專利名稱：抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
此發(fā)明涉及抗原肽(antigenic peptide)。
背景技術(shù)：
數(shù)個(gè)對(duì)人體健康重要的病原體是可變異的病原體，如HIV-1，HIV-2，乙型和丙型肝炎病毒，流感病毒(influenza)，1-4型登革熱病毒(dengue virus)，瘧疾病原體，和結(jié)核病病原體。這些可變異病原體及其高度遺傳變異性給開發(fā)針對(duì)它們的疫苗帶來困難。特別是全世界感染了HIV的人數(shù)迅速增長，尤其是在衛(wèi)生保健資源貧乏的國家。開發(fā)高度有效的疫苗可幫助限制此流行病的傳播。開發(fā)此疫苗的一個(gè)主要障礙是HIV的極高遺傳多樣性。在世界的多個(gè)地區(qū)觀察到在不同的亞型中、在單個(gè)亞型中甚至有時(shí)在一個(gè)個(gè)體中存在遺傳多樣性。此變異性由在病毒復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的病毒蛋白的高頻(high rate)突變導(dǎo)致。見例如，Coffin，J.M.Science 1995，267483-489；Delwart等，J.Virol.1994686672-6683；Markham R.B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，9512568-12573；和McCutchan，F(xiàn).E.等，AIDS 1996 10 Suppl 3S13-S20，其每篇全文引入作為參考。
動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示，同時(shí)暴露于多個(gè)抗原決定簇通常會(huì)誘導(dǎo)對(duì)它們中每一個(gè)的免疫反應(yīng)(Thomson，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995，925845-5849；Thomson，S.A.等，J.Virol.1998，722246-2252；和Woodberry，T.等，J.Virol.1999，735320-5325，其每篇全文引入作為參考)。這表明多個(gè)抗原決定簇適合作為單個(gè)疫苗構(gòu)建體的組分。
發(fā)明概述針對(duì)可變異病原體的免疫反應(yīng)的保護(hù)性成分通常針對(duì)蛋白的可變區(qū)。從另一個(gè)角度，如果保護(hù)性反應(yīng)是針對(duì)蛋白的保守區(qū)的話，那么病原體的變異性不會(huì)給感染的免疫控制和疫苗預(yù)防帶來問題。然而針對(duì)可變異病原體的保守區(qū)的免疫反應(yīng)通常被證明是無保護(hù)性的。基于可變區(qū)的肽抗原能誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)，但這些區(qū)的可變異性很大，因此添加單個(gè)肽序列來覆蓋變異性是不實(shí)際的。針對(duì)可變異病原體的有效疫苗應(yīng)包括多種抗原，來產(chǎn)生針對(duì)個(gè)體可能會(huì)接觸的病原體的變體的免疫反應(yīng)。
針對(duì)可變異感染因子(infectious agent)的疫苗預(yù)防或治療需要構(gòu)建一種疫苗，它能誘導(dǎo)針對(duì)抗原可變區(qū)的寬范圍(wide-range)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。要針對(duì)可變異感染因子進(jìn)行疫苗預(yù)防或治療，就要開發(fā)針對(duì)其蛋白組分可變區(qū)或高變區(qū)能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的疫苗。
含有一或多個(gè)潛在保護(hù)性表位的嵌合肽抗原文庫以及包含這些抗原的疫苗構(gòu)建體能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。特別是嵌合肽文庫能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，其包括對(duì)HIV-1，HIV-2，丙型和乙型肝炎病毒，流感病毒，1-4型登革熱病毒，瘧疾病原體，和結(jié)核病病原體，或其它可變異病原體的體液和細(xì)胞反應(yīng)。
可設(shè)計(jì)嵌合肽文庫來代表蛋白表位的天然出現(xiàn)的及潛在的變體。用此方式開發(fā)的肽文庫能產(chǎn)生廣泛的免疫交叉反應(yīng)，并可用來構(gòu)建疫苗，藥物，和診斷試劑盒?？蓪⒋嗽O(shè)計(jì)方法用于范圍廣泛的感染因子的抗原決定簇。對(duì)一種感染因子或其蛋白之一或?qū)τ谠摰鞍椎膯蝹€(gè)表位可用不同方法。
嵌合肽的免疫原性組(set)被稱為可變異嵌合肽文庫(VCPL)，它代表了抗原活性區(qū)的天然出現(xiàn)的和潛在的可變異性?？勺儺惽逗想奈膸焓窃谝换蚨鄠€(gè)位置可變異的同源性肽的組。設(shè)計(jì)它們的目的是模擬感染因子的可變異的保護(hù)性決定簇的遺傳多樣性。此VCPL能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有共同特異性的寬范圍的抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其覆蓋了可變異感染因子的抗原變體的多樣性。
本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生抗原肽的家族的方法，其包括在病原體蛋白的區(qū)域內(nèi)定位多個(gè)可變異位置，選擇包含所述多個(gè)可變異位置的病原體蛋白的肽序列，基于與在所述病原體蛋白可變異位置上天然出現(xiàn)的氨基酸殘基的抗原相似性、為所述可變異位置之一選擇一或多個(gè)取代物氨基酸殘基(substituteamino acid residue)；并產(chǎn)生基于所述肽序列、并包含所述取代物氨基酸殘基的抗原肽的家族。
