專(zhuān)利名稱(chēng)：：合成β－內(nèi)酰胺酶抑制劑中間體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶法合成二環(huán)-雜芳基-2-甲酸中間體的方法，該中間體適用于通過(guò)選擇性酶解位置水解酯的混合物來(lái)制備β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。
背景技術(shù)：
：為了治療人類(lèi)疾病，不斷地需要新的改良的抗生素。抗生素抗性生物體是持續(xù)的問(wèn)題，而萬(wàn)古霉素是最后的防線(xiàn)，特別是在醫(yī)院，萬(wàn)古霉素抗性株在醫(yī)院分離的病原體中持續(xù)增高。最近的調(diào)查發(fā)現(xiàn)美國(guó)醫(yī)院的腸球菌屬的7.9％現(xiàn)在是萬(wàn)古霉素抗性株(“NosocomialEnterococciResistanttoVancomycin”MorbidityandMortalityWeeklyReport42(30)597-598(1993))。報(bào)道了其它的抗萬(wàn)古霉素抗性和其它抗屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的抗生素，(Handwergers.etal.，Clin.Infect.Dis.1993(16)，750-755)。耐藥生物體對(duì)其它重要的抗生素也是難題，包括哌拉西林。在克服抗藥性生物體，并通過(guò)抑制某些耐藥菌株產(chǎn)生的特異性酶，β內(nèi)酰胺酶的活性提高抗生素的有效性的努力中，β內(nèi)酰胺酶抑制劑于目前使用的抗生素聯(lián)用或同時(shí)給予。顯然，抗生素抗性是一個(gè)發(fā)展的公共健康問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新抗生素可給內(nèi)科醫(yī)生提供附加的選擇治療方案。此外，醫(yī)療界認(rèn)識(shí)到對(duì)附加的抗生素有持續(xù)的需求，目前β內(nèi)酰胺酶抑制劑有利于增強(qiáng)目前現(xiàn)有的已發(fā)展出抗性的抗生素。新的β內(nèi)酰胺酶抑制劑的制備需要可有效產(chǎn)生制備β內(nèi)酰胺酶終產(chǎn)物所必需的中間體的方法。在許多合成方法的情況下，生產(chǎn)出的化合物的混合物需要色譜分離純化。本發(fā)明克服了混合物純化和分離的問(wèn)題，方式為提供另外的方法以通過(guò)選擇性酶解位置酯異構(gòu)體混合物中的一個(gè)酯異構(gòu)體，制備單一羧酸中間體。水解酶如脂肪酶、酯酶或蛋白酶在動(dòng)力學(xué)拆分分離手性分子上的用法，已在文獻(xiàn)中完整建立，(Zaks，A，.Curr.OpinioninChemBiol.2001，5，130-136.；Wang，C-HandWhitesidesG.M.InEnzymesinsyntheticorganicchemistryTetrahedronorganicchemistryseriesvol.12pp.41-130，Pergamonpress；BerglundP，andHult，K.Biocatalyticsynthesisofenantiopurecompoundsusing脂肪酶s，pp633-657，In“Stereoselectivebiocatalysis”，ed.Patel，R.N.MarcelDekkerInc.，2000)。優(yōu)選通過(guò)酶裂解存在于相同分子上的一個(gè)酯基(也稱(chēng)為特定選擇性)也是已知的，(Keller，J.W，Hamilton，B.J.，TetrahedronLetts.1986，27，1249.；PirrungM.C.，andKrishnamurthyN.，J.Org.Chem.1993，58，954)。但是，通過(guò)酶解選擇性水解位置酯異構(gòu)體，并分離本發(fā)明所述的所需的羧酸中間體化合物是未知的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及制備式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸的方法，其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，該方法包括酶解其中X、Y和R如上所定義的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6，或選擇性地在下式的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5的混合物中酶解，其中X、Y和R如上所定義和產(chǎn)生下式的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7其中Y如上所定義，并分離二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7。烷基為1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基部分。芳烷基(C1-C6)指1-6個(gè)碳原子的烷基部分被芳基部分取代，其中芳基部分被定義為有6-12個(gè)碳原子的芳烴部分，該部分選自下述基團(tuán)苯基、α-萘基、β-萘基、聯(lián)苯基、蒽基、四氫萘基、芴基、茚滿(mǎn)基、亞聯(lián)苯基和苊基。芳烷基(C1-C6)部分包括芐基、1-苯乙基、2-苯乙基、3-苯乙基、2-苯丙基、4-硝基芐基等。早期的專(zhuān)利申請(qǐng)描述了用色譜法分離位置(positional)酯混合物，將合適的酯還原為醇，再將醇氧化為醛，制備二環(huán)雜芳基-2-甲醛的方法。(參見(jiàn)U.S.Ser.No.60/377052，申請(qǐng)日2002年5月1日，WyethCaseAM100862L1)。此處所述的合成方法不需使用色譜法。在本發(fā)明中，專(zhuān)一性酶切一種酯異構(gòu)體有效的促進(jìn)了所需中間體羧酸的分離，有利于從第二酯異構(gòu)體制備β內(nèi)酰胺酶抑制劑。5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸是制備β內(nèi)酰胺酶抑制劑，(5R，6Z)-6-(5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-基亞甲基)-7-氧代-4-硫代-1-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚-2-烯-2-甲酸的關(guān)鍵中間體，該關(guān)鍵中間體可通過(guò)化學(xué)水解位置異構(gòu)體的混合物形成，或色譜分離單一位置異構(gòu)體然后化學(xué)水解形成。但是化學(xué)水解異構(gòu)體混合物后，需要進(jìn)行另一步困難的色譜分離以分離5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸。如本文所述，5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸是從酯異構(gòu)體的混合物通過(guò)酶解水性溶劑中的所需的酯來(lái)選擇性合成的。通過(guò)化學(xué)方法分離酯可導(dǎo)致非選擇性水解不需要的酯，從而產(chǎn)生的酸的低異構(gòu)體純度。此外，酶解可消除結(jié)晶步驟。5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸的分離的酸的純度可高于99％，所述酶法的收率可至少為82％，并包括非常簡(jiǎn)單的處理步驟通過(guò)有機(jī)溶劑萃取含水溶劑分離不需的酯，酸化含水溶劑并過(guò)濾分離不溶性酸。處理?xiàng)l件簡(jiǎn)單、酶價(jià)格低廉，提高了制備5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸的處理有效性。特別是本發(fā)明為酶解下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5混合物和其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，來(lái)選擇性產(chǎn)生下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7；其中X和Y如上所定義；包括a)使其中X、Y和R如上所定義的二環(huán)雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5的混合物與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；b)通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；c)通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；d)分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；e)分離作為游離酸或其藥學(xué)上可接受的鹽的下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7，其中X和Y如上所定義。特別是，脂肪酶、酰基轉(zhuǎn)移酶和蛋白酶表現(xiàn)出對(duì)5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯的特異性高于對(duì)5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯。本發(fā)明還提供制備下式的二環(huán)雜芳基甲醛11的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；該方法包含以下步驟a.用亞硝化試劑將其中X和Y為上述所定義的式1的氨基酸亞硝基化，形成其中X和Y為上述所定義的式2的亞硝基化合物b.