專利名稱：瑞香狼毒中新狼毒素b的提取分離方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥、獸藥和農(nóng)藥中間體或原藥領(lǐng)域中瑞香狼毒的綜合利用，尤其是涉及一種瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法及其作為植物殺菌劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瑞香狼毒(Stellera Chamaejasme L.)系瑞香科狼毒屬植物，別名有狼毒、斷腸草等，其根是傳統(tǒng)中藥狠毒的基質(zhì)，具有散結(jié)逐水，止痛和殺蟲(chóng)作用。早在1959年出版的《中國(guó)土農(nóng)藥志》中就有將瑞香狼毒作為植物源農(nóng)藥應(yīng)用的記載，當(dāng)時(shí)人們將狼毒根的粉末埋入地下用于防治田間地下害蟲(chóng)，或?qū)⒗嵌镜乃嵋簢姙⒃谥参锶~面用于防除葉面豆蚜、菜蚜、葉銹病等。近年來(lái)，有研究者相繼開(kāi)發(fā)出含狼毒粗提物的植物原農(nóng)藥，有的已申請(qǐng)專利。但這些狼毒型植物源農(nóng)藥均為殺蟲(chóng)劑，少數(shù)幾個(gè)有明確的有效成分和含量，大部分專利中則不清楚其殺蟲(chóng)活性成分。張潔等(專利申請(qǐng)?zhí)?0116146)發(fā)明了由紫莖澤蘭、瑞香狼毒和魚(yú)藤制備廣譜性生滅蟲(chóng)劑的方法，該法制備的滅蟲(chóng)劑屬于復(fù)方制劑，其殺蟲(chóng)有效成分不清，作用對(duì)象不含植物病原菌。張克杰等(專利申請(qǐng)?zhí)?2133769)敘述了由狼毒根、莖制備生物農(nóng)藥狼毒素水乳劑的工藝，該法制備的產(chǎn)品屬于單方制劑，殺蟲(chóng)有效成分及其含量明確，為1.1％～5％。但同樣其作用對(duì)象僅為植物害蟲(chóng)，不含植物病原菌。劉世貴等(專利申請(qǐng)?zhí)?2133971)公開(kāi)了由狼毒促提取物、印楝素和益母草生物堿等制備植物殺蟲(chóng)劑的方法，該法得到的產(chǎn)品為復(fù)配制劑，其中狼毒提取物中的有效成分不清楚，作用對(duì)象同樣僅為植物害蟲(chóng)。韓明理等(專利申請(qǐng)?zhí)?2100771.3)敘述了由瑞香狼毒制備0.3％狼毒素植殺水劑的制備方法，該產(chǎn)品為單方制劑，有效成分為狼毒素，作用對(duì)象仍然為只是植物害蟲(chóng)。其生產(chǎn)工藝中只涉及狼毒根的粗提物，而不涉及狼毒素的分離。綜上所述，可以看出，狼毒作為植物源農(nóng)藥的應(yīng)用主要為殺蟲(chóng)劑，關(guān)于其殺菌劑的研究和開(kāi)發(fā)還屬于空白。
Niwa等人(Tetrahydron Letters，1984，25(34)3735-3738)最早從瑞香狼毒根中分離鑒定出新狼毒素B。隨后有馮寶民(中草藥，2001，32(1)14-15)等多人的研究相繼證實(shí)了Niwa等人的研究結(jié)果。這些研究具有共同的特點(diǎn)，即都是屬于植物化學(xué)或天然產(chǎn)物化學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，其研究方法均為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，提取效率低，分離方法復(fù)雜繁瑣，根本不適宜于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。其次，所有關(guān)于新狼毒素B的研究報(bào)道極少涉及其生物活性的研究，更沒(méi)有關(guān)于新狼毒素B對(duì)植物病原菌即作為植物殺菌劑的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法及其應(yīng)用，其從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個(gè)對(duì)多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即新狼毒素B，適合規(guī)?；瘡睦嵌靖刑崛》蛛x新狼毒素B，生產(chǎn)方法和工藝簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、合理，同時(shí)，提供新狼毒素B作為廣譜性植物殺菌活性成分的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特殊之處在于包括以下操作步驟將狼毒根粉加入溶劑進(jìn)行提取，然后進(jìn)行第一次硅膠柱層析粗分，得一次粗分物，再進(jìn)行第二次硅膠柱層析粗分，得二次粗分物，再對(duì)二次粗分物進(jìn)行純化。
上述操作步驟包括以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間30～50min。提取液經(jīng)過(guò)濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的新狼毒素B。
上述操作步驟包括(1)將狼毒根粉碎至一定程度，按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶4～1∶10的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度30℃～55℃，每批原材料采用同種溶劑連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間為30～50min，超聲功率為1.8W，每次超聲時(shí)間為6s，兩次超聲之間的時(shí)間間隔為4s；(2)每次提取結(jié)束后，采用離心過(guò)濾，收集濾液，將3次提取液合并，負(fù)壓蒸除溶劑后，得粗提物，回收的溶劑可反復(fù)使用，總提取率根據(jù)溶劑的種類不同而不同，一般為7％～21％，粗提物中新狼毒素B的含量為5％～25％，粗提物無(wú)需分離純化，可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑，也可選用其他有機(jī)溶劑對(duì)該粗提物進(jìn)行二次超聲提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