專利名稱：結(jié)核分枝桿菌之超氧化物歧化酶的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?9815528.4，申請日為1999年11月9日，發(fā)明名稱為“結(jié)核分枝桿菌之超氧化物歧化酶”的中國專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶催化超氧化物自由基(O2-)成為氧分子(O2)及過氧化氫(H2O2)的轉(zhuǎn)變。因為這樣的分子會與細胞的基因組DNA作用而誘導(dǎo)突變，所以超氧化物自由基的轉(zhuǎn)變通常對細胞而言是有利的。
超氧化物歧化酶(SOD)基于它們對于活性所需要的無機原子而分類。已定義了三個SOD家族需要錳的超氧化物歧化酶(MnSOD)、需要鐵的超氧化物歧化酶(FeSOD)以及需要銅和鋅的超氧化物歧化酶(Cu，ZnSOD)。
MnSODs已發(fā)現(xiàn)存在于線粒體及原核生物中，而FeSODs已發(fā)現(xiàn)存在于原核生物、遠古真核生物以及一些植物之中。Cu，ZnSODs起初發(fā)現(xiàn)于真核生物，后來在數(shù)種細菌之中發(fā)現(xiàn)。
巨噬細胞是脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要力量。這樣的細胞可藉由吞入病菌并以超氧化物自由基攻擊而殺死病原體(例如細菌)。因此，分泌的Cu，ZnSOD可能在細菌性病原體，特別是在巨噬細胞中生存及生長的病原體的生存中起作用。
發(fā)明概述本發(fā)明是以在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中發(fā)現(xiàn)分泌的Cu，ZnSOD為基礎(chǔ)。已發(fā)現(xiàn)特異性地與這個結(jié)核分枝桿菌SOD結(jié)合的抗體，可用于檢測此細菌之存在。也發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者發(fā)展出抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體。因此，患者所產(chǎn)生之抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，是在該患者中對于結(jié)核病的診斷特征。
因此，本發(fā)明以一種抗體為特征，例如，一種可特異性地結(jié)合由SEQ ID NO2的氨基酸序列所組成之多肽的單克隆抗體，而SEQ ID NO2是結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的氨基酸序列?？贵w特異性地結(jié)合多肽是指它基本上不會結(jié)合樣品內(nèi)的其它成份。Cu，ZnSOD或銅/鋅超氧化物歧化酶，是加速超氧化物自由基轉(zhuǎn)變至氧分子及過氧化氫的多肽，并且其超氧化物歧化酶的活性取決于銅及鋅原子或離子的存在。
本發(fā)明也包括一種檢測哺乳動物感染結(jié)核分枝桿菌的方法，包括(1)提供一段包括SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽；(2)在足以使抗體結(jié)合至此多肽的條件下，使此多肽與收集自哺乳動物的生物學樣品接觸(例如，人類血清樣品)；以及(3)測定結(jié)合至此多肽之抗體的存在，其中此抗體的存在表示哺乳動物感染結(jié)核分枝桿菌。這個方法任選地包括移除不與此多肽結(jié)合的抗體的步驟。
本發(fā)明的特征還在于測試一化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，包括(1)將此化合物與一多肽接觸，此多肽是Cu，ZnSOD(也稱為銅/鋅超氧化物歧化酶)并具有與SEQID NO2至少50％相同性(例如，至少60、70、80、90或100％相同性)的氨基酸序列；(2)測量超氧化物歧化酶活性水平；以及(3)比較此化合物存在時與不存在時之超氧化物歧化酶活性水平。當此化合物存在時的超氧化物歧化酶活性水平比此化合物不存在時的超氧化物歧化酶活性水平低時，此化合物稱為可抑制多肽的超氧化物歧化酶活性。此多肽可以在細胞(例如細菌)內(nèi)，例如，在細菌的周質(zhì)內(nèi)。
為了加速本方法的檢測或測試方法，可將多肽結(jié)合至固體的支持物(例如，塑料的支持物，例如微滴板)。此外，也可將多肽共價結(jié)合至固體支持珠(例如，瓊脂糖)上。在此多肽與支持物之間的共價連結(jié)，可藉由本領(lǐng)域中所熟知的方法而達成。例如，此多肽可藉由將此多肽與化學活化形式的支持物反應(yīng)，而共價連結(jié)至支持物(例如，CNBr活化的瓊脂糖4B或EAH瓊脂糖4B，可從Pharmacia獲得)。此外，可將等量的多肽沉積在微滴板的每個孔中，藉此產(chǎn)生一種陣列(array)，在這種陣列上可平行地比較多個化合物，或針對結(jié)核分枝桿菌的存在分析多個樣品。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中之結(jié)核分枝桿菌的抗體，檢測哺乳動物感染結(jié)核分枝桿菌的方法，以及測試化合物之抑制超氧化物歧化酶活性的能力之方法。本發(fā)明的這些方面通過發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌所產(chǎn)生之一種新的Cu，ZnSOD而實現(xiàn)。