將亞硝基化合物2與脫水劑反應(yīng)，并用無(wú)機(jī)堿中和，形成其中X和Y為上述所定義的式3的內(nèi)鎓鹽c.式3的內(nèi)鎓鹽與其中R1為1-6個(gè)碳原子的烷基的式HC≡CCO2R14的丙炔酸酯在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)，形成式5的二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯和式6的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯的混合物，其中R1、X和Y如上述所定義d.使二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；e.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；f.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；g.分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；h.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7或其鹽其中X和Y如上所定義；i.使二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7或其藥學(xué)上可接受的鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)，形成活性中間體8，其中Q為從偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑形成的離去基團(tuán)，其中X和Y如上所定義j.使活性中間體8或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與式R3NHOR29的取代羥胺反應(yīng)，其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基，在有機(jī)堿存在下反應(yīng)得到式10的酰胺其中X和Y如上所定義；用還原劑還原式10的酰胺得到二環(huán)雜芳基甲醛11其中X和Y如上所定義，并分離二環(huán)雜芳基甲醛11。另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案提供了制備二環(huán)雜芳基甲醛11的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；該方法包括以下步驟a.使二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中X和Y如上所定義且R1為1-6個(gè)碳原子的烷基與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；b.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；c.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；d.分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；e.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7或其藥學(xué)上可接受的鹽其中X和Y如上所定義；f.使二環(huán)雜芳基-2-甲酸7或其鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)形成活性中間體8，其中Q為形成自偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑的離去基團(tuán)，X和Y如上所定義g.使活性中間體8或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與式R3NHOR29的取代羥胺其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基，在有機(jī)堿的存在下反應(yīng)得到式10的酰胺其中X、Y、R2和R3如上所定義；h.用還原劑還原式10的酰胺得到式11的二環(huán)雜芳基甲醛11其中X和Y如上所定義并分離式11的二環(huán)雜芳基甲醛。本發(fā)明還提供制備下式的二環(huán)雜芳基青霉烯-2-甲酸16、保護(hù)的酸、藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選堿金屬鹽的方法其中A和B其中之一表示H，另一個(gè)表示以下部分Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；R3為1-6個(gè)碳原子的烷基；R6為H、選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基、-CHR3OCOC1-C6的體內(nèi)可水解的酯或藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽；該方法包含以下步驟a.用亞硝化試劑將其中X和Y為上述所定義的式1的氨基酸亞硝基化，形成其中X和Y為上述所定義的式2的化合物b.將亞硝基化合物2與脫水劑反應(yīng)，并用無(wú)機(jī)堿中和，形成其中X和Y為上述所定義的式3的內(nèi)鎓鹽c.式3的內(nèi)鎓鹽與其中R1為1-6個(gè)碳原子的烷基的式HC≡CCO2R14的丙炔酸酯在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)，形成二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中R1、X和Y如上述所定義d.使其中X、Y和R1如上所定義的二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；e.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；f.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；g.分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；h.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義；i.使二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7或其藥學(xué)上可接受的鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)，形成式8的活性中間體反應(yīng)，其中Q為從偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑形成的離去基團(tuán)其中X和Y如上所定義j.使式8的活性中間體或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與式R3NHOR29的取代羥胺，其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基，在有機(jī)堿的存在下反應(yīng)得到式10的酰胺，其中X、Y、R2和R3如上所定義k.用還原劑還原式10的酰胺得到式11的二環(huán)雜芳基甲醛，其中X、Y、R2和R3如上所定義l.使二環(huán)雜芳基甲醛11與下式的溴-青霉烯13縮合，其中R6為體內(nèi)可水解的酯，選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基和CHR3OCOC1-C6或另外的芐基或?qū)ο趸S基保護(hù)基，在路易斯酸、醚合物和弱堿存在下，形成下式的羥醛14，其中X、Y和R6如上所定義m.將羥醛14與酰氯或酸酐，(R4)Cl或(R4)2O，或與四鹵甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反應(yīng)，形成中間體化合物15，其中R4為烷基SO2、芳基SO2、烷基CO或芳基CO；X1為Br、I或Cl；X、Y和R6如上述所定義；R5為X1或OR4；和n.通過(guò)還原消除方法將中間體化合物15轉(zhuǎn)化為下式的二環(huán)-雜芳基-青霉烯-2-甲酸16，其中R6為H，如果需要轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽或轉(zhuǎn)化為酯，其中R6為C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基和-CHR3OCOC1-C6并分離二環(huán)-雜芳基-青霉烯-2-甲酸16。本發(fā)明還包括制備具有式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸的方法，該方法包括酶解具有式6的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯，或選擇性地在二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5的混合物中產(chǎn)生式7二環(huán)-雜芳基-2-甲酸。例如，所得的式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸可通過(guò)以下反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成具式11的二環(huán)雜芳基甲醛使二環(huán)-雜芳基2-甲酸7或其反應(yīng)性衍生物與具有式R3NHOR29的胺(其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子烷基)或其反應(yīng)性衍生物反應(yīng)，得到式10的酰胺，并用還原劑還原式10的酰胺。