枚喾N不同種類的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。這種情況下，可以連續(xù)地或者非連續(xù)地、同時(shí)或者分別地進(jìn)行多個(gè)測定。
作為代表性的酶標(biāo)記，可列舉辣根過氧化物酶等過氧化物酶、大腸桿菌β-D-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶，蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶、牛小腸堿性磷酸酶、大腸桿菌堿性磷酸酶等堿性磷酸酶等。
可以用馬來酰亞胺化合物等交聯(lián)劑按照公知的方法使這些酶與抗體結(jié)合。作為底物，可以使用與所用的酶的種類相對應(yīng)的公知的物質(zhì)。例如4-甲基傘形花磷酸酯(umbelliferone phosphate)等羥基香豆素衍生物、硝基苯基磷酸酯等磷酸化酚衍生物等。例如可以在用過氧化物酶作為酶時(shí)，使用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，或作為酶用堿性磷酸酶時(shí)，可以使用對硝基苯酚等。在本發(fā)明中，在形成信號(hào)時(shí)，也可以組合使用4-羥苯基醋酸、o-苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、5-氨基水楊酸、3，3-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物(DAB)、3-氨基9-乙基卡巴唑(AEC)、酪胺、發(fā)光氨、光澤精蟲熒光素(Lucigenin Luciferin)及其衍生物；Pholad luciferin等和辣根過氧化物酶等的過氧化物酶；Lumigen PPD、(4-甲基)傘形酮內(nèi)酯-磷酸、p-硝基酚-磷酸、酚-磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)等和堿性磷酸酶；4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷這種傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、o-硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷等硝基酚葡萄糖醛酸苷等與基β-D-葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、TBTS等與葡萄糖氧化酶等酶試劑?？梢允褂脤Ρ蕉?、羥基苯醌、羥基蒽醌等對苯二酚化合物、硫辛酸、谷胱甘肽等的硫醇類化合物、酚衍生物等在酶等作用下形成的物質(zhì)。
作為放射性同位素，可以使用常規(guī)在RIA中使用的32P、125I、14C、35S、3H等。作為熒光物質(zhì)或者化學(xué)發(fā)光化合物，可列舉異硫氰酸熒光素(FITC)，例如異硫氰基羅丹明B、四甲基異硫氰基羅丹明(RITC)、四甲基異硫氰基羅丹明異構(gòu)體R(TRITC)等羅丹明衍生物、7-氨基-4-香豆素-3-醋酸、丹磺酰氯、丹磺酰氟、熒光胺、藻膽素、吖啶酯鹽、光藻素、熒光素酶、雌馬酚等發(fā)光胺、咪唑、草酸酯、稀土類螯合化合物、香豆素衍生物等。作為熒光色素，可以使用通常在熒光抗體法中使用的物質(zhì)。在對包括發(fā)色、熒光等生成的信號(hào)等進(jìn)行檢測時(shí)，既可以通過目測，也可以使用公知的裝置，例如也可以使用熒光光度計(jì)、讀板儀等。此外，在對放射性同位素等發(fā)出的信號(hào)進(jìn)行檢測時(shí)，也可以使用公知的裝置，例如也可以使用γ計(jì)數(shù)器、液閃計(jì)數(shù)器等。
在標(biāo)記抗體時(shí)，可以利用硫醇基和馬來酰亞胺基的反應(yīng)、吡啶基雙硫基和硫醇基的反應(yīng)、氨基和醛基的反應(yīng)等，也可以從公知的方法或者本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易得到的方法，還有對這些進(jìn)行修飾后的方法中加以適當(dāng)選擇。可以使用能在制備免疫原性復(fù)合物中使用的縮合劑、能在與載體的結(jié)合中使用的縮合劑等。作為縮合劑，可以列舉甲醛、戊二醛、六甲撐二異氰酸酯、六甲撐二異硫氰酸酯、N，N′-聚甲撐二碘乙酰胺、N，N′-乙撐二馬來酰亞胺、聚乙二醇二丁二酰琥珀酸酯、二重氮苯氰、1-乙基-3--(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺、琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶乙基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亞胺-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯(SMCC)、N-磺酸琥珀酰亞胺基-4-(N-甲基馬來酰亞胺)環(huán)己烷-1-碳酸酯、N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基4-(苯基來酰亞胺)丁酯、N-(ε-羥己酰馬來酰亞胺)琥珀酰亞胺(EMCS)、亞氨基四氫噻吩、S-乙?；鶐€基琥珀酸酐、甲基-3-(4′-二巰基吡啶)丙酰胺酯、甲基-4-巰基丁酰亞胺酯、甲基-3-巰基丁酰亞胺酯、N-馬來酰胺-S-乙酰丁酰乙酯等。
作為在診斷方法中使用這種抗體的一種實(shí)施形式，是在液相體系中檢測抗體與HRF蛋白質(zhì)的結(jié)合。例如將發(fā)明(2)的抗體進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記了的抗體與機(jī)體試樣接觸使標(biāo)記的抗體與HRF蛋白質(zhì)結(jié)合，分離該結(jié)合物?？梢杂霉姆蛛x方法(層析法、固相法等)作為分離方法等分離HRF蛋白質(zhì)+標(biāo)記抗體的結(jié)合物。此外，可以使用以公知的Western印跡為基準(zhǔn)的方法。在測定標(biāo)記的信號(hào)時(shí)，當(dāng)用酶作為標(biāo)記的情況下，加入在酶的作用下可分解顯色的底物，通過測定光學(xué)測定底物的分解量計(jì)算酶的活性，將其換算成結(jié)合的抗體量，與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較計(jì)算出抗體量。當(dāng)使用的是放射性同位素的情況下，用液閃計(jì)數(shù)器等測定放射性同位素發(fā)出的放射線量。此外，使用的是熒光色素的情況下，可以通過組裝有熒光顯微鏡的測定裝置測定熒光量。
作為在液相體系進(jìn)行診斷的以外的方法，可使發(fā)明(2)的抗體(一抗)與機(jī)體試樣接觸，使一抗與HRF蛋白質(zhì)結(jié)合，使標(biāo)記的發(fā)明(2)的抗體(二抗)與該結(jié)合物結(jié)合，檢測該三者結(jié)合物上的標(biāo)記信號(hào)。或者，為了進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)，也可以首先將未標(biāo)記的二抗與抗體+抗原肽結(jié)合物結(jié)合，然后向該二抗上結(jié)合標(biāo)記物質(zhì)。進(jìn)行這種向二抗上結(jié)合標(biāo)記物質(zhì)時(shí)，例如可以將二抗進(jìn)行生物素化，將標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行親和素化?；蛘咭部梢詷?biāo)記可識(shí)別二抗的部分區(qū)域(例如Fc區(qū)域)的抗體(三抗)，使該三抗與二抗結(jié)合。并且，可以一抗和二抗二者都可以使用單克隆抗體，或者，也可以在一抗和二抗中的任何一方使用多克隆抗體。從液相中分離結(jié)合物或者檢測信號(hào)與上述相同。此外，作為可使該診斷方法簡便并且大范圍地實(shí)施的方式，提供發(fā)明(10)的診斷試劑盒。