于新狼毒素B的粗分；(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成質(zhì)量濃度約20％的溶液，在不斷攪拌下，加入相當(dāng)于粗提物3～7倍質(zhì)量的大約200目的柱層析硅膠，將拌樣后的硅膠在常溫下晾干，加到硅膠柱的頂端，進(jìn)行干柱層析，依次采用氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得一次粗分物，該粗分物中的新狼毒素B含量為45％～55％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑；(4)將一次粗分物采用與(3)類似的方法進(jìn)行柱層析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，以新狼毒素B標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用TLC法或HPLC法對(duì)各流份進(jìn)行檢測(cè)，合并含有新狼毒素B的流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得二次粗分物，該粗分物中的新狼毒素B含量為80％～90％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑；(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱進(jìn)行純化，收集含有新狼毒素B的流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得新狼毒素B精品，含量為95％～99％，可作為標(biāo)準(zhǔn)樣品或分析純化學(xué)試劑使用。
上述步驟(1)中，提取溶劑選用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇中的一種，提取方案包括A.直接用乙酸乙酯或丙酮進(jìn)行超聲提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，，提取溫度為30℃～55℃，所得粗提取物為淡黃色無(wú)晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱層析分離。乙酸乙酯和丙酮的提取率分別為5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇進(jìn)行超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物殺菌劑或二次提取，本次提取率為18％～25％，用丙酮對(duì)甲醇粗提物進(jìn)行二次超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相當(dāng)于所用植物材料的10％～12％，為黃色無(wú)晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱層析分離。
上述步驟(2)中，將粗提物用丙酮配成質(zhì)量濃度約20％的溶液，加入3～7倍質(zhì)量的柱層析用硅膠，室溫晾干拌樣后的硅膠或用40℃熱風(fēng)常壓干燥，然后加到硅膠柱頂端進(jìn)行第一次干柱層析粗分，硅膠柱的規(guī)格為高度/直徑10∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的1～3倍，首先采用氯仿進(jìn)行洗脫，直到流出液幾乎無(wú)色為止，然后換用乙酸乙酯洗脫，直至TLC或HPLC檢測(cè)無(wú)新狼毒素B流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶劑后得一次粗分物，其質(zhì)量約為上樣量的40％～50％。該粗分物的新狼毒素B含量為45％～55％。
上述步驟(3)中，將一次粗分物用丙酮配成飽和溶液，加到硅膠柱頂端進(jìn)行濕柱硅膠層析，硅膠柱的規(guī)格為高度/直徑20∶1。硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的50～100倍，以氯仿—丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，收集含有新狼毒素B的主要流份，蒸除溶劑后得二次粗分物，黃色無(wú)晶形粉末，其質(zhì)量約為上樣量的40％～50％，新狼毒素B的含量為80％～90％。
上述步驟(4)中，將二次粗分物用甲醇配成飽和溶液，并事先用甲醇平衡過(guò)的sephadex LH-20進(jìn)行純化，柱子的規(guī)格為高度/直徑10∶1，sephadex LH-20的粒度為200～400目，上樣量為柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇為洗脫劑，減壓濃縮含新狼毒素B的流份，得新狼毒素B精品，其質(zhì)量約為上樣量的85％～90％，整個(gè)工藝的總收率相當(dāng)于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為95％～99％。
上述新狼毒素B的物理參數(shù)如下新狼毒素B，淡黃色無(wú)定型固體，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)λmax298，221。IR(KBr)υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMRδ(CD3COCD3)2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下為H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13CNMRδ(CD3COCD3)48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)，127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2″′)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9′′)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。
HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)296nm。
一種瑞香狼毒中新狼毒素B作為植物殺菌劑的應(yīng)用，其特殊之處在于所述殺菌劑以瑞香狼毒根提取物為原料，以新狼毒素B為主要?dú)⒕行С煞郑糜陬A(yù)防和治療由蘋(píng)果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等引起的植物病害。
上述新狼毒素B為2200mg·L-1濃度。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下本發(fā)明首次采用生物活性跟蹤法和化學(xué)分離法，從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個(gè)對(duì)多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即新狼毒素B(chamaechromone)。同時(shí)，開(kāi)發(fā)出從狼毒根中提取分離新狼毒素B的生產(chǎn)工藝，提取效率高，分離方法簡(jiǎn)單，適宜于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，并首次將新狼毒素B作為植物殺菌劑應(yīng)用。
四

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；圖2為新狼毒素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
圖3為新狼毒素B的HPLC圖譜。
五具體實(shí)施例方式1、參見(jiàn)圖1，本發(fā)明采用4步法來(lái)獲得不同含量的新狼毒素B，即提取、第一次硅膠柱層析粗分、第二次硅膠柱層析粗分、sephadexLH-20純化，各步分離所獲得目標(biāo)物中新狼毒素B的含量分別為5％～25％，45％～55％，80％～90％，95％～99％。其工藝流程如下1.1、將狼毒根粉碎至一定程度，其細(xì)度無(wú)嚴(yán)格要求，一般為直徑1mm。按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶8的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度為40℃。每批原材料采用同種溶劑連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間為40min。超聲功率為1.8W，每次超聲時(shí)間為6s，兩次超聲之間的時(shí)間間隔為4s。如果以分離新狼毒素B精品為最終目的，選用乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯/丙酮1∶1(V/V)為溶劑。如果以提取粗提取用于配制瑞香狼毒殺菌劑為最終目的，則選用甲醇為溶劑。
1.2、提取時(shí)的固液分離，可采用負(fù)壓過(guò)濾、離心過(guò)濾或壓榨過(guò)濾三種方法之一，最好采用離心過(guò)濾。濾液經(jīng)水泵減壓，在38℃下蒸除溶劑后，得粗提物?；厥盏娜軇┛煞磸?fù)使用?？偺崛÷矢鶕?jù)溶劑的種類不同而不同，乙酸乙酯、丙酮和甲醇的提取率分別為5.2％、6.4％和21％。三種粗提物中新狼毒素B的含量大約分別為20％、6％和5％。三種粗提物無(wú)需分離純化，均可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑。如果以分離新狼毒素B精品為最終目的，則選用乙酸乙酯或丙酮提取物。
1.3、在對(duì)乙酸乙酯或丙酮粗提取進(jìn)行第一次硅膠柱層析時(shí)，選擇丙酮溶解粗提物，配成質(zhì)量濃度約20％的溶液。然后，加入相當(dāng)于粗提物3～7倍質(zhì)量的大約200目的柱層析硅膠，快速拌勻后，常溫晾干。加到相當(dāng)于拌樣硅膠質(zhì)量的1/8的硅膠柱的頂端，進(jìn)行干柱層析。依次采用氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。新狼毒素B存在于乙酸乙酯流份中，水泵減壓蒸除溶劑后，得一次粗分物。該粗分物中的新狼毒素B含量為45％～55％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑，亦可作為農(nóng)用殺菌劑原藥出售。
1.4、在對(duì)一次粗分物進(jìn)行硅膠柱層析時(shí)，采用常規(guī)干柱層析。采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑裝柱，同時(shí)又作為洗脫劑。以新狼毒素B標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用TLC法或HPLC法對(duì)各流份進(jìn)行檢測(cè)。合并含有新狼毒素B的所有流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得二次粗分物。該粗分物中的新狼毒素B含量為80％～90％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑。
1.5、對(duì)二次粗分物的純化采用sephadex LH-20凝膠色譜進(jìn)行。柱子的規(guī)格為高度/直徑10∶1。sephadex LH-20的粒度為300目。上樣量為柱中sephadex LH-20用量的1/50倍。以甲醇為洗脫劑，收集合并僅含新狼毒素B的流份，減壓濃縮后可獲得新狼毒素B精品，其收率約為上樣量的85％～90％，相當(dāng)于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為95％～99％。
2、新狼毒素B作為植物殺菌劑的應(yīng)用本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了新狼毒素B在植物殺菌方面的新作用和新用途，填補(bǔ)了狼毒和新狼毒素B在植物殺菌方面的研究空白。研究結(jié)果證實(shí)，新狼毒素B在2200mg·L-1濃度對(duì)蘋(píng)果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等植物病原菌的抑制率分別為81.1％，80.0％，77.3％，87.8％，98.5％，96.8％，81.0％。因此，新狼毒素B有望成為新的植物源農(nóng)用殺菌劑。
