專利名稱：Tnf－樣分泌性蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎的蛋白質(zhì)INSP058，經(jīng)本發(fā)明鑒定為一種TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)，本發(fā)明還涉及該蛋白質(zhì)和編碼基因的核酸序列在診斷、預(yù)防和治療疾病中的應(yīng)用。
本文所引用的出版物、專利和專利申請，均納入其全文作為參考。
背景技術(shù)：
目前，藥物發(fā)現(xiàn)方法正蘊釀著一場根本革命，因為功能基因組學(xué)年代已經(jīng)來臨。術(shù)語“功能基因組學(xué)”應(yīng)用于使用生物信息學(xué)工具將功能歸因于感興趣的蛋白質(zhì)序列的方法。這些工具正日益顯示其必要性，因為序列數(shù)據(jù)產(chǎn)生的速度遠遠高于研究實驗室將功能劃分給這些蛋白質(zhì)序列的能力。
隨著生物信息學(xué)工具的功效和準確性提高，這些工具正快速取代生物化學(xué)特性鑒定的常規(guī)技術(shù)。事實上，鑒定本發(fā)明所用的先進生物信息學(xué)工具現(xiàn)在能夠輸出可獲得較高置信度的結(jié)果。
各所研究院和商業(yè)機構(gòu)正在檢查已有的序列數(shù)據(jù)，并且逐漸獲得重大發(fā)現(xiàn)。例如，Incyte Genomics，Inc.提交了一個專利申請，公開號為WO 00/68380，該專利申請涉及人胞外基質(zhì)與粘著相關(guān)蛋白質(zhì)(EXMAD)有關(guān)的序列以及鑒定和編碼EXMAD的聚核苷酸。然而，仍然有必要鑒定和特性分析其它基因和它們編碼的多肽，作為研究和藥物發(fā)現(xiàn)的目標。
分泌性蛋白質(zhì)細胞制造和分泌胞外蛋白質(zhì)的能力是許多生物過程的中心。酶、生長因子、胞外基質(zhì)蛋白和信號傳導(dǎo)分子全部由細胞分泌出來。這是分泌小泡與質(zhì)膜融合所致。多數(shù)情況下，但不是所有情況，蛋白質(zhì)被信號肽導(dǎo)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并進入分泌小泡。信號肽是順式作用序列，影響多肽鏈從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至膜結(jié)合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌進入胞外基質(zhì)，或者留在質(zhì)膜內(nèi)。留在質(zhì)膜內(nèi)的多肽有一或多個跨膜結(jié)構(gòu)域。在細胞機能中發(fā)揮中心作用的分泌性蛋白質(zhì)的例子是細胞因子、激素、胞外基質(zhì)蛋白(粘附分子)、蛋白酶、TNF樣蛋白質(zhì)及生長和分化因子。
因此，分泌性蛋白質(zhì)活性的改變?yōu)楦淖兗膊”硇吞峁┝艘环N手段，這樣，鑒定新穎的分泌性蛋白質(zhì)特別是TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)是有密切聯(lián)系的，這是因為它們在某些疾病中起著一定作用，因而可用于研究新的療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)INSP058蛋白質(zhì)是TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第一方面一實施例提供一種多肽，該多肽(i)包括SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO12所示的氨基酸序列；(ii)是其片段，該片段是TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
本發(fā)明第一方面第二實施例提供一種多肽，該多肽(i)由SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO12所示的氨基酸序列組成；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
較佳地，第一或第二實施例的片段或功能等同物由SEQ ID NO9和/或SEQ ID NO16所示的氨基酸序列組成。
下文將具有SEQ ID NO8所示的序列的多肽稱為“INSP058多肽”。此處也將該蛋白質(zhì)稱為TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)。鑒定該蛋白質(zhì)為已知功能蛋白質(zhì)的最接近聯(lián)系物是補體1q蛋白質(zhì)。補體1q(C1q)蛋白質(zhì)是TNF相關(guān)蛋白質(zhì)，這是因為晶體學(xué)研究已經(jīng)揭示，TNF和小鼠ACRP30的球狀g C1q結(jié)構(gòu)域有極其密切關(guān)系的三級結(jié)構(gòu)和三聚組織，提示TNF與C1q家族之間有進化聯(lián)系。到目前為止，人C1q基因家族包含13個成員，包括諸如CRF、ACRP30、CORS26、EMILIN-1、EMILIN-2等膠原成員、膠原蛋白VII和X以及諸如precerebellin和multimerin等非膠原成員。ACRP30是一種豐富的血清蛋白質(zhì)，應(yīng)答胰島素而在脂肪組織中合成，在肥胖的小鼠和人體內(nèi)下調(diào)。關(guān)于C1q家族的最新綜述，可參見Bodmer等的文章(TRENDS in Biochemical Sciences27(1)19-26，2002)。
C1q家族成員可用來治療、預(yù)防和/或診斷醫(yī)學(xué)病癥和疾病，譬如細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎癥疾病，包括過敏癥、炎癥性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道發(fā)炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化癥、血栓癥、敗血癥、休克、再灌注損傷和缺血；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和疼痛；發(fā)育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質(zhì)疏松和肥胖、AIDS和腎?。桓腥?，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病癥，特別是由C1q家族蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些。
可以預(yù)測，INSP058多肽由三個外顯子編碼(外顯子1編碼具有SEQ IDNO2所示序列的多肽，外顯子2編碼具有SEQ ID NO4所示序列的多肽，外顯子3編碼具有SEQ ID NO6所示序列的多肽)?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了一個與SEQ ID NO8有一定相似性的序列，但該蛋白質(zhì)沒有被注釋為帶有TNF-樣折疊的分泌性蛋白質(zhì)。此多肽序列在國際專利申請WO 00/68380中以SEQID NO8表示，明確地排除于本發(fā)明這一方面的范圍內(nèi)。
下文將具有SEQ ID NO10所示的序列的多肽稱為“INSP058SV多肽”或“INSP058SV”。INSP058SV多肽是INSP058多肽的剪報變體，經(jīng)由在外顯子3中間部分缺失產(chǎn)生(SEQ ID NO5)。此缺失以及外顯子3一部分的缺失，在核苷酸序列中引入了讀框移動，結(jié)果是一個早期終止密碼子，這樣，翻譯INSP058SV多肽的長度比INSP058多肽短得多(圖10)。INSP058SV蛋白質(zhì)缺少一個與C1q結(jié)構(gòu)域匹配的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在全長INSP058可以找到，提示INSP058SV可以是INSP058的拮抗劑，例如起著與多肽INSP058譯本競爭受體上同一個結(jié)合位的作用。在這種機制中，INSP058SV多肽不會刺激受體，因此不會誘導(dǎo)正常的生物作用。所以，這種多肽可以是天然多肽的競爭抑制劑。
雖然申請人并不希望受此理論約束，但要求INSP058多肽和INSP058SV多肽各自的首15個氨基酸形成信號肽。
SEQ ID NO14是無信號序列的全長INSP058多肽序列。下文將具有SEQID NO14所示的序列的多肽稱為“INSP058成熟多肽”。
本文所用的術(shù)語“INSP058多肽”包括含有INSP058外顯子1多肽、INSP058外顯子2多肽、INSP058外顯子3多肽、INSP058多肽和INSP058成熟多肽的多肽。
SEQ ID NO16是無信號序列的全長INSP058SV多肽序列。下文將具有SEQ ID NO16所示的序列的多肽稱為“INSP058SV成熟多肽”。
本文所用的術(shù)語“INSP058SV多肽”包括含有INSP058SV成熟多肽的多肽。
本發(fā)明第二方面提供一種編碼本發(fā)明第一方面的多肽的純化核酸分子。該純化核酸分子最好包括SEQ ID NO7(編碼INSP058多肽)、SEQ ID NO9(編碼INSP058SV多肽)、SEQ ID NO11(編碼成熟INSP058外顯子1多肽)、SEQ ID NO13(編碼成熟INSP058多肽)、SEQ ID NO15(編碼成熟INSP058SV多肽)所示的核酸序列，或者是該序列的一個冗余等同物或片段。
本發(fā)明還提供該純化核酸分子由SEQ ID NO7(編碼INSP058多肽)、SEQID NO9(編碼INSP058SV多肽)、SEQ ID NO11(編碼成熟INSP058外顯子1多肽)、SEQ ID NO13(編碼成熟INSP058多肽)、SEQ ID NO15(編碼成熟INSP058SV多肽)所示的核酸序列組成，或者是該序列的一個冗余等同物或片段。
本發(fā)明第三方面提供一種在高度嚴謹條件下與本發(fā)明第二方面的核酸分子雜交的純化核酸分子。
本發(fā)明第四方面提供一種含有本發(fā)明第二或第三方面的核酸分子的載體，例如表達載體。
本發(fā)明第五方面提供一種用本發(fā)明第四方面的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
本發(fā)明第六方面提供一種特異性地結(jié)合本發(fā)明第一方面的多肽的配體。較佳地，所述配體抑制本發(fā)明第一方面的多肽的功能，后者是具有TNF--樣活性的分泌性蛋白質(zhì)。本發(fā)明多肽的配體可以有各種形式，包括天然或修飾基質(zhì)、酶、受體、有機小分子(如分子量最多為2000D最好800D或以下的天然或合成有機小分子)、肽模擬物、無機分子、肽、多肽、抗體、上述物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能模擬物。
本發(fā)明第七方面提供一種化合物，它能有效地改變編碼本發(fā)明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者能調(diào)節(jié)本發(fā)明第一方面的多肽的活性。
本發(fā)明第七方面的化合物可增加(激動)或者減少(拮抗)多肽的基因表達水平或活性。重要的是，對INSP058多肽功能的鑒定允許設(shè)計能夠鑒定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的篩選方法。本發(fā)明第六和第七方面的配體和化合物可用這樣的方法鑒定。這些方法包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明第八方面提供本發(fā)明第一方面的多肽，或者本發(fā)明第二或第三方面的核酸分子，或者本發(fā)明第四方面的載體，或者本發(fā)明第五方面的宿主細胞，或者本發(fā)明第六方面的配體，或者本發(fā)明第七方面的化合物在治療或診斷涉及TNF--樣分泌性蛋白質(zhì)的疾病中的應(yīng)用。這些疾病可包括但不限于細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎癥疾病，包括過敏癥、炎癥性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道發(fā)炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化癥、血栓癥、敗血癥、休克、再灌注損傷和缺血；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和疼痛；發(fā)育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質(zhì)疏松和肥胖、AIDS和腎病；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病癥，特別是由C1q家族蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些。這些分子也可用來制造治療上述疾病的藥物。本發(fā)明第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的一部分分子也可用制造治療上述疾病的藥物。
本發(fā)明第九方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估所述病人組織中編碼本發(fā)明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發(fā)明第一方面的多肽的活性，并將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法最好在體外進行?？捎妙愃品椒ūO(jiān)測對病人疾病的治療，其中多肽或核酸分子的表達水平或活性在一段時間內(nèi)趨向于對照水平，表示該疾病獲得緩解。
檢測本發(fā)明第一方面的多肽的優(yōu)選方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽復(fù)合物的條件下，將本發(fā)明第六方面的一種配體，例如抗體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述復(fù)合物。
本領(lǐng)域的讀者將懂得，本發(fā)明第九方面的方法有很多種，例如，核酸與短探針雜交法、點突變分析法、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增法以及使用抗體檢測異常蛋白水平的方法。類似方法的使用可以是短期或長期，以治療病人被監(jiān)測的疾病。本發(fā)明還提供一些用于這些方法中診斷疾病的試劑盒。
較佳地，用本發(fā)明第九方面的方法診斷的疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的疾病，如上所述。
本發(fā)明第十方面提供本發(fā)明第一方面的多肽作為TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
本發(fā)明第十一方面提供一種藥物組合物，該組合物含有本發(fā)明第一方面的多肽，或者本發(fā)明第二或第三方面的核酸分子，或者本發(fā)明第四方面的載體，或者本發(fā)明第五方面的宿主細胞，或者本發(fā)明第六方面的配體，或者本發(fā)明第七方面的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明第十二方面提供本發(fā)明第一方面的多肽，或者本發(fā)明第二或第三方面的核酸分子，或者本發(fā)明第四方面的載體，或者本發(fā)明第五方面的宿主細胞，或者本發(fā)明第六方面的配體，或者本發(fā)明第七方面的化合物在制造診斷或治療疾病的藥物中的應(yīng)用。
較佳地，所述疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的疾病，如上所述。
本發(fā)明第十三方面提供一種治療病人疾病的方法，該方法包括把本發(fā)明第一方面的多肽，或者本發(fā)明第二或第三方面的核酸分子，或者本發(fā)明第四方面的載體，或者本發(fā)明第五方面的宿主細胞，或者本發(fā)明第六方面的配體，或者本發(fā)明第七方面的化合物給予該病人。
當與健康受試者中編碼本發(fā)明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發(fā)明第一方面的多肽的活性相比，患病病人的該表達水平或活性較低的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、宿主細胞、配體或化合物應(yīng)該是激動劑。相反，當與健康受試者中所述多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性較高的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、宿主細胞、配體或化合物應(yīng)該是拮抗劑。拮抗劑的例子包括反義核酸分子、核酶和配體，例如抗體。
較佳地，所述疾病是涉及TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的疾病，如上所述。
本發(fā)明第十四方面提供轉(zhuǎn)基因或剔除非人動物，它們被轉(zhuǎn)化為表達本發(fā)明第一方面的多肽的更高水平、更低水平或不表達。這些轉(zhuǎn)基因動物是研究疾病極為有用的模型，也可用在鑒定有效治療或診斷該疾病的化合物的篩選方案中。
以下，給出為實施本發(fā)明而可采用的標準技術(shù)和步驟的概要。應(yīng)明白，本發(fā)明并不限于所述的這些具體方法、方案、細胞系、載體和試劑。還應(yīng)明白，本文所用的術(shù)語目的僅在于描述具體實施例，該術(shù)語不應(yīng)該被看成為限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍只由所附權(quán)利要求書的術(shù)語限定。
本說明書中核苷酸和氨基酸使用標準縮寫。
除非另有指出，本發(fā)明的做法是采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們都已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。