本發(fā)明另一方面提供了設(shè)計(jì)肽序列的家族的方法，其包括在病原體蛋白的區(qū)域內(nèi)定位多個(gè)可變異位置，選擇包含所述多個(gè)可變異位置的病原體蛋白的肽序列，并基于與在所述病原體蛋白可變異位置上天然出現(xiàn)的氨基酸殘基的抗原相似性、為所述肽的可變異位置之一選擇一或多個(gè)取代物氨基酸殘基，從而形成肽序列的家族。
所述選擇可包括用抗原相似性矩陣來確定抗原相似性。指定(assign)抗原肽的家族的每個(gè)取代物氨基酸殘基的頻率。所述制備可包括基于指定的頻率來權(quán)重(weighting)抗原肽的家族中的取代物氨基酸殘基。所述指定可包括考慮天然出現(xiàn)變異的頻率。所述病原體蛋白可包括高變區(qū)。所述病原體蛋白可與病毒相關(guān)。所述病毒可以是HIV，乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，或流感病毒。所述病原體蛋白可以是HIV gp120。所述區(qū)域可以是V1，V2，V3，V4或V5區(qū)。所述病原體蛋白可與瘧疾病原體，登革熱病原體或結(jié)核病病原體相關(guān)。
所述抗原肽的家族可包括多個(gè)成員，從而所述成員一起與在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)每個(gè)天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。所述抗原肽的家族可包括多個(gè)成員，從而所述成員一起與在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)非天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。所述方法可包括鑒定所述家族的肽序列，其中所鑒定的肽序列代表了整個(gè)家族的序列多樣性?？设b定少于500個(gè)序列，這些序列作為整個(gè)家族的序列多樣性的代表。所述鑒定可包括計(jì)算所述家族的肽序列之間的距離。所述計(jì)算距離可包括使用抗原相似性矩陣。
所述方法可包括確定所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性。如果確定所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性超過預(yù)確定的閾值，所述方法可包括在制備所述家族之前從所述抗原肽的家族中去除此肽。
產(chǎn)生所述抗原肽的家族包括通過化學(xué)合成所述肽的家族。所述化學(xué)合成包括組合合成(combinatorial synthesis)，其中形成的所述肽為不同序列的混合物。可混合所述分開的肽。所述化學(xué)合成可包括平行合成(parallel synthesis)，其中每個(gè)肽與其它肽分開形成。產(chǎn)生所述抗原肽的家族可包括用宿主生物體表達(dá)所述肽的家族。
本發(fā)明另一方面提供了包含抗原肽的家族的組合物，所述抗原肽具有的氨基酸序列與病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列有抗原相似性，其中所述家族中每個(gè)抗原肽具有至少一個(gè)相對(duì)于家族中的其它抗原肽變異的氨基酸位置。
在變異的位置上一個(gè)氨基酸殘基會(huì)比另一個(gè)出現(xiàn)得更頻繁。所述家族可包括多于150或多于1,000個(gè)彼此獨(dú)特的(mutually unique)抗原肽。所述家族可包括少于100,000或少于50,000個(gè)彼此獨(dú)特的抗原肽。所述家族可包括在1,000和50,000個(gè)之間的彼此獨(dú)特的抗原肽。所述抗原肽的家族可包括與HIV亞型的序列具有抗原相似性的序列。所述亞型可以是A亞型，B亞型，C亞型，D亞型，F(xiàn)亞型，G亞型，重組亞型，N組HIV的亞型，O組HIV的亞型或它們的組合。所述抗原肽的家族的至少兩個(gè)成員可混合在一起。所述抗原肽的家族可根據(jù)序列分開。所述家族可包括多抗原肽(multiple antigenicpeptide)。
本發(fā)明另一方面提供了在受試者誘發(fā)免疫反應(yīng)的方法，其包括給予所述受試者包含抗原肽的家族的組合物，所述抗原肽具有的氨基酸序列與病原體的病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列有抗原相似性。
可用抗原相似性矩陣確定抗原相似性。可在受試者被所述病原體感染前給予其所述組合物。所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可與所述病原體蛋白亞型的氨基酸序列有抗原相似性。所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可與所述病原體蛋白一種以上的亞型的氨基酸序列有抗原相似性。將所述組合物給予被所述病原體感染的受試者。該受試者可被所述病原體的亞型感染。所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列可與該受試者所感染的亞型的氨基酸序列有抗原相似性。
本發(fā)明另一方面提供了診斷感染的方法，其包括使樣品與肽的家族接觸，所述肽的氨基酸序列與病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列有抗原相似性，其中家族中每個(gè)肽有至少一個(gè)相對(duì)于家族中其它肽變異的氨基酸位置。