I.多肽在本發(fā)明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽包括以下所說明的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD多肽。在本發(fā)明之方法中，有用的Cu，ZnSOD多肽并不限于天然發(fā)生的序列。也可使用含有取代、刪除或插入的Cu，ZnSOD，只要那些多肽保留至少一種與天然發(fā)生之多肽相關(guān)的活性，并且至少與天然發(fā)生之序列有至少50％的相同性。
為了測定兩個序列的相同性百分比，針對理想比較之目的而比對序列(例如，為了與第二個氨基酸序列有理想的比對，可在第一個氨基酸序列之中插入間隙)。接著比對在相對應(yīng)之氨基酸位置的氨基酸殘基。當在第一序列的位置被第二序列中之相對應(yīng)位置的相同氨基酸殘基所占據(jù)時，則這些分子在那個位置就是相同的。在這兩個序列之間的相同性百分比，是這些序列所共有的相同位置之數(shù)目的函數(shù)(也就是，相同性％＝相同位置的數(shù)目/所有位置的數(shù)目×100)。
兩個序列之間的同源性及相同性之百分比的測定，可使用數(shù)學算法來達成。用于比較兩個序列的數(shù)學算法之實例是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268(1990)的算法，修正版是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877(1993)的算法。這樣的算法被納入Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)的NBLAST及XBLAST的程序中。BLAST蛋白質(zhì)搜索可與XBLAST程序一起執(zhí)行，分數(shù)＝50，字長度＝3，以得到同源于在本發(fā)明的方法中是有用之蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列。為得到有間隙的比對之比較目的，可使用Gapped BLAST，如Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)所說明。當使用BLAST及Gapped BLAST程序時，可使用個別程序(例如，XBLAST及NBLAST)的預(yù)設(shè)參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。另一個用于比對序列的數(shù)學算法是Myers等人，CABIOS(1989)的算法。這樣的算法是并入ALIGN程序(第二版)之中，其為GCG序列比對軟件包的部份。當使用此ALIGN程序來比較氨基酸序列時，可使用PAM120重量殘基表、12的間隙長度障礙以及4的間隙障礙。
在兩個序列之間的相同性百分比，是使用上述的技術(shù)并允許間隙的存在而測定。在計算相同性百分比時，只有完全符合的才計算。
Cu，ZnSOD的實例是Cu，ZnSOD-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，這不是天然發(fā)生的，但在本發(fā)明之方法中是有效用的。這樣的蛋白質(zhì)可在細菌中大量制造，并可藉由谷胱甘肽親和柱而輕易地分離。在SOD之候選抑制劑的存在或不存在下(即，候選結(jié)核分枝桿菌抗微生物劑)，此融合蛋白可用于活體外的SOD分析。
II.抗體此處所使用的名詞“抗體”，是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子之免疫活性的部份，也就是，包含抗原結(jié)合位點的分子，其可特異性地結(jié)合至抗原，例如，結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD。特異性地結(jié)合至結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的分子是可結(jié)合結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD，但基本上不與樣品，例如，一種天然地包含結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的生物學樣品，中的其它分子結(jié)合之分子。免疫球蛋白之免疫活性部份的實例包括F(ab)及F(ab’)2片段，這些片段可藉由以酶(例如，胃蛋白酶)處理抗體而產(chǎn)生。本發(fā)明提供與結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD結(jié)合的多克隆以及單克隆抗體。此處所使用的名詞“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”，是指一群抗體分子，其只包含一種抗原的結(jié)合位點，這個位點有能力與結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD之特定的抗原決定位點引起免疫反應(yīng)。單克隆抗體組合物因此對于與其免疫反應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD，典型地表現(xiàn)出單一的結(jié)合親和性。
抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的多克隆抗體，可藉由以結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD免疫原，免疫適合的個體而制備。被免疫的個體之抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體效價，可藉由標準方法隨著時間監(jiān)測，例如，使用固定化的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD之酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。如果需要的話，針對抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體分子，可從哺乳動物中分離(例如，從血液中)，并進一步藉由熟知的方法而純化，例如，藉由蛋白質(zhì)A柱層析分析而得到IgG的部份。在免疫后的適當時間，例如，當抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體效價是最高的時候，可從此個體得到制造抗體的細胞，并藉由標準技術(shù)而制備單克隆抗體，例如，在以下文獻所說明的，Kohler等人，Nature 256495-497，1975；Kozbor等人，Immunol.Today 472，1983；以及Cole等人，單克隆抗體及癌癥治療，Alan R.Liss公司，77-96頁，1985。用于生產(chǎn)各種單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是熟知的(參見，例如，Coligan等人編輯，免疫學的現(xiàn)今方法，John Wiley & Sons公司，紐約，1994)。簡言之，將永生細胞系(典型地是骨髓瘤)與淋巴細胞(典型地是脾細胞)融合，而此淋巴細胞是來自以如上所述結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD作為免疫原而免疫的哺乳動物，并且篩選所產(chǎn)生之雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液，鑒定產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD結(jié)合之單克隆抗體的雜交瘤。
許多用來融合淋巴球細胞與永生細胞系的熟知方法中的任何一種，皆可應(yīng)用于產(chǎn)生抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD之抗體的目的(參見，例如，免疫學的現(xiàn)今方法，同上；Galfre等人，Nature 26655052，1977；Kenneth，單克隆抗體生物學分析的新方面，Plenum Publishing公司，紐約，1980；以及Lerner YaleJ.Biol.Med.，54387-402，1981)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會體認，在這樣的方法中有許多變異也是有用的。典型地，永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)是衍生自與淋巴細胞相同的哺乳動物。例如，藉由將來自本發(fā)明之免疫原制備物所免疫的小鼠之淋巴細胞，與永生小鼠細胞系，例如，對含有次黃嘌呤、氨基喋呤及胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的骨髓瘤細胞系，融合而制成小鼠的雜交瘤。許多骨髓瘤細胞系的任何一種細胞系，根據(jù)標準技術(shù)，皆可用作融合配偶體，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8或Sp2/O-Ag14骨髓瘤細胞系。這些細胞系可從ATCC獲得。典型地，使用聚乙二醇(“PEG”)將對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。由此融合所導(dǎo)致的雜交瘤細胞，接著用HAT培養(yǎng)基篩選，HAT培養(yǎng)基會殺死未融合的骨髓瘤細胞以及雖融合但無效的骨髓瘤細胞(未融合的骨髓瘤細胞過幾天就會死亡，因為它們并沒有轉(zhuǎn)化)。使用標準的ELISA分析，針對結(jié)合結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，藉由篩選雜交瘤的培養(yǎng)上清液而檢測產(chǎn)生本發(fā)明之單克隆抗體的雜交瘤細胞。
另一種制備分泌單克隆抗體之雜交瘤的方法，是藉由以結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD來篩選重組的組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)，而鑒定并分離抗結(jié)合結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的單克隆抗體，藉此分離可結(jié)合結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD之免疫球蛋白文庫的成員。用于產(chǎn)生及篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄編號27-9400-01；以及Stratagen SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄編號240612)。此外，對于使用在產(chǎn)生及篩選抗體展示文庫是特別經(jīng)得起考驗的方法及試劑的實例，可在以下文獻中發(fā)現(xiàn)，例如，美國專利第5,223,409號；PCT出版編號WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690及WO90/02809；Fuchs等人，Bio/Technology 91370-1372，1991；Hay等人，Hum Antibod Hybridomas 381-85，1992；Huse等人，Science 2461275-1281，1989；以及Griffiths等人，EMBO J.12725-734，1993。