這些技術(shù)在有關(guān)文獻中已有詳細解釋。例如，可參考以下特別適用的文獻Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154&155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein PurificationPrinciples and Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的術(shù)語“多肽”包括含有相互間以肽鍵或修飾肽鍵連接的兩個或以上氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)，即肽同構(gòu)物(isostere)。該術(shù)語指短鏈(肽和寡肽)和長鏈(蛋白質(zhì))。
本發(fā)明的多肽可以是成熟蛋白質(zhì)形式，或者可以是前(pre-，pro-，prepro-)蛋白質(zhì)，其可通過切割前部分而被激活，產(chǎn)生活性成熟多肽。這些多肽中的前序列可以是先導(dǎo)序列或者分泌序列或者是用來純化成熟多肽序列的序列。
本發(fā)明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，有利的往往包括一或多個附加氨基酸序列，這些附加氨基酸序列可含有分泌序列或先導(dǎo)序列、前序列(pro-sequences)、有助純化的序列、或者例如在重組生產(chǎn)中賦予蛋白質(zhì)更高穩(wěn)定性的序列。另一個選擇或者另一方面是，成熟多肽可與另一種化合物，例如與延長該多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
多肽可含有由天然過程，例如翻譯后加工，或者由本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸，它們不同于20個基因編碼的氨基酸。在已知的修飾中，本發(fā)明的多肽通常帶有的修飾是糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸化、例如谷氨酸殘基的γ-羧酸化，羥基化和ADP-核糖基化。其它可能的修飾包括乙?；?、酰化、酰胺化、黃素的共價附著、血素分子的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯(lián)形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸鹽形成、甲?；?、GPI錨著形成、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒?；⑥D(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)中插入氨基酸例如精氨?；?，以及遍在蛋白化。
修飾可發(fā)生于多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。事實上，天然存在的肽和合成肽一般通過共價修飾封閉肽的氨基或羧基末端，或者封閉二者，這樣的修飾存在于本發(fā)明的多肽中。
發(fā)生在多肽內(nèi)的修飾通常是隨制成該多肽而變化。對于重組制成的多肽，通過特定宿主細胞翻譯后修飾能力以及存在于所述多肽的氨基序列中的修飾信號來確定大部分修飾的性質(zhì)和程度。例如，不同類型的宿主細胞之間糖基化型式是不同的。
本發(fā)明的多肽可以任何合適的方式制成。這些多肽包括分離的天然存在的多肽(例如自細胞培養(yǎng)基中純化而來)、重組產(chǎn)生的多肽(包括融合蛋白)、合成產(chǎn)生的多肽或者通過這些方法組合所產(chǎn)生的多肽。
本發(fā)明第一方面的功能等同多肽可以是與INSP058多肽同源的多肽。如果一個多肽的序列與另一個多肽的序列具有足夠高程度的同一性或相似性，本文就用術(shù)語“同源的”來形容該兩個多肽?！巴恍浴北硎驹诒葘π蛄械娜魏翁囟ㄎ恢蒙?，兩個序列之間的氨基酸殘基是相同的?！跋嗨菩浴北硎驹诒葘π蛄械娜魏翁囟ㄎ恢蒙?，兩個序列的氨基酸殘基是相似的。同一性和相似性的程度不難計算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP058多肽的天然生物變體(例如，產(chǎn)生多肽的物種內(nèi)等位基因變體或地理變體)和突變體(例如，含有氨基酸取代、插入或缺失的突變體)。這些突變體可包括其一或多個氨基酸殘基被保守性或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)取代的多肽，這樣一個取代的氨基酸殘基可以或不必是遺傳密碼編碼的殘基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間；在Asn和Gln之間；在堿性殘基Lys和Arg之間；或者在芳香族殘基Phe和Tyr之間。特別優(yōu)選的是這樣一些變體有多個氨基酸，即5至10個氨基酸，1至5個氨基酸，1至3個氨基酸，1至2個氨基酸，或者僅有1個氨基酸以任意組合取代、缺失或插入的變體。特別優(yōu)選的是不改變該蛋白質(zhì)的性質(zhì)和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特別優(yōu)選的還有保守性取代。這些突變體也包括其中一或多個氨基酸殘基包括一取代基團的多肽。
通常，兩個多肽之間的同一性大于30％，就認為它們在功能上是等同的。本發(fā)明第一方面的功能等同多肽與INSP058多肽，或其活性片段的序列同一性優(yōu)選大于80％。更好的多肽與INSP058多肽的序列同一性分別具有大于85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
本發(fā)明第一方面的功能等同多肽還可以是已用一或多種結(jié)構(gòu)對比技術(shù)鑒定的多肽。例如，可以應(yīng)用Inpharmatica Genome Threader技術(shù)(它構(gòu)成用于產(chǎn)生Biopendium檢索數(shù)據(jù)庫的檢索工具的其中一部分，參見共同待審批PCT專利申請PCT/GB01/01105)來鑒定現(xiàn)時具有未知功能的多肽，這些多肽雖然與INSP058多肽具有較低的序列同一性，但由于與INSP058多肽序列共享較高水平的結(jié)構(gòu)同源性，故可預(yù)計它們有TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的功能。“較高水平的結(jié)構(gòu)同源性”指用Inpharmatica Genome Threader預(yù)測兩個蛋白質(zhì)確定共享10％和以上的結(jié)構(gòu)同源性。
本發(fā)明第一方面的多肽還包括INSP058多肽的片段、INSP058多肽的功能等同物的片段，只要那些片段保留了TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的功能，或者帶有與INSP058多肽相同的抗原性決定簇。
本文所用的術(shù)語“片段”指氨基酸序列與INSP058多肽或它的其中一種功能等同物的部分而非全部氨基酸序列相同的多肽。這些片段應(yīng)包括所述序列的至少n個保守性氨基酸，取決于特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性決定簇。
全長INSP058多肽的片段可由1或多個相鄰?fù)怙@子序列的組合或者由部分外顯子序列的組合組成。例如，這樣的組合可包括INSP058多肽的外顯子1、2和外顯子3的部分序列，INSP058SV就是這樣的情況。
這些片段可以是“獨立的(free-standing)”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分，也不與其它氨基酸或多肽融合，或者它們可包含在它們構(gòu)成其中一部分或區(qū)域的較大多肽之內(nèi)。當包含在較大多肽之內(nèi)時，本發(fā)明的片段最好構(gòu)成單個連續(xù)區(qū)域。例如，一些優(yōu)選實施例涉及一個片段，其具有與該片段的氨基末端融合的前多肽區(qū)域，和/或具有與該片段的羧基末端融合的附加區(qū)域。然而，單一個較大多肽內(nèi)可含有多個片段。
本發(fā)明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一個抗原性決定簇)可被應(yīng)用來產(chǎn)生對這些多肽有免疫特異性的配體，例如多克隆或單克隆抗體。這些抗體可用于分離或鑒定表達本發(fā)明的多肽的克隆，或者用于親和力層析法純化這些多肽?？贵w還可用來幫助診斷或治療，以及其它應(yīng)用，這對本發(fā)領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
術(shù)語“免疫特異性”指抗體對本發(fā)明的多肽的親和力遠遠大于它們對現(xiàn)有領(lǐng)域其它相關(guān)多肽的親和力。本文所用的術(shù)語“抗體”指能夠與所述抗原性決定簇結(jié)合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，這些抗體與本發(fā)明第一方面的多肽結(jié)合。
“遠遠較大的親和力”指的是與已知的分泌性蛋白質(zhì)的親和力相比，本發(fā)明多肽的親和力有可測量的增大。
較佳的是，對本發(fā)明多肽的親和力相對于已知的細胞表面受體多肽至少增大1.5倍，2倍，5倍，10倍，100倍，103倍，104倍，105倍、106倍。
如果需要多克隆抗體，可用本發(fā)明第一方面的多肽使一種選定哺乳動物免疫，例如小鼠、兔、山羊或馬。用來免疫動物的多肽可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或者可通過化學(xué)方法合成。有需要的時候，可將多肽與一載體蛋白質(zhì)連接。通過化學(xué)方法與多肽偶聯(lián)的常用載體包括牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血藍蛋白。然后，用偶聯(lián)的多肽來免疫動物。采集該免疫動物的血清，再按公知的程序，例如免疫親和力層析法加以處理。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地生產(chǎn)針對本發(fā)明第一方面的多肽的單克隆抗體。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體的一般方法已為人所公知(例如，參見Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 472(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可針對各種性質(zhì)，即同種型、表位、親和力等，篩選對本發(fā)明第一方面的多肽產(chǎn)生的多系列單克隆抗體。單克隆抗體特別用于純化它們所針對的各種多肽。另一方面，編碼感興趣的單克隆抗體的基因可通過例如本領(lǐng)域公知的PCR技術(shù)在雜交瘤中分離出來，并可在適當載體中克隆和表達。
還可使用嵌合抗體，其中非人的可變區(qū)與人穩(wěn)定區(qū)連接或融合(例如，參見Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可對抗體進行修飾，例如通過使它人源化，以便在某一個體內(nèi)的免疫原性減弱(參見ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”指非人供體抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)內(nèi)CDR氨基酸和選定的其它氨基酸已經(jīng)被人抗體的等同氨基酸所取代的抗體分子。所以，人源化抗體與人抗體極為相近，但具有與該供體抗體結(jié)合的能力。
另一個選擇是，抗體可以是“雙特異性”抗體，即它是一種有兩個不同抗原結(jié)合區(qū)的抗體，每一結(jié)合區(qū)針對不同表位。
可應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)選擇基因，所述基因編碼具有與本發(fā)明多肽結(jié)合的活性的抗體，多肽來自為具有相關(guān)抗體而篩選的以PCR技術(shù)擴增的人淋巴細胞V基因庫，或者天然文庫(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。這些抗體的親和力也可通過鏈改組加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技術(shù)產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體有額外應(yīng)用，因為它們可用作免疫測定法、放射性免疫測定法(RIA)或者酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)中的試劑。這些應(yīng)用可使用可分析檢測到的試劑，例如放射性同位素、螢光分子或酶來標記抗體。
本發(fā)明第二和第三方面的優(yōu)選核酸分子是編碼SEO ID NO8所示的多肽序列和功能上等同的多肽的那些分子。這些核酸分子可用于本文描述的方法和應(yīng)用中。本發(fā)明的核酸分子最好含有至少n個本文所公開的序列中的連續(xù)核苷酸，取決于特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本發(fā)明的核酸分子還包括上述核酸分子的補體序列(例如，用于反義或探測目的)。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因組DNA。這樣一些核酸分子可通過克隆、化學(xué)合成技術(shù)或其組合獲得。例如，核酸分子可通過應(yīng)用諸如固相亞磷酰胺化學(xué)合成從基因組或cDNA文庫化學(xué)合成，或者從生物體中分離而制備。RNA分子的產(chǎn)生是運用DNA序列的體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄。
核酸分子可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱有義鏈，或者它可以是非編碼鏈，也稱反義鏈。
術(shù)語“核酸分子”還包括DNA和RNA類似物，例如含有修飾骨架的那些類似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的術(shù)語“PNA”指反義分子或反基因試劑，其含有長至少5個核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與最好以賴氨酸為末端的氨基酸殘基肽骨架連接。該末端賴氨酸使組合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延長它們在細胞內(nèi)的停留時間，在細胞內(nèi)它們優(yōu)先與補體單鏈DNA和RNA結(jié)合，并終止轉(zhuǎn)錄延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)AnticancerDrug Des.853-63)。
編碼SEQ ID NO8所示的多肽的核酸分子可與SEQ ID NO7所示的核酸分子的編碼序列相同。
這些分子還可以有另一個不同序列，因為遺傳密碼簡并性，該不同序列編碼SEQ ID NO8所示的多肽。這樣一些核酸分子可包括，但不限于，成熟多肽自身的編碼序列；成熟多肽的編碼序列加上附加編碼序列，例如編碼先導(dǎo)序列或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的編碼序列，加上或不加上前述附加編碼序列，再加上另外一些非編碼序列，包括非編碼5’和3’序列，例如在轉(zhuǎn)錄(包括終止信號)、核糖體結(jié)合和mRNA穩(wěn)定性中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄非翻譯序列。核酸分子還包括編碼附加氨基酸的附加序列，例如提供附加功能的那些氨基酸。
本發(fā)明第二和第三方面的核酸分子也可編碼本發(fā)明第一方面的多肽及片段的片段或功能等同物。這樣一種核酸分子可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體，或者該分子可以是未知是天然存在的變體。核酸分子的非天然存在的變體可通過誘變技術(shù)制成，包括適用于核酸分子、細胞或生物體的那些技術(shù)。
就此而言，這些變體是通過核苷酸取代、缺失或插入而不同于上述核酸分子的變體。取代、缺失或插入可涉及一或多個核苷酸。變體可在編碼區(qū)或非編碼區(qū)或者二者內(nèi)發(fā)生變化。編碼區(qū)內(nèi)的變化可產(chǎn)生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。
本發(fā)明的核酸分子也可以采用本領(lǐng)域公知的方法為多種原因而進行改造，這些原因包括修飾克隆、加工、和/或基因產(chǎn)物(多肽)的表達。可用來改造核苷酸序列的技術(shù)還包括應(yīng)用隨機斷裂所作的DNA改組、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新裝配。可利用定點誘變插入新的限制位點，改變糖基化模式，修改密碼子偏向，產(chǎn)生剪接變體，引入突變等等。
編碼本發(fā)明第一方面的多肽的核酸分子可與異源序列連接，以致該組合核酸分子編碼融合蛋白。這樣一些組合核酸分子包括在本發(fā)明第二和第三方面之內(nèi)。例如，要在肽庫中篩選抑制多肽活性的抑制劑，用這種組合核酸分子表達可被市售抗體識別的融合蛋白是有用的。融合蛋白還可被改造成含有位于本發(fā)明多肽的序列與異源蛋白質(zhì)的序列之間的切割位點，這樣，切割該多肽，從該異源蛋白質(zhì)中純化出來。