所述肽的家族可與病原體亞型在抗原性上相似，或與一種以上病原體亞型相似。可將所述肽的家族在接觸前固定在基質(zhì)(substrate)上。所述方法可包括確定所述樣品是否包含與所述肽的家族特異性結(jié)合的抗體。
通常，抗原肽文庫代表了病原體蛋白可變區(qū)的存在的和潛在的多樣性。所述肽文庫可用于預(yù)防、治療和診斷的應(yīng)用?？捎梦膸齑聿≡w表位的完全抗原多樣性(full antigenic diversity)。為反映病原體所有變體的多樣性而設(shè)計(jì)的文庫可以是廣譜的(broad-spectrum)疫苗或是診斷性試劑。為反映病原體一或多個(gè)亞型的多樣性而設(shè)計(jì)的文庫可以是亞型特異性疫苗或是診斷性試劑?？蓮奈膸烊コc發(fā)現(xiàn)于人類蛋白的序列高度相似并因此可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的肽序列?？稍O(shè)計(jì)已知序列的任何可變異的病原體蛋白的文庫?？勺儺惒≡w的例子包括HIV-1，HIV-2，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，流感病毒，1-4型登革熱病毒，瘧疾病原體，和結(jié)核病病原體。
如下說明書將詳細(xì)描述一或多個(gè)實(shí)施方案。其它特征和優(yōu)點(diǎn)在說明書和權(quán)利要求書中明顯可見。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)做了很多努力來開發(fā)特別是針對(duì)HIV的疫苗，但至今未成功。為了針對(duì)寬范圍的HIV-1分離體(isolate)有效，潛在的疫苗應(yīng)包含主要分離體的免疫原，其代表了HIV-1分離體的整個(gè)范圍。必需鑒定這些免疫原并提高其免疫原特性(McMichael，A.J.，和Hanke，T，Nature Medicine 2003，9874-880；Baltimore，D.和Heilman，C.Sci.Am.1998，27998-103；和van der Groen，G等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998，14Suppl.3S211-S221，其每篇全文引入作為參考)。
因此，所得疫苗構(gòu)建體應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代傳遞工具和佐劑，包含對(duì)寬范圍的HIV-1分離體特異的、關(guān)鍵的保護(hù)性B細(xì)胞和T細(xì)胞的表位。需要激活免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞免疫(Berzofsky，J.A.，和Berkower，I.J.，AIDS 1995，9 Suppl.AS 143-S 157，其每篇全文引入作為參考)。據(jù)認(rèn)為，粘膜上的局部免疫反應(yīng)和循環(huán)的中和抗體對(duì)預(yù)防HIV感染起主要作用，而病毒特異性CTL可能去除被感染的細(xì)胞。見例如，Lehner，T.等，Science 1992，2581365-1369；和Goulder，P.J.和Walker，B.D.Nature Med.1999，51233-1235，其每篇全文引入作為參考。
HIV包膜糖蛋白的氨基酸序列(也稱env或gp120)在獨(dú)立分離體之間和來自一個(gè)感染個(gè)體的連續(xù)分離體之間是高度變異的。gp120的氨基酸可變異性集中在特定可變區(qū)，編號(hào)為V1-V5。變化最大的區(qū)域通常包含中和表位，從而該病毒部分地逃避了宿主免疫反應(yīng)并使感染持續(xù)下去。gp120的主要中和性決定簇位于第三個(gè)高變區(qū)(V3)。
因發(fā)現(xiàn)V3區(qū)為主要的中和決定簇，現(xiàn)已開發(fā)數(shù)個(gè)針對(duì)HIV-1的侯選肽疫苗。例如，合理設(shè)計(jì)針對(duì)HIV的多價(jià)亞單位疫苗的方法包括確定來自世界各地區(qū)的HIV gp120分離體的V2和V3區(qū)的中和表位。見例如，美國專利6,042,836，其全文引入作為參考。另一個(gè)合成的免疫原性HIV-1肽的途徑包括設(shè)計(jì)串聯(lián)的合成肽，該肽包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的表位序列和多個(gè)不同哦功能HIV分離體的V3環(huán)序列。見例如，美國專利5,817,754，其全文引入作為參考。然而，V3區(qū)的高度遺傳變異性產(chǎn)生了多樣的序列，所述序列不能被同時(shí)引入疫苗構(gòu)建體。
基于與疫苗同樣的原因，要診斷抗可變異感染因子高變區(qū)的抗體是極為困難的。這些抗體在免疫反應(yīng)中最早出現(xiàn)并且占優(yōu)勢。一個(gè)例子是抗HIV-1gp120的V3區(qū)的抗體。見例如，Baltimore，D.和Heilman，C.Sci.Am.1998，27998-103，Berzofsky，J.A.，和Berkower，I.J.，AIDS 1995，9Suppl.AS143-S157，和Carlos，M.P.等，AIDSRes.Hum.Retroviruses2000，16153-161，其每篇全文引入作為參考。
診斷抗gp120的V3高變區(qū)的抗體依賴于涉及的抗原的基因型和感染因子的基因型。它需要使用多個(gè)對(duì)應(yīng)于范圍廣泛的HIV-1變體的多個(gè)序列。否則，漏掉病毒的罕見變體或被修飾的變體的風(fēng)險(xiǎn)很高。
以肽為基礎(chǔ)的疫苗可包括肽的文庫。所述肽可與病原體蛋白的可變區(qū)相似。特別是所述可變區(qū)可包含已知的抗原決定簇。選擇文庫中的肽序列以使其代表所述可變區(qū)的天然出現(xiàn)和潛在的可變異性。