此外，抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的重組抗體，例如，嵌合的及人源化的單克隆抗體，包括人類及非人類兩個的部份，可藉由標準的重組DNA技術(shù)而達成，也是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的嵌合及人源化的單克隆抗體，可藉由本領(lǐng)域中所熟知的重組DNA技術(shù)而制造，例如，使用下列文獻所說明的方法，例如，PCT出版物WO 87/02671及WO 86/01533；歐洲專利申請第184187、171496、173494及125023號；美國專利第4,816,567及5,225,539號；Better等人，Science 2401041-1043，1988；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443，1987；Lie等人，J.Immunol.1393521-3526，1987；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218，1987；Nishimura等人，Canc.Res.47999-1005，1987；Wood等人，Nature 314446-449，1985；Shaw等人，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559，1988；Morrison，Science 2291202-1207，1985；Oi等人，Bio/Techniques 4214，1986；Jones等人，Nature 321552-525，1986；Verhoeyan等人，Science 2391534，1988；以及Beidler等人，J.Immunol.1414053-4060，1988。
抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體(例如，單克隆抗體)，可藉由標準技術(shù)(例如，親和性柱層析分析或免疫沉淀)而分離結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD?？菇Y(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的抗體，可加速來自細菌之天然結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的純化，以及宿主細胞表達之重組產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的純化。此外，抗結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD之抗體，可用來檢測結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD(例如，在細胞溶胞物中或在血清樣品中)，以評估結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD蛋白質(zhì)的豐富度。藉由將抗體與可檢測的物質(zhì)連結(jié)在一起而可加速檢測?？蓹z測的物質(zhì)之實例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)以及放射性物質(zhì)。適合的酶之實例包括，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿脂酶。適合的輔基之實例包括，鏈霉抗生物素/生物素以及抗生物素/生物素。適合的熒光物質(zhì)之實例包括，傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白。發(fā)光材料之實例包括，魯米諾(Luminol)。生物冷發(fā)光材料之實例包括，蟲螢光素酶、蟲螢光素以及水母發(fā)光蛋白(aequorin)。適合的放射性材料之實例包括，125I、131I、35S或3H。
III.以Cu，ZnSOD接觸一化合物對于活體外的分析，可藉由將Cu，ZnSOD與此化合物在溶液、懸浮液或凝膠中混合，而使Cu，ZnSOD接觸化合物。這個溶液、懸浮液或凝膠接著用于SOD分析。
對于細胞分析，任何Cu，ZnSOD多肽可在細胞中表達，如果此細胞并不是已經(jīng)表達Cu，ZnSOD的，或任何Cu，ZnSOD多肽可在細胞中過度表達，如果此細胞已經(jīng)表達Cu，ZnSOD的話。在細胞中表達蛋白質(zhì)的方法是在本領(lǐng)域中所熟知的。