具有式11的二環(huán)雜芳基甲醛可被轉(zhuǎn)化成具式16的化合物。具式16的化合物可從具式11的二環(huán)雜芳基甲醛以WO03/093279所述的方式制備。發(fā)明詳述如方案I所示，其中X、Y、R和n如上所述的氨基酸1(L，D或消旋體)在亞硝化試劑存在下被亞硝基化，亞硝化試劑包括亞硝酸鈉和鹽酸，得到1-亞硝基-氨基酸2，2再與脫水劑反應(yīng)，脫水劑包括但不局限于三氟醋酐，通過(guò)文獻(xiàn)所述方法(Ranganathan，D.；Shakti，B.“ANovelProlineDerivedMeso-IonicSynthon.”TetrahedronLetts.198324(10)；1067-1070)和后處理修飾，包括將反應(yīng)混合物中形成的三氟乙酰氯用無(wú)機(jī)堿的水溶液如碳酸氫鉀或碳酸鉀(等)或無(wú)水無(wú)機(jī)堿如粉狀碳酸鉀中和，然后用可以排除對(duì)色譜法需要的溶劑如二氯甲烷提取所需化合物，來(lái)制備內(nèi)鎓鹽3。用方法(Ranganathan，D.；Shakti，B.“ANovel脯氨酸DerivedMeso-IonicSynthon.”TetrahedronLetts.198324(10)；1067-1070)將內(nèi)鎓鹽3與丙炔酸酯4，其中R1為1-6個(gè)碳原子的烷基，如丙炔酸乙酯，優(yōu)選為甲基或乙基，在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)，非質(zhì)子溶劑包括取代的芳香族化合物(如氯苯、均三甲苯等)，取代的酰胺類(lèi)(如N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺等)，亞砜類(lèi)(如二甲亞砜等)和醚類(lèi)(如乙二醇的醚如1，2-二乙基、1，2-二甲基等)得到二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物，其中R1、X和Y如上述所定義。優(yōu)選的反應(yīng)溫度為約100-165℃。優(yōu)選的溶劑為乙二醇的醚(二乙基、二甲基等)取代的酰胺類(lèi)(N，N-二甲基甲酰胺)和取代的芳香族化合物如氯苯，在上述溶劑中酯的混合物中，以有利于所需的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6比例形成，范圍為約1.5∶1至約3∶1。特別優(yōu)選的溶劑包括二乙基乙二醇(1，2-二乙氧基乙烷，DEE)，或氯苯，其中在約120-125℃反應(yīng)8-12小時(shí)，形成二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5的混合物，其比率為約1.5∶1-2.5∶1，該比例有利于二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6，帶有很少的來(lái)自多聚物的污染。使二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5的混合物與水解酶接觸，二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6優(yōu)于二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5在合適的溶劑中可以被選擇性地水解，得到二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7，其中X和Y如上所定義。水解酶，包括脂肪酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶和酯酶。水解酶首先溶解在含水溶劑中，任選緩沖于優(yōu)選的pH范圍6.5-7.8。就酶活性而言，優(yōu)選的pH位于有效的pH范圍中，該范圍可促使所用的特定酶的活性狀態(tài)能夠水解所述酯。水解酶包括脂肪酶、酯酶、?；D(zhuǎn)移酶和蛋白酶。優(yōu)選的緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液、磷酸鉀緩沖液或其它pH在約7.25的緩沖液。酶濃度在含水溶劑中可變化，范圍為例如3mg-10mg/ml，典型值為6mg/ml?？扇芜x加入共溶劑。共溶劑包括乙腈和N，N-二甲基甲酰胺，優(yōu)選10％乙腈。乙腈作為共溶劑在酶反應(yīng)混合物中從0-30％測(cè)試其效果。乙腈促使酯混合物更好地分布于水性反應(yīng)體系中。結(jié)果顯示乙腈并不影響酶選擇性，如果濃度高于10％只輕微降低酶反應(yīng)速率。當(dāng)化學(xué)合成后粗酯混合物不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于酶反應(yīng)時(shí)，向反應(yīng)中添加10％乙腈(終濃度)促進(jìn)酯底物的均勻分布，對(duì)酶活性和選擇性沒(méi)有任何不利影響。自從使用了固定化酶制劑，反應(yīng)后酶的分離就簡(jiǎn)便了。有效pH范圍可為約4.0-10.0。但是，如果酶水解的pH達(dá)到5.0或更低，酶活性可被抑制并導(dǎo)致底物的不完全水解。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，添加堿特別是氫氧化鈉溶液或氫氧化銨等使pH保持在約7.0，優(yōu)選6.5-7.8的范圍。酶反應(yīng)時(shí)間從9-72小時(shí)變動(dòng)，取決于水解酶的類(lèi)型和反應(yīng)混合物中所用的底物濃度。底物的水解程度用HPLC監(jiān)測(cè)或通過(guò)監(jiān)測(cè)堿的消耗以保持反應(yīng)的pH在約7.0。所需的酯的水解程度不影響所需酸產(chǎn)物的異構(gòu)體純度，但是如果底物酯水解不完全，只能得到低產(chǎn)率的酸產(chǎn)物。從未水解的酯二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5純化二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7可以簡(jiǎn)便地通過(guò)有機(jī)溶劑萃取未水解的酯進(jìn)行。合適的有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸叔丁酯、乙醚、異丙醚或任何其它未水解的酯可溶于其中的水互溶性有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。二環(huán)雜芳基-2-甲酸7可通過(guò)凍干或蒸發(fā)分離的水相分離。二環(huán)雜芳基-2-甲酸7可任選在將分離的水相pH用無(wú)機(jī)酸優(yōu)選鹽酸調(diào)節(jié)至約2.0-約3.0后分離。方案I方案I(續(xù))如方案I所進(jìn)一步描述，將二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7的任選的其堿金屬鹽(鈉、鉀、鋰等)轉(zhuǎn)換成活性中間體8通過(guò)幾種方法完成。優(yōu)選的，使二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與酰鹵試劑SO2Q2或QCOCOQ，其中Q為氯或溴，例如乙二酰氯、亞硫酰氯和亞硫酰溴等，在合適的非質(zhì)子溶劑(例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲苯、二甲氧基乙烷等)優(yōu)選在N，N-二烷基酰胺催化劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下，在合適的溫度下(-10-30℃)反應(yīng)，得到活性中間體8，其中Q為氯或溴。這樣產(chǎn)生活性中間體8與羥胺R3NHOR29反應(yīng)，其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基[即R3NHOR2，其中R3、R2＝Me，即O，N-二甲基羥胺等]，在合適的溶劑中，例如二氯甲烷、甲苯、二甲氧基乙烷等，在有機(jī)堿的存在下例如三乙胺、N，N-二異丙基乙胺、吡啶等、在溫度范圍為-10-50℃下，反應(yīng)得到酰胺10，其中X、Y、R2和R3如上所定義。優(yōu)選的方法包括產(chǎn)生活性中間體8其中Q為Cl，與乙二酰氯在二氯甲烷中，在約0-25℃，在催化量的N，N-二甲基甲酰胺存在下，并接著使活性中間體8其中Q為Cl與取代的羥胺鹽酸鹽9在吡啶或N，N-二異丙基乙胺的存在下反應(yīng)，反應(yīng)溫度范圍為約0-25℃，得到酰胺10，其中X、Y、R2和R3如上所定義?；蛘撸钚灾虚g體8其中Q為Cl或Br可在有機(jī)堿例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀等存在下，與取代的羥胺鹽酸鹽9在兩相系統(tǒng)中例如二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯等和水中反應(yīng)。特別優(yōu)選的形成酰胺10方法，該酰胺中X、Y、R2和R3如上所定義的方法，為使用Schotten-Baumen條件，其中2-甲酸的活性中間體8的溶液其中Q為Cl，在二氯甲烷中(產(chǎn)生自亞硫酰氯/N，N-二甲基甲酰胺)與取代的羥胺9的水溶液在無(wú)機(jī)堿碳酸鉀的存在下，在溫度范圍為約10-20℃下反應(yīng)。特別是，N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺優(yōu)選由Schotten-Baumen條件產(chǎn)生，分離后不需進(jìn)一步純化。使二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7，其包括5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸，與取代的羥胺，9(方案I)偶聯(lián)，來(lái)合成酰胺10其中X、Y、R2和R3如上所定義，可用幾種方法進(jìn)行。