本發(fā)明的核酸分子還包括一些反義分子，它們與編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子部分互補，因而與編碼核酸分子雜交。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，這些反義分子，例如寡核苷酸，可設(shè)計成識別、特異性地結(jié)合以及防止編碼本發(fā)明多肽的靶核酸的轉(zhuǎn)錄(例如，參見Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的術(shù)語“雜交”指兩個核酸分子通過氫鍵相互締合。通常，將一個分子固定于固相支持物上，而另一個分子在溶液中游離。然后，在有利氫鍵鍵合的條件下使兩個分子相互接觸。影響鍵合的因素包括溶劑的類型和體積；反應(yīng)溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相分子與固相支持物非特異性附著的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO)；分子的濃度；提高分子締合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；雜交后洗滌條件的嚴謹程度(參見上述文獻Sambrook等)。
應(yīng)用本領(lǐng)域公知的雜交測定法(例如，參見上述文獻Sambrook等，同上)，可檢查一個完全互補分子與靶分子雜交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)的教導(dǎo)，在不同嚴謹程度的條件下，使基本上同源的分子競爭并抑制完全同源的分子與靶分子的結(jié)合。
“嚴謹程度”指在雜交反應(yīng)中與不同的分子締合相比，有利于極度相似的分子締合的條件。高度嚴謹雜交條件定義為42℃下在一溶液中培養(yǎng)過夜，該溶液含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性剪切鮭魚精子DNA，然后，約65℃下在0.1X SSC中洗滌過濾器。低度嚴謹條件涉及在35℃下進行的雜交反應(yīng)(參見上述文獻Sambrook等)。雜交使用的優(yōu)選條件是高度嚴謹雜交條件。
本發(fā)明該方面的優(yōu)選例子是其全長至少有70％與編碼INSP058多肽(SEQID NO8)的核酸分子相同的核酸分子以及基本上與這些核酸分子互補的核酸分子。本發(fā)明該方面的優(yōu)選核酸分子含有一區(qū)域，該區(qū)域的全長至少有97％與此編碼序列相同，或者是一個互補核酸分子。就此而言，特別優(yōu)選的是其全長至少有98％，優(yōu)選至少99％或以上與所述核酸分子相同的核酸分子。優(yōu)選的例子是編碼基本上保留與INSP058多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本發(fā)明還提供一種檢測本發(fā)明核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)在雜交條件下，將本發(fā)明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；以及(b)檢測所形成的任何雙鏈體。
下文另外討論關(guān)于本發(fā)明可采用的測定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因組DNA的雜交探針，分離編碼INSP058多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及分離與編碼該多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因組克隆。
在這點上，可以使用以下技術(shù)，其中包括已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，為了舉例說明討論如下。DNA的測序和分析方法已為人公知，在本領(lǐng)域中可以得到，事實上這些方法也用于以下討論的本發(fā)明很多實施例中。這些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列諾片段測序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐熱T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者這些酶的組合，以及校讀外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE擴增系統(tǒng)中找到的那些外切核酸酶。優(yōu)選的測序方法可應(yīng)用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、PeltierThermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化劑以及373和377 DNA測序儀(Perkin Elmer)等儀器進行自動操作。
一種分離編碼具有與INSP058多肽等同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本領(lǐng)域公認的標準程序用天然或人工設(shè)計的探針探測基因組或cDNA文庫(例如，參見″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，GreenePublishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特別有用的探針含有至少15個，優(yōu)選至少30個，更好是至少50個鄰接堿基，這些堿基對應(yīng)于，或者與適當?shù)木幋a基因的核酸序列(SEQ ID NO7)互補。使用可分析檢測到的試劑標記探針，方便鑒定。有用的試劑包括，但不限于，放射性同位素、螢光染料和能夠催化待檢測產(chǎn)物形成的酶。有了這些探針，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就能夠從人、哺乳動物或其它動物來源中分離出感興趣的基因組DNA、cDNA或RNA聚核苷酸編碼蛋白質(zhì)的互補拷貝，并能夠在這些來源中篩選出有關(guān)序列，例如該家族、類型和/或亞型的額外成員。
多數(shù)情況下，分離的cDNA序列是不完整的，因為編碼多肽的區(qū)域通常在5’端被截短?，F(xiàn)時有一些方法可獲得全長cDNA，或者將短cDNA延長。應(yīng)用部分核苷酸序列和本領(lǐng)域公知的方法檢測上游序列，例如啟動子和調(diào)控組件，可將這些序列延長。例如，可采用的一種方法是基于快速擴增cDNA末端的方法(RACE；例如參見Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)對這種技術(shù)進行了改進，例如使較長cDNA的檢索大大簡化。另一種稍稍不同的技術(shù)稱為“限制位點”PCR，它使用通用探針檢索鄰接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。以基于已知區(qū)域的趨異性引物，也可用反向PCR來擴增或延長序列(Triglia，T.等，(1988)Nucleic Acids Res.168186)。捕捉PCR是可使用的另一種方法，它涉及通過PCR技術(shù)擴增鄰接人和酵母人工染色體DNA中已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用來檢索未知序列的另一種方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic Acids Res.193055-3060)。另外，人們可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文庫來查看基因組DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。這種方法不需篩選文庫，可用于尋找內(nèi)含子/外顯子接合。
當篩選全長cDNA時，最好用已經(jīng)按大小進行選擇包含了較大cDNA的文庫。優(yōu)選的還有隨機引物文庫，因為它們含有較多含基因5’區(qū)的序列。對于寡d(T)文庫不能產(chǎn)生全長cDNA的情形，最好使用隨機引物文庫?；蚪M文庫可用來將序列延伸進入5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
在本發(fā)明一實施例中，本發(fā)明的核酸分子可用來進行染色體定位。在這一技術(shù)中，核酸分子特異性靶向，并能與單個人染色體的特定位置雜交。對本發(fā)明染色體的相關(guān)序列作圖譜，是確認那些序列與基因相關(guān)疾病相互關(guān)系的重要步驟。一旦將序列與準確染色體位置在圖譜反映出來，就可以將染色體上序列的物理位置與基因圖譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起來。這些數(shù)據(jù)例如可以在人類孟德爾遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫中找到(Johns Hopkins大學(xué)韋爾奇醫(yī)學(xué)庫在線提供)。然后，通過連鎖分析(物理相鄰基因的共同繼承)確定基因與定位在同一個染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。這為研究人員用定位克隆或其它基因發(fā)現(xiàn)技術(shù)檢索疾病基因提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖分析粗略確定了疾病或綜合征位于特定基因組區(qū)，定位在該區(qū)域的任何序列代表相關(guān)或調(diào)控基因，可作進一步研究。核酸分子還可用來檢測由于正常、載體或染病個體之間移位、反轉(zhuǎn)等造成染色體位置的差異。
本發(fā)明的核酸分子對于組織定位也是有價值的。這些技術(shù)通過檢測編碼多肽的mRNA可以確定該多肽在組織中的表達模式。這些技術(shù)包括原位雜交技術(shù)和核苷酸擴增技術(shù)，例如PCR。從研究中獲得的結(jié)果可知道生物體中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表達模式與突變基因編碼的mRNA的正常表達模式之間的比較研究為理解突變多肽在疾病中的作用提供了有價值的認知。不適當表達可以是時間、空間或量化。
還可采取基因沉默方法使編碼本發(fā)明多肽的基因內(nèi)源表達下調(diào)。一種方法是RNA干擾(RNAi)(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)，可用來使序列特異性翻譯后基因沉默。短dsRNA寡核苷酸在體外合成，并導(dǎo)入細胞中。這些dsRNA寡核苷酸的序列特異性結(jié)合引發(fā)靶mRNA降解，從而減少或消除靶蛋白質(zhì)表達。
評估上述基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上測量多肽的表達(例如，Western印跡)。
本發(fā)明的載體包含本發(fā)明的核酸分子，可以是克隆或表達載體。本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，它們可用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明的多肽的制備可以重組形式在宿主細胞所含的載體內(nèi)表達它們的編碼核酸分子。這些表達方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，很多方法已由上述的Sambrook和Fernandez與Hoeffler的書(1998，eds.″Gene expression systems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)詳細敘述。
一般而言，可使用適合維持、繁殖或表達核酸分子在一所需宿主內(nèi)產(chǎn)生多肽的任何系統(tǒng)或載體。應(yīng)用各種公知的常規(guī)技術(shù)，例如上述Sambrook中描述的技術(shù)，可將適當?shù)暮塑账嵝蛄胁迦胍槐磉_系統(tǒng)中。通常，可使編碼基因受控于調(diào)控組件，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點(對于細菌表達)，任選地是操縱子，以便將編碼所希望的多肽的DNA序列轉(zhuǎn)錄至轉(zhuǎn)化宿主細胞的RNA內(nèi)。
例如，適當?shù)谋磉_系統(tǒng)的例子包括染色體系統(tǒng)、附加體系統(tǒng)和病毒衍生系統(tǒng)，包括例如衍生自以下物質(zhì)的載體細菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)位子、酵母附加體、插入組件、酵母染色體組件、病毒，例如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者其組合，例如從質(zhì)粒和噬菌體遺傳因子所產(chǎn)生的載體，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色體(HACs)也可用來輸送質(zhì)粒中所含有和表達的較大DNA片段。
特別適合的表達系統(tǒng)包括微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)或者用細胞表達載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或者動物細胞系統(tǒng)。無細胞翻譯系統(tǒng)也可用來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
參照許多標準實驗手冊，例如Davis等(Basic Methods in Molecular Biology(1986))和上述Sambrook等中描述的方法，可將編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。特別適合的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、微量注射、陽離子質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕加載、彈導(dǎo)導(dǎo)入或感染(參見上述Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman&Leinwald，1998)。在真核細胞中，表達系統(tǒng)可以是暫時的(例如附加體)或者永久的(染色體整合)，取決于該系統(tǒng)的需要。
編碼核酸分子可以包括或不包括編碼調(diào)控序列例如信號肽或先導(dǎo)序列的序列，有需要的時候，例如將翻譯的多肽分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、胞質(zhì)間隙或胞外環(huán)境中。這些信號可以與該多肽內(nèi)源，或者它們可以是異源信號。先導(dǎo)序列可在翻譯后加工中被細菌宿主除去。
除了調(diào)控序列之外，希望可以加入能調(diào)節(jié)與宿主細胞生長有關(guān)的多肽表達的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的例子是對化學(xué)和物理刺激，包括調(diào)節(jié)化合物的存在，或者對各種溫度或代謝條件的應(yīng)答可引起基因的表達增大或減少的序列。調(diào)節(jié)序列是載體的那些非翻譯區(qū)，例如增強子、啟動子以及5’和3’非翻譯區(qū)。它們與宿主細胞蛋白質(zhì)相互作用，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些調(diào)節(jié)序列的強度和特異性可以是不同的。取決于所用的載體系統(tǒng)和宿主，可使用任何數(shù)量的適當轉(zhuǎn)錄和翻譯組件，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子。例如在細菌系統(tǒng)內(nèi)克隆時，可使用誘導(dǎo)型啟動子，例如Bluescript噬菌粒的雜交lacZ啟動子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM質(zhì)粒(Gibco BRL)等等。在昆蟲細胞內(nèi)可用桿狀病毒多角體蛋白啟動子。由植物細胞基因組(例如，熱激、RUBISCO和貯藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒啟動子或先導(dǎo)序列)衍生而來的啟動子或增強子可克隆到載體中。哺乳動物細胞系統(tǒng)優(yōu)選使用哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。如果需要產(chǎn)生含有序列的多個拷貝的細胞系，可使用基于SV40或EBV的載體和一適當選擇性標記物。
構(gòu)建一個表達載體，用適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可以使特定核酸編碼序列位于該載體內(nèi)，所述編碼序列相對于調(diào)節(jié)序列的定位和方向使得該編碼序列在該調(diào)節(jié)序列的“控制”下轉(zhuǎn)錄，即與DNA分子結(jié)合的RNA聚合酶在調(diào)節(jié)序列下轉(zhuǎn)錄該編碼序列。在一些情況下，有需要將序列修飾成它可以適當方向附著于調(diào)控序列，即維持讀框。
調(diào)控序列和其它調(diào)節(jié)序列可在插入載體之前先連接到核酸編碼序列。另一個選擇是，直接將編碼序列克隆到已經(jīng)含有調(diào)控序列和適當限制位點的表達載體中。
對于長時間高得率地生產(chǎn)重組多肽，最好有穩(wěn)定的表達。例如，穩(wěn)定地表達感興趣的多肽的細胞系可以用含有病毒來源復(fù)制的表達載體和/或同一個或不同載體上的內(nèi)源性表達組件和選擇性基因轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入載體之后，允許細胞先在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，再轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。選擇性標記物的目的是為選擇帶來抗性，它的存在可以使成功表達導(dǎo)入序列的細胞生長和恢復(fù)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆可應(yīng)用適合細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)進行增殖。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知哺乳動物細胞系可用作表達宿主，而哺乳動物細胞系包括美國典型菌種保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化細胞系，包括但不限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎(COS)細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK 293細胞、Bowes黑色素瘤細胞和人肝細胞癌(例如Hep G2)細胞以及其它許多細胞系。