如果Cu，ZnSOD在細胞中，化合物可藉由本領(lǐng)域中所熟知的方法輸送至細胞內(nèi)。如果此化合物是可通透膜的分子，則此化合物可直接與此細胞混合，使得Cu，ZnSOD與此化合物接觸。如果此化合物不是可通透膜的分子，例如許多大分子，或者如果此化合物是多肽、核酸或病毒載體，那么此化合物可藉由電穿孔輸送至細胞內(nèi)。
此外，細胞可以是體內(nèi)的動物細胞。此化合物可藉由任何本領(lǐng)域公知的途徑輸送至此細胞，包括靜脈內(nèi)注射。另外，如果輸送進細胞是需要的，則多肽化合物可藉由核酸或病毒載體而給藥。
IV.超氧化物歧化酶分析對于超氧化物歧化酶活性的分析可藉由任何本領(lǐng)域所知的標準技術(shù)而測定。例如，參見說明于Beauchamp等人，Anal.Biochem.44276-287，1971以及其中之參考文獻的分析方法。
許多的這些分析是依靠氮藍四唑(NBT)的光還原，其為一種由超氧化物自由基的產(chǎn)生所調(diào)節(jié)的過程。超氧化物歧化酶的活性是反應(yīng)在NBT之還原的抑制上。NBT曝露適當光源會使之轉(zhuǎn)變成藍色染劑，可藉由560nm的吸光值而定量。然而在超氧化物歧化酶存在的情況下，NBT之光還原成藍色染劑的情形會減少或排除?；诖烁拍畹奶禺惓绦蚴潜绢I(lǐng)域中已知的。例如，參見以下所說明的程序。
不需詳細闡述，基于以上的揭露及以下的說明，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本發(fā)明于極致。以下的實施例只是說明本領(lǐng)域技術(shù)人員如何實施此發(fā)明，并非用以限制本文之其余部份。任何在本文中所引用的出版物，都并入為參考資料。
實施例1結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD的克隆和鑒定分別使用大腸桿菌株XL1 blue(Stratagen)以及BL21(DE3)(Novagen)進行克隆及重組蛋白的過度表達。使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv作為電子顯微鏡分析。
根據(jù)標準方法執(zhí)行克隆程序。藉由PCR從結(jié)核分枝桿菌的基因組擴增sodC基因的片段，使用寡核苷酸對5’-CATATGTCTACAGTTCCGGGTACCA-3’(SEQ ID NO3)以及5’-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3’(SEQ IDNO4)，以用于全長克隆，而5’-CATATGCCAAAGCCCGCCGATCA-3’(SEQ ID NO5)以及5’-GGATCCAAGCTAGCCGGAACCAATGA-3’(SEQ ID NO6)則用于截短形式的克隆(說明如下)。將此PCR產(chǎn)物克隆進T-載體pT7-Blue(Novagen)，并隨后亞克隆進表達載體pET15B(Novagen)的NdeI及BamHI位置。根據(jù)制造商的操作說明，使用ABIBigDye(PE Applied Biosystems)熒光測序化學及ABI PRISM310基因分析自動測序儀(PE Applied Biosystems)，而測序此克隆之片段的兩條鏈。
測序的結(jié)果顯示sod C基因包含下列開放讀框ATGCCAAAGCCCGCCGATCACCGCAATCACGCAGCTGTCAGCACGTCGGTCCTGTCCGCGTTGTTTCTGGGCGCCGGTGCCGCGCTGCTGAGCGCATGCTCGTCGCCGCAGCACGCGTCTACAGTTCCGGGTACCACGCCGTCGATTTGGACCGGATCGCCCGCGCCGTCGGGACTTTCGGGTCACGACGAGGAGTCGCCCGGTGCGCAGAGCCTGACCAGTACCCTGACGGCGCCCGACGGCACGAAGGTAGCGACCGCGAAGTTCGAGTTCGCCAACGGCTATGCCACCGTCACGATCGCGACGACCGGCGTCGGTAAGCTCACGCCCGGCTTCCACGGCCTACACATCCACCAGGTGGGTAAGTGTGAGCCCAACTCGGTTGCCCCCACCGGCGGTGCGCCCGGCAACTTTCTGTCCGCCGGCGGCCACTACCACGTGCCAGGGCATACCGGCACCCCCGCCAGCGGCGACCTGGCCTCGCTGCAGGTACGCGGTGACGGTTCGGCGATGCTGGTGACCACCACCGACGCCTTCACCATGGACGACCTGCTGAGCGGCGCGAAAACCGCGATCATCATTCACGCCGGCGCCGACAACTTTGCCAACATTCCGCCAGAACGCTACGTCCAGGTCAATGGGACTCCGGGTCCCGACGAGACGACGTTGACCACCGGCGACGCCGGCAAGCGGGTGGCGTGCGGTGTCATTGGTTCCGGC(SEQ ID NO1).
此開放讀框結(jié)束于一個緊接于上述序列的天然TAG停止密碼。此開放讀框編碼一段240個氨基酸的多肽，其序列如下MPKPADHRNHAAVSTSVLSALFLGAGAALLSACSSPQHASTVPGTTPSIWTGSPAPSGLSGHDEESPGAQSLTSTLTAPDGTKVATAKFEFANGYATVTIATTGVGKLTPGFHGLHIHQVGKCEPNSVAPTGGAPGNFLSAGGHYHAVPGHTGTPASGDLASLQVRGDGSAMLVTTTDAFTMDDLLSGAKTAIIIHAGADNFANIPPERYVQVNGTPGPDETTLTTGDAGKRVACGVIGS (SEQ IDNO2).