在一個(gè)典型的偶聯(lián)方法中，所述二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7和取代的羥胺9與合適的偶聯(lián)試劑反應(yīng)。合適的偶聯(lián)試劑將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換成活性中間體8其中Q為得自偶聯(lián)試劑的離去基團(tuán)，致使酰胺連鍵在羧酸和所述取代的羥胺之間形成。合適的偶聯(lián)試劑的例子包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽-羥基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羥基苯并三唑二環(huán)己基碳二亞胺/HBT、二環(huán)己基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷?；杌铩⒈交攘姿狨ゼ舆溥?、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP-試劑)、N，N’雙[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(phosphorodiamidicchloride)(BOBCl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽、溴-三-吡咯烷-1-基(pyrrolidino)-鏻六氟磷酸鹽和苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸鹽。該偶聯(lián)反應(yīng)分幾步完成，或在縮短的過(guò)程中完成。典型的偶聯(lián)反應(yīng)通常在惰性溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選非質(zhì)子溶劑，在溫度為約-20℃至約50℃進(jìn)行約1-48小時(shí)，任選在季胺存在下進(jìn)行，所述季胺如N，N-二異丙基乙胺N-甲基嗎啉、N-甲基吡咯烷、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2，6-二-叔-丁基-4-甲基吡啶、吡啶等。合適的溶劑包括乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二氧六環(huán)或氯仿或其混合物。在一個(gè)多步偶聯(lián)反應(yīng)的實(shí)例中，二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與偶聯(lián)試劑反應(yīng)形成活性中間體8，可任選被分離，其中Q為離去基團(tuán)。在第二步中，活性中間體8然后與取代的羥胺9反應(yīng)得到酰胺10。又一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)的實(shí)例將酸轉(zhuǎn)化為活性中間體包括亞硫酰氯、亞硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟，形成酰氟(Q為F)或氯甲酸烷基酯例如氯甲酸異丁基酯或氯甲酸異丙烯基酯(在季胺存在下)，形成甲酸的混合酸酐。另一個(gè)制備混合的酸酐的偶聯(lián)試劑的實(shí)例為2，4，6-三氯苯甲酰氯[Inanagaetal.Bull.Chem.Soc.Jpn.52，1989(1979)]。偶聯(lián)反應(yīng)通常在惰性溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選非質(zhì)子溶劑，在溫度為約-20℃至約30℃進(jìn)行約1-24小時(shí)，任選在季胺存在下進(jìn)行，所述季胺如N，N-二異丙基乙胺N-甲基嗎啉、N-甲基吡咯烷、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、2，6-二-叔-丁基-4-甲基吡啶、吡啶等。合適的溶劑包括乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二氧六環(huán)或氯仿或其混合物。活性中間體8偶聯(lián)的第二步已在上文描述，其中活性中間體從羧酸鹽制備。在第二步驟中，當(dāng)活性中間體為混合的酸酐時(shí)，如上文所述，將合適溶劑中的胺加入到混合酸酐溶液中，在合適的堿存在下，如上文所述，在用于活化的溫度下，并將所述溫度逐漸調(diào)至約30℃。將所述胺在用于活化的溫度下加入到溶液中，并將溫度調(diào)至約30℃。反應(yīng)進(jìn)行約1-48h。其它偶聯(lián)反應(yīng)的實(shí)例將酸轉(zhuǎn)化為活性中間體，任選分離的，例如活性酯，包括三氟醋酸五氟苯基酯，其提供活化的酚酯。特別是，簡(jiǎn)單酯例如甲基、乙基和丙基酯，通過(guò)使5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸與相應(yīng)的醇用常規(guī)方法產(chǎn)生，也可用作活性中間體。提供活性中間體的偶聯(lián)試劑如?；B氮化物還包括二苯基磷?；B氮化物。提供活性中間體的偶聯(lián)試劑如?；杌锇ǘ一柞；杌?。偶聯(lián)反應(yīng)一般在約在-30℃和60℃之間進(jìn)行，經(jīng)常在0℃或以下。在第二步，將取代的羥胺加入到活性中間體的溶液中，在用于活化的溫度下，并將溫度緩慢調(diào)至約30℃。反應(yīng)時(shí)間為1-96小時(shí)。其它的偶聯(lián)試劑如上文所定義。還原所述酰胺10其中X、Y、R2和R3如上所定義得到二環(huán)雜芳基甲醛11，可用還原劑進(jìn)行，所述還原劑包括過(guò)量的氫化試劑，例如氫化鋁鋰和氫化二異丁基鋁[DIBAL(H)]，在溶劑中例如四氫呋喃、乙醚和甲苯，溫度在約-10-25℃。優(yōu)選使用氫化鋁鋰在四氫呋喃中，在約0-25℃范圍。描述了特別優(yōu)選的方法，其中還原試劑為氫化鋁鋰，反應(yīng)溶劑為四氫呋喃。反應(yīng)溫度在0-5℃持續(xù)約18小時(shí)。為減少副產(chǎn)物的量，醇12，其產(chǎn)生自用水猝滅反應(yīng)混合物，優(yōu)選向反應(yīng)混合物中加入四氫呋喃和水的溶液來(lái)猝滅反應(yīng)。優(yōu)選用二氯甲烷的酸提取。特別優(yōu)選的是對(duì)二環(huán)雜芳基甲醛11的純化，經(jīng)水可溶性亞硫酸氫鈉復(fù)合物，其特別有效地除去殘留醇12。如方案II所進(jìn)一步描述，二環(huán)-雜芳基青霉烯-2-甲酸16，保護(hù)的酸或其藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽，其中A和B之一表示氫，另一個(gè)表示下式部分其中X和Y如上所定義，可通過(guò)使如方案I所述制備的二環(huán)雜芳基甲醛11與6-溴-青霉烯13縮合，該化合物具有保護(hù)的酸其中R6為體內(nèi)可水解的酯，選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基和CHR3OCOC1-C6，或者芐基或?qū)ο趸S基保護(hù)基，在路易斯酸存在下，優(yōu)選無(wú)水鹵(Br或Cl)化鎂更優(yōu)選無(wú)水MgBr2或MgBr2醚合物和弱堿例如三乙胺、二甲氨基吡啶(DMAP)或二異丙基乙基胺存在下，在低溫優(yōu)選在約-20℃至-40℃反應(yīng)，得到羥醛14，該化合物可用酰氯或酸酐優(yōu)選官能化為乙酸酯、三氟甲磺酸酯或甲苯磺酸酯，或任選與四鹵甲烷和三苯基膦與室溫在合適的有機(jī)溶劑優(yōu)選CH2Cl2中反應(yīng)轉(zhuǎn)化成鹵素衍生物得到中間體15。使羥醛14與酰氯或酸酐反應(yīng)，(R4)Cl或(R4)O，或與四鹵甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反應(yīng)，形成中間體化合物15其中R4為烷基SO2、烷基CO或芳基CO；X1為Br、I或Cl；A和R如上所定義；R6為X1或OR4。中間體15可被轉(zhuǎn)化成所需的二環(huán)-雜芳基-青霉烯-2-甲酸16被保護(hù)的酸或其藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽，方法為用金屬例如活化的鋅和磷酸鹽緩沖液在適度的溫度下優(yōu)選約20℃-35℃在pH約6.5-8.0條件下進(jìn)行還原消除；或經(jīng)催化劑優(yōu)選鈀碳?xì)浠?。?yīng)該注意，要進(jìn)行還原消除步驟以使羧基脫保護(hù)發(fā)生。如果羧基氧上的保護(hù)基為對(duì)硝基芐基取代基，則還原消除和脫保護(hù)可一步完成。但如果保護(hù)基不是對(duì)硝基芐基取代基，根據(jù)保護(hù)基的性質(zhì)可進(jìn)行兩步反應(yīng)。產(chǎn)物可分離為游離酸或藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽。以上所述兩步反應(yīng)可不分離中間體15使整個(gè)反應(yīng)在一步完成。此外，所述游離堿或堿金屬鹽可轉(zhuǎn)化成酯，其中R6為C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基和-CHR3OCOC1-C6。方案II本公開(kāi)中用到了許多術(shù)語(yǔ)，下面提供了一些定義。此處所述的芳基是指6-12個(gè)碳原子芳烴部分。此處所用的術(shù)語(yǔ)C5-C6環(huán)烷基是指具有5-6個(gè)碳原子的飽和單環(huán)。示例性環(huán)烷基包括環(huán)戊基或環(huán)己基。此處所用的術(shù)語(yǔ)含水溶劑指水。此處所用的術(shù)語(yǔ)″反應(yīng)″是指將化學(xué)反應(yīng)物放在一起在可以引起化學(xué)反應(yīng)的條件下發(fā)生反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)″離去基團(tuán)″一般指容易被親核試劑取代的基團(tuán)，如胺類(lèi)。