使用抗體的其他的診斷方法是在固相體系中使抗體和HRF蛋白質(zhì)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法。在該固相體系的方法中，優(yōu)選的方法可進(jìn)行極其微量的HRF蛋白質(zhì)的檢測和簡便地操作的方法。即，該固相體系的方法是如下的方法將發(fā)明(2)的抗體固定到樹脂板上或者膜上等，使HRF蛋白質(zhì)與該固定化的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，使經(jīng)標(biāo)記了的發(fā)明(3)抗體的標(biāo)記化抗體與板上殘留的抗體+HRF蛋白質(zhì)結(jié)合物相結(jié)合，檢測該標(biāo)記抗體的信號(hào)。該方法是稱為“夾心法”的方法，使用酶作為標(biāo)記物的情況下，ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)是廣泛使用的方法。其中的兩類抗體二者均可以使用單克隆抗體，或者其中的任何一方使用多克隆抗體。
在本發(fā)明中的診斷是通過免疫染色，例如組織或者細(xì)胞染色、免疫電子顯微鏡、免疫分析，可以進(jìn)行例如競爭型免疫分析或者非競爭型免疫分析、放射免疫測定法(RIA)、熒光免疫測定法(FIA)、發(fā)光免疫測定法(LIA)、酶免疫測定法(EIA)、ELISA等，在可以進(jìn)行或者不進(jìn)行B-F分離的情況下，對其進(jìn)行測定。優(yōu)選RIA、EIA、FIA、LIA，此外，可列舉夾心法分析。在夾心法測定中還可以包括同時(shí)夾心分析、正向(forward)夾心分析或者反向夾心分析等。
在本發(fā)明中，作為測定HRF蛋白質(zhì)的量的系統(tǒng)，例如針對組織的免疫染色、免疫電鏡等的蛋白質(zhì)測定體系；針對組織抽提物、血液、體液等的EIA、RIA、FIA、LIA、Western印跡等蛋白質(zhì)測定體系。
在EIA測定體系中，例如在競爭法中將抗HRF抗體用作固定化抗體使用，使用標(biāo)記抗原以及未標(biāo)記抗原(作為抗原，可列舉HRF蛋白質(zhì)或者其片段肽等)，此外，在非競爭法中，例如在夾心法中，可以利用固定化的抗HRF抗體或者標(biāo)記的抗HRF抗體之外，可以直接標(biāo)記抗HRF抗體，或者不進(jìn)行固定化，針對抗HRF抗體進(jìn)行抗體標(biāo)記，來進(jìn)行固定化。作為增加敏感度的方法，例如與非酶標(biāo)記的一抗的組合可列舉利用高分子聚合物和酶以及一抗(例如使用Envision試劑；Enhanced polymer one-step staining(EPOS)等)；與非酶標(biāo)記二抗的組合可列舉PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等酶與抗酶抗體復(fù)合物的組合，SABC(avidin-biotinylated peroxidasecomplex)法等生物素標(biāo)記二抗和親和素復(fù)合物的組合、ABC(Streptavidin-biotin complex)法、LSAB(labeledstreptavidin-biotin)法等生物素標(biāo)記二抗以及生物素標(biāo)記酶-鏈霉親和素復(fù)合物的組合、CSA(catalyzed signal amplification)法等SABC和生物素標(biāo)記酪胺與酶標(biāo)記鏈霉親和素的組合，用高分子聚合物標(biāo)記二抗和酶等。
對于上述的常規(guī)的技術(shù)方法的詳細(xì)介紹可以參見綜述、書籍等，[例如入江寬編，“放射免疫分析”，講談社，昭和49年發(fā)行；入江寬編，“續(xù)放射免疫分析”，講談社，昭和54年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”，醫(yī)學(xué)書院，昭和53年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”(第2版)，醫(yī)學(xué)書院，昭和57年發(fā)行；石川榮治等編，“酶免疫測定法”(第3版)，醫(yī)學(xué)書院，昭和62年發(fā)行；H.V.Vunakiset al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New Youk(1980)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.73(Immunochemical Techniques，Part B)”Academic Press，NewYouk(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，”Methods in Enzymology”，Vol.74(Immunochemical Techniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods inEnzynology”，Vol.84(Immunochemical Techniques，PartDSecected Immunoassays)，Academic Press，New York(1982)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part EMonoclonal Antibodies andGeneral Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.121(Immunochemical Techniques，PartIHybridoma Technology andMonoclonal Antibodies)，Academic Press，New York(1986)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，Academic Press，New York(1989)；M.Wilchek et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.184(Avidin-Biotin Technology)，Academic Press，New York(1990)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.203(Molecular Design and ModelingConcepts andApplications，Part BAntibodies and Antigens，Nucleic Acids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，New York(1991)等中的內(nèi)容或者其中所引用文獻(xiàn)的內(nèi)容。
本申請?zhí)峁┝俗鳛樵谠摴滔囿w系中的細(xì)胞抽提物或者血液中測定蛋白質(zhì)的量的診斷方法的發(fā)明(7)。即，該發(fā)明(7)是一種子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征為其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機(jī)體試樣與固定有上述發(fā)明(2)的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機(jī)體試樣接觸的載體的工序；(c)使標(biāo)記的上述發(fā)明(3)的抗體接觸經(jīng)過工序(b)中洗滌后的載體的工序；(d)測定載體上的結(jié)合標(biāo)記或者游離標(biāo)記的工序；(e)以在工序(d)測定的標(biāo)記量作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序，以及(f)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者其風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
此外，作為可使該診斷方法簡便并且在范圍地實(shí)施的方式，提供了發(fā)明(11)的診斷試劑盒。
此外，本申請?zhí)峁┝擞米髟诠滔囿w系中測定組織或者細(xì)胞的HRF蛋白質(zhì)的量的方法的發(fā)明(8)的診斷方法。即，該方法是一種子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征為其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機(jī)體試樣進(jìn)行組織固定化處理的工序；