模擬病原體的可變異蛋白區(qū)域遺傳多樣性的嵌合肽文庫能誘導(dǎo)對(duì)廣譜病原體變體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。為設(shè)計(jì)嵌合肽文庫，進(jìn)行蛋白序列信息的理論分析。所述合理(rational)分析設(shè)計(jì)出能模擬所述可變異蛋白區(qū)域的所有已知和潛在變體的文庫。所述文庫可以是亞型特異性文庫，它只模擬那些屬于病原體特定亞型的變體，或者所述文庫是模擬屬于一個(gè)以上亞型的變體的廣譜文庫。所述文庫的肽可結(jié)合對(duì)其各種抗原性變體特異的抗體。
一般通過分析來自可變異病原體的蛋白序列來開始設(shè)計(jì)抗原性嵌合肽文庫。鑒定所述蛋白的可變區(qū)。所述可變區(qū)可以是已知的抗原決定簇。選擇所述蛋白序列內(nèi)包括至少一個(gè)可變位置的肽片段為所述嵌合肽文庫的基礎(chǔ)。所述片段包括一或多個(gè)具有天然序列變異的位置。所述肽片段可包括不改變的位置。所述片段可以是10-50個(gè)殘基長度，如15-45個(gè)殘基或20-40個(gè)殘基長度。鑒定出在肽的每個(gè)可變異位置出現(xiàn)的殘基以及每個(gè)出現(xiàn)的頻率。通過考慮與在那個(gè)位置天然出現(xiàn)的殘基的抗原相似性來選擇文庫中每個(gè)可變異位置上的殘基。根據(jù)每個(gè)殘基或與其對(duì)應(yīng)的抗原性相似的殘基的天然出現(xiàn)頻率來設(shè)定每個(gè)殘基在可變異位置上的頻率。如下將更具體描述對(duì)殘基和頻率的選擇?？梢宰詣?dòng)，即用計(jì)算機(jī)程序來選擇殘基和確定頻率。
文庫中的序列數(shù)(文庫大小)是肽中每個(gè)位置上可能的殘基數(shù)的產(chǎn)物。所述文庫大小可包括，例如，多于200,000,000個(gè)序列，少于200,000,000個(gè)序列，少于500,000個(gè)序列，少于200,000個(gè)序列，少于100,000個(gè)序列，少于50,000個(gè)序列，多于5,000個(gè)序列，多于10,000個(gè)序列，或多于20,000個(gè)序列?？梢酝ㄟ^去除出現(xiàn)頻率最低的殘基來減少所述文庫大小，直到達(dá)到理想大小。
嵌合肽的免疫原性組(可變異的嵌合肽文庫或VCPL)在一起時(shí)，代表抗原活性區(qū)的天然出現(xiàn)的和潛在的可變異性。可變異嵌合肽文庫是在一或多個(gè)位置可變異的同源性肽的組。設(shè)計(jì)它們是為了模擬感染因子的主要可變異保護(hù)性決定簇的遺傳多樣性。這些VCPL可誘導(dǎo)多種抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其具有覆蓋所述感染因子抗原性變體的多樣性的聯(lián)合(joint)特異性。因此，VCPLs誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，所述反應(yīng)針對(duì)感染因子現(xiàn)存變體的多樣性并且針對(duì)未來可能出現(xiàn)的潛在變體。
可構(gòu)建可變異嵌合肽的文庫，從而這些肽的保守位置代表了對(duì)所有序列共有的氨基酸，并且由一或多個(gè)氨基酸來模擬可變異位置的同種異型(heterogeneous)多樣性。所述模擬氨基酸可以是嵌合的，換言之，它們模擬可變異位置通常的同種異型性，但無須在天然序列的已知和潛在的多樣性的對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)。
設(shè)計(jì)VCPL的方法是基于對(duì)優(yōu)勢免疫蛋白表位的排列(organization)和誘導(dǎo)針對(duì)靶病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)的整體結(jié)構(gòu)證據(jù)的深入調(diào)查。通過收集并分析來自靶病原體的氨基酸序列，并估計(jì)病原體亞型的遺傳可變異性和流行病學(xué)顯著性來開始設(shè)計(jì)文庫。搜索所述氨基酸序列中對(duì)開發(fā)針對(duì)病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)有用的保守、可變和高變區(qū)。
可對(duì)設(shè)計(jì)文庫所來自的病原體蛋白序列進(jìn)行選擇來控制所述肽文庫的抗原特性。例如，模擬病原體特定亞型的文庫可通過僅選擇來自那個(gè)亞型的序列來設(shè)計(jì)。在整個(gè)基因組中，在任一亞型或亞-亞型中序列彼此的相似性一般超過了這些序列和其它亞型的序列的相似性。M組是HIV-1全球流行的(pandemic)主要病毒組，并且它包含多個(gè)亞型。O組是“偏離(outlier)”組，而N組是非-M、非-O病毒的很獨(dú)特的形式。M組HIV-1的HIV-1亞型，例如，是HIV-1序列的系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的組或進(jìn)化枝(clade)，并被標(biāo)記為A1，A2，B，C，D，F(xiàn)1，F(xiàn)2，G，H，J和K。除此以外，重組的HIV-1序列是可能的，其中病毒基因組包含來自一個(gè)以上亞型的序列的區(qū)域。例如見hiv-web.lanl.gov上的HIV Sequence Database。這些亞型代表了HIV的不同譜系，并具有一些地理相關(guān)性。例如當(dāng)發(fā)現(xiàn)特定亞型在特定地理位置占優(yōu)勢時(shí)，模擬特定亞型或重組形式的文庫是有用的。