這類(lèi)離去基團(tuán)在本領(lǐng)域是已知的。該離去基團(tuán)的實(shí)例包括但不局限于，N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯并三唑、氟、氯、溴、1，1′-羰二咪唑等。如此處所用，接觸是用來(lái)表示在水性介質(zhì)中將酯反應(yīng)物放在一起，在水解酶的存在下使酶解反應(yīng)發(fā)生。如此處所用，術(shù)語(yǔ)可水解酯表示任何通常用于保護(hù)羧酸不被此處所述的水解酶水解的酯。如此處所用，有效的水解酶指可從酯反應(yīng)物或酯反應(yīng)物的混合物產(chǎn)生可檢測(cè)量的甲酸產(chǎn)物的酶。有效的水解酶選自脂肪酶、酯酶、?；D(zhuǎn)移酶或蛋白酶。特定的實(shí)例包括南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶B、曲霉屬(Aspergillus)?；D(zhuǎn)移酶、米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶M、褶皺假絲酵母(C.rugosa)脂肪酶和來(lái)自假單胞菌種(Pseudomonassp.)的脂肪酶。如此處所用，有效量的有效水解酶是指酶的量可從酯底物產(chǎn)生可檢測(cè)量的酸產(chǎn)物。一般而言，有效量的范圍在約3mg-10mg/ml，優(yōu)選約6mg/ml。如此處所用，酶反應(yīng)的有效pH范圍為所給的酶對(duì)酯底物表現(xiàn)出催化活性的pH。該pH范圍可變化，并取決于所用的特定酶。例如，對(duì)脂肪酶而言，有效pH范圍為約5.0-10.0。類(lèi)似的，對(duì)蛋白酶而言，有效范圍為約4.0-10.0，對(duì)酰基轉(zhuǎn)移酶而言，有效pH范圍為約5.0-10.0。優(yōu)選的pH范圍為約6.5-約7.8。也優(yōu)選的pH范圍為約7.2-7.5。更優(yōu)選的pH范圍為約7.0。如此處所用，酶反應(yīng)的有效溫度為所給的酶對(duì)所給的底物表現(xiàn)出活性的溫度。例如，溫度通常為約20℃-65℃，取決于所用的酶。優(yōu)選的有效溫度為約37℃。如此處所用，酶選擇性指一個(gè)反應(yīng)，其中一個(gè)官能團(tuán)(如酯基團(tuán))可被取代在分子上的不同位置(位置異構(gòu)體)，而反應(yīng)僅在一個(gè)位置選擇性發(fā)生。如此處所用，酶水解有效時(shí)間為約9-72小時(shí)。此處所用的本發(fā)明的方法制備的堿性化合物的藥學(xué)上可接受的鹽是由如下有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸得到的乳酸、檸檬酸、醋酸、酒石酸、反丁烯二酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、丙二酸、氫氯酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸以及類(lèi)似于已知的可接受的酸。有羧酸存在時(shí)，本發(fā)明的方法制備的化合物的鹽是與如下的堿形成的堿金屬(Na、K、Li)或堿土金屬(Ca或Mg)。此處所用的無(wú)機(jī)酸指的是硫酸、鹽酸等。將在下列實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)地描述，這些實(shí)施例以說(shuō)明的方式給出而不是為了限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)方法通用酶條件5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物在1ml反應(yīng)中測(cè)試篩選酶活，反應(yīng)由高壓液相色譜分析(HPLC)。典型的底物濃度范圍為1mg-20mg/ml，溶劑為0.1M磷酸鉀緩沖液pH7.25，該溶劑含有5-10mg酶或如果該酶為液體為10μl。將反應(yīng)物于37℃孵育過(guò)夜。當(dāng)酯被水解時(shí)，通過(guò)一滴初始pH的反應(yīng)物到約6.0來(lái)指示。HPLC條件在在WatersHPLC(AllianceHT2795)上，用WatersTMSymmetryTMC18柱3.5m；4.6×75mm)和以下的溶劑梯度分析樣品。溶劑A5％乙腈，10mM乙酸銨水溶液；溶劑B80％乙腈，10mM乙酸銨水溶液。梯度條件為；90％A10％B-60％A40％B在10分鐘內(nèi)；100％B在15min內(nèi)；繼續(xù)用100％B達(dá)20min，轉(zhuǎn)回90％A10％B?；衔镌?15或226nm檢測(cè)。流速為1mL/min。不同的待測(cè)酶列于表1。待測(cè)酶中，來(lái)自曲霉種(Aspergillussp.)的酰基轉(zhuǎn)移酶、來(lái)自假單胞菌種(Pseudomonassp.)和南極假絲酵母(Candidaantarctica)的脂肪酶顯示出選擇性水解所需酯形成所需的酸異構(gòu)體。來(lái)自豬肝臟的酯酶顯示出對(duì)兩異構(gòu)體的非選擇性水解。表1.針對(duì)5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯*和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯**的酯混合物的酶的列表實(shí)施例1用真菌酰基轉(zhuǎn)移酶的酯水解用酯底物混合物測(cè)試將N-乙酰氨基酸衍生物水解為相應(yīng)的氨基酸的?；D(zhuǎn)移酶。反應(yīng)混合物含有約8.5mg酰基轉(zhuǎn)移酶(約255?；D(zhuǎn)移酶單位)，0.15mM氯化鈷的1ml磷酸鉀緩沖液pH約7.0。向其中加入約10mg的底物酯混合物，并于37℃孵育。酶反應(yīng)過(guò)程通過(guò)用HPLC分析少量樣品來(lái)監(jiān)測(cè)。所需的酯異構(gòu)體5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯被酶水解，而5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯不被水解。實(shí)施例2用假單胞菌種的脂肪酶的水解根據(jù)上述通用酶條件，1.50g5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物用約100mg的假單胞菌種脂肪酶(L-6)在50ml0.1M磷酸鉀緩沖液pH7.25中水解，向其中加入0.5ml乙腈以使底物在緩沖液中均勻分布。37℃混合反應(yīng)物。酶解后釋放的酸降低了反應(yīng)pH。定期檢查反應(yīng)的pH，如果其為7.0或更低，則加入1N氫氧化鈉將pH調(diào)至約7.30。這樣，pH保持高于7.0。孵育72h后，所需的酯水解達(dá)到約70％，根據(jù)HPLC分析。經(jīng)0.2μ膜過(guò)濾酶反應(yīng)物，移去粗酶制品中的不溶物質(zhì)。在pH7.0，用乙酸乙酯(1∶1)萃取酶反應(yīng)物兩次，移去所有剩余酯，只將5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸留在水相。凍干含酸產(chǎn)物的水相，將回收的固體溶于甲醇。分離并棄去不溶于甲醇的鹽。蒸發(fā)含5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸(灰黃色)的甲醇，回收約0.5g的5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸。LC-MS和NMR的數(shù)據(jù)一致表明僅存在所需的酸，異構(gòu)體純度為100％。HPLC檢測(cè)的酸純度為97％。HPLC條件為ProdigyODS3柱4.6×150mm。溶劑A0.02％三氟乙酸(TFA)的水溶液。溶劑B0.02％TFA的乙腈溶液。所用的梯度為在0時(shí)90％A和10％B，梯度在20min達(dá)到，5％A和95％B并持續(xù)至25min。實(shí)施例3脂肪酶對(duì)酯異構(gòu)體的非選擇性水解在某些條件下，例如水解酶過(guò)量和底物濃度低以及長(zhǎng)時(shí)間孵育反應(yīng)物會(huì)導(dǎo)致兩種酯異構(gòu)體被同樣的脂肪酶以非選擇性方式水解，而所述脂肪酶在另外的條件下會(huì)顯示出對(duì)所需的酯異構(gòu)體的非常好的水解選擇性。這類(lèi)南極假絲酵母脂肪酶B的固定化形式的非選擇性水解條件的實(shí)例為23g(10000U/g)的酶與2.5g的酯混合物在1LpH7.25的緩沖液中一起孵育，37℃持續(xù)66小時(shí)。就固定化酶制劑而言，活性單位定義為如下的酯合成單位。每分鐘可由丙醇和月桂酸合成1μmole的月桂酸丙酯的酶量為1個(gè)單位。類(lèi)似的，就南極假絲酵母脂肪酶B的可溶形式而言，非選擇性酯底物的水解條件是，5g酶(～120000U/g)2.5g酯混合物在1LpH7.25的磷酸鹽緩沖液中，在37℃持續(xù)18h。酶可溶形式的活性單位定義為25℃，每分鐘可由甘油三丁酸酯釋放1μmol丁酸的酶量。在上述條件下，兩種南極假絲酵母脂肪酶B制劑顯示出對(duì)兩種酯異構(gòu)體5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的非選擇性水解。實(shí)施例4用南極假絲酵母脂肪酶B發(fā)展出的方法用南極假絲酵母脂肪酶B和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的酯混合物在pH7.25的緩沖液中的實(shí)驗(yàn)顯示出該脂肪酶可選擇性水解所需的酯異構(gòu)體。典型的酶水解反應(yīng)物含有6g/L酶，底物酯混合物范圍為10-133g/L，pH用pHstat和3N氫氧化銨控制。