使用PSORT程序分析(http//psort.nibb.ac.jp/)，在這個多肽的氨基端發(fā)現(xiàn)一個推定的信號肽(下劃線者)。
使用編碼上述SOD版本的pET15B表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細胞。L-sodC質(zhì)粒包括SEQ ID NO1。S-sodC質(zhì)粒包括SEQ ID NO1的核苷酸118-720，也就是不包括編碼信號肽的序列。M-sodC質(zhì)粒包括核苷酸118-720，但在天然終止密碼子由一T至A的突變，因此變成編碼賴氨酸。接著在編碼該新的賴氨酸之密碼子的下游加入額外的序列(CCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAA；SEQ ID NO7)，藉此編碼額外的氨基酸序列PNNSSTLAAVTSGSGC(SEQ ID NO8)。藉由將此攜帶重組sodC質(zhì)粒的BL21(DE3)細菌在包含0.5mM IPTG的LB培養(yǎng)液，以37℃培養(yǎng)100分鐘而誘導(dǎo)此重組蛋白的表達。離心回收細菌，并經(jīng)由在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)及10mM咪唑中超聲處理而使細胞溶解。變性在包涵體(inclusion bodies)中的重組蛋白，并溶解于20mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、8M尿素及50mM咪唑中。接著根據(jù)制造商操作說明，將蛋白質(zhì)在組氨酸捕獲螯合柱上(Pharmacia)純化。藉由在4℃對50mM Tris-HCl，pH7.8，1mM CuSO4以及1mM ZnSO4的透析，而將純化的重組蛋白復(fù)性，其中透析液更換數(shù)次。將純化的蛋白質(zhì)儲存于添加20％甘油的透析液中。溶解于不含細胞之提取液中的重組蛋白，則是使用相同的柱在天然條件下而純化(也就是，以不含CuSO4的透析液)。
在IPTG誘導(dǎo)時，大部分過度表達的蛋白質(zhì)存在于不可溶的包涵體內(nèi)。將這些在包涵體之中的蛋白質(zhì)變性，以尿素溶解，并純化以接近均質(zhì)，如同以考馬斯(Coomassie)亮藍R-250染色之SDS-PAGE所顯示的。小部份的這些蛋白質(zhì)也以溶解的形式而從細胞溶胞物純化。此SDS-PAGE還顯示L-sodC表現(xiàn)大約28-32kDa的分子量，M-sodC表現(xiàn)大約26kDa的分子量，而S-sodC表現(xiàn)大約24-25kDa的分子量。
藉由把在考馬斯亮藍R-250染色之SDS-PAGE上的親和性純化的M-sodC分級分離，而制備用于抗體制備的M-sodC。將含有此M-sodC的凝膠切片與完全弗氏(Freund’s)佐劑混合，并用此混合物免疫三月齡新西蘭白兔。在起初的免疫之后，接著以混合于不完全Freund’s佐劑的蛋白質(zhì)加強免疫三次。在最后一次加強后以十天之間隔，收集抗血清。
將欲分析的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE中分級分離，電轉(zhuǎn)移至Immobilon TM-P膜上(Millipore)，以兔抗血清，接著以辣根過氧化物酶綴合的驢抗兔IgG抗體(Amersion)檢測。以增強的化學發(fā)光試劑盒(ECL，Amersion)檢測目標條帶，并以Hyperfilm-MP底片記錄。
抗此純化之重組M-sodC蛋白質(zhì)的兔多克隆抗血清識別所有三種形式的SOD蛋白質(zhì)，并且不與大腸桿菌之sodC基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)。更重要的是，此抗血清在結(jié)核分枝桿菌溶胞物中識別一個大小約26kDa的單一多肽，證明此sodC序列表達蛋白質(zhì)。這個發(fā)現(xiàn)亦暗示結(jié)核分枝桿菌SOD是加工變?yōu)槌墒斓男问讲⒎置冢缤陨纤A(yù)測。
為了評估此重組白質(zhì)之SOD酶活性，將此細菌表達的蛋白質(zhì)重新懸浮于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)及0.1mM EDTA之中，經(jīng)由超聲處理并且離心以得到細菌提取物。藉由非變性聚丙烯酰胺凝膠分離此提取物，以NBT染色，并如Beauchamp所述(文獻同上)曝露于光線下，從而評估SOD的活性。已知1mM KCN會選擇性地抑制Cu，ZnSOD活性，因此將之加入對照組樣品中以確認SOD活性是來自于Cu，ZnSOD酶。