3、參見(jiàn)圖2，圖2為新狼毒素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，物理參數(shù)如下新狼毒素B，淡黃色無(wú)定型固體，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)λmax298，221。IR(KBr)υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMR δ(CD3COCD3)2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下為H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13CNMRδ(CD3COCD3)48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)，127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2″′)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9′′)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。
參見(jiàn)圖3，HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，WatersALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)296nm。
權(quán)利要求
1.一種瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟將狼毒根粉加入溶劑進(jìn)行提取，然后進(jìn)行第一次硅膠柱層析粗分，得一次粗分物，再進(jìn)行第二次硅膠柱層析粗分，得二次粗分物，再對(duì)二次粗分物進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間30～50min，提取液經(jīng)過(guò)濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的新狼毒素B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)將狼毒根粉碎，按照狼毒根粉重量(kg)和溶劑體積(L)1∶4～1∶10的比例，采用間歇式超聲波提取，提取溫度30℃～55℃，每批原材料采用同種溶劑連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間為30～50min，超聲功率為1.8W，每次超聲時(shí)間為6s，兩次超聲之間的時(shí)間間隔為4s；(2)每次提取結(jié)束后，采用離心過(guò)濾，收集濾液，將3次提取液合并，負(fù)壓蒸除溶劑后，得粗提物，回收的溶劑可反復(fù)使用，總提取率根據(jù)溶劑的種類不同而不同，一般為7％～21％，粗提物中新狼毒素B的含量為5％～25％，粗提物無(wú)需分離純化，可直接用于配制植物殺菌劑水乳劑，也可選用其他有機(jī)溶劑對(duì)該粗提物進(jìn)行二次超聲提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于新狼毒素B的粗分；(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成質(zhì)量濃度約20％的溶液，在不斷攪拌下，加入相當(dāng)于粗提物3～7倍質(zhì)量的200目的柱層析硅膠，將拌樣后的硅膠在常溫下晾干，加到硅膠柱的頂端，進(jìn)行干柱層析，依次采用氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行洗脫，收集乙酸乙酯流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得一次粗分物，該粗分物中的新狼毒素B含量為40％～50％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑；(4)將一次粗分物采用與(3)類似的方法進(jìn)行柱層析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，以新狼毒素B標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用TLC法或HPLC法對(duì)各流份進(jìn)行檢測(cè)，合并含有新狼毒素B的流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得二次粗分物，該粗分物中的新狼毒素B含量為80％～90％，可直接用于配制醫(yī)用或農(nóng)用殺菌劑；(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱進(jìn)行純化，收集含有新狼毒素B的流份，負(fù)壓蒸除溶劑后，得新狼毒素B精品，含量為90％～95％，可作為標(biāo)準(zhǔn)樣品或分析純化學(xué)試劑使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于所述步驟(1)中，提取溶劑選用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇，提取方案包括A.