如果pH失控，從酶反應(yīng)釋放的酸會(huì)降低pH，如果達(dá)到5.0或更低，則酶活性可被抑制并導(dǎo)致底物不完全水解，使酸產(chǎn)率降低。為了獲得對(duì)所需酯異構(gòu)體的完全水解，pH保持在約7.0。實(shí)施例5南極假絲酵母脂肪酶B與5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯的混合物在133g/L的反應(yīng)為試驗(yàn)大規(guī)模轉(zhuǎn)化的加工條件，使用了來(lái)自它們的合成反應(yīng)的未經(jīng)進(jìn)一步純化的酯底物的混合物。在終體積為30ml的、含有10％乙腈、4.05g的5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-2-甲酸乙酯和5，6-二氫-4H-吡咯并(1，2-b)吡唑-3-甲酸乙酯混合物和0.2g脂肪酶0.1MTris-HCl緩沖液中，37℃孵育Novozym435，pH控制在7.20-7.50。用氫氧化銨(3N)來(lái)控制pH，利用帶自動(dòng)控制的pH-stat將堿加入以保持pH。在帶有pH滴定計(jì)(Brinkmann，model718Titrino)夾套玻璃反應(yīng)器中建立反應(yīng)。氫氧化銨消耗停止后，表示不再?gòu)孽ニ庑纬伤?，通過(guò)溶劑萃取停止反應(yīng)。用等體積(～30ml)的乙酸乙酯在約中性pH下萃取反應(yīng)混合物三次，直到水相澄清。乙酸乙酯萃取除去了剩余所需酯同時(shí)除去了其它來(lái)自反應(yīng)的有色物質(zhì)。用濃鹽酸將水相的pH降至～3.0，羧酸產(chǎn)物開(kāi)始沉淀。再加入鹽酸直到pH達(dá)到～2.0，并繼續(xù)攪拌。于4℃將玻璃反應(yīng)器保溫1h。將酸性沉淀經(jīng)中號(hào)濾器過(guò)濾(Buchnerfunnel)，并風(fēng)干。使用上述條件的特定實(shí)施例示于表2。表2.酯法酯水解條件和酸產(chǎn)物的產(chǎn)率<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="777">條目粗酯混合物制劑溶劑粗底物濃度(g/L)總反應(yīng)體積(0.1MTris-HClpH7.3)反應(yīng)時(shí)間(12h內(nèi)完全)回收的酸12DMF1DEE24.04g(133g/L)4.05g(133g/L)30mL30mL19h17h0.962g1.33g</table></tables>1.N，N-二甲基甲酰胺(DMF)2.1，2-二乙氧基乙烷(DEE)化學(xué)分析顯示所得酸(表1條目2)純度為99.8％(HPLC法)，含11％水分和0.387％灰分。HNMR、LC-MS和IR數(shù)據(jù)證實(shí)所得物質(zhì)為預(yù)期從酶反應(yīng)得到的所需酸。實(shí)施例6從5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸合成N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺將5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酸，3.8g，25mmol)在40ml的2M乙二酰氯的二氯甲烷溶液中打漿，并向漿液中加入幾滴二甲基甲酰胺。所得混合物在氮?dú)庀掠?5-22℃攪拌10-12小時(shí)。所得的酰氯的深色溶液蒸發(fā)得到干殘留物。將殘留物溶于甲苯(50ml)并再次蒸發(fā)得到粗酰氯。向攪拌的二氯甲烷(100ml)中的粗酰氯和N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(2.7g，27.5mmol)的混合物中，于0-5℃滴加吡啶(4.7g，3.2ml，60mmol)，在氮?dú)庀虏⒈３譁囟燃s0-5℃。使所得的攪拌混合物在4小時(shí)內(nèi)溫至15-20℃，反應(yīng)經(jīng)HPLC監(jiān)測(cè)完全程度(ProdigyODS34.6×150mm柱，用10min梯度從90∶10至10∶90水/含0.02％三氟乙酸的乙腈，于254nm檢測(cè)UV。酰胺的保留時(shí)間為1.1min)。用水(50ml)洗滌混合物，濃縮并在短硅膠柱上用氯仿洗脫純化，蒸發(fā)揮發(fā)物后，得到N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺，4.1g，86％)的淺棕色結(jié)晶固體，m.p.45-50℃，經(jīng)NMR、質(zhì)譜和元素分析鑒定。實(shí)施例75，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛向N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺，2.5g，12.8mmol)的在冰/水浴中冷至0-5℃的四氫呋喃(35mL)溶液中，分幾部分在7小時(shí)內(nèi)加入氫化鋁鋰顆粒(0.211g，5.53mmol)。使反應(yīng)混合物升至室溫過(guò)夜(16小時(shí))。薄層色譜[TLCEMScience硅膠60F-254板，溶劑(20∶1)CH2Cl2∶CH3OH；Rf0.66(5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛)，0.38(N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺)顯示少量的N-甲氧基-N-甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲酰胺。使反應(yīng)混合物在冰/水浴中冷至0-5℃，加入另一部分氫化鋁鋰(64mg，1.68mmol)。于0-5℃再過(guò)3小時(shí)，滴加飽和硫酸鈉溶液(1.0mL)猝滅反應(yīng)。15分鐘后，形成淺灰色的凝膠，加入四氫呋喃(50mL)和硫酸鎂(2g)。攪拌混合物10分鐘后過(guò)濾。減壓濃縮濾液得到1.6g澄清無(wú)色油狀物。向該無(wú)色油狀物中加入二氯甲烷(25mL)和1.5N鹽酸(5mL)。將有機(jī)層減壓濃縮并用油泵抽真空干燥，得到1.31g(77％產(chǎn)率)的5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛的白色固體，1HNMR(CDCl3)2.67-2.75(m，2H)，2.95(t，2H，J＝7.3Hz)，4.22(t，2H，J＝7.3Hz)，6.52(s，1H)，9.89(s，1H)。權(quán)利要求1.一種制備下式的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，所述方法包括酶解二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6其中X、Y和R如上所定義產(chǎn)生下式的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義，并分離二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7。2.一種制備二環(huán)雜芳基-2-甲酸7的方法，其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，所述方法包括酶解下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5的混合物中的二環(huán)雜芳基-2-甲酸酯6和其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，選擇性產(chǎn)生下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義所述方法包括以下步驟a)使其中X、Y和R如上所定義的二環(huán)雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5的混合物與有效量的有效水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；b)通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；c)通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；d)分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；e)分離作為羧酸或其藥學(xué)上可接受的鹽的下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義。3.權(quán)利要求2的方法，其中有效水解酶選自脂肪酶、酰基轉(zhuǎn)移酶和蛋白酶。4.權(quán)利要求3的方法，其中有效水解酶選自南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶B、曲霉屬(Aspergillus)?；D(zhuǎn)移酶、米曲霉(Aspergillusoryzae)蛋白酶M、褶皺假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶和來(lái)自假單胞菌種(Pseudomonassp)的脂肪酶。5.權(quán)利要求2的方法，其中有效量的有效水解酶在約3mg-10mg/ml的范圍內(nèi)。6.權(quán)利要求5的方法，其中有效量的有效水解酶為約6mg/ml。7.權(quán)利要求2的方法，還包括約20-65℃的有效溫度。8.權(quán)利要求7的方法，其中有效溫度為約37℃。9.權(quán)利要求2的方法，其中有效pH范圍為約4.0-約10.0。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述反應(yīng)的有效pH通過(guò)添加堿保持在約6.5-7.8。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述反應(yīng)的有效pH通過(guò)添加堿保持在約7.0。