抗原活性區(qū)序列的潛在進(jìn)化變體數(shù)可以很多。例如，HIV-1 gp120的V3區(qū)的潛在抗原可變異性可以高達(dá)1025-1030個(gè)變體。一旦由天然出現(xiàn)的序列確定了在肽的每個(gè)位置的完全可變異性，可以通過識(shí)別決定所述抗原變體基因型多樣性的最顯著氨基酸來降低所需VCPL的可變異性。多個(gè)氨基酸在免疫原性表位的可變異位置出現(xiàn)的頻率由它們?cè)谒?at issue)區(qū)的序列比對(duì)中的相對(duì)出現(xiàn)情況來決定。
可通過識(shí)別在每個(gè)可變異位置最具有抗原優(yōu)勢的氨基酸來減少所述VCPL的大小，并將它們組合到可變異組合物的組中，并以一或多個(gè)氨基酸代表可變異組合物的組?；诳乖嗨菩源_定代表可變異組合物的組的氨基酸。
抗原相似性是一個(gè)氨基酸殘基在蛋白-蛋白相互作用，例如抗體-抗原作用中取代另一個(gè)的容易程度的定量量度。如果在特定表位用一個(gè)殘基取代另一個(gè)殘基對(duì)那個(gè)表位的抗原表現(xiàn)影響小的話，那么這兩個(gè)殘基在抗原性方面非常相似。相反，如果所述取代的影響大，那么這兩個(gè)殘基的抗原相似性低。一般物理和化學(xué)性質(zhì)相似的殘基會(huì)具有高的抗原相似性。
可用矩陣，即抗原相似性矩陣(ASM)表示抗原相似性。構(gòu)建矩陣見例如，Maksyutov，A.Z.，Eroshkin，A.M.，和Kulichkov，V.A，Mol.Biol.1987，2130-47所述，其全文引入作為參考。所述矩陣可解釋兩個(gè)殘基的親合力，即兩個(gè)殘基在球狀蛋白中如何頻繁地接觸，如同3D結(jié)構(gòu)檢查所確定的那樣。見例如，Warme，P.K.，和Morgan，R.S.，J.Mol.Bill 1978，118289-304，其全文引入作為參考。也對(duì)免疫球蛋白高變區(qū)中的氨基酸出現(xiàn)頻率作了矩陣核算。見例如，Bourgarit，J.，J.Ann.Immunol.1980，131D267-287，其全文引入作為參考。
可用如下公式轉(zhuǎn)化起始矩陣的值A(chǔ)SMij＝100-(Rij+Rji)/2對(duì)于每對(duì)氨基酸i和j，和Rij和Rji是起始矩陣的元件(element)，因此產(chǎn)生了對(duì)稱(symmetric)矩陣。為區(qū)分合適的(coinciding)氨基酸的作用，并增加在抗原表位頻繁出現(xiàn)的殘基權(quán)重，可根據(jù)如下公式調(diào)整對(duì)角線元件(diagonalelement)ASMii＝ASMii+5(hi+si+c)其中hi是氨基酸的親水性(Hopp，T.P.，和Woods，K.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1981，783824-3828，其全文引入作為參考)，si是蛋白抗原決定簇中該氨基酸的相對(duì)頻率(Maksyutov，A.Z.和Zagrebelnaya，E.S.，Comp.Applic.Biosci.1993，9291-297，其全文引入作為參考)，并且c是hi+si的最小值6.6，引入它是為了確保(hi+si+c)的總和為正。最終，為滿足局部(local)比對(duì)程序SIM，從矩陣中的每個(gè)元件減去數(shù)量75。表1顯示了一個(gè)這樣的矩陣。表1的ASM是為了搜索出在抗體或另一結(jié)合配體與結(jié)合位置相互作用方面表現(xiàn)出相近結(jié)構(gòu)特征的局部相似區(qū)(locally similar region)(見例如，Maksyutov A.Z.等，Molecular Biology 2002，36346-358，其全文引入作為參考)。
一對(duì)氨基酸的矩陣值大(qualitatively)表示它們是彼此的良好取代物，數(shù)值小表示它們彼此取代不好。例如，根據(jù)矩陣?yán)i氨酸和亮氨酸(矩陣值為9)的抗原相似性高，但纈氨酸和天冬氨酸(矩陣值為-59)卻不是，這與從化學(xué)方面的考慮所期望的相同。
表1 查找在肽的每個(gè)位置天然出現(xiàn)的每對(duì)殘基的矩陣值。矩陣值為正的一對(duì)殘基在文庫中會(huì)被在天然序列中出現(xiàn)較頻繁的一個(gè)殘基所代表，并且該殘基在文庫的頻率將會(huì)是它所代表的每個(gè)殘基頻率的總和。剩下的殘基以亞組(subgroup)組合，對(duì)于每個(gè)亞組，在矩陣中搜索與亞組中的每個(gè)殘基矩陣值為正的殘基。如果發(fā)現(xiàn)了此殘基，那么指定它的頻率等于亞組中殘基頻率的總和。此殘基可以是不在那個(gè)位置天然出現(xiàn)的殘基。如果天然出現(xiàn)的殘基與在那個(gè)位置天然出現(xiàn)的任何其它殘基無為正的矩陣值，并不能被在那個(gè)位置非天然出現(xiàn)的其它殘基所代表，那么它將在文庫中代表自身。
舉例如何用矩陣來選擇肽文庫中特定位置的殘基，考慮一個(gè)可變異位置，該位置天然出現(xiàn)如下六個(gè)不同殘基A(5％)，D(20％)，E(35％)，M(22％)，V(10％)，和Y(8％)。然后查找每對(duì)天然出現(xiàn)的殘基的矩陣值A(chǔ)D-41AE-49AM-7AV-1AY-25DE4DM-7DV-59DY-26EM-55
EV-62EY-20MV-1MY-10VY-32只有一對(duì)殘基DE的矩陣值為正。這對(duì)殘基會(huì)被天然出現(xiàn)較頻繁的殘基E代表，并會(huì)有與它所代表的殘基的頻率總和(20+35＝55％)相等的頻率。將剩下的殘基A，M，V和Y分為亞組，并且搜索矩陣來尋找與這些殘基抗原性相似的其它殘基。每個(gè)殘基A，M和V的亞組與L都有為正的矩陣值A(chǔ)L3ML4VL9因此文庫中的A，M和V會(huì)被L代表，L與它們?nèi)齻€(gè)在抗原性上相似。L在文庫中的頻率是A，M和V的頻率總和5+10+22＝37％。最終因?yàn)閅不與另一個(gè)殘基在抗原性上相似，Y在文庫中以頻率8％代表自身。表2總結(jié)了在此例中，天然序列的殘基如何被文庫代表的。