桿狀病毒系統(tǒng)中，用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的物質(zhì)在市場上以試劑盒形式提供，可以購自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(“MaxBac”試劑盒)。這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特別適合該系統(tǒng)使用的宿主細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞。
本領(lǐng)域已經(jīng)知道很多植物細胞培養(yǎng)基和全植物遺傳表達系統(tǒng)。合適的植物細胞遺傳表達系統(tǒng)的例子包括美國專利US 5,693,506；US 5,659,122；和US5,608,143中描述的系統(tǒng)。植物細胞培養(yǎng)基的遺傳表達的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具體地說，可使用分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有轉(zhuǎn)移基因。特別是所有植物可從培養(yǎng)細胞或組織中再生，包括但不限于甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其它樹木、豆類和蔬菜的所有主要種屬。
特別優(yōu)選的細菌宿主細胞的例子包括鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草芽孢桿菌細胞。
特別適合真菌表達的宿主細胞的例子包括酵母細胞(例如釀酒酵母)和曲霉菌細胞。
本領(lǐng)域已經(jīng)知道許多選擇系統(tǒng)，它們都可用來回收轉(zhuǎn)化細胞系。例如，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等人，(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy，I.等人，(1980)Cell 22817-23)基因可分別用在tk-或aprt±細胞中。
另外，選擇的基礎(chǔ)可以是抗代謝物、抗生素或除草劑抗性；例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分別賦予綠黃隆和草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性。此外，還描述了其它選擇性基因，它們的例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
雖然標記基因表達的存在或不存在提示感興趣的基因也是存在的，但它的存在和表達有待確認。例如，如果在一標記基因序列中插入相關(guān)的基因，標記基因功能不存在則可以確定含有適當序列的轉(zhuǎn)化細胞。另一個選擇是，在單個啟動子控制下將標記基因與編碼本發(fā)明的多肽的序列串聯(lián)放置。標記基因應(yīng)答誘導(dǎo)或選擇的表達通常也表示串聯(lián)基因的表達。
另外，含有編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列，并表達所述多肽的宿主細胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種程序進行鑒定。這些程序包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物分析，例如，螢光激活細胞分類術(shù)(FACS)或免疫測定技術(shù)(例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和放射性免疫測定法(RIA))，包括用來檢測和/或定量分析核酸或蛋白質(zhì)的膜、溶液或芯片技術(shù)(參見Hampton，R.等人，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等人，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種各樣標記和連接技術(shù)可用在不同的核酸和氨基酸試驗中。產(chǎn)生標記雜交的裝置或者檢測與編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子有關(guān)的序列的PCR探針包括，寡標記、鎳翻譯、末端標記或使用標記聚核苷酸的PCR擴增。另外，也可將編碼本發(fā)明的多肽的序列克隆到載體內(nèi)，以產(chǎn)生mRNA探針。這些載體是本領(lǐng)域公知的，可通過商業(yè)途徑獲得，加入諸如T7、T3或SP6等適當RNA聚合酶和標記核苷酸可在體外合成RNA探針。這些步驟使用市場上供應(yīng)的各種試劑盒(Pharmacia&Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))進行。
易于檢測的合適報導(dǎo)分子或標記包括放射性核、酶和螢光、化學(xué)發(fā)光或發(fā)色試劑和物質(zhì)、協(xié)同因子、抑制劑、磁性粒子等等。
本發(fā)明的核酸分子還可用來制造轉(zhuǎn)基因動物，特別是嚙齒動物。這些轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。這可通過局部修飾體細胞，或者通過種系治療引入遺傳修飾來實現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)基因動物特別適用于制作動物模型，分析作為本發(fā)明多肽的調(diào)節(jié)劑的藥物分子。
從重組細胞培養(yǎng)基中回收和純化多肽的方法是公知的，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陽離子或陰離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水基相互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法和血凝素層析法。高效液相層析法特別適用于純化。當分離和/或純化期間多肽發(fā)生變性時，可應(yīng)用蛋白質(zhì)再折疊的公知技術(shù)來再產(chǎn)生活性構(gòu)象。
也可利用特異性載體結(jié)構(gòu)來幫助蛋白質(zhì)純化，有需要的時候，將編碼本發(fā)明的多肽的序列與編碼有利于可溶性蛋白質(zhì)純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核酸序列連接。有利于純化的結(jié)構(gòu)域的例子包括金屬螯合肽，例如允許在固定金屬上純化的肌氨酸-色氨酸組件，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，以及用在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的結(jié)構(gòu)域。為了方便純化，可以采用可切割接頭序列的內(nèi)含物，例如在純化結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明的多肽之間的對XA因子或腸激酶有特異性的序列。一種這樣的表達載體為融合蛋白的表達提供準備，所述融合蛋白含有本發(fā)明的多肽，與硫氧還蛋白或腸激酶切割位點前面的多個肌氨酸殘基融合。肌氨酸殘基有利于固定金屬離子親和力層析法(IMAC)的純化，參見Porath，J.等人的描述(Prot.Exp.Purif.3263-281，(1992))，而硫氧還蛋白或腸激酶切割位點為從融合蛋白純化多肽提供了一種手段。Kroll，D.J.等人對含有融合蛋白的載體進行了討論(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
如果多肽的表達是用在篩選測定法中，通常最好是在它表達的宿主細胞表面上產(chǎn)生該多肽。在此情況下，宿主細胞可在用于篩選測定法之前，例如用螢光激活細胞分類術(shù)(FACS)或免疫測定技術(shù)之前收獲。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，可回收該培養(yǎng)基以便回收和純化表達多肽。如果多肽是在細胞內(nèi)產(chǎn)生，則回收多肽之前必須先溶解細胞。
本發(fā)明的多肽可用來篩選各種藥物篩選技術(shù)使用的化合物庫。這些化合物可以激活(激動)或抑制(拮抗)本發(fā)明多肽的基因的表達水平或活性，構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。優(yōu)選的化合物是能有效地改變編碼本發(fā)明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者調(diào)節(jié)本發(fā)明第一方面的多肽的活性。
激動劑或拮抗劑化合物可從，例如，細胞制劑、無細胞制劑、化學(xué)庫或天然混合產(chǎn)物中分離出來。這些激動劑或拮抗劑可以是天然的或者是經(jīng)修飾的物質(zhì)、配體、酶、受體或者結(jié)構(gòu)或功能類似物。關(guān)于這些篩選技術(shù)的綜述，可參見Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
最有可能成為良好拮抗劑的化合物是與本發(fā)明的多肽結(jié)合但在結(jié)合后又不會誘導(dǎo)該多肽生物作用的分子。潛在的拮抗劑包括有機小分子、肽、多肽和抗體，它們與本發(fā)明的多肽結(jié)合，由此抑制或消除它的活性。以這種方式，多肽與正常細胞結(jié)合分子的結(jié)合可被抑制，從而抑制該多肽的正常生物活性。
用在此篩選技術(shù)中的本發(fā)明的多肽可以在溶液中游離，附著于固相支持物上，留在細胞表面或位于細胞內(nèi)。一般而言，這些篩選程序可涉及使用表達與測試化合物接觸的多肽的適當細胞或細胞膜，觀察結(jié)合、或功能反應(yīng)的刺激或抑制。再將與測試化合物接觸的細胞和不接觸測試化合物的對照細胞的功能反應(yīng)作比較。借助適當檢測系統(tǒng)，這種測定方法可以評估測試化合物是否導(dǎo)致多肽激活產(chǎn)生一個信號。一般情況下，在已知激動劑的存在下分析激活的抑制劑，在測試化合物存在下觀察激活對激動劑的影響。
一種鑒定本發(fā)明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優(yōu)選方法包括(a)在允許與多肽結(jié)合的條件下，將在其表面上表達本發(fā)明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結(jié)合之后提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過測定化合物與多肽相互作用所產(chǎn)生的信號水平來確定該化合物是否結(jié)合和激活或抑制該多肽。
另一種鑒定本發(fā)明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優(yōu)選方法包括(a)在允許與多肽結(jié)合的條件下，將在其表面上表達本發(fā)明第一方面的多肽的細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結(jié)合之后提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過對化合物與多肽相互作用所產(chǎn)生的信號水平與在該化合物不存在下的信號水平作比較來確定該化合物是否結(jié)合和激活或抑制該多肽。
在另一優(yōu)選實施例中，上述的通用方法還包括在多肽的標記或無標記配體存在下對激動劑或拮抗劑進行鑒定。
在另一實施例中，鑒定本發(fā)明的多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括在允許結(jié)合多肽的條件和候選化合物存在下，測定配體與其表面上帶有本發(fā)明的多肽的細胞、或者與含有這樣一種多肽的細胞膜結(jié)合的抑制，并測定與該多肽結(jié)合的配體數(shù)量。能夠引起配體結(jié)合減少的化合物就認為是激動劑或拮抗劑。配體最好是帶標記的。
更具體地說，篩選多肽拮抗劑或激動劑化合物的方法包括以下步驟(a)使標記的配體與在細胞表面上表達本發(fā)明的多肽的全細胞，或者含有本發(fā)明的多肽的細胞膜培養(yǎng)，(b)測定與全細胞或細胞膜結(jié)合的標記配體數(shù)量，(c)在步驟(a)的標記配體和全細胞或者細胞膜的混合物中加入候選化合物，使該混合物達到平衡；(d)測定步驟(c)之后與全細胞或細胞膜結(jié)合的標記配體數(shù)量；以及
(e)比較步驟(b)和(d)中結(jié)合的標記配體之差值，將引起步驟(d)的結(jié)合減少的化合物看成激動劑或拮抗劑。
上述一些實施例可應(yīng)用簡單結(jié)合測定法，其中測試化合物與帶有多肽的表面的附著是運用與該測試化合物直接或間接結(jié)合的標記檢測，或者可應(yīng)用涉及與標記競爭物競爭的測定法檢測。另一個實施例采用競爭藥物篩選測定法，其中能夠結(jié)合多肽的中和抗體與測試化合物特異性地競爭結(jié)合。以此方式可用抗體檢測對多肽有特異性結(jié)合親和力的任何測試化合物的存在。
另外，如果本發(fā)明的野生型多肽(INSP058)本質(zhì)上與受體正常結(jié)合，那么在本發(fā)明另一方面中，本發(fā)明的多肽可以是該野生型多肽的拮抗劑。一般認為，這種多肽的例子是INSP058SV。本發(fā)明此方面中，本發(fā)明的多肽能夠與INSP058多肽競爭受體上同一個結(jié)合位。INSP058SV多肽不會刺激受體，因此不會誘導(dǎo)正常的生物作用。所以，本發(fā)明的多肽是天然多肽的競爭抑制劑。較佳地，本發(fā)明此方面的競爭抑制劑包括或由SEQ ID NO10或SEQ IDNO16所示的氨基酸序列組成。本領(lǐng)域技術(shù)可輕易對上述篩選拮抗劑的方法作適應(yīng)性修改，以篩選競爭抑制劑。
也可把測定法設(shè)計成檢測加入的測試化合物對細胞內(nèi)編碼多肽的mRNA產(chǎn)生的作用。例如，ELISA可構(gòu)建成通過本領(lǐng)域公知的標準方法以單克隆抗體或多克隆抗體測量多肽的分泌水平或細胞相關(guān)水平，這可用來檢索抑制或增強在適當操縱的細胞或組織中產(chǎn)生多肽的化合物。然后，測定多肽與測試化合物之間的結(jié)合復(fù)合物的形成。
本發(fā)明包括的測定法是在過表達或切除檢測中涉及使用本發(fā)明的基因和多肽的方法。這些測定法涉及細胞內(nèi)這些基因/多肽水平的操縱，以及該操縱事件對被操縱細胞生理的影響的評估。例如，這些實驗揭示與特定基因/多肽有關(guān)聯(lián)的信號傳導(dǎo)和代謝通道的詳細信息，產(chǎn)生關(guān)于與待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，并提供調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的方法的思路。
可采用另一種藥物篩選技術(shù)，它高通量篩選對感興趣的多肽具有適當結(jié)合親和力的化合物(參見國際專利申請WO84/03564)。在這一方法中，在固相基質(zhì)上合成大量不同的小測試化合物，它們再與本發(fā)明的多肽反應(yīng)，洗滌。一種固定多肽的方法是用非中和抗體。以本領(lǐng)域公知的方法可檢測結(jié)合多肽。純化的多肽也可直接鋪在板上，用于上述藥物篩選技術(shù)中。
通過本領(lǐng)域公知的標準受體結(jié)合技術(shù)，例如配體結(jié)合和交聯(lián)測定法，本發(fā)明的多肽可用來鑒定膜結(jié)合或可溶性受體，在配體結(jié)合和交聯(lián)測定法中，多肽用放射性同位素標記，以化學(xué)方法修飾，或者與有利于它的檢測或純化的肽序列融合，并與推定受體來源(例如，細胞組合物、細胞膜、細胞上清液、組織抽提物或體液)一起培育。結(jié)合的效率可用生物物理技術(shù)，如表面胞質(zhì)基因共振和光譜測定。結(jié)合測定法用于純化和克隆受體，但也可鑒定多肽的激動劑和拮抗劑，這些激動劑和拮抗劑與其受體競爭結(jié)合多肽。進行篩選測定的標準方法已為本領(lǐng)域所熟悉。
本發(fā)明還包括一種篩選試劑盒，它可用在鑒定上述的激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質(zhì)、酶的方法中。
本發(fā)明包括激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質(zhì)和酶以及通過上述方法發(fā)現(xiàn)的能調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的活性或抗原性的其它化合物。
本發(fā)明還提供一些藥物組合物，其含有本發(fā)明的多肽、核酸、配體或化合物，以及合適的藥物載體。這些組合物適合用作治療或診斷試劑、疫苗、或其它免疫原性組合物，下文將作詳細說明。
根據(jù)本文所用的術(shù)語，當組合物中以X+Y的總重量計時至少85％是X，就認為含有多肽、核酸、配體或化合物[X]的組合物“基本上不含”雜質(zhì)[本文以Y表示]。優(yōu)選X占組合物中X+Y總重量的至少約90％，更好至少約95％、98％或者甚至99％(重量)。