(b)將在工序(a)中制備的組織固定化標(biāo)本制成切片的工序；(c)通過上述發(fā)明(2)的抗體對在工序(b)中得到的組織切片進(jìn)行免疫組織染色的工序；(d)以通過工序(c)測定的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序，以及(e)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者其風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
在該發(fā)明(8)的方法中，可以使用1種抗體或者2種抗體(例如發(fā)明(2)的抗體和標(biāo)記的抗Ig抗體等)進(jìn)行通過抗體的免疫組織染色。
作為可有效地進(jìn)行如發(fā)明(8)等的診斷的手段，提供了發(fā)明(9)的診斷試劑盒。
發(fā)明(9)～(11)的診斷試劑盒是為了進(jìn)行上述各診斷方法的試劑盒。這些試劑盒可以根據(jù)被檢成分的種類存在各種市售的，本發(fā)明的診斷試劑盒除了可以使用由本發(fā)明提供的抗體和/或標(biāo)記抗體之外，也可以使用公知公用的試劑盒中所用的各要素構(gòu)成的試劑盒。
并且，通過本申請?zhí)峁┑脑\斷方法，可以將2種以上前述的各種方法相組合，或者可以例如并用以公知的方法(例如Northern印跡法、RT-PCR法、DNA微陣列法等)進(jìn)行測定方法。
發(fā)明(12)是一種可識(shí)別HRF蛋白質(zhì)，并且能中和HRF蛋白質(zhì)的活性的抗體，發(fā)明(13)是含有該抗體的子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療藥物。此外，發(fā)明(14)是一種治療子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的方法，其特征在于，向體內(nèi)給予上述抗體或者治療藥物。
發(fā)明(12)的抗體是具有中和HRF蛋白質(zhì)的活性(即，妨礙或者抑制HRF蛋白質(zhì)的活性)的抗體，其對子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療有效。如下面的實(shí)施例所示，HRF蛋白質(zhì)產(chǎn)生過剩的細(xì)胞在體內(nèi)增殖活躍，據(jù)此認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)HRF蛋白質(zhì)的過?；钚詫?dǎo)致了子宮內(nèi)膜組織的移植或者增殖。因此，通過中和該HRF蛋白質(zhì)的活性，有可能治療子宮內(nèi)膜異位或者至少停止或者抑制該病的發(fā)展、惡化。
將可使HRF強(qiáng)制表達(dá)的細(xì)胞置于小鼠等的動(dòng)物體內(nèi)，如注入到腹腔內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腹腔內(nèi)引起子宮內(nèi)膜異位樣病變，據(jù)此闡明可以利用上述可中和HRF的抗體，抑制HRF的影響等，將其應(yīng)用到治療中。
發(fā)明(12)的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，進(jìn)一步優(yōu)選人源化的單克隆抗體。將非人抗體進(jìn)行人源化的方法是公知的，例如用人抗體的相應(yīng)序列置換來自嚙齒動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如Joneset al.，Nature，1986，321522-525；Riechmann et al.，Nature，1988，332323-327；Verhoeyen et al.，Science，1988，2391534-1536)。這種“人源化”抗體是用自非人種的相對應(yīng)的序列置換無傷的人的可變區(qū)域的1個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基得到的嵌合抗體(例如美國專利4816567)。實(shí)際上，人源化抗體典型的是用幾個(gè)CDR殘基以及根據(jù)不同情況的幾個(gè)FR殘基置換嚙齒類抗體對應(yīng)部位的殘基而得到的抗體。此外，除此之外可以按照幾個(gè)公知的方法(例如Hoogenboom andWinter，1991，J.Mol.Biol.，227381；Marks et al.，1991，J.Mol.Biol.，222581；Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss.p.77；Boerner et al.，1991，J.Immunol.，147(1)86-95)制備人源化抗體。此外，可以通過轉(zhuǎn)基因有人免疫球蛋白基因座的動(dòng)物，例如將內(nèi)源性免疫球蛋白基因?qū)氲讲糠只蛘咄耆Щ畹男∈笾惺怪a(chǎn)生人源化抗體(例如美國專利5545807號(hào)、美國專利5569425號(hào)、美國專利5625126號(hào)、美國專利5633425號(hào)、美國專利5661016號(hào)，Marks et al.，1992，Bio/Technology10，779-783；Lonberg et al.，1994，Nature，368856-859；Morrison，1994，Nauture，368812-13；Fishwild et al.，1996，NatureBiotechnology，14845-51；Neuberger，1996，NatureBiotechnology，14826；Lonberg and Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.，1365-93)。
將發(fā)明(13)的藥劑制備成含有上述抗體的制劑。即，將具有所期望程度的純度的抗體以親油性制劑或者水性溶液的形態(tài)，與任意在制劑上允許的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑相混合，制備并加以保存(Remingtons′s Pharmaceutical Science 18thedition 1990)。所允許的載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑的用量以及濃度以不對患者產(chǎn)生毒性為條件，可以根據(jù)劑型或者給藥途徑加以適當(dāng)選擇。例如磷酸、檸檬酸以及其他的有機(jī)酸等緩沖液；含有抗壞血酸以及蛋氨酸的防氧化劑；防腐劑(十八烷基二甲基芐基銨氯化物、六水氯化鎂、ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド、酚、丁基或者芐醇、對羥基苯甲酸甲酯或者丙酯等羥基苯甲酸的烷基酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇以及m-甲酚等)，低分子量(約不足10個(gè)殘基)多肽、血清白蛋白、明膠或者免疫球蛋白等蛋白質(zhì)，聚乙烯吡咯烷酮等親水性聚合物、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或者賴氨酸等氨基酸；含有甘油、甘露糖、或者糊精的單糖、雙糖以及其他碳水化合物EDTA等的螯合劑、蔗糖、鼠李糖醇、海藻糖、山梨醇等糖，鈉等鹽成對離子，金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)或者吐溫(TWEEN)(商品名)、PLURONICS(商品名)、以及聚乙二醇(PEG)等的非離子表面活性劑。
本發(fā)明的試劑可以含有細(xì)胞毒性制劑、細(xì)胞因子或生長抑制劑等活性成分。這些成分也可以包含在例如通過凝聚技術(shù)或者表面聚合制備的微囊(例如各種羥甲基纖維素或者明膠微囊以及多聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、或者膠體狀藥物遞送體系&1t；BR(例如脂質(zhì)體、白蛋白小球、微乳液、納米粒子以及納米囊)中(參見Remington′sPharmaceutical Science 18thedition，1990)。