直接用乙酸乙酯或丙酮進(jìn)行超聲提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，提取溫度為30℃～55℃，所得粗提取物為淡黃色無(wú)晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱層析分離，乙酸乙酯和丙酮的提取率分別為5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇進(jìn)行超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物殺菌劑或二次提取，本次提取率為18％～25％，用丙酮對(duì)甲醇粗提物進(jìn)行二次超聲提取，提取條件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相當(dāng)于所用植物材料的10％～12％，為黃色無(wú)晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱層析分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于所述步驟(2)中，將粗提物用丙酮配成質(zhì)量濃度約20％的溶液，加入3～7倍質(zhì)量的柱層析用硅膠，室溫晾干拌樣后的硅膠或用40℃熱風(fēng)常壓干燥，然后加到硅膠柱頂端進(jìn)行第一次干柱層析粗分，硅膠柱的規(guī)格為高度/直徑10∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的1～3倍，首先采用氯仿進(jìn)行洗脫，直到流出液幾乎無(wú)色為止，然后換用乙酸乙酯洗脫，直至TLC或HPLC檢測(cè)無(wú)新狼毒素B流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶劑后得一次粗分物，其質(zhì)量為上樣量的40％～50％，該粗分物的新狼毒素B含量為40％～50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于所述步驟(3)中，將一次粗分物用丙酮配成飽和溶液，加到硅膠柱頂端進(jìn)行濕柱硅膠層析，硅膠柱的規(guī)格為高度/直徑20∶1，硅膠填充料的粒度為100～300目，其用量為上樣量的50～100倍，以氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶劑作為洗脫劑，收集含有新狼毒素B的主要流份，蒸除溶劑后得二次粗分物，黃色無(wú)晶形粉末，其質(zhì)量為上樣量的40％～50％，新狼毒素B的含量為80％～90％。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于所述步驟(4)中，將二次粗分物用甲醇配成飽和溶液，并事先用甲醇平衡過(guò)的sephadex LH-20進(jìn)行純化，柱子的規(guī)格為高度/直徑10∶1，sephadex LH-20的粒度為200～400目，上樣量為柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇為洗脫劑，減壓濃縮含新狼毒素B的流份，得新狼毒素B精品，其質(zhì)量為上樣量的85％～90％，整個(gè)工藝的總收率相當(dāng)于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，純度為90％～95％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法，其特征在于新狼毒素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和特征物理參數(shù)如下 新狼毒素B(neochamaejasmine B)新狼毒素B，淡黃色無(wú)定型固體，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)λmax298，221。IR(KBr)υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMRδ(CD3COCD3)2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下為H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13C NMRδ(CD3COCD3)48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)， 127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9″)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。HPLC圖譜洗脫劑CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高壓液相色譜儀，柱子為Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒徑4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)296nm。
9.一種瑞香狼毒中新狼毒素B作為植物殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述殺菌劑以瑞香狼毒根提取物為原料，以新狼毒素B為主要?dú)⒕行С煞?，用于預(yù)防和治療由蘋(píng)果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternaria solani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，煙草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici.)等引起的植物病害。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的瑞香狼毒中新狼毒素B作為植物殺菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述新狼毒素B為2200mg·L-1濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分離方法及其應(yīng)用，其從瑞香狼毒根中分離鑒定出一個(gè)對(duì)多種植物病原菌具有抑制和殺滅作用的廣譜性殺菌活性成分，即新狼毒素B，本發(fā)明包括以下操作步驟以瑞香狼毒根為原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯與丙酮的混合物為溶劑，采用30℃～55℃超聲波常壓連續(xù)提取3次，每次提取時(shí)間30～50min。提取液經(jīng)過(guò)濾、濃縮和柱色譜層析獲得60％～99％的新狼毒素B。
文檔編號(hào)C07D407/00GK1544433SQ20031010594
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月20日
發(fā)明者周樂(lè), 周 樂(lè) 申請(qǐng)人:周樂(lè), 周 樂(lè)