藥物組合物最好含有治療有效量的本發(fā)明的多肽、核酸分子、配體或化合物。本文所用的術(shù)語“治療有效量”指需要治療、緩解、或預(yù)防目標疾病或病癥，或者具有可檢測的治療或預(yù)防作用的治療藥劑的用量。任何一種化合物的有效治療劑量最初可在例如腫瘤細胞的細胞培養(yǎng)測定法、或者動物模型通常是小鼠、兔、狗、或豬模型中估計。動物模型還可用來確定適當?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。有了這些信息，就可以確定給予人的有用給藥劑量和途徑。
人受試者的準確有效劑量取決于疾病狀態(tài)的嚴重程度、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應(yīng)靈敏度，以及治療耐受性/反應(yīng)。該用量可以常規(guī)實驗測定，由醫(yī)生判斷。通常，有效劑量從0.01毫克/千克至50毫克/千克，優(yōu)選從0.05毫克/千克至10毫克/千克。組合物可單獨給予病人，或者與其它藥劑、藥物或激素結(jié)合給予。
一種藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體，作為治療試劑給予。這些載體包括抗體和其它多肽、基因和其它治療試劑，例如脂質(zhì)體，只要該載體本身不會誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體，而且載體的給予不會產(chǎn)生過高毒性。合適的載體可以是大的代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒顆粒。
還可使用藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)對藥學(xué)上可接受的載體作了詳盡討論。
治療組合物中藥學(xué)上可接受的載體也可含有水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另外，這些組合物還可含有輔助物質(zhì)，例如，濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等等。這些載體能將藥物組合物配制成供病人攝取的片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等等。
一旦配成以后，本發(fā)明的組合物可直接給予受試者。接受治療的受試者可以是動物；特別是人受試者。
本發(fā)明使用的藥物組合物可以任何途徑給予，包括但不限于，口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、脊髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮或經(jīng)皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。本發(fā)明的藥物組合物也可用基因槍或無針注射器給予。一般將治療組合物制成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制成適合注射前溶解或懸浮于液體介質(zhì)中的固體形式。
通過注射可將組合物直接輸送到皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)，或者送到組織間質(zhì)空間。組合物也可施加在病變部位。劑量治療可分單劑或多劑。
如果本發(fā)明的多肽的活性在一特定疾病狀態(tài)中是過度的，有多種方法可采用。其中一種方法包括把上述抑制劑化合物(拮抗劑)與藥學(xué)上可接受的載體一起給予受試者，抑制劑化合物的量為通過例如阻斷配體、基質(zhì)、酶、受體的結(jié)合，或者抑制第二信號而抑制多肽的功能，從而緩解異常狀況的有效量。這些拮抗劑優(yōu)選是抗體。這些拮抗劑最好是嵌合抗體和/或人源化抗體，如前所述，可使它們的免疫原性減至最低。
另一種方法是給予保留了對上述配體、基質(zhì)、酶、受體有結(jié)合親和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相關(guān)部分的片段的形式給予。
在一替換方法中，應(yīng)用表達封閉技術(shù)，例如用內(nèi)部產(chǎn)生或另外給予的反義核酸分子(如上所述)，抑制編碼多肽的基因表達。設(shè)計多肽的編碼基因的調(diào)控區(qū)、5’區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)(信號序列、啟動子、增強子和內(nèi)含子)的互補序列或反義核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可獲得對基因表達的修飾。類似地，用“三螺旋體”堿基成對方法可實現(xiàn)抑制。三螺旋體成對是有用的，這是因為它能抑制雙螺旋體充分打開以結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子的能力。應(yīng)用三螺旋DNA的治療取得最新進展，在文獻中已有描述(Gee，J.E.等人，(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and Immunologic Approaches，F(xiàn)uturaPublishing Co.，Mt.Kisco，NY)?；パa序列或反義分子還可設(shè)計成防止轉(zhuǎn)錄子與核糖體結(jié)合，從而封閉mRNA的翻譯。這些寡核苷酸可給予，或在體內(nèi)表達中原位產(chǎn)生。
另外，使用對它的編碼mRNA序列有特異性的核糖體，可防止表達本發(fā)明的多肽。核糖體是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，參見Usman，N等人，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)?？稍O(shè)計合成核糖體，在選定位置上特異性切割mRNA，從而防止mRNA翻譯為功能多肽。核糖體通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然堿基合成。另一個選擇是，核糖體可用非天然骨架，例如2’-氧-甲基RNA合成，保護核糖核酸酶免于降解，還可含有經(jīng)修飾的堿基。
可對RNA分子進行修飾，以增加胞內(nèi)穩(wěn)定性和延長半衰期?？赡艿男揎棸ǖ幌抻?，在分子的5’和/或3’末端加入側(cè)翼序列或在分子的骨架內(nèi)使用硫代磷酸或2’-氧-甲基而不用磷酸二酯酶連鎖。這一概念對于產(chǎn)生PNA是固有的，可延伸至所有這些分子中，方法是包含非常規(guī)堿基，例如肌苷、核苷(queosine)和高修飾鳥苷(butosine)以及乙?；?、甲基-、硫代-、及類似修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它們不易被內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶識別。
有一些方法治療與本發(fā)明的多肽表達不足夠或與其活性相關(guān)的異常癥狀。其中一種方法包括把治療有效量的能激活該多肽的化合物，即上述激動劑給予病人，緩解異常征狀。另外，也可以給予治療量的多肽與適當藥物載體，以恢復(fù)多肽的相關(guān)生理平衡。
基因療法可用來在受試者體內(nèi)通過相關(guān)細胞內(nèi)源性產(chǎn)生多肽?；虔煼ㄒ孕拚委熁蛑脫Q缺陷基因，永久治療多肽的不適當產(chǎn)生。
本發(fā)明的基因療法可發(fā)生于體內(nèi)或體外。體外基因療法需要分離和純化病人的細胞，導(dǎo)入治療基因，以及將經(jīng)基因改造的細胞再引入病人體內(nèi)。與之相反，體內(nèi)基因療法不需要分離和純化病人的細胞。
治療基因往往被“包裝”以方便給予病人?；蜉斔唾x形劑可以是非病毒，例如脂質(zhì)體，或者復(fù)制缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美國專利US 5,252,479所述的腺伴隨病毒(AVV)載體。例如，可對編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子進行改造，以在復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中表達。然后，分離這種表達構(gòu)建體，導(dǎo)入用含有編碼多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細胞內(nèi)，使該包裝細胞現(xiàn)在能產(chǎn)生含有感興趣的基因的感染病毒粒子。將這些生產(chǎn)細胞給予病人，體內(nèi)改造細胞和體內(nèi)表達多肽(參見“Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches”(納入作為文獻參考)，Human MolecularGenetics(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一種方法是給予“裸露DNA”，其中治療基因直接注入血流或肌肉組織。
對于本發(fā)明的多肽或核酸分子是引起疾病的試劑的情形，本發(fā)明提出它們可用在疫苗中，產(chǎn)生針對疾病引發(fā)劑的抗體。
本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或者是治療性的(即治療感染后疾病)。這些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白質(zhì)或核酸，通常與前述藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合，包括本身不會誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的任何載體。這些載體還可用作免疫刺激劑(“輔助劑”)。此外，抗原或免疫原可與細菌類毒素例如來自白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌和其它致病原的類毒素偶聯(lián)。
因為多肽可以在胃內(nèi)分解，所以含有多肽的疫苗最好腸胃外給予(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮內(nèi)注射)。適合腸胃外給予的制劑包括無菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使制劑與接受者的血液等滲的溶解物，以及無菌水懸浮液或非水懸浮液，其可包括懸浮劑或增稠劑。
本發(fā)明的疫苗制劑可制成單劑或多劑容器。例如，密封安瓿和小瓶可儲存于凍干條件下，只要在使用之前加入無菌液體載體。劑量取決于疫苗的比活性，通過常規(guī)實驗可輕易測定。
還可通過基因傳送與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體，例如參見國際專利申請WO98/55607。
在配制疫苗組合物時也可使用“快速注射”技術(shù)(例如見www.powderject.com)。
國際專利申請WO 00/29428描述了許多接種疫苗和疫苗輸送系統(tǒng)的合適方法。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子作為診斷試劑的用途。檢測以本發(fā)明核酸分子(該核酸分子與功能障礙相關(guān))為特點的基因突變形式提供了一種診斷工具，它可加入或限定因為基因的表達不足、過度表達或者空間或時間表達發(fā)生改變而引起的疾病或疾病易感性的診斷。通過各種技術(shù)可在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個體。
用于診斷的核酸分子可從受試者的細胞中獲得，例如從血液、尿、唾液、組織活體或尸體材料中獲得?；蚪MDNA可直接用作檢測，或者在分析前用PCR、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴增(SDA)或者其它擴增技術(shù)酶解擴增(參見Saiki等人，Nature，324，163-166(1986)；Bej等人，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等人，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一實施例中，本發(fā)明該方面提供一種診斷病人疾病的方法，該方法包括評估編碼本發(fā)明的多肽的天然基因的表達水平，并將所述表達水平與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法包括以下步驟(a)在允許本發(fā)明的核酸分子和核酸探針形成雜交復(fù)合物的嚴謹條件下，將病人的組織樣品與探針接觸；(b)在與步驟(a)相同的條件下，將對照樣品與所述探針接觸；(c)以及檢測所述樣品中是否存在雜交復(fù)合物。
其中，檢測到病人樣品中雜交復(fù)合物的水平與對照樣品中雜交復(fù)合物不同，表示患病。
本發(fā)明另一方面包括一種診斷方法，其包括以下步驟(a)從待測試疾病的病人中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離本發(fā)明的核酸分子；(c)通過檢測與疾病相關(guān)的核酸分子是否存在突變，診斷病人疾病。
為了幫助上述方法檢測核酸分子，可包括擴增步驟，例如利用PCR技術(shù)。
將擴增產(chǎn)物大小的變化與正常基因型比較，可檢測到缺失或插入。將擴增DNA與本發(fā)明的標記RNA，或者與本發(fā)明的標記反義DNA序列雜交，可以鑒定點突變。以核糖核酸酶消化或評估熔點溫度的差異，區(qū)分完全匹配的序列與錯配的雙鏈體。病人是否存在突變可這樣檢測將DNA與在嚴謹條件下和該DNA雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應(yīng)于與疾病相關(guān)的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；檢測探針鏈的未雜交部分是否存在即表示該DNA鏈的對應(yīng)部分存在或不存在與疾病相關(guān)的突變。
這樣的診斷特別適用于產(chǎn)前，甚至新生兒測試。
參考基因與“突變體”基因之間的點突變和其它序列差異可通過公知技術(shù)鑒定，例如，直接DNA測序或單鏈構(gòu)象多態(tài)性(參見Orita等人，Genomics，5，874-879(1989))。例如，測序引物可與改良PCR產(chǎn)生的雙鏈PCR產(chǎn)物或單鏈模板分子一起使用。以使用放射性標記核苷酸的常規(guī)程序或者通過使用螢光標記的自動測序程序，進行序列測定?？寺NA節(jié)段也可用作檢測特異性DNA片段的探針。當與PCR結(jié)合時該方法的靈敏度大大提高。另外，點突變和其它序列變異，例如多態(tài)性，可參照上述方法檢測，例如使用等位基因特異性寡核苷酸對不同于單個核苷酸的序列進行PCR擴增。
在變性試劑存在或不存在下改變DNA片段的凝膠電泳遷移率，或直接對DNA測序都可以檢測到DNA序列的差異(例如Myers等人，Science(1985)2301242))。特定位置的序列變化可通過核酸酶保護測定法揭示，例如RNase和S1保護，或者化學(xué)切割方法發(fā)現(xiàn)(Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401)。
除了常規(guī)凝膠電泳和DNA序列測定之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突變也可用原位分析加以檢測(例如，參見Keller等人，DNA Probes，2nd Ed.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，換言之，可分析細胞內(nèi)DNA或RNA序列的突變，無需分離或固定在膜上。螢光原位雜交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的綜述已有很多報導(dǎo)(例如，參見Trachuck等人，Science，250，559-562(1990)，and Trask等人，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本發(fā)明另一實施例中，構(gòu)建了包括本發(fā)明核酸分子的寡核苷酸探針陣列，對遺傳變體、突變和多態(tài)性進行有效篩選。陣列技術(shù)方法是公知的，獲得廣泛應(yīng)用，可用來解釋分子遺傳方面的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(例如，參見M.Chee等人，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一實施例中，按照PCT申請WO95/11995(Chee等人)；Lockhart，D.J.等人((1996)Nat.Biotech.141675-1680))；以及Schena，M.等人((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619))描述的方法制作和使用陣列。寡核苷酸對的范圍從2至1,000,000以上。應(yīng)用光引導(dǎo)化學(xué)法在基質(zhì)的指定區(qū)域上合成低聚物?；|(zhì)可以是紙、尼龍或其它種類的膜、過濾器、芯片、玻璃載片或其它任何合適的固相支持物。另外，參照PCT申請WO95/25116(Baldeschweiler等人)中描述的方法，使用化學(xué)偶聯(lián)程序和噴墨應(yīng)用裝置可在基質(zhì)表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系統(tǒng)、熱學(xué)、紫外線、機械或化學(xué)結(jié)合程序，以類似斑點(或狹線)印跡的“柵格”陣列將cDNA片段或寡核苷酸設(shè)置和連接于基質(zhì)表面上。陣列，例如上述的那些陣列，可用人手或現(xiàn)有設(shè)備(斑點印跡或狹線印跡裝置)、材料(任何合適的固相支持物)和機器(包括自動儀器)制作，它們可含有8、24、96、384、1536或6144個寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之間的任何數(shù)目，該數(shù)目能夠使陣列有效地應(yīng)用于市場上買到的儀器中。