此外，向體內(nèi)給藥的制劑必需是無菌的。使之通過滅菌過濾膜的過濾很容易實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。制成緩釋制劑也可以。緩釋制劑的優(yōu)選例是含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)(例如膜或者微囊的形狀)。緩釋性制劑的例子為聚酯水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或者聚(乙烯醇))、ポリアクチド(美國專利3773919號(hào))、L-谷氨酸以及γ-乙基-L谷氨酸酯、非分解性的乙烯-醋酸乙烯、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-甘油酸共聚物與醋酸羅沙替丁的可以注射的小球)等分解性乳酸-甘油酸共聚物、聚-(D)-3-羥基丁酸等。此外，乙烯-醋酸乙烯以及乳酸-甘油酸等的聚合物可以歷時(shí)100天釋放出分子。
可以通過向生物體內(nèi)給予上述抗體或者藥物制劑來實(shí)施發(fā)明(14)的治療方法。例如將藥物制劑局部給藥到子宮內(nèi)膜處或者通過靜脈給藥到全身的方法?？贵w的給藥量對應(yīng)于患者的體重、癥狀等，可以是每天大約100μg/Kg體重～10mg/Kg體重左右。
實(shí)施例以下，通過示出實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，本發(fā)明并不受到下述例子的限制。
試驗(yàn)例11.材料和方法1-1.組織材料為了制備RNA，從18例患者中得到以下的試樣。1)子宮內(nèi)膜異位移植物(n＝21)、2)來自子宮內(nèi)膜異位患者的正常部位的子宮內(nèi)膜組織(通過搔爬得到的，n＝4)、3)來自未患子宮內(nèi)膜異位的患者的正常子宮內(nèi)膜組織(n＝6)。幾種試樣來自同一個(gè)人的不同部位。將試樣在液氮中冷凍，儲(chǔ)存在-80℃，準(zhǔn)備用于制備RNA。從卵巢得到子宮內(nèi)膜異位的移植物。所用的試樣是將用于制備RNA的正常子宮內(nèi)膜組織、和從患者的平滑肌腫塊或者子宮脫落物中得到的能正常地增殖和分泌的子宮內(nèi)膜組織在福爾馬林中固定、石蠟包埋后得到的。病理標(biāo)本是通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行階段區(qū)分，其結(jié)果將子宮內(nèi)膜異位分成第III直到IV階段(t-ASRMrevised American Society forReproductive Medicine classification of endometriosis“修訂版美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)子宮內(nèi)膜異位分類”，1996)。此外，該研究的女性受檢者未表現(xiàn)出子宮內(nèi)膜的過形成或者腫瘤形成，在手術(shù)前未接受抗炎藥物或者激素藥物給藥。手術(shù)前獲得書面同意，按照東京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院的人體調(diào)查相關(guān)設(shè)施內(nèi)部監(jiān)察委員會(huì)所確認(rèn)的程序進(jìn)行。
1-2.Northern印跡分析根據(jù)文獻(xiàn)(Oikawa K.et al.Cancer Res.2001，61(15)5707-9)的內(nèi)容進(jìn)行Northern印跡。按照文獻(xiàn)(Oikawa K.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)的內(nèi)容制備HRF探針。以人β肌動(dòng)蛋白cDNA對照探針(CLONTECHLaboratories Inc.)為標(biāo)準(zhǔn)。
1-3.用于Southern印跡分析的RT-PCR根據(jù)文獻(xiàn)(Kubota M.et al.Am.J.Pathol.1997，151(3)735-44)的內(nèi)容，使用寡核苷酸dT引物，從總RNA合成第一鏈的cDNA。然后，將得到的第1鏈cDNA溶液2μl(1×)和10μl(5×)用作模板，進(jìn)行PCR。在添加下述4種引物后，在初期于95℃變性2分鐘，(于95℃下，0.5分鐘，于65℃下，0.5分鐘，于72℃下，1分鐘)進(jìn)行×22循環(huán)的條件下，PCR擴(kuò)增CYP1A1和β肌動(dòng)蛋白的cDNA片段。
用于擴(kuò)增CYP1A1的引物5′-ccacaaccaccaagaactgcttag-3′(SEQ ID3)5′-gaaggggacgaaggaagagtg-3′(SEQ ID4)用于擴(kuò)增β肌動(dòng)蛋白的引物5′-gggaaatcgtgcgtgacgttaag-3′(SEQ ID5)5′-tgtgttggcgtacaggtctttg-3′(SEQ ID6)通過瓊脂糖電泳分離擴(kuò)增的產(chǎn)物后，進(jìn)行印跡和雜交。通過使用上述的引物對的逆轉(zhuǎn)錄PCR得到CYP1A1 cDNA探針。將人β肌動(dòng)蛋白cDNA探針(CLONTECH)作為對照。使用Rediprime II random trimelabeling system(Amersham Pharmacia Biotech)，用32P標(biāo)記這些cDNA探針。
1-4.制備抗體和免疫組織化學(xué)方法使用兔子，按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備針對來自人HRF的寡肽(GKLEEQRPERVKPFMTSEQ ID2的101-116)的肽抗體，將其命名為HRF-GKL。免疫組織化學(xué)分析是在抗HRF抗體、HRF-TPY(Oikawa K.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)以及HRF-GKL(按照1∶100稀釋)或者抗人CD68抗體(1∶100稀釋，Dako公司)的混合液存在的情況下，將脫臘的切片溫育1夜。進(jìn)行抗HRF染色時(shí)，使用壓力滅菌器對脫臘的切片進(jìn)行熱誘導(dǎo)性的抗原恢復(fù)。使用LSABC(Dako)進(jìn)行檢測，此處將3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)用作顯色物質(zhì)。使用蘇木素進(jìn)行逆染。
1-5. Western印跡分析可以按照文獻(xiàn)(Oikawa K.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，290(3)984-7)的內(nèi)容進(jìn)行Western印跡分析。使用抗HRF(HRF-GKL或者HRF-TPY)進(jìn)行膜的探針處理，按照1∶2000的稀釋比例進(jìn)行。使用ECL plus Western blotting detection system(AmershamPharmacia Biotech)進(jìn)行信號(hào)檢測。
1-6.細(xì)胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)得到NIH3T3細(xì)胞。將細(xì)胞保持在37℃的條件下、于添加了10％DMEM(GIBCO BRL，LifeTechnologies，Inc.)中，在5％CO2的環(huán)境下。使用下述引物通過PCR擴(kuò)增含有全長ORF的小鼠HRF cDNA5′-ttggatccatgatcatctaccgggacctg-3′(SEQ ID7)5′-ttgaattcttaacatttctccatctctaa-3′(SEQ ID8)將得到的片段用BamHI以及EcoRI消化，克隆到逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體MSCV-puro(CLONTECH)的BglII-EcoRI部位。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備和感染流程可以按照文獻(xiàn)(Kuroda＞et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96(9)5025-30)的內(nèi)容。感染24小時(shí)后，使用1μg/ml嘌呤霉素(CLONTECH)歷時(shí)2周對感染細(xì)胞進(jìn)行篩選。
1-7動(dòng)物和處置將5×105個(gè)細(xì)胞的部分樣品注射到6周齡的雌性BALB/C裸鼠的腹腔內(nèi)，進(jìn)行移植分析。2周后處死動(dòng)物，測定移植物克隆數(shù)。