表2

理論分析針對(duì)肽文庫的抗體的潛在交叉反應(yīng)性表明，為誘導(dǎo)足夠廣泛的免疫交叉反應(yīng)來覆蓋可變異感染因子的整組抗原變體，需要包含數(shù)萬個(gè)同源性肽的文庫。具有數(shù)百個(gè)同源性肽的較小文庫不能誘導(dǎo)針對(duì)可變異感染因子的屆已存在的和潛在變體的足夠廣泛的免疫反應(yīng)。然而，使文庫大小變大也會(huì)增加該文庫未來引發(fā)自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。通過評(píng)估抗同源性抗原的抗體的交叉反應(yīng)性的方法來進(jìn)行此分析。見例如，Maksyutov A.Z.，VoprosyVirusologii 1989，3283-288；Maksyutov A.Z.，Eroshkin A.M.，和KulichkovV.A.，Molekularnaya Biologiya 1987，2139-47；Maksyutov，A.Z.，和Zagrebelnaya，E.S.，Computer Applications in the Biosciences 1993，9291-297；以及Maksyutov，A.Z.，和Zagrebelnyi S.N.，Molekularnaya Biologiya1993，27980-991，其每篇引入本文作為參考。
一般在個(gè)體自然感染并選擇感染因子的抗原變體時(shí)，時(shí)間太短以致不能形成能與正常人類蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)來誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的足量免疫效應(yīng)物。誘導(dǎo)自身免疫進(jìn)程通常需要長時(shí)間，并通常需要致敏抗原恒定存在。因此，由于可變異感染因子高變區(qū)變體與人類蛋白之間的局部相似性(localsimilarity)可能使在個(gè)體自身致敏的可能性不顯著。另一方面，重復(fù)使用肽疫苗來預(yù)防或治療傳染病會(huì)誘導(dǎo)自身免疫狀況的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，在設(shè)計(jì)多表位疫苗構(gòu)建體，特別是包含佐劑來增強(qiáng)免疫反應(yīng)的疫苗構(gòu)建體時(shí)，需要考慮能引起自身免疫狀況的可變異感染因子可變區(qū)的“時(shí)間保守性”變體的長期持續(xù)性。所以，基于VCPL設(shè)計(jì)疫苗構(gòu)建體需要全面地在理論上考慮VCPL肽和整組人類蛋白之間的局部相似性。
對(duì)文庫中有產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)潛力的序列進(jìn)行篩選是有利的。如果文庫中的肽與在人類蛋白存在的肽高度相似，那么會(huì)產(chǎn)生對(duì)所述人類蛋白的免疫反應(yīng)，從而對(duì)人的健康產(chǎn)生有害影響?？赏ㄟ^確定文庫中的肽序列與在人類蛋白中發(fā)現(xiàn)的序列的抗原相似性，來計(jì)算肽序列可產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的可能性量度。
在設(shè)計(jì)VCPL方法的最后一步中，可分析VCPL肽和整組人類蛋白的局部相似性。針對(duì)由于VCPL肽與人類蛋白的局部相似性而產(chǎn)生的潛在的自身免疫原性決定簇，可篩選基于VCPL的侯選疫苗。可從文庫去除這些潛在的自身免疫原性決定簇。
可選擇要在VCPL模擬的表位，使其無自身免疫性。在識(shí)別與人類蛋白表現(xiàn)出接近的局部相似性的區(qū)域的基礎(chǔ)上，鑒定感染因子蛋白中潛在的免疫致病性區(qū)域的方法為合理設(shè)計(jì)針對(duì)病原微生物的安全多表位疫苗提供了途徑，因?yàn)樗梢匀コ龓в忻庖咧虏摿Φ谋砦?。特別是，應(yīng)該去除與出現(xiàn)頻繁和/或支持機(jī)體重要生理功能的人類蛋白表現(xiàn)出相似性的抗原決定簇。
為檢索文庫序列和人類蛋白之間的相似性，可用SIM程序(Huang，X.和Miller，W.，Adv.Appl.Math.，1991，12，337-357，其全文引入作為參考)。人類蛋白序列可得自公共數(shù)據(jù)庫例如SWISS-PROT(rl.41，F(xiàn)EB-2003)和SP-TrEMBL(rl.23，MAR-2003)?？捎脷W洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EuropeanMolecular Biology Laboratory)(EMBL)服務(wù)器上的SIM版本進(jìn)行比對(duì)。SIM程序可用參數(shù)如下缺口(gap)-打開(open)罰分100，缺口-延伸罰分20。
局部相似性搜索會(huì)帶來很多偶然的發(fā)現(xiàn)(hit)，其中很多在來自文庫的肽序列和人類蛋白的區(qū)域之間有低相似性。它可用于過濾相似性檢索的結(jié)果來鑒定最相關(guān)的肽-蛋白相似性?？扇缦逻M(jìn)行過濾。將二十個(gè)常出現(xiàn)的氨基酸分為交叉的具有物理化學(xué)相似性的組1組-Lys，Arg；2組-Asp，Glu；3組-Asn，Gln；4組-Ser，Thr；5組-Ala，Ile，Leu，Val；6組-Ala，Gly；7組-Leu，Phe；8組-Leu，Met，Val；和9組-Phe，Trp，Tyr。