大部分在大腸桿菌表達的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD發(fā)現(xiàn)于不溶的包涵體之中，并且不具有任何酶活性。為了重建此酶活性，將來自包涵體所制備之純化的重組蛋白質(zhì)以尿素變性，并藉由在Gu2+及Zn2+之溶液中透析而復(fù)性。從包涵體純化出來之還原的重組M-sodC蛋白質(zhì)在藍色NBT-染色的凝膠上形成多重白色條帶。這些條帶可能代表活性的重組蛋白質(zhì)之多樣構(gòu)象。
從可溶的細胞質(zhì)部份純化出來的重組Cu，ZnSOD(S-sodC)，在藍色NBT-染色的凝膠上表達出單一的白色條帶。當凝膠在1mM KCN的存在下染色時，代表結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD(S-sodC)、酵母菌Cu，ZnSOD以及結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD(M-sodC)之還原形式的白色條帶都消失。這個結(jié)果證明由結(jié)核分枝桿菌sodC基因所編碼的蛋白質(zhì)，是編碼一種以Cu，Zn為輔因子的真實超氧化物歧化酶。
為了測定Cu，ZnSOD在細胞區(qū)室中的定位，將L-sodC酶在大腸桿菌中表達，然后依下面方法將此細菌進行免疫金標記電子顯微鏡分析。制備15nm的膠態(tài)金-IgG復(fù)合物并如同Lin等人，J.Ultrastruct.Res.8416-23，1983；以及Chang等人，J.Gen.Virol.781175-1179，1997所說明的方法執(zhí)行免疫金標記。簡言之，將一些結(jié)核分枝桿菌的菌落從瓊脂斜面上刮下，并以4℃在1％的福爾馬林及0.1M的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH7.2)中，固定過夜。將此固定的樣品于0℃，在0.1M的氯化銨及0.1M的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH7.2)中，中和30分鐘。中和之后，接著透過一系列的甲醇清洗而脫水，第一次是在0℃用50％甲醇清洗15分鐘，接著以75％及90％的甲醇重復(fù)，接著以100％的甲醇在-20℃清洗兩次，每次1小時。以等級系列包埋劑LR Gold滲透此脫水的樣品。首先藉由浸在25％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，1小時而滲透此樣品。接著將此樣品浸在50％的LR Gold、10％PVP-6000中，-20℃，2小時，然后是75％LR Gold，-20℃，4小時。最后，以100％的LR Gold，-20℃，2小時，將此樣品完全滲透。在-20℃，以長波紫外光輻射達24小時而激活包埋劑的聚合作用，并且此樣品在室溫中24小時而變硬。將LR Gold包埋的樣品之超薄切片(100nm)固定在200目鎳網(wǎng)(其以碳支撐的膠棉薄膜覆蓋)。將網(wǎng)上的切片以3％正常山羊血清(溶于PBS)封阻10分鐘，與抗Cu，ZnSOD的兔抗血清(參見上述)保溫15分鐘，以1％正常山羊血清(溶于PBS)清洗，并且與膠態(tài)金-IgG復(fù)合物保溫10分鐘。在以醋酸鈾和檸檬酸鉛對照之前，以三重玻璃蒸餾水廣泛地清洗網(wǎng)。此切片以Zeiss EM109電子顯微鏡(Zeiss，德國)檢驗。
因為格蘭氏陽性的結(jié)核分枝桿菌中不存在周質(zhì)空間，因此可檢驗出Cu，ZnSOD分泌至細菌的周圍。使用免疫金標記以及電子顯微鏡，顯示Cu，ZnSOD主要位于結(jié)核分枝桿菌的周圍。這個發(fā)現(xiàn)與上述的發(fā)現(xiàn)一致，即(1)Cu，ZnSOD具有一推定的信號肽序列，以及(2)成熟之天然發(fā)生的Cu，ZnSOD表現(xiàn)出類似于SDS-PAGE凝膠上之截短S-sodC蛋白質(zhì)的大小。這些信息暗示結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD或者分泌或者附著在細菌的外表面上。
在另一實驗中，在大腸桿菌表達結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD。接著使用上述之免疫金標記電子顯微鏡測定所表達之蛋白質(zhì)的位置。染色的結(jié)果顯示Cu，ZnSOD主要位于細菌的周質(zhì)空間。因此，這個蛋白質(zhì)可在適合大量產(chǎn)生此蛋白質(zhì)的細胞中重組地產(chǎn)生并分泌。