2.結(jié)果2-1.在子宮內(nèi)膜異位中TCDD誘導(dǎo)性基因HRF的表達(dá)模式通過Northern印跡分析，測定子宮內(nèi)膜異位時(shí)的HRF表達(dá)模式。其結(jié)果，在經(jīng)確認(rèn)從5例患者中的3例中得到的子宮內(nèi)膜異位移植物組織中有HRF的高水平表達(dá)(圖1A以及1B)。為了通過二噁英誘導(dǎo)人的細(xì)胞色素p450基因超家族的一部分(例如CYP1A1、CYP1A2以及CYP1B1)，針對二噁英依賴性的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的基本目標(biāo)是誘導(dǎo)CYP1A1。為此，為了調(diào)查暴露于二噁英與HRF表達(dá)的關(guān)系，在此通過Southern分析使用RT-PCR調(diào)查CYP1A1的表達(dá)(Trifa Y.etal.J.Biol.Chem.1998，273(7)3980-5；Oikawa K.et al.Gene 2000，261(2)221-8)。其結(jié)果，CYP1A1并未在全部例中表現(xiàn)出高的HRF表達(dá)(圖1A以及1B)。所以，在幾種情況下，HRF表達(dá)可能與TCDD的誘導(dǎo)無關(guān)，由此確認(rèn)在子宮內(nèi)膜異位中的HRF的誘導(dǎo)與TCDD暴露無關(guān)。
2-2.在子宮內(nèi)膜異位移植物中的HRF過表達(dá)經(jīng)確認(rèn)在子宮內(nèi)膜異位再次復(fù)發(fā)的患者的子宮內(nèi)膜異位移植物中存在HRF的過表達(dá)。即，針對7例子宮內(nèi)膜異位患者進(jìn)行了Nortern印跡分析(圖2A)。比較正常的子宮內(nèi)膜組織以及患有子宮內(nèi)膜異位的患者的正常部位的子宮內(nèi)膜，觀察到在子宮內(nèi)膜移植物上存在HRF的高度表達(dá)。
2-3.在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位移植物上的HRF的免疫組織化學(xué)通過使用抗HRF多克隆抗體的免疫組織化學(xué)測定表達(dá)HRF的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的類型。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HRF共存于子宮內(nèi)膜腺與正常組織的間質(zhì)細(xì)胞中，與間質(zhì)細(xì)胞相比，子宮內(nèi)膜腺表現(xiàn)出更強(qiáng)的表達(dá)(圖3A和3B)。表達(dá)模式在分泌與增殖相之間沒有顯著變化。進(jìn)一步對在子宮內(nèi)膜異位移植物上的HRF表達(dá)進(jìn)行了調(diào)查。其結(jié)果，在卵巢子宮內(nèi)膜異位移植物的間質(zhì)以及上皮成分兩處均存在HRF(圖3C和3E)。在正常的子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞上HRF表達(dá)較弱，與此相對，在卵巢的子宮內(nèi)膜異位移植物上，子宮內(nèi)膜腺與間質(zhì)細(xì)胞的任何一方均表現(xiàn)出同樣的高水平的HRF表達(dá)。在用免疫前的血清作對照的情況下沒有觀察到這些與HRF相對的特異性的信號(hào)(未出示數(shù)據(jù))?？墒?，在子宮內(nèi)膜異位移植物上誘導(dǎo)HRF的機(jī)制尚不清楚。據(jù)報(bào)道通過M-CSF而使之處于活化階段的巨噬細(xì)胞能誘導(dǎo)HRF(Teshima S.et al.J.Immunol.1998，161(11)6353-66)，與此一致的是在子宮內(nèi)膜異位移植物中觀察到與CD68陽性巨噬細(xì)胞的相關(guān)性(Hornung D.etal.Am.J.Pathol.2001，158(6)1949-54)。所以，利用對移植物的連續(xù)切片的CD68染色，鑒定發(fā)現(xiàn)在HRF過表達(dá)區(qū)域內(nèi)部有CD68陽性的巨噬細(xì)胞(圖3F)。使用蘇木素-伊紅染色后的對照切片表現(xiàn)了子宮內(nèi)膜異位移植物的整體性的形態(tài)。根據(jù)這些結(jié)果，可以認(rèn)為在子宮內(nèi)膜異位移植物上的HRF的產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞相關(guān)。
2-4.HRF對NIH3T3細(xì)胞的腹腔內(nèi)移植的效果對HRF表達(dá)增加所造成的生理學(xué)影響進(jìn)行調(diào)查。子宮內(nèi)膜異位的原因尚不明確(Klninckx R.P.et al.Gynecol Obstet Invest.1999，47Suppl 13-9，discussion 9-10；van der Linden P.J.Q.FrontBiosci.1997，2c48-52)。如果遵照主要的假說，子宮內(nèi)膜組織通過輸卵管逆流達(dá)到腹腔(逆行性月經(jīng))后的移植以及增殖導(dǎo)致發(fā)生子宮內(nèi)膜異位。在這里關(guān)于HRF針對該移植的影響進(jìn)行研究。最初，制備HRF過表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。用表達(dá)HRF的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-HRF)感染后，確認(rèn)HRF高表達(dá)(圖4A)。然后，將這些細(xì)胞(pMSCV-HRF-3T3細(xì)胞)注射到裸鼠的腹腔內(nèi)。與用對照載體(pMSC-3T3)感染的細(xì)胞相比較，pMSCV-HRF-3T3細(xì)胞具有高的移植能力(圖4B)。從這些數(shù)據(jù)可知HRF不僅與免疫學(xué)功能不全有關(guān)，而且在子宮內(nèi)膜異位移植物的初期發(fā)展時(shí)也發(fā)揮著重要的作用。
實(shí)施例2多克隆抗體的制備制備含有抗HRF抗體的抗血清，從該血清中純化抗HRF抗體。
作為致敏抗原可以選擇合成人HRF蛋白質(zhì)(序列號(hào)2)中101-116位的肽。將合成的肽以HLA為載體，使其結(jié)合，然后與KLH混合(相對50μg的肽加入50μg的KLH)。將由此得到的抗原液與弗氏完全佐劑混合，制備含有致敏抗原的溶液。將該溶液按照每2周每次1ml的量皮下注射(5次)到體重3～4kg的兔子(SPF Japanese WhiteRabbit)中。
然后，在第5次皮下注射后，間隔1周后從兔子采取血液，制備血清。確認(rèn)得到的血清中所含有的抗體能特異性地識(shí)別HRF蛋白質(zhì)，將其作為抗HRF抗體。
通過ELISA法確認(rèn)抗血清為抗HRF抗體(HRF-GKL)。
首先，用20mM碳酸緩沖液(pH9.6)稀釋的抗原多肽包被聚乙烯制成的96孔平板(100ng/孔)，然后，用含有0.05％Tween20的PBS洗滌，去除未吸附的肽。向各孔中加入從免疫的兔子中采取得到的血液中的血清，在室溫下靜置約1小時(shí)。洗滌后，添加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白作為二抗，然后再于室溫下靜置約1小時(shí)。洗滌后，添加底物過氧化氫和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)使之顯色。向各孔中加入2N硫酸中止顯色反應(yīng)，使用用于微孔板的吸光度測定儀測定450nm的吸光度，據(jù)此測定顯色程度。作為比較，與免疫前采取的血清相比較，確認(rèn)血清中所含有的抗體確實(shí)能特異性地識(shí)別HRF蛋白質(zhì)。上述操作可以使用重組蛋白質(zhì)作為抗原。
將10μg NIH3T3的全細(xì)胞裂解物添加到14％的SDS-PAGE上，用2000倍稀釋的抗血清在Western印跡中進(jìn)行檢測，將得到的含有抗HRF抗體的血清加到信號(hào)條帶上，以此確認(rèn)其純度。該抗體能在小鼠和人細(xì)胞中檢測出相同大小的蛋白質(zhì)。
可以使用將上述HRF蛋白質(zhì)的101-116位肽固定到親和凝膠(BIO-RAD公司制造)后的柱子通過親和層析進(jìn)行純化的抗HRF抗體的制備。將純化的HRF肽與親和凝膠-10(BIO-RAD公司制造)混合，在4℃下反應(yīng)過夜后，用20mM磷酸緩沖液-生理鹽水(PBS)充分洗滌親和凝膠，在含有100mM單乙醇胺的PBS中對親和凝膠上未反應(yīng)的官能基團(tuán)進(jìn)行過夜封閉，最后用PBS再次洗滌，制備肽固定化柱。向該固定化柱上添加含有抗HRF抗體的兔血清，用PBS充分洗滌后，用20mM甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH4.0)洗脫吸附的抗HRF抗體。用200mM Tris-鹽酸緩沖液立即中和洗脫的抗HRF抗體，用PBS透析1晚后，凍存在-80℃。