對(duì)于文庫肽和人類蛋白之間的局部相似性的每個(gè)發(fā)現(xiàn)，計(jì)算如下值相似性指數(shù)(SIM程序確定的Score)；匹配氨基酸的百分比(Match％)；匹配氨基酸數(shù)(M)；錯(cuò)配(mismatch)氨基酸數(shù)(MM)；缺口數(shù)(Gap)；保守取代數(shù)(Ccons)(即1，2，3&4，5-9組內(nèi)的取代數(shù))；帶電荷氨基酸(His，Lys，Arg，Asp，Glu)被帶相反電荷(C+-)的氨基酸取代的數(shù)；帶電荷氨基酸的非保守取代或缺失數(shù)(C±)；極性氨基酸(Asn，Gln，Ser，Thr)的非保守取代或缺失數(shù)(Cpolar)；和芳香族氨基酸(Phe，Trp，Tyr)的非保守取代或缺失數(shù)(Carom)。
然后用經(jīng)驗(yàn)(empirical)的算法檢測是否符合如下條件1)不低于320的相似性指數(shù)(Score≥320)。
2)已知區(qū)中的匹配氨基酸數(shù)不低于6(M≥6)。
3)匹配百分比不低于50％(Match％≥50％)。
4)已知區(qū)中的匹配氨基酸和保守取代數(shù)不低于8M+Ccons≥8。然而，如果在同源性區(qū)中有亞區(qū)，其包含一行8個(gè)保守的或者匹配的氨基酸的鏈(string)，那么將此區(qū)看作一個(gè)整體而不再考慮匹配的百分比(Match％)。
5)(MM-Ccons+Gap)/(M+Ccons)≤{0.37|M＝6+∞}6)1.5*C+-+C±+0.5*(Cpolar+Carom)≤0.1+0.5*(M+Ccons-6)如果符合了所有上述標(biāo)準(zhǔn)，那么可考慮人類蛋白的性質(zhì)和/或功能。如果文庫的序列與在人類蛋白頻繁出現(xiàn)的序列相似，或與具有重要生理功能的蛋白的序列相似，可從文庫中去除該序列。
某些情況下，理想的文庫具有少量的序列，如少于1,000個(gè)序列，少于500個(gè)序列，或少于250個(gè)序列。所述文庫代表了在天然出現(xiàn)的序列中發(fā)現(xiàn)的完全抗原多樣性。可通過從大文庫(例如VCPL)選擇序列來建立這樣的代表性嵌合肽文庫(RCPL)，從而所選擇的序列代表了在天然出現(xiàn)的序列和從大文庫產(chǎn)生的非天然序列中發(fā)現(xiàn)的完全抗原多樣性。非天然序列能反映潛在的序列，例如，通過包括在單一序列中非天然發(fā)現(xiàn)在一起的不同位置上的變體。
因?yàn)镽CPL具有的肽數(shù)比VCPL少，它本身不太可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。與VCPL中的殘基頻率相似，選作RCPL的序列可向某些位置上的某些殘基偏移(bias)。RCPL也可偏向特定個(gè)別序列。換言之，如果RCPL包括100個(gè)獨(dú)特的肽序列，那么這些肽可以任意比率組合。除了小很多的序列數(shù)外，RCPL的抗原多樣性可以象RCPL所來自的VCPL的抗原多樣性一樣大。由此，相對(duì)少量的化學(xué)種類(chemical species)(即肽序列)的混合物會(huì)和極大量的化學(xué)種類的混合物產(chǎn)生同樣廣泛的免疫反應(yīng)。
RCPL是均勻覆蓋感染因子高變區(qū)多樣性變體的同源性肽組。RCPL由文庫中較小量的肽(與VCPL相比)來表征，其均勻覆蓋可變異感染因子高變區(qū)的抗原性變體組，包括潛在的變體。設(shè)計(jì)RCPL來模擬感染因子的主要可變異保護(hù)性決定簇的抗原多樣性。RCPL會(huì)產(chǎn)生寬范圍的抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其組合的特異性覆蓋了可變異感染因子的抗原性變體組。因此，RCPL能誘導(dǎo)對(duì)抗可變異感染因子的現(xiàn)存及潛在變體的多樣性的體液和細(xì)胞反應(yīng)。
為選擇RCPL中肽的具體數(shù)目N，隨機(jī)從所模擬的高變異抗原活性區(qū)(例如VCPL)的變體的完全(whole)多樣性中選擇大量的(例如＞1,000，＞10,000，＞100,000，＞1,000,000，或＞10,000,000)肽序列，來計(jì)算模擬區(qū)具體位置上的氨基酸出現(xiàn)頻率。隨機(jī)選擇的肽序列組的排列順序是根據(jù)它們?cè)谒M的高變異抗原區(qū)的變體的完全多樣性中出現(xiàn)的相對(duì)頻率。使用隨機(jī)選擇的肽組中最初37-100％的序列。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定所用的所述百分比。
選擇在每個(gè)位置具有最大出現(xiàn)頻率的氨基酸的肽序列作為RCPL的第一個(gè)序列?；蛘?，可用所模擬的高變異抗原區(qū)變體組的任何肽作為第一個(gè)序列，或者作為參照序列。
從隨機(jī)選擇的肽的組中選擇每個(gè)隨后加到RCPL的肽序列，從而使新序列和所有以前加到文庫中的所有序列之間的距離達(dá)到最大或接近最大?？捎每乖嗨菩跃仃噥泶_定兩個(gè)肽之間的距離Rij(例如見表1)。根據(jù)如下計(jì)算RijRij=Σk=1lF(ik,jk)]]>
其中ik是肽i的第k個(gè)殘基，jk肽j的第k個(gè)殘基，并且l是文庫中每個(gè)肽的氨基酸殘基數(shù)。可用抗原相似性矩陣描述函數(shù)FF(ik，jk)＝ASM(ik，jk)其中ASM(ik，jk)值是被ik和jk代表的殘基對(duì)的矩陣值。
對(duì)隨機(jī)選擇肽的每個(gè)肽n，根據(jù)公式來計(jì)算所選的最初N個(gè)肽(即已存在于RCPL的那些)和肽n之間的Sn距離總和Sn=Σi=1NRin]]>其中Rin的計(jì)算如上。將具有Sn最大值的肽n加到所述文庫。一直從一大組隨機(jī)選擇的序列中選擇序列直到RCPL達(dá)到理想的序列數(shù)。
或者可簡單用函數(shù)F來計(jì)數(shù)兩個(gè)肽之間的取代數(shù)。在這種情況下，當(dāng)ik等于jk(即兩個(gè)肽在位置k具有相同的殘基)時(shí)F(ik，jk)值是1，并且當(dāng)ik和jk不同時(shí)F(ik，jk)是0。以此方式選擇時(shí)，RCPL的序列應(yīng)均勻覆蓋所模擬的高變異抗原活性區(qū)的整組變體。