實施例2用于檢測結(jié)核分枝桿菌的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)因為結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD曝露于細胞的外面，所以藉由使用特異于Cu，ZnSOD的抗體而發(fā)展ELISA的檢測分析。以1.22、4.88、19.5、78.1、312或1250ng/ml的S-sodC溶液，藉由在4℃保溫過夜而包被孔。接著移除蛋白質(zhì)，并以10％的胎牛血清(溶于PBST)在37℃封阻孔2小時。以PBST清洗孔三次，并加入稀釋1∶4000的兔抗血清(在上述實施例1所得到的)。將兔抗血清在孔中于4℃過夜保溫。之后，以PBST清洗孔三次，并加入稀釋1∶1000的辣根過氧化物酶綴合的驢抗兔IgG抗體(Amersion，目錄編號NA943)。將驢抗體在37℃下，于孔中保溫6小時。再以PBST清洗孔三次，然后藉由加入TMB(KPL公司)并在室溫下保溫不超過30分鐘而顯色。加入1M H3PO4而終止反應(yīng)。
450nm的吸收值讀數(shù)表明在10ng及1000ng之間有一動態(tài)的或可計量的檢測范圍。含有超過1000ng的樣品，讀數(shù)不再是動力學的。這個結(jié)果顯示藉由使用特異于Cu，ZnSOD的抗體可發(fā)展用于檢測結(jié)核分枝桿菌之有用的ELISA方法。
實施例3檢測結(jié)核分枝桿菌的感染因為結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD曝露于細胞外的環(huán)境，所以可檢驗結(jié)核病人產(chǎn)生抗Cu，ZnSOD之抗體的能力。使用病人血清，以Western印跡法檢測上述的結(jié)核分枝桿菌Cu，ZnSOD。結(jié)果顯示110個病人有12個產(chǎn)生抗Cu，ZnSOD的抗體，證實在個體中抗這個蛋白質(zhì)的抗體之存在可用作結(jié)核病替代標記。
其它實施方案應(yīng)了解的是，雖然本發(fā)明已連同其詳述而說明，但前面的說明是用以舉例而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是藉由后附的權(quán)利要求書而定義。其它方面、優(yōu)點、以及修飾是在本
權(quán)利要求
1.一種測試化合物是否抑制多肽之超氧化物歧化酶活性的方法，該方法包括將此化合物與一多肽接觸，此多肽是銅/鋅超氧化物歧化酶，并具有與SEQ ID NO2至少50％相同性的氨基酸序列；測量該多肽所表現(xiàn)之超氧化物歧化酶活性水平；以及比較該化合物存在時與不存在時之超氧化物歧化酶活性水平；其中，當該化合物存在時的超氧化物歧化酶活性水平比該化合物不存在時的超氧化物歧化酶活性水平低的時候，該化合物抑制該多肽的超氧化物歧化酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該多肽結(jié)合至固體支持物。
3.如權(quán)利要求2所述之方法，其中該固體支持物是塑料。
4.如權(quán)利要求2所述之方法，其中該固體支持物是一陣列，而且該多肽結(jié)合至該陣列的每個組件上。
5.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該多肽是在細胞內(nèi)。
6.如權(quán)利要求5所述之方法，其中該細胞是細菌細胞。
7.如權(quán)利要求1所述之方法，其中該氨基酸序列與SEQID NO2至少有70％的相同性。
8.如權(quán)利要求7所述之方法，其中該氨基酸序列與SEQID NO2至少有90％的相同性。
9.如權(quán)利要求8所述之方法，其中該氨基酸序列是SEQID NO2。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌超氧化物歧化酶的抗體，使用它們以用于檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，測試結(jié)核分枝桿菌超氧化物歧化酶之抑制劑的方法，以及檢測結(jié)核感染的方法。
文檔編號C07K16/12GK1644708SQ20041008839
公開日2005年7月27日 申請日期1999年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月13日
發(fā)明者李芳仁, 吳忠勳 申請人:永信藥品工業(yè)股份有限公司