12.權(quán)利要求2的方法，其中所述任選的緩沖液選自磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述緩沖液為T(mén)ris-HCl。14.權(quán)利要求2的方法，其中所述任選的共溶劑選自乙腈或N，N-二甲基甲酰胺。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述共溶劑為乙腈。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述共溶劑乙腈的濃度為約10％。17.權(quán)利要求11的方法，其中所述堿選自氫氧化鈉或氫氧化銨。18.權(quán)利要求2的方法，其中所述pH用鹽酸調(diào)至約2.0-約3.0。19.權(quán)利要求2的方法，其中所述有效時(shí)間為約9-72小時(shí)。20.一種制備下式的二環(huán)雜芳基甲醛11的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；該方法包括以下步驟a.用亞硝化試劑亞硝化下式的氨基酸1其中X和Y如上所定義；形成式2的亞硝基化合物其中X和Y如上所定義；b.使所述亞硝基化合物2與脫水劑反應(yīng)，并用無(wú)機(jī)堿中和形成式3的內(nèi)鎓鹽，其中X和Y如上所定義；c.使式3的內(nèi)鎓鹽與式4的丙炔酸酯反應(yīng)HC≡CCO2R14其中R1為1-6個(gè)碳原子的烷基，在非質(zhì)子溶劑中形成二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物其中X、Y和R1如上所定義；d.使其中X、Y和R1如上所定義的二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中并任選在共溶劑存在下接觸；e.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；f.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；g.分離水性溶劑并任選用無(wú)機(jī)酸調(diào)節(jié)pH至少至約2.0-約3.0；h.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義；i.使其中X和Y如上所定義的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7或其鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)，形成活性中間體8，其中Q為從偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑形成的離去基團(tuán)其中X、Y和Q如上所定義；j.使活性中間體8或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羥胺在有機(jī)堿的存在下反應(yīng)，得到式10的酰胺其中X、Y、R2和R3如上所定義；k.用還原劑還原式10的酰胺得到二環(huán)雜芳基甲醛11其中X和Y如上所定義，并分離二環(huán)雜芳基甲醛11。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述亞硝化試劑為亞硝酸鈉的鹽酸溶液。22.權(quán)利要求20的方法，其中R1為甲基或乙基。23.權(quán)利要求20的方法，其中所述脫水劑三氟乙酸酐。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述非質(zhì)子溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、氯苯或1，2-二乙氧基乙烷，溫度為約100-165℃。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述非質(zhì)子溶劑為1，2-二乙氧基乙烷或氯苯，在溫度為約120-125℃形成二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物，比例范圍為約1∶1.5-約1∶2.5。26.權(quán)利要求20的方法，其中所述酰鹵試劑為SO2Q2或QCOCOQ，其中Q為氯或溴。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述酰鹵試劑選自亞硫酰溴、亞硫酰氯和乙二酰氯。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述酰鹵試劑為乙二酰氯。29.權(quán)利要求20的方法，其中所述偶聯(lián)試劑選自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽-羥基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羥基苯并三唑二環(huán)己基碳二亞胺/HBT、二環(huán)己基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷酰基氰化物、苯基二氯磷酸酯加咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP-試劑)、N，N’雙[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(BOBCl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽、溴-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸鹽、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸鹽、亞硫酰氯、亞硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟、氯甲酸異丁酯、氯甲酸異丙烯基酯、三氟醋酸五氟苯基酯、二苯基磷?；B氮化物和二乙基磷?；杌?。30.權(quán)利要求20的方法，其中所述有機(jī)堿選自三乙胺、N，N-二異丙基乙胺和吡啶。31.權(quán)利要求20的方法，其中所述取代的羥胺是在Schotten-Baumen條件下反應(yīng)。32.權(quán)利要求20的方法，其中所述還原劑為氫化物試劑。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述氫化物試劑選自氫化鋁鋰和氫化二異丁基鋁[DIBAL(H)]。34.權(quán)利要求20的方法，其中X為-CH2-。35.由權(quán)利要求20的方法制備的化合物5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛。36.權(quán)利要求20的方法，其中所述有效時(shí)間為約9-72小時(shí)。37.一種制備二環(huán)雜芳基甲醛11的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；該方法包括以下步驟a.使二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物其中X、Y和R1如上所定義，與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)反應(yīng)有效的時(shí)間，任選在緩沖液中，并任選在共溶劑存在下反應(yīng)；b.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；c.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；d.分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；e.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義；f.使所述二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7或其鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)形成活性中間體8，其中Q為從偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑形成的離去基團(tuán)其中X和Y如上所定義；g.使活性中間體8或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羥胺在有機(jī)堿的存在下反應(yīng)，得到式10的酰胺其中X、Y、R2和R3如上所定義；h.用還原劑還原式10的酰胺得到式11的二環(huán)雜芳基甲醛其中X和Y如上所定義，并分離式11的二環(huán)雜芳基甲醛。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述酰鹵試劑為SO2Q2或QCOCOQ，其中Q為氯或溴。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述酰鹵試劑選自亞硫酰溴、亞硫酰氯和乙二酰氯。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述酰鹵試劑為乙二酰氯。41.權(quán)利要求37的方法，其中所述偶聯(lián)試劑選自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽-羥基苯并三唑(DEC/HBT)、羰二咪唑、羰二咪唑/羥基苯并三唑二環(huán)己基碳二亞胺/HBT、二環(huán)己基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)、碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓、二苯基氧膦基氯(DPPCl)、丙膦酸酐(丙烷膦酸酸酐、PAA)、二乙基磷?；杌?