實(shí)施例3夾心EIA按照下述的方法，從實(shí)施例2制備的抗HRF抗體以及公知的抗HRF抗體中至少選出1種，通過2種抗HRF抗體的適當(dāng)組合特異性地檢測、測定HRF蛋白質(zhì)，由此構(gòu)成夾心EIA系統(tǒng)。EIA系統(tǒng)可以是一步法也可以是兩步法，標(biāo)記的抗體不限定于Fab′-HRP。根據(jù)測定的目的，可以縮短、延長等調(diào)整各反應(yīng)緩沖液的組成或者反應(yīng)條件。此外，作為標(biāo)準(zhǔn)品的人HRF可以從組織培養(yǎng)上清、細(xì)胞培養(yǎng)上清或者以實(shí)施例1記載的內(nèi)容或者其它的方法使之表達(dá)的重組體中進(jìn)行純化。可以將離子交換、凝膠過濾、使用抗人HRF抗體的親和層析或者除此以外的各種親和層析的組合實(shí)現(xiàn)純化。
(a)標(biāo)記抗體的制備向含有抗HRF抗體(HRF-GKL)的0.1M NaCl的0.1M醋酸緩沖液，pH4.2中添加抗體量的2％(W/W)的胃蛋白酶，在37℃消化24小時(shí)。向消化物中添加3M Tris-HCl、pH7.5，使反應(yīng)中止。通過以0.1M磷酸緩沖液、pH7.0平衡的超凝膠AcA54柱進(jìn)行凝膠過濾，分離得到F(ab′)2級(jí)分。在該F(ab′)2級(jí)分中使終濃度為0.01M地添加半胱胺鹽酸鹽，于37℃還原1.5小時(shí)，通過以含5mM EDTA的0.1M磷酸緩沖液、pH6.0平衡的超凝膠AcA54柱進(jìn)行凝膠過濾，分離得到F(ab′)2級(jí)分。
除了上述操作之外，可以將HRP溶解到0.1M磷酸緩沖液、pH7.0中，將HRP的25倍摩爾量的EMCS作為DMF添加到其中，在30℃使之反應(yīng)30分鐘。將其以用0.1M磷酸緩沖液、pH6.0平衡的NICK-5柱(Pharmacia)進(jìn)行凝膠過濾，分離得到馬來酰亞胺標(biāo)記的HRP級(jí)分。
使等摩爾地將Fab′組分與馬來酰亞胺標(biāo)記的HPR混合兩種級(jí)分，使之在4℃反應(yīng)20小時(shí)后，以Fab′10倍摩爾量的N-乙基馬來酰亞胺封閉未反應(yīng)的巰基。將其用以0.1M磷酸緩沖液、pH6.5平衡的超凝膠AcA54柱進(jìn)行凝膠過濾，分離得到F(ab′)-HRP標(biāo)記抗體。向其中添加0.1％BSA以及0.001％氯己定(Chlorhexidine)，保存在4℃。對使用其他的抗人HRF抗體進(jìn)行同樣的處理。
(b)抗體結(jié)合載體的制備將抗HRF抗體(HRF-TPY)溶解到0.1M磷酸緩沖液、pH7.5中，使之濃度為50μg/mL。將該抗體溶液按照每孔100μL添加到96孔板中，在4℃靜置18小時(shí)。去除抗體溶液，用生理鹽水洗滌1次，用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，在pH8.0洗滌3次后，添加含有1％BSA、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，pH8.0進(jìn)行封閉。對使用的其他的抗人HRF抗體進(jìn)行同樣的處理，制備固定化抗體。
(c)分步夾心EIA法將純化的人HRF級(jí)分作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，制成用于定量人HRF的標(biāo)準(zhǔn)曲線。含有1％BSA、0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，在pH8.0梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)人HRF，將其分裝，向其中分別加入用含有1％BSA、0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，在pH8.0制備的標(biāo)記抗體Fab′-HRP，充分混合。將制備的抗體結(jié)合微孔板用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，在pH8.0洗滌3次，添加標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)記抗體混合液。在室溫反應(yīng)1小時(shí)后，用含有0.05％Tween20、0.1M NaCl、5mM CaCl2的Tris-HCl緩沖液，在pH8.0洗滌3次。然后，在含有6％二甲基甲酰胺、0.005％g過氧化氫的0.1M醋酸緩沖液(pH5.5)中溶解0.01％3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺，將其加入到向各孔中，在室溫下反應(yīng)20分鐘后，添加2N硫酸，中止反應(yīng)。用微孔板讀板儀測定該反應(yīng)混合液在450nm的吸收，算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
可以從來自人的體液成分、各種人組織的抽提液、來自人或者重組體等的各種培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞提取液、培養(yǎng)上清等中制備待測樣品。代替標(biāo)準(zhǔn)人HRF，將各種待測樣品供給上述的一步夾心EIA，與標(biāo)準(zhǔn)人HRH同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。將有待檢樣品得到吸光度與保準(zhǔn)曲線對比，計(jì)算出待檢樣品中含有的人HRF的量。
除了上述之外，使用市售的抗人HRF抗體，按照瓜谷郁等編、“生物化學(xué)試驗(yàn)法27、石川榮治著、酶標(biāo)記法”，株式會(huì)社學(xué)會(huì)出版中心(1991年6月20日發(fā)行)以及日本生化學(xué)會(huì)編、“續(xù)生化學(xué)試驗(yàn)講座5”、免疫生化學(xué)研究法”、p107-112，東京化學(xué)同人，1986年3月14日發(fā)行中記載的方法(也包括這些方法中引用的文獻(xiàn)中記載的方法)，制備酶標(biāo)記抗體，再將其用于測定。
實(shí)施例4Western印跡表達(dá)人HRF的細(xì)胞或者組織的培養(yǎng)上清以及純化的重組人HRF在還原條件下，用10％-15％的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到polyvinylidene difluoride(PVDF)膜(MILLIPORE)。然后用含有5％的BSA或者5％脫脂奶粉以及0.05％疊氮鈉的TBS(封閉緩沖液)在室溫條件下封閉0.5-1小時(shí)后，用HRF-GKL處理，在25℃下，溫育6小時(shí)以下。用含有0.1％Tween 20的TBS(含有0.05％疊氮鈉)洗滌各膜4次，將結(jié)合的抗體與用封閉緩沖液按照1∶1000稀釋的HRP結(jié)合抗兔免疫球蛋白抗體在25℃下，反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用含有0.1％Tween20的TBS(含有0.05％疊氮鈉)洗滌膜4次，通過Enhancedchemiluminescence(ECL，Amersham Pharmacia)檢測結(jié)合的抗體。
除此之外，使用HRF-TPY，按照口野嘉幸等編，“基因/蛋白質(zhì)、試驗(yàn)操作，封閉方法”、p212-241、Softscience公司、昭和62年11月10日發(fā)行中記載的方法(也包括這些文獻(xiàn)中引用的文獻(xiàn)中記載的方法)，進(jìn)行Western印跡。