除了上述討論的方法之外，通過包括測定受試者樣品中多肽或mRNA水平異常增加或減少的方法可以診斷疾病。采用本領(lǐng)域公知的任何方法可以在RNA水平上測定表達減少或增加，以便對聚核苷酸作定量分析，例如核酸擴增，如PCR、RT-PCR、RNase保護、Northern印跡和其它雜交方法。
可用來確定從宿主獲得的樣品中本發(fā)明的多肽水平的測定技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上文提到的一些文獻中已有討論(包括放射性免疫測定法、競爭結(jié)合測定法、Western印跡分析和ELISA試驗)。本發(fā)明該方面提供一種診斷方法，其包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽復(fù)合物的條件下，將上述一種配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述復(fù)合物。
測定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS還可為診斷多肽表達的變化或異常水平提供基礎(chǔ)。在適合形成復(fù)合物的條件下將正常哺乳動物受試者，優(yōu)選是人的體液或細胞抽提物與針對多肽的抗體結(jié)合，確立多肽表達的正常或標準值。標準復(fù)合物形成的數(shù)量可用各種方法定量測定，例如光度計裝置。
特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體可用來診斷以多肽表達為特點的癥狀或疾病，或者用在測定法中監(jiān)測以本發(fā)明的多肽、核酸分子、配體和其它化合物治療的病人。用于診斷目的的抗體可以用上述關(guān)于治療所述的相同方法制成。對多肽的診斷分析包括利用抗體和標記檢測人體液或者細胞或組織抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修飾或不作修飾，將它們與報導(dǎo)分子共價或非共價結(jié)合加上標記?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域已知的各種各樣報導(dǎo)分子，其中一些已在上文作了描述。
將在受試者活體組織獲得的對照樣品和患病樣品中表達的多肽數(shù)量與標準值作比較。標準值與受試者值之間的偏差建立診斷疾病的參數(shù)?？赏ㄟ^診斷分析法區(qū)分多肽不存在、存在和過度表達，并監(jiān)測治療干預(yù)期間多肽水平的調(diào)節(jié)。這些分析也可用來評估動物研究、臨床試驗或個體病人的監(jiān)測治療中特定治療方案的療效。
本發(fā)明的一種診斷試劑盒可包括(a)本發(fā)明的核酸分子；(b)本發(fā)明的多肽；或者(c)本發(fā)明的配體。
本發(fā)明一方面提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括第一容器，其含有在嚴謹條件下與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，其含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。這種試劑盒還可包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
本發(fā)明另一方面也提供一種診斷試劑盒，該試劑盒可包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是本發(fā)明的核酸分子。
為了檢測本發(fā)明的多肽，一種診斷試劑盒可包括一或多種與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體；一種用來檢測該抗體與多肽之間結(jié)合反應(yīng)的試劑。
這些試劑盒都可用于診斷疾病或疾病易感性，譬如是細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎癥疾病，包括過敏癥、炎癥性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道發(fā)炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化癥、血栓癥、敗血癥、休克、再灌注損傷和缺血；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和疼痛；發(fā)育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質(zhì)疏松和肥胖、AIDS和腎?。桓腥荆ú《拘愿腥?、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病癥，特別是由C1q家族蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些。
以下，將通過舉例說明，特別是結(jié)合INSP058多肽對本發(fā)明的各個方面和實施例進行描述。
應(yīng)明白，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可以作出改型。


圖1使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)在NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫獲得的前10個BLAST結(jié)果。
圖2以BLAST對SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)與最接近序列(大麻哈魚的otolin-1)產(chǎn)生的序列對比。
圖3使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)獲得的前20個GenomeThreader結(jié)果。前3個結(jié)果的PDB代碼表示下列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1c28鏈A、B和C。補體-1q家族蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)提示與腫瘤壞死因子有進化聯(lián)系。
圖4以Genome Threader對SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)與圖3中第一個PDB結(jié)構(gòu)(1c28)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)性對比。
圖5AINSP058多肽序列(SEQ ID NO8)所含信號肽的SignalP-NN預(yù)測序列。
圖5BINSP058多肽序列(SEQ ID NO8)所含信號肽的SignalP-HMM預(yù)測序列。
圖6INSP058的預(yù)測核苷酸序列與翻譯。
圖7采用INSP058-CP1和INSP058-CP2為引物克隆的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列與翻譯。
圖8pCRII-TOPO-INSP058SV的圖譜。
圖9INSP058克隆核苷酸序列(INSP058SV)與預(yù)測的INSP058序列之間的序列對比。
圖10INSP058預(yù)測氨基酸序列與克隆INSP058SV氨基酸序列之間的序列對比。
圖11表達載體pEAK12d的圖譜。
圖12Gateway載體pDONR201的圖譜。
圖13pEAK12d-INSP058SV-6HIS的圖譜。
具體實施例方式
實施例1 INSP058以SEQ ID NO8作為NCBI非冗余序列數(shù)據(jù)庫的BLAST查詢序列。與該查詢序列最接近的匹配是大麻哈魚的otolin-1(圖1)。圖2所示為INSP058查詢序列與大麻哈魚的otolin-1序列的對比。圖3所示為使用SEQ ID NO8(INSP058多肽序列)獲得的前20個Genome Threader結(jié)果。前3個結(jié)果的PDB代碼表示下列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1c28鏈A、B和C。補體-1q家族蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)提示與腫瘤壞死因子有進化聯(lián)系。圖4所示為以Genome Threader對SEQ IDNO8(INSP058多肽序列)與圖3中第一個PDB結(jié)構(gòu)(1c28)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)性對比。
采用SignalP v2.0(見網(wǎng)址www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0所描述，這是一個預(yù)測不同有機體氨基酸序列中信號肽切割位點是否存在及其位置的程序)對INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)進行分析。SignalP v2.0包含兩個信號肽預(yù)測方法SignalP-NN(基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))和SignalP-HMM(基于隱馬爾可夫模型)。圖5A和5B所示為INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)的SignalP結(jié)果。圖5A和5B顯示，INSP058多肽序列(SEQ ID NO8)的最可能切割位點在位置15與16之間。
實施例2 INSP058剪接變體1.1 cDNA文庫人cDNA文庫(在噬菌體λ載體中)購自Stratagene或Clontech，或者由Serono Pharmaceutical Research Institute根據(jù)制造商方案(Stratagene)在λZAP或λGT10載體中制成。噬菌體λDNA按照制造商(Promega，Corporation，Madison WI.)的說明用Wizard Lambda Preps DNA純化系統(tǒng)在小規(guī)模的感染大腸桿菌宿主菌株培養(yǎng)基中制備。使用的文庫和宿主菌株列于表1中。隨后的PCR反應(yīng)采用了代表26個不同庫的7個集合體(100ng/μl噬菌體DNA)或者各個庫的噬菌體DNA。
表1人cDNA文庫

1.2對噬菌體文庫DNA的虛擬cDNA進行PCR擴增設(shè)計基因特異性PCR擴增引物(INSP058-CP1和INSP058-CP2，圖6和表2)，擴增一個990bp產(chǎn)物，該產(chǎn)物預(yù)期含有INSP058的差不多全長預(yù)測編碼序列。這些引物用在針對表1所示噬菌體cDNA文庫集合體的PCR中。用MJ Research DNA Engine在50μl終體積中進行PCR擴增，該終體積含有1XAmpliTaqTM緩沖液、200μM dNTPs、克隆引物各50pmole、2.5單位AmpliTaqTM(Perkin Elmer)和噬菌體文庫集合體DNA各100ng，程序如下94℃循環(huán)40次，1分鐘；以及72℃，1分鐘；然后，72℃循環(huán)1次，7分鐘，4℃持續(xù)循環(huán)。
表2 INSP058克隆和測序引物

下劃線序列＝Kozak序列粗體＝終止密碼子斜線序列＝His標簽在1X TAE緩沖液(Invitrogen)中的0.8％瓊脂糖凝膠上看到各個擴增產(chǎn)物，并用Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)從凝膠純化。這些PCR產(chǎn)物在50μl無菌水中洗脫出來，直接被亞克隆或儲存于-20℃。
1.3用于PCR的基因特異性克隆引物設(shè)計長度為18至25個堿基的PCR引物對，以便運用引物設(shè)計軟件(Scientific&Educational Software，PO Box 72045，Durham，NC 27722-2045，USA)擴增INSP058 cDNA的部分序列。將PCR引物優(yōu)化至溫度接近55±10℃，GC含量為40-60％。選擇對靶序列INSP058有高度選擇性的引物(幾乎沒有不是非特異性引發(fā))。由于PCR引物設(shè)計的優(yōu)化，INSP058-CP1缺少INSP058預(yù)測克隆序列的前8bp。
1.4 PCR產(chǎn)物的亞克隆用購自Invitrogen Corporation的TA克隆試劑盒，在制造商指定的條件下將PCR產(chǎn)物亞克隆到拓樸異構(gòu)酶I修飾的克隆載體(pCRII TOPO)中。簡言之，從人文庫集合體P擴增反應(yīng)中取4μl凝膠純化的PCR產(chǎn)物，室溫下與1μlTOPO載體和1μl鹽溶液培養(yǎng)15分鐘。再按以下方法將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)中50μl One Shot TOP10細胞等分試樣在冰上解凍，加入2μl TOPO反應(yīng)物。該混合物冰上培育15分鐘，再在42℃培育熱激剛好30秒。將樣品送回冰上，加入250μl溫熱SOC培養(yǎng)基(室溫)。樣品在37℃搖動培育(220rpm)1小時。然后，將轉(zhuǎn)化混合物鋪在含有氨比西林(100μg/ml)的L-broth(LB)板上，37℃培育過夜。
1.5氨比西林抗性集落的選擇選擇大量氨比西林抗性集落，將細胞穿刺到96孔板的各個孔中，每孔帶有含氨比西林(100μg/ml)的L-broth板。
1.6質(zhì)粒DNA的制備和測序由穿刺培養(yǎng)基制備小量制備(Miniprep)質(zhì)粒DNA，用GATC Biotech AG(Jakob-Stadler-Platz 7，D-78467 Konstanz)以T7為引物對該質(zhì)粒DNA進行DNA測序。克隆cDNA片段的序列見圖7。
2.含有INSP058SV的cDNA文庫/模板的鑒定用λcDNA文庫集合體P(人胸腺、脾、外周血單核細胞和睪丸)鑒定了用INSP058-CP1和INSP058-CP2獲得的PCR產(chǎn)物，所述產(chǎn)物以453bp遷移，小于預(yù)期大小。圖8所示為克隆PCR產(chǎn)物(pCRII-TOPO-INSP058)(質(zhì)粒IDnumber 12917)的質(zhì)粒圖譜。該克隆序列缺失INSP058預(yù)測克隆序列的前8bp，但一直到核苷酸位置267都與預(yù)測INSP058序列相同，由于存在一個538bp缺失，所以它在核苷酸位置267與預(yù)測序列不同(圖9)。最長ORF(包括5’端缺失的8bp)的翻譯產(chǎn)生一個長99個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中1-89個氨基酸與INSP058預(yù)測序列相同(圖11)。所以，克隆序列對應(yīng)于INSP058的短剪接變體(稱INSP058SV)。
3.在HEK293/EBNA細胞中表達INSP058SV的質(zhì)粒的構(gòu)建通過DNA測序鑒定了一個含有INSP058SV編碼序列(ORF)的pCRII-TOPO克隆(圖7)，再運用GatewayTM克隆方法(Invitrogen)以此克隆將插入片段亞克隆到哺乳動物細胞表達載體pEAK12d(圖11)中。
3.1與符合讀框的6HIS標簽序列融合的Gateway兼容性INSP058 ORF的產(chǎn)生Gateway克隆方法的第一階段涉及二步PCR反應(yīng)，該反應(yīng)用attB1重組位點和Kozak序列在5’末端側(cè)翼，以及用編碼符合讀框的6組氨酸(6HIS)標記、終止密碼子和attB2重組位點(Gateway相容的cDNA)在3’末端側(cè)翼產(chǎn)生INSP058 ORF。第一次PCR反應(yīng)(在50微升終體積中)含有1.5μl(約25ng)pCR II TOPO-INSP058SV(質(zhì)粒12917，圖8)、1.5μl dNTPs(10mM)、5μl 10XPfx聚合酶緩沖液、1μl MgSO4(50mM)、基因特異性引物各0.5μl(100μM)(INSP058-EX1正向，INSP058-EX1反向)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。在95℃首次變性步驟進行PCR反應(yīng)1分鐘，然后94℃循環(huán)10次15秒；55℃30秒，以及68℃2分鐘，4℃持續(xù)循環(huán)。按照生產(chǎn)商的指示，用Wizard PCR prep DNA純化系統(tǒng)(Promega)直接在反應(yīng)混合物中純化PCR產(chǎn)物。第二次PCR反應(yīng)(在50微升終體積中)含有10μl純化PCR產(chǎn)物、1.5μldNTPs(5mM)、5μl 10X Pfx聚合酶緩沖液、1μl MgSO4(50mM)、Gateway轉(zhuǎn)化引物各0.5μl(100μM)(GCP正向，GCP反向)和0.5μl of Platinum PfxDNA聚合酶。第二次PCR反應(yīng)的條件是95℃1分鐘；94℃循環(huán)4次15秒；50℃30秒以及68℃2分鐘；94℃循環(huán)25次15秒；55℃30秒和68℃3.5分鐘；然后4℃持續(xù)循環(huán)。參照上述方法純化PCR產(chǎn)物。
3.2 Gateway相容的INSP058SV ORF亞克隆到Gateway入門載體pDONR201和表達載體pEAK12dGateway克隆方法的第二階段按如下方法將Gateway修飾的PCR產(chǎn)物亞克隆到Gateway入門載體pDONR201(Invitrogen，圖12)將5μl純化的PCR產(chǎn)物與1.5μl pDONR201載體(0.1μg/μl)、2μl BP緩沖液和1.5μl BP克隆酶混合物(Invitrogen)室溫培育1小時。加入蛋白酶K(2μg)終止反應(yīng)，37℃培育多10分鐘。取該反應(yīng)的一等分試樣(2μl)，采用Biorad Gene PulserTM電穿孔儀通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B細胞。轉(zhuǎn)化物鋪在LB-卡那霉素板上。用Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promega)自1-4個獲得的集落制備質(zhì)粒Miniprep DNA，重組反應(yīng)使用1.5μl質(zhì)粒洗脫液，所述反應(yīng)的10μl終體積含有1.5μl pEAK12d載體(圖9)(0.1μg/μl)、2μl LR緩沖液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)。混合物在室溫培育1小時，加入蛋白酶K(2μg)終止反應(yīng)，37℃培育多10分鐘。取該反應(yīng)的一等分試樣(1μl)，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B細胞。