、苯基二氯磷酸酯加咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP-試劑)、N，N’雙[2-氧代-3-噁唑烷基]二氨基磷酰氯(BOBCl)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽、溴-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸鹽、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-1-基-鏻六氟磷酸鹽、亞硫酰氯、亞硫酰溴、乙二酰氯、氰尿酰氟、氯甲酸異丁酯、氯甲酸異丙烯基酯、三氟醋酸五氟苯基酯、二苯基磷?；B氮化物和二乙基磷?；杌?。42.權(quán)利要求37的方法，其中所述有機(jī)堿選自三乙胺、N，N-二異丙基乙胺和吡啶。43.權(quán)利要求37的方法，其中所述取代的羥胺是在Schotten-Baumen條件下反應(yīng)。44.權(quán)利要求37的方法，其中所述還原劑為氫化物試劑。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述氫化物試劑選自氫化鋁鋰和氫化二異丁基鋁[DIBAL(H)]。46.權(quán)利要求37的方法，其中X為-CH2-。47.由權(quán)利要求37的方法制備的化合物5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-2-甲醛。48.權(quán)利要求37的方法，其中所述有效時(shí)間為約9-72小時(shí)。49.一種制備下式的二環(huán)雜芳基青霉烯-2-甲酸16、保護(hù)的酸、藥學(xué)上可接受的鹽或優(yōu)選的堿金屬鹽的方法其中A和B之一表示氫，另一個(gè)表示下式部分Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；R3為1-6個(gè)碳原子的烷基；R6為H、選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基、-CHR3OCOC1-C6的體內(nèi)可水解的酯或藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選堿金屬鹽；該方法包括以下步驟a.用亞硝化試劑亞硝化下式的氨基酸1，其中X和Y如上所定義；形成式2的亞硝基化合物其中X和Y如上所定義；b.使所述亞硝基化合物2與脫水劑反應(yīng)，并用無(wú)機(jī)堿中和形成式3的內(nèi)鎓鹽，其中X和Y如上所定義；c.使式3的內(nèi)鎓鹽與式4的丙炔酸酯反應(yīng)HC≡CCO2R14其中R1為1-6個(gè)碳原子的烷基，在非質(zhì)子溶劑中形成二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物其中X、Y和R1如上所定義；d.使二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5和二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6的混合物與有效量的水解酶在含水溶劑中在有效的pH范圍內(nèi)接觸有效的時(shí)間，任選在緩沖液中，并任選在共溶劑存在下接觸；e.通過(guò)添加堿使pH保持在約6.5-約7.8；f.通過(guò)有機(jī)溶劑萃取除去二環(huán)雜芳基-3-甲酸酯5；g.分離水性溶劑并任選調(diào)節(jié)pH至約2.0-約3.0；h.分離下式的二環(huán)雜芳基-2-甲酸7其中X和Y如上所定義；i.使二環(huán)雜芳基-2-甲酸7或其鹽與酰鹵試劑或偶聯(lián)試劑反應(yīng)，形成式8的活性中間體，其中Q為從偶聯(lián)試劑或酰鹵試劑形成的離去基團(tuán)，其中X和Y如上所定義；使活性中間體8或二環(huán)-雜芳基-2-甲酸7與其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子的烷基的式R3NHOR29的取代羥胺在有機(jī)堿的存在下反應(yīng)得到式10的酰胺其中X、Y、R2和R3如上所定義；j.用還原劑還原式10的酰胺得到式11的二環(huán)雜芳基甲醛其中X和Y如上所定義；k.將二環(huán)雜芳基甲醛11與下式的溴-青霉烯13縮合具有被保護(hù)的酸的R6，其中R6為選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基、和-CHR3OCOC1-C6或另外的芐基或?qū)ο趸S基保護(hù)基團(tuán)的體內(nèi)可水解的酯；在路易斯酸、醚合物和弱堿存在下，形成下式的羥醛14，其中X、Y和R6如上述所定義1.將羥醛14與酰氯或酸酐，(R4)Cl或(R4)2O，或與四鹵甲烷，C(X1)4，和三苯基膦反應(yīng)，形成中間體化合物15，其中R4為烷基SO2、芳基SO2、烷基CO或芳基CO；X1為Br、I或Cl；X、Y和R6如上述所定義；R5為X1或OR4；且m.用還原消除方法將中間體化合物15轉(zhuǎn)化為下式的二環(huán)-雜芳基-青霉烯-2-甲酸16，其中R6為H，并且需要時(shí)轉(zhuǎn)化為酯，其中R6為C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基或-CHR3OCOC1-C6，藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選堿金屬鹽，其中A、B和R6如上述所定義并分離二環(huán)-雜芳基-青霉烯-2-甲酸16。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述路易斯酸為無(wú)水鹵化鎂。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述路易斯酸為無(wú)水MgBr2。52.權(quán)利要求49的方法，其中所述弱堿為三乙胺、DMAP或二異丙基乙基胺。53.權(quán)利要求49的方法，其中所述低溫為約-20℃至約-40℃。54.權(quán)利要求49的方法，其中所述中間體化合物15為乙酸酯、三氟甲磺酸酯或甲苯磺酸酯。55.權(quán)利要求49的方法，其中所述中間體化合物15不是分離的。56.權(quán)利要求49的方法，其中所述還原消除方法是用活性鋅和磷酸鹽緩沖液在約6.5-8.0的pH下進(jìn)行或在催化劑作用下氫化。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述催化劑為鈀炭。58.權(quán)利要求49的方法，其中所述還原消除方法是在約20℃-35℃溫度下進(jìn)行。59.權(quán)利要求49的方法，其中所述式11的二環(huán)雜芳基甲醛被純化為水溶性亞硫酸氫鈉復(fù)合物。60.一種制備式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為-NR、O、S或-CH2-；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2，所述方法包括酶解其中X、Y和R如上所定義的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6，或選擇性地在下式的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸酯6和二環(huán)-雜芳基-3-甲酸酯5的混合物中酶解，其中X、Y和R如上所定義和產(chǎn)生式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸其中X和Y如上所定義。61.一種制備式11的二環(huán)雜芳基甲醛的方法其中Y為(CH2)n；n為1或2；X為NR、O、S或CH2；R為1-6個(gè)碳原子的烷基或芳烷基(C1-C6)；條件是當(dāng)X為NR或O時(shí)n為2；所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求60中要求保護(hù)的方法制備式7的化合物，并將式7的二環(huán)-雜芳基-2-甲酸轉(zhuǎn)化成式11的二環(huán)雜芳基甲醛。62.權(quán)利要求61的方法，其中式11的二環(huán)雜芳基甲醛通過(guò)以下反應(yīng)制備使二環(huán)-雜芳基2-甲酸7或其反應(yīng)性衍生物與具有式R3NHOR29的胺(其中R2和R3獨(dú)立為1-6個(gè)碳原子烷基)或其反應(yīng)性衍生物反應(yīng)，得到式10的酰胺，其中X、Y、R2和R3如上所定義；并用還原劑還原式10的酰胺。63.一種制備下式的二環(huán)雜芳基青霉烯-2-甲酸16保護(hù)的酸、藥學(xué)上可接受的鹽或優(yōu)選的堿金屬鹽的方法其中A和B之一表示氫，另一個(gè)表示以下部分其中X和Y如權(quán)利要求61所定義，R6為H、選自C1-C6烷基、C5-C6環(huán)烷基、-CHR3OCOC1-C6、芐基或?qū)ο趸S基保護(hù)基的體內(nèi)可水解的酯或藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選堿金屬鹽；所述方法包括通過(guò)權(quán)利要求61或62要求保護(hù)的方法制備式11的二環(huán)雜芳基甲醛，并將式11的二環(huán)雜芳基甲醛轉(zhuǎn)化成具式16的化合物。全文摘要本發(fā)明涉及酶法生產(chǎn)式(I)的中間體二環(huán)－雜芳基－2－甲酸的方法，其中X和Y定義于說(shuō)明書(shū)中，該化合物適用于通過(guò)以下方法制備β內(nèi)酰胺酶抑制劑選擇性酶解式(II)和(III)的位置可水解酯的混合物，其中X、Y和R定義于說(shuō)明書(shū)中。文檔編號(hào)C07D519/00GK1823069SQ200480020149公開(kāi)日2006年8月23日申請(qǐng)日期2004年5月12日優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日發(fā)明者R·V·馬圖爾,M·E·魯彭申請(qǐng)人:惠氏控股公司