實(shí)施例5單克隆抗體的制備從患者中獲取的人子宮內(nèi)膜異位病變部位組織的細(xì)胞中制備總RNA，據(jù)此進(jìn)行RT-PCR，分離人全長HRF cDNA。根據(jù)人HRF cDNA全長序列(SEQ ID1)，用下述的寡核苷酸作為PCR引物5′引物(Bgl II)gcgcagatctATGATTATCTACCGGGAC(SEQ ID9)3′引物(Eco RI)ggccgaattcAGATCCAAAATAATTGCC(SEQ ID10)然后，將得到PCR產(chǎn)物克隆到桿狀病毒載體pYNG HisA中，使之感染蠶后，從蠶的體液中提取人HRF蛋白質(zhì)。然后，使用鎳柱通過組氨酸Tag純化蛋白質(zhì)。之后將100μg純化的蛋白質(zhì)分3次免疫到雌性Balb/C小鼠中，此后，切取回腸淋巴節(jié)，使之與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞P3U1融合，得到雜交瘤。將能產(chǎn)生HRF抗體的雜交瘤進(jìn)行2次極限稀釋，最終得到雜交瘤HRF25、HRF26、HRF28。用ELISA法進(jìn)行雜交瘤的篩選。具體而言，將1μg/ml的抗原(由桿狀病毒制備的HRF蛋白質(zhì))吸附到ERISA平板3912(Falcon公司制造)上。使之與雜交瘤上清反應(yīng)，再次與作為二抗的山羊抗小鼠IgG(Zymed 81-6522)反應(yīng)。添加ALP Rose(Shino-test制造)作為底物，測定A660nm的吸光度。結(jié)果得到克隆No.4、18、25、26、28、46、51、54、55、56。吸光度的測定結(jié)果如表1所示。
表1
此外，進(jìn)行使用這些培養(yǎng)上清的Western印跡。具體而言，從確認(rèn)表達(dá)HRF的BJAB中提取總蛋白質(zhì)，按照Laemmili方法進(jìn)行SDS-PAGE，進(jìn)行硝基纖維素膜的封閉。然后，使之與作為一抗的5倍稀釋的雜交瘤上清反應(yīng)，進(jìn)行研究。結(jié)果確認(rèn)克隆No.25(HRF25)、26(HRF26)、28(HRF28)能檢測出HRF蛋白質(zhì)的單一條帶。并且，該3個(gè)抗體均為IgG抗體。
此外，以上的結(jié)果表明抗HRF抗體能非常特異性地識(shí)別人HRF。
抗原使用實(shí)施例1的2-4中的強(qiáng)制表達(dá)HRF的NIH3T3細(xì)胞，在體內(nèi)和體外篩選上述得到的單克隆抗體的活性，經(jīng)確認(rèn)具有活性的抗體可以判定其有望作為子宮內(nèi)膜異位的診斷藥物、治療藥物。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過以上的詳細(xì)說明，根據(jù)本發(fā)明，可以提供簡便并且確實(shí)地診斷子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病以及患病風(fēng)險(xiǎn)的方法和為實(shí)現(xiàn)該目的而采用的材料。據(jù)此，可以使早期發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病、選擇更確切的治療方法、防止再發(fā)等成為可能。
序列表<110>白麗高科<120>子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法<130>03-F-104PCT<150>JP2003-196459<151>2003-07-14<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>830<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(95)..(613)<223>
<400>1cccccccgag cgccgctccg gctgcaccgc gctcgctccg agtttcaggc tcgtgctaag 60ctagcgccgt cgtcgtctcc cttcagtcgc catc atg att atc tac cgg gac ctc115Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu1 5atc agc cac gat gag atg ttc tcc gac atc tac aag atc cgg gag atc 163Ile Ser His Asp Glu Met Phe Ser Asp Ile Tyr Lys Ile Arg Glu Ile10 15 20gcg gac ggg ttg tgc ctg gag gtg gag ggg aag atg gtc agt agg aca 211Ala Asp Gly Leu Cys Leu Glu Val Glu Gly Lys Met Val Ser Arg Thr25 30 35gaa ggt aac att gat gac tcg ctc att ggt gga aat gcc tcc gct gaa 259Glu Gly Asn Ile Asp Asp Ser Leu Ile Gly Gly Asn Ala Ser Ala Glu40 45 50 55ggc ccc gag ggc gaa ggt acc gaa agc aca gta atc act ggt gtc gat 307Gly Pro Glu Gly Glu Gly Thr Glu Ser Thr Val Ile Thr Gly Val Asp60 65 70
att gtc atg aac cat cac ctg cag gaa aca agt ttc aca aaa gaa gcc355Ile Val Met Asn His His Leu Gln Glu Thr Ser Phe Thr Lys Glu Ala75 80 85tac aag aag tac atc aaa gat tac atg aaa tca atc aaa ggg aaa ctt403Tyr Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Tyr Met Lys Ser Ile Lys Gly Lys Leu90 95 100gaa gaa cag aga cca gaa aga gta aaa cct ttt atg aca ggg gct gca451Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys Pro Phe Met Thr Gly Ala Ala105 110 115gaa caa atc aag cac atc ctt gct aat ttc aaa aac tac cag ttc ttt499Glu Gln Ile Lys His Ile Leu Ala Asn Phe Lys Asn Tyr Gln Phe Phe120 125 130 135att ggt gaa aac atg aat cca gat ggc atg gtt gct cta ttg gac tac547Ile Gly Glu Asn Met Asn Pro Asp Gly Met Val Ala Leu Leu Asp Tyr140 145 150cgt gag gat ggt gtg acc cca tat atg att ttc ttt aag gat ggt tta595Arg Glu Asp Gly Val Thr Pro Tyr Met Ile Phe Phe Lys Asp Gly Leu155 160 165gaa atg gaa aaa tgt taa caaatgtggc aattattttg gatctatcac 643Glu Met Glu Lys Cys170ctgtcatcat aactggcttc tgcttgtcat ccacacaaca ccaggactta agacaaatgg 703gactgatgtc atcttgagct cttcatttat tttgactgtg atttatttgg agtggaggca 763ttgtttttaa gaaaaacatg tcatgtaggt tgtctaaaaa taaaatgcat ttaaactcat 823ttgagag830<210>2<211>172<212>PRT<213>智人<400>2Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Ile Ser His Asp Glu Met Phe Ser Asp1 5 10 15