如上所述通過進行集落PCR鑒定了含有正確插入序列的克隆，但使用的PCR引物是pEAK12d(pEAK12d F和pEAK12d R)。用Qiaprep Turbo 9600自動化系統(tǒng)(Qiagen)或人工操作使用Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promegacat.no.1460)由含有正確插入序列的克隆分離出質(zhì)粒Miniprep DNA，并且以pEAK12d F和pEAK12d R引物確認序列。
從序列已被確認的克隆取500ml培養(yǎng)基，制備用氯化銫梯度純化的質(zhì)粒pEAK12d-INSP058SV-6HIS(質(zhì)粒ID number 13081，圖13)maxi-prep DNA，制備方法參照Sambrook J.等人的方法(Molecular Cloning，a LaboratoryManual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，將質(zhì)粒DNA以1μg/μl重懸于無菌水中，-20℃儲存。
此外，現(xiàn)在用pEAK12d-INSP058SV-6HIS表達載體進行其它實驗。運用此載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系能夠使INSP058SV蛋白質(zhì)獲得高水平表達，因而能夠?qū)NSP058SV多肽的功能特點進行連續(xù)研究。以下材料和方法是適合這些實驗用的其中一個例子。
細胞培養(yǎng)基表達埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎腎293細胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)維持懸浮在無Ex-cell VPRO血清的培養(yǎng)基中(種子儲備，維持培養(yǎng)基，JRH)。轉(zhuǎn)染前16至20小時(第1天)，將細胞接種在2x T225燒瓶中(每個燒瓶50毫升，接種在含有2％FBS移種培養(yǎng)基(JRH)的DMEM/F12(1∶1)中，密度為2×105個細胞/毫升)。第二天(轉(zhuǎn)染第0天)，用JetPEITM試劑進行轉(zhuǎn)染(2μl/μg質(zhì)粒DNA，PolyPlus-transfection轉(zhuǎn)染試劑)。每個燒瓶中，質(zhì)粒DNA與GFP(螢光報導(dǎo)基因)DNA共轉(zhuǎn)染。再將轉(zhuǎn)染混合物加入2x T225燒瓶中，37℃(5％CO2)培育6天。在第1和第6天進行定性螢光檢驗，確認陽性轉(zhuǎn)染(Axiovert 10 Zeiss)。
在第6天(收獲天)，將兩個燒瓶中的上清液(100ml)合并，離心(4℃，400g)，并置于帶有獨特鑒定器的器皿內(nèi)。保留一等分試樣(500μl)，對6His標簽蛋白作QC(內(nèi)部生物加工QC)。
參照BP/PEI/HH/02/04中稱之“懸浮細胞PEI轉(zhuǎn)染”的方案，以Polysciences的聚乙烯亞胺為轉(zhuǎn)染劑進行放大批量生產(chǎn)。
純化方法含有C端帶6His標簽的重組蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基樣品用冷凍緩沖液A(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)甘油，pH 7.5)稀釋。樣品經(jīng)無菌過濾器(Millipore)過濾，4℃儲存于無菌方形培養(yǎng)瓶中(Nalgene)。
4℃下用連接到樣品自動裝載器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)進行純化。純化程序由兩個連續(xù)步驟組成在裝有鎳離子的Poros20MC(Applied Biosystems)柱(4.6×50mm，0.83ml)上進行金屬親和力層析，再在Sephadex G-25培養(yǎng)(Amersham Pharmacia)柱(1.0×10cm)上進行凝膠過濾。
第一個層析步驟的金屬親和柱用30柱體積的EDTA溶液(100mM EDTA；1M NaCl；pH 8.0)再生，用15柱體積的100mM硫酸鎳溶液洗滌重新裝載鎳離子，用10柱體積的緩沖液A和7柱體積的緩沖液B(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)400mM甘油；咪唑，pH 7.5)洗滌，最后用15柱體積含15mM咪唑的緩沖液A平衡。樣品用Labomatic的樣品裝載器轉(zhuǎn)移到200毫升定量環(huán)，然后以10ml/min的速率裝到鎳金屬親和柱上。親和柱再用12柱體積的緩沖液A和28柱體積含20mM咪唑的緩沖液A洗滌。在20mM咪唑洗滌期間，附著比較松散的污染蛋白質(zhì)從柱中洗脫出來。重組的His標簽蛋白質(zhì)最后用10柱體積的緩沖液B洗脫，流速為2ml/min，收集洗脫出來的蛋白質(zhì)。
第二層析步驟的Sephadex G-25凝膠過濾柱用2毫升緩沖液D(1.137M氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；pH 7.2)再生，然后用4柱體積的緩沖液C(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；20％(重量/體積)甘油；pH 7.4)平衡。從鎳柱洗脫出來的峰值餾分自動通過連接到VISION的整合型樣品裝載器裝在Sephadex G-25柱上，蛋白質(zhì)用緩沖液C洗脫，流速為2ml/min。該餾分經(jīng)過無菌離心過濾器(Millipore)過濾，凍存于-80℃。取樣品的一等分試樣以SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝膠；Novex)Western印跡和抗His抗體進行分析。NuPAGE凝膠可用0.1％考馬斯亮藍R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)室溫染色1小時，然后用20％甲醇，7.5％乙酸去色，直至背景澄清，蛋白質(zhì)帶清晰可見。
電泳后將蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。室溫下用5％在緩沖液E(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；0.1％Tween 20，pH 7.4)中的奶粉封閉纖維素膜1小時，再于4℃在緩沖液E中的2.5％奶粉中與2種兔多克隆抗His抗體(G-18和H-15，各0.2μg/ml；SantaCruz)混合物培養(yǎng)過夜。室溫再培養(yǎng)1小時之后，膜用緩沖液E(3×10分鐘)洗滌，再與結(jié)合HRP的第二抗兔抗體(DAKO，HRP 0399)室溫培養(yǎng)2小時，第二抗體用含2.5％奶粉的緩沖液E稀釋至1/3000。用緩沖液E(3×10分鐘)洗滌之后，膜用ECL試劑盒(Amersham Pharmacia)顯影1分鐘。然后，將膜與超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接觸，使超膜顯影，對Western印跡影像作目測分析。
對于由考馬斯亮藍染色檢測到蛋白質(zhì)帶的樣品，采用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)可確定它們所含蛋白質(zhì)的濃度，以牛血清白蛋白為標準。
此外，細胞系中INSP058SV多肽過度表達或表達下調(diào)都可用來確定轉(zhuǎn)錄激活對宿主細胞基因組的影響。把免疫沉淀法與Western印跡分析結(jié)合以及免疫沉淀法與質(zhì)譜結(jié)合，都可鑒定INSP058SV多肽的二聚配偶體、共激活劑和共抑制劑。
序列表SEQ ID NO1(INSP058核苷酸序列外顯子1)1 ATGAGGATCT GGTGGCTTCT GCTTGCCATT GAAATCTGCA CAGGGAACAT51 AAACTCACAG GACACCTGCA GGCAAGGGCA CCCTGGAATC CCTGGGAACC101 CCGGTCACAA TGGTCTGCCT GGAAGAGATG GACGAGACGG AGCGAAGGGT151 GACAAAGGCG ATGCAGSEQ ID NO2(INSP058蛋白質(zhì)序列外顯子1)1 MRIWWLLLAI EICTGNINSQ DTCRQGHPGI PGNPGHNGLP GRDGRDGAKG51 DKGDAGSEQ ID NO3(INSP058核苷酸序列外顯子2)1 GAGAACCAGG ACGTCCTGGC AGCCCGGGGA AGGATGGGAC GAGTGGAGAG51 AAGGGAGAAC GAGSEQ ID NO4(INSP058蛋白質(zhì)序列外顯子2)1 EPGRPGSPGK DGTSGEKGER GSEQ ID NO5(INSP058核苷酸序列外顯子3)1 GAGCAGATGG AAAAGTTGAA GCAAAAGGCA TCAAAGGTGA TCAAGGCTCA51 AGAGGATCCC CAGGAAAACA TGGCCCCAAG GGGCTTGCAG GGCCCATGGG101 AGAGAAGGGC CTCCGAGGAG AGACTGGGCC TCAGGGGCAG AAGGGGAATA
151 AGGGTGACGT GGGTCCCACT GGTCCTGAGG GGCCAAGGGG CAACATTGGG201 CCTTTGGGCC CAACTGGTTT ACCGGGCCCC ATGGGCCCTA TTGGAAAGCC251 TGGTCCCAAA GGAGAAGCTG GACCCACGGG GCCCCAGGGT GAGCCAGGAG301 TCCGGGGAAT AAGAGGCTGG AAAGGAGATC GAGGAGAGAA AGGGAAAATC351 GGTGAGACTC TAGTCTTGCC AAAAAGTGCT TTCACTGTGG GGCTCACGGT401 GCTGAGCAAG TTTCCTTCTT CAGATATGCC CATTAAATTT GATAAGATCC451 TGTATAACGA ATTCAACCAT TATGATACAG CAGCGGGGAA ATTCACGTGC501 CACATTGCTG GGGTCTATTA CTTCACCTAC CACATCACTG TTTTCTCCAG551 AAATGTTCAG GTGTCTTTGG TCAAAAATGG AGTAAAAATA CTGCACACCA601 AAGATGCTTA CATGAGCTCT GAGGACCAGG CCTCTGGCGG CATTGTCCTG651 CAGCTGAAGC TCGGGGATGA GGTGTGGCTG CAGGTGACAG GAGGAGAGAG701 GTTCAATGGC TTGTTTGCTG ATGAGGACGA TGACACAACT TTCACAGGGT751 TCCTTCTGTT CAGCAGCCCGSEQ ID NO6(INSP058蛋白質(zhì)序列外顯子3)1 ADGKVEAKGI KGDQGSRGSP GKHGPKGLAG PMGEKGLRGE TGPQGQKGNK51 GDVGPTGPEG PRGNIGPLGP TGLPGPMGPI GKPGPKGEAG PTGPQGEPGV101 RGIRGWKGDR GEKGKIGETL VLPKSAFTVG LTVLSKFPSS DMPIKFDKIL151 YNEFNHYDTA AGKFTCHIAG VYYFTYHITV FSRNVQVSLV KNGVKILHTK201 DAYMSSEDQA SGGIVLQLKL GDEVWLQVTG GERFNGLFAD EDDDTTFTGF251 LLFSSP
SEQ ID NO7(INSP058全核苷酸序列)1 ATGAGGATCT GGTGGCTTCT GCTTGCCATT GAAATCTGCA CAGGGAACAT51 AAACTCACAG GACACCTGCA GGCAAGGGCA CCCTGGAATC CCTGGGAACC101 CCGGTCACAA TGGTCTGCCT GGAAGAGATG GACGAGACGG AGCGAAGGGT151 GACAAAGGCG ATGCAGGAGA ACCAGGACGT CCTGGCAGCC CGGGGAAGGA201 TGGGACGAGT GGAGAGAAGG GAGAACGAGG AGCAGATGGA AAAGTTGAAG251 CAAAAGGCAT CAAAGGTGAT CAAGGCTCAA GAGGATCCCC AGGAAAACAT301 GGCCCCAAGG GGCTTGCAGG GCCCATGGGA GAGAAGGGCC TCCGAGGAGA351 GACTGGGCCT CAGGGGCAGA AGGGGAATAA GGGTGACGTG GGTCCCACTG401 GTCCTGAGGG GCCAAGGGGC AACATTGGGC CTTTGGGCCC AACTGGTTTA451 CCGGGCCCCA TGGGCCCTAT TGGAAAGCCT GGTCCCAAAG GAGAAGCTGG501 ACCCACGGGG CCCCAGGGTG AGCCAGGAGT CCGGGGAATA AGAGGCTGGA551 AAGGAGATCG AGGAGAGAAA GGGAAAATCG GTGAGACTCT AGTCTTGCCA601 AAAAGTGCTT TCACTGTGGG GCTCACGGTG CTGAGCAAGT TTCCTTCTTC651 AGATATGCCC ATTAAATTTG ATAAGATCCT GTATAACGAA TTCAACCATT701 ATGATACAGC AGCGGGGAAA TTCACGTGCC ACATTGCTGG GGTCTATTAC751 TTCACCTACC ACATCACTGT TTTCTCCAGA AATGTTCAGG TGTCTTTGGT801 CAAAAATGGA GTAAAAATAC TGCACACCAA AGATGCTTAC ATGAGCTCTG851 AGGACCAGGC CTCTGGCGGC ATTGTCCTGC AGCTGAAGCT CGGGGATGAG901 GTGTGGCTGC AGGTGACAGG AGGAGAGAGG TTCAATGGCT TGTTTGCTGA951 TGAGGACGAT GACACAACTT TCACAGGGTT CCTTCTGTTC AGCAGCCCG
SEQ ID NO8(INSP058全蛋白質(zhì)序列)1 MRIWWLLLAI EICTGNINSQ DTCRQGHPGI PGNPGHNGLP GRDGRDGAKG51 DKGDAGEPGR PGSPGKDGTS GEKGERGADG KVEAKGIKGD QGSRGSPGKH101 GPKGLAGPMG EKGLRGETGP QGQKGNKGDV GPTGPEGPRG NIGPLGPTGL151 PGPMGPIGKP GPKGEAGPTG PQGEPGVRGI RGWKGDRGEK GKIGETLVLP201 KSAFTVGLTV LSKFPSSDMP IKFDKILYNE FNHYDTAAGK FTCHIAGVYY251 FTYHITVFSR NVQVSLVKNG VKILHTKDAY MSSEDQASGG IVLQLKLGDE301 VWLQVTGGER FNGLFADEDD DTTFTGFLLF SSPSEQ ID NO9(INSP058SV全核苷酸序列)ATGAGGATCTGGTGGCTTCTGCTTGCCATTGAAATCTGCACAGGGAACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGGAGAACCAGGATGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAACGGAGTAASEQ ID NO10(INSP058SV全蛋白質(zhì)序列)MRIWWLLLAIEICTGNINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGCPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGMFRCLWSKTESEQ ID NO11(成熟INSP058和INSP058SV核苷酸序列外顯子1)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGSEQ ID NO12(成熟INSP058和INSP058SV蛋白質(zhì)序列外顯子1)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGSEQ ID NO13(成熟INSP058核苷酸序列)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCA
GGAGAACCAGGACGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGTGATCAAGGCTCAAGAGGATCCCCAGGAAAACATGGCCCCAAGGGGCTTGCAGGGCCCATGGGAGAGAAGGGCCTCCGAGGAGAGACTGGGCCTCAGGGGCAGAAGGGGAATAAGGGTGACGTGGGTCCCACTGGTCCTGAGGGGCCAAGGGGCAACATTGGGCCTTTGGGCCCAACTGGTTTACCGGGCCCCATGGGCCCTATTGGAAAGCCTGGTCCCAAAGGAGAAGCTGGACCCACGGGGCCCCAGGGTGAGCCAGGAGTCCGGGGAATAAGAGGCTGGAAAGGAGATCGAGGAGAGAAAGGGAAAATCGGTGAGACTCTAGTCTTGCCAAAAAGTGCTTTCACTGTGGGGCTCACGGTGCTGAGCAAGTTTCCTTCTTCAGATATGCCCATTAAATTTGATAAGATCCTGTATAACGAATTCAACCATTATGATACAGCAGCGGGGAAATTCACGTGCCACATTGCTGGGGTCTATTACTTCACCTACCACATCACTGTTTTCTCCAGAAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAATGGAGTAAAAATACTGCACACCAAAGATGCTTACATGAGCTCTGAGGACCAGGCCTCTGGCGGCATTGTCCTGCAGCTGAAGCTCGGGGATGAGGTGTGGCTGCAGGTGACAGGAGGAGAGAGGTTCAATGGCTTGTTTGCTGATGAGGACGATGACACAACTTTCACAGGGTTCCTTCTGTTCAGCAGCCCGSEQ ID NO14(成熟INSP058蛋白質(zhì)序列)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGRPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGDQGSRGSPGKHGPKGIAGPMGEKGLRGETGPQGQKGNKGDVGPTGPEGPRGNIGPLGPTGLPGPMGPIGKPGPKGEAGPTGPQGEPGVRGIRGWKGDRGEKGKIGETLVLPKSAFTVGLTVLSKFPSSDMPIKFDKILYNEFNHYDTAAGKFTCHIAGVYYFTYHITVFSRNVQVSLVKNGVKILHTKDAYMSSEDQASGGIVLQLKLGDEVWLQVTGGERFNGLFADEDDDTTFTGFLLFSSPSEQ ID NO15(成熟INSP058SV核苷酸序列)AACATAAACTCACAGGACACCTGCAGGCAAGGGCACCCTGGAATCCCTGGGAACCCCGGTCACAATGGTCTGCCTGGAAGAGATGGACGAGACGGAGCGAAGGGTGACAAAGGCGATGCAGGAGAACCAGGATGTCCTGGCAGCCCGGGGAAGGATGGGACGAGTGGAGAGAAGGGAGAACGAGGAGCAGATGGAAAAGTTGAAGCAAAAGGCATCAAAGGAATGTTCAGGTGTCTTTGGTCAAAAACGGAGTAASEQ ID NO16(成熟INSP058SV蛋白質(zhì)序列)NINSQDTCRQGHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGCPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGMFRCLWSKTE
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，所述多肽(i)包括SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO14所示的氨基酸序列；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽(i)由SEQ ID NO8和/或SEQ ID NO14所示的氨基酸序列組成；(ii)是其片段，該片段具有TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)功能，或者具有與(i)所述多肽相同的抗原決定簇；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等同物。
3.一種多肽，它是如權(quán)利要求1或2的(iii)部分所述的功能等同物，與與SEQ ID NO8所示的氨基酸序列同源。
4.一種多肽，它是如權(quán)利要求1至3中任何一項所述的片段或功能等同物，與SEQ ID NO8所示的氨基酸序列或其活性片段具有80％以上的序列同一性，優(yōu)選85％、90％、95％、98％或99％以上的序列同一性。
5.一種多肽，它是如權(quán)利要求1至4中任何一項所述的功能等同物，與具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的多肽有高度的結(jié)構(gòu)同源性。
6.一種多肽，它是如權(quán)利要求1、2或4中所述的片段，所述片段具有與權(quán)利要求1至4中任何一項的(i)部分所述的多肽相同的抗原決定簇，由SEQ ID NO8所示氨基酸序列的7或以上個氨基酸殘基組成。
7.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，它由SEQ ID NO10和/或SEQ ID NO16所示的氨基酸序列組成。
8.一種編碼上述權(quán)利要求中任何一項所述的多肽的純化核酸分子。
9.如權(quán)利要求8所述的純化核酸分子，其特征在于所述核酸分子具有SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15所示的核酸序列，或者是其冗余等同物或片段。
10.一種純化核酸分子，它在高度嚴謹條件下與權(quán)利要求8或9的核酸分子雜交。
11.一種載體，它含有權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
12.一種用權(quán)利要求11所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
13.一種配體，它特異性地結(jié)合權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽。
14.如權(quán)利要求13中所述的配體，其特征在于所述配體是一種抗體。
15.一種化合物，它增加或降低權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽的表達水平或活性。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其特征在于所述化合物與權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽結(jié)合，并且不會誘導(dǎo)該多肽的任何生物作用。
17.如權(quán)利要求15或16所述的化合物，其特征在于所述化合物是天然或修飾的基質(zhì)、配體、酶、受體或者結(jié)構(gòu)或功能類似物。
18.如權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽、權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權(quán)利要求11所述的載體、權(quán)利要求12所述的宿主細胞、權(quán)利要求13或14所述的配體、或者權(quán)利要求15至17中任何一項所述的化合物，在治療或診所疾病中的應(yīng)用。
19.一種診斷病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括評估所述病人組織中編碼權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽的天然基因的表達水平或者評估所述病人組織中權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽的活性，并將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于所述方法在體外進行。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽復(fù)合物的條件下，將權(quán)利要求13或14所述的配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述復(fù)合物。
22.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(a)在允許權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子和核酸探針之間形成雜交復(fù)合物的嚴謹條件下，將病人的組織樣品與該探針接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下，將對照樣品與所述探針接觸；以及(c)檢測所述樣品中是否存在雜交復(fù)合物，其中，檢測到病人樣品中雜交復(fù)合物的水平與對照樣品中雜交復(fù)合物水平不同，表示患病。
23.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(a)在允許權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子和核酸引物之間形成雜交復(fù)合物的嚴謹條件下，將病人組織的核酸樣品與該引物接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下，將對照樣品與所述引物接觸；以及(c)擴增樣品中的核酸；(d)檢測病人和對照樣品中擴增核酸的水平；其中，檢測到病人樣品的擴增核酸水平與對照樣品的擴增核酸水平明顯不同，表示患病。
24.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于所述方法包括(a)從有待測試疾病的病人中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子；以及(c)通過檢測核酸分子與疾病相關(guān)的突變是否存在，診斷病人疾病。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述方法還包括擴增核酸分子以形成擴增產(chǎn)物，以及檢測該擴增產(chǎn)物中是否存在突變。
26.如權(quán)利要求24或25所述的方法，其特征在于所述病人是否存在突變是這樣檢測的將所述核酸分子與在嚴謹條件下和所述核酸分子雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應(yīng)于與疾病相關(guān)的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；以及檢測探針鏈的未雜交部分是否存在，表示與疾病相關(guān)的突變存在或不存在。
27.如權(quán)利要求19至26中任何一項所述的方法，其特征在于所述疾病包括但不限于細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎癥疾病，包括過敏癥、炎癥性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道發(fā)炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化癥、血栓癥、敗血癥、休克、再灌注損傷和缺血；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和疼痛；發(fā)育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質(zhì)疏松和肥胖、AIDS和腎?。桓腥?，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病癥，特別是由C1q家族蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些。
28.如權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽作為TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
29.一種藥物組合物，其特征在于所述組合物含有權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽、權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權(quán)利要求11所述的載體、權(quán)利要求12所述的宿主細胞、權(quán)利要求13或14所述的配體、或者權(quán)利要求15至17中任何一項所述的化合物。
30.一種疫苗組合物，其特征在于所述組合物含有權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽或權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
31.如權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽、權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權(quán)利要求11所述的載體、權(quán)利要求12所述的宿主細胞、權(quán)利要求13或14所述的配體、權(quán)利要求15至17中任何一項所述的化合物、或者權(quán)利要求29所述的藥物組合物在制備治療以下疾病的藥物中的應(yīng)用細胞增殖性疾病，包括腫瘤、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳癌、胰腺癌、頭頸癌及其它實體腫瘤；骨髓增生性疾病，例如白血病、非何杰金氏淋巴瘤、白血球減少癥、血小板減少癥、血管生成障礙、卡波西氏肉瘤；自身免疫/炎癥疾病，包括過敏癥、炎癥性腸疾病、關(guān)節(jié)炎、銀屑病和呼吸道發(fā)炎、哮喘和器官移植排斥；心血管疾病，包括高血壓、水腫、心絞痛、動脈硬化癥、血栓癥、敗血癥、休克、再灌注損傷和缺血；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、阿耳茨海默氏病、腦損傷、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和疼痛；發(fā)育障礙；代謝性疾病，包括糖尿病、骨質(zhì)疏松和肥胖、AIDS和腎??；感染，包括病毒性感染、細菌性感染、真菌性感染和寄生蟲感染；以及其它由TNF-樣分泌性蛋白質(zhì)介導(dǎo)的病癥，特別是由C1q家族蛋白質(zhì)介導(dǎo)的那些。
32.一種治療病人疾病的方法，其特征在于所述方法包括把權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽、權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子、權(quán)利要求11所述的載體、權(quán)利要求12所述的宿主細胞、權(quán)利要求13或14所述的配體、權(quán)利要求15至17中任何一項所述的化合物、或者權(quán)利要求29所述的藥物組合物給予該病人。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性是較低的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是激動劑。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病病人的該表達水平或活性是較高的，給予該病人的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是拮抗劑。
35.一種監(jiān)測病人疾病治療的方法，其特征在于所述方法包括在一段時間內(nèi)監(jiān)測病人組織中權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽的表達水平或活性、或權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子的表達水平，若在該時間內(nèi)所述表達水平或活性趨向于對照水平，表示該疾病獲得緩解。
36.一種鑒定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽、或者權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子與懷疑對所述多肽或核酸分子有結(jié)合親和力的一或多種化合物接觸，以及選擇能特異性地結(jié)合所述核酸分子或多肽的化合物。
37.一種診斷疾病的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括第一容器，它含有在嚴謹條件下與權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，它含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。
38.如權(quán)利要求37所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
39.一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是權(quán)利要求8至10中任何一項所述的核酸分子。
40.一種試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括一或多種與權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽結(jié)合的抗體；以及一種用來檢測所述抗體與所述多肽之間結(jié)合反應(yīng)的試劑。
41.一種轉(zhuǎn)基因或剔除非人動物，其特征在于所述動物被轉(zhuǎn)化為表達更高水平、更低水平或不表達權(quán)利要求1至7中任何一項所述的多肽。
42.一種篩選有效治療疾病的化合物的方法，其特征在于所述方法包括將權(quán)利要求41所述的非人轉(zhuǎn)基因動物與候選化合物接觸，并測定該化合物對動物疾病的影響。
43.如權(quán)利要求32至36或權(quán)利要求42中任何一項所述的方法，其特征在于所述疾病是權(quán)利要求27所列出的其中一種疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎蛋白質(zhì)INSP058，它經(jīng)本發(fā)明鑒定為TNF－樣分泌性蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及該蛋白質(zhì)和編碼基因的核酸序列在診斷、預(yù)防和治療疾病中的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/18GK1816565SQ03826818
公開日2006年8月9日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日
發(fā)明者S·N·菲茲杰拉德, R·J·法根, C·B·菲爾普斯, C·鮑爾, M·伊伯森, M·優(yōu)克 申請人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司