Ile Tyr Lys Ile Arg Glu Ile Ala Asp Gly Leu Cys Leu Glu Val Glu20 25 30Gly Lys Met Val Ser Arg Thr Glu Gly Asn Ile Asp Asp Ser Leu Ile35 40 45Gly Gly Asn Ala Ser Ala Glu Gly Pro Glu Gly Glu Gly Thr Glu Ser50 55 60Thr Val Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Met Asn His His Leu Gln Glu65 70 75 80Thr Ser Phe Thr Lys Glu Ala Tyr Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Tyr Met85 90 95Lys Ser Ile Lys Gly Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys100 105 110Pro Phe Met Thr Gly Ala Ala Glu Gln Ile Lys His Ile Leu Ala Asn115 120 125Phe Lys Asn Tyr Gln Phe Phe Ile Gly Glu Asn Met Asn Pro Asp Gly130 135 140Met Val Ala Leu Leu Asp Tyr Arg Glu Asp Gly Val Thr Pro Tyr Met145 150 155 160Ile Phe Phe Lys Asp Gly Leu Glu Met Glu Lys Cys165 170<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>3ccacaaccac caagaactgc ttag 24<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>4gaaggggacg aaggaagagt g 21<210>5
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>5gggaaatcgt gcgtgacgtt aag23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>6tgtgttggcg tacaggtctt tg 22<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>7ttggatccat gatcatctac cgggacctg 29<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>8ttgaattctt aacatttctc catctctaa 29
<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>9gcgcagatct atgattatct accgggac28<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>10ggccgaattc agatccaaaa taattgcc 28
權(quán)利要求
1.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，測定受檢者機(jī)體試樣中組胺釋放因子(HRF蛋白質(zhì))的存在量，將HRF蛋白質(zhì)的量與正常機(jī)體試樣中的量相比較，與正常機(jī)體試樣相比而HRF蛋白質(zhì)的量表現(xiàn)出有意義地高的受檢者被判定為患有子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的患者或者具有患該疾病的高風(fēng)險(xiǎn)者。
2.識(shí)別HRF蛋白質(zhì)的抗體。
3.與所述權(quán)利要求2的抗體不同的表位結(jié)合的抗體。
4.權(quán)利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第90～130位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
5.權(quán)利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第1～95位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
6.權(quán)利要求2或者3的抗體，是用具有從序列表序列號(hào)2的氨基酸序列的第115～172位選出的連續(xù)的5～20個(gè)氨基酸殘基的肽作為免疫抗原而獲得的抗體。
7.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，其中至少包括下述工序(a)使受檢者的機(jī)體試樣與固定有上述權(quán)利要求2的抗體的載體接觸的工序；(b)洗滌在工序(a)中與機(jī)體試樣接觸的載體的工序；(c)使標(biāo)記的上述權(quán)利要求3的抗體接觸經(jīng)過工序(b)的洗滌的載體的工序；(d)測定載體上的結(jié)合標(biāo)記或者游離的標(biāo)記的工序；(e)以在工序(d)中測定的標(biāo)記量作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序；以及，(f)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者該病的患病風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
8.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的診斷方法，其特征在于，其中至少包括下述工序(a)對受檢者的機(jī)體試樣進(jìn)行組織固定化處理的工序；(b)將工序(a)中制備的組織固定化標(biāo)本制成切片的工序；(c)以上述權(quán)利要求2的抗體對在工序(b)中得到的切片組織進(jìn)行免疫組織染色的工序；(d)以在工序(c)中得到的免疫組織染色的程度作為HRF蛋白質(zhì)的量的指標(biāo)，與正常機(jī)體試樣的結(jié)果進(jìn)行比較的工序；以及，(e)將與正常機(jī)體試樣進(jìn)行比較而表現(xiàn)出有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為表示與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者該病的患病風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)的工序。
9.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病診斷試劑盒，其特征在于，至少含有標(biāo)記了的上述權(quán)利要求2的抗體。
10.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病診斷試劑盒，其特征在于，其中至少含有下述要素(a)上述權(quán)利要求2的抗體；以及，(b)標(biāo)記了的上述權(quán)利要求3的抗體。
11.子宮內(nèi)膜異位診斷試劑盒，其特征在于，其中至少含有下述要素(a)固定有上述權(quán)利要求2的抗體的載體；以及，(b)標(biāo)記了的上述權(quán)利要求3的抗體。
12.抗體，其可識(shí)別HRF蛋白質(zhì)，并且可中和HRF蛋白質(zhì)的活性。
13.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療藥物，其特征在于，其中含有權(quán)利要求12的抗體。
14.子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療方法，其特征在于向體內(nèi)給予權(quán)利要求12的抗體或者權(quán)利要求13的治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明通過測定受試者機(jī)體試樣中的組胺釋放因子(HRF)蛋白質(zhì)的存在量，將該HRF蛋白質(zhì)的量與正常機(jī)體試樣中的量相比較，將與正常機(jī)體試樣相比有意義地高的HRF蛋白質(zhì)的量作為子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病或者其風(fēng)險(xiǎn)程度的指標(biāo)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1823274SQ20048002021
公開日2006年8月23日 申請日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月14日
發(fā)明者小杉好紀(jì), 黑田雅彥, 及川恒輔, 大林徹也 申請人:株式會(huì)社白麗高科