可篩選RCPL中包括的具有上述自身免疫原性質(zhì)的每個(gè)肽。如果確定肽序列具有誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的潛力，可將它從RCPL排除。然后選擇另一個(gè)具有實(shí)際相同的所需性質(zhì)的候選物作為RCPL中的下一個(gè)肽。設(shè)計(jì)選擇的算法，從而使加到RCPL的每個(gè)新的肽是從許多等值的序列中選擇的(即與文庫中以前的肽序列距離相同)。
本文描述的所選擇的足量的肽可均勻覆蓋可變異感染因子的高變異表位的抗原變體的完全多樣性。構(gòu)成RCPL的肽數(shù)越多，它能誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)“越強(qiáng)(denser)”。因?yàn)檫x擇N個(gè)肽的運(yùn)算法是遞增的，所以開始的N/2個(gè)肽也會(huì)均勻覆蓋變體的完全多樣性，只是不如選擇N個(gè)肽所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)。
可將代表性嵌合肽文庫構(gòu)建為侯選疫苗。文庫中的肽序列一起覆蓋了可變異感染因子的高變異抗原活性區(qū)變體的完全多樣性。設(shè)計(jì)所述序列以模擬感染因子的主要可變異的保護(hù)性決定簇的遺傳多樣性。模擬的肽也可以是嵌合的，因?yàn)楸M管它們模擬了變體的同種異型組，RCPL中的序列事實(shí)上出現(xiàn)在極少的(如果有)表位序列的已知和潛在變體中。
一般可人工或用自動(dòng)合成儀來合成肽文庫，見例如Lebl M.和Krchnak V.(1997)Solid-Phase Peptide Synthesis，Methosls in Enzymology，289，AcademicPress，Minneapolis，Minnesota所述，其全文引入作為參考。該合成可以是組合合成，其中氨基酸混合物被偶聯(lián)到延長的肽上，并形成肽序列的混合物。在組合合成中，按照殘基在肽中每個(gè)位置的理想比率的規(guī)定將氨基酸加入偶聯(lián)反應(yīng)，調(diào)整對(duì)每個(gè)氨基酸的相對(duì)偶聯(lián)比率?；蛘呖捎闷叫泻铣蓙碇苽湮膸欤渲忻總€(gè)序列被分開合成，并且所述文庫可以是一組單一的純肽序列。此文庫可通過混合純肽來轉(zhuǎn)化為混合物。
要制備大文庫時(shí)可優(yōu)選自動(dòng)組合合成。要制備單個(gè)序列(例如RCPL)的小文庫時(shí)，可優(yōu)選分開合成(split synthesis)。
肽文庫可以是多抗原肽(MAP)的一部分。多抗原肽包括延伸出多條肽的分支核(branched core)。該分支核可基于賴氨酸的分支重復(fù)序列(branchingrepeat)。MAP包括例如4或8條肽鏈。MAP包括疏水基團(tuán)，如從棕櫚酸衍生的烷基鏈。該疏水基團(tuán)可利于MAP與脂質(zhì)體或病毒樣顆粒的裝配。
所述肽可包括20個(gè)通常天然出現(xiàn)的L-氨基酸。所述肽可任選包括對(duì)應(yīng)的D-氨基酸，或D-和L-氨基酸的混合物。肽中也可同樣包括非天然氨基酸。
可用重組方法制備肽文庫。可將編碼文庫肽的DNA構(gòu)建體引入能用所述構(gòu)建體表達(dá)蛋白的宿主生物中。合適的宿主生物包括細(xì)菌如大腸桿菌，乳桿菌(Lactobacillus)，和Bifida，和植物，如煙草。
肽文庫可用于診斷應(yīng)用，例如確定抗體的存在或確定CTL的功能。例如，此文庫可被用作酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的抗原來確定受試樣本中是否存在抗體。在固相分析如ELISA中，文庫的肽被固定在基質(zhì)(例如，聚苯乙烯孔)上。然后在可形成特異性肽-抗體復(fù)合體的條件下，使基質(zhì)暴露于受試樣本(例如受試者的血清)。再洗脫任何未結(jié)合的抗體。然后檢測通過特異性肽-抗體相互作用與基底相連的抗體。所述檢測包括使所述抗體暴露于對(duì)所述受試者免疫球蛋白特異的二抗。所述二抗可被放射性標(biāo)記，或偶聯(lián)到催化有色產(chǎn)物形成的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶上。
診斷性肽文庫可以是廣譜診斷試劑，或亞型特異性試劑。如果將該文庫設(shè)計(jì)成與病原體的所有已知亞型在抗原性上相似，那么無論該受試者是被何種亞型感染的，它都可被用于檢測已經(jīng)被該病原體感染的受試者。然而，如果將該文庫設(shè)計(jì)成只與一種亞型在抗原性上相似，那么如果受試者被相同亞型感染，它可被用于檢測?？梢砸黄鹗褂靡唤M亞型特異性文庫來確定受試者是被若干亞型中的哪一種感染的。
已知基于抗原肽的疫苗。見例如，美國專利4,601,903，4,599,230和4,599,231，它們均引入本文作為參考?？蓪⒁呙缰苽涑煽勺⑸涞?，如液體溶液或乳濁液。所述肽可與和該肽匹配的藥物可接受載體混合。所述載體包括水，生理鹽水，右旋糖，甘油，乙醇及其組合。所述疫苗還可包含輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，或加強(qiáng)疫苗有效性的佐劑。對(duì)于疫苗起佐劑作用的方法包括使用制劑如氫氧化鋁或磷酸鋁(alum)，通常使用其0.05-0.1％的磷酸鹽緩沖鹽水溶液?？赏ㄟ^皮下或肌肉內(nèi)注射腸胃外給藥疫苗?；蛘撸渌o藥模式(包括栓劑和口服制劑)也可能是理想的。對(duì)于栓劑，粘合劑(binder)和載體可包括，例如聚乙二醇或甘油三酯?？诜苿┛砂ㄍǔＪ褂玫妮o料，例如，藥品級(jí)的糖精，纖維素和碳酸鎂。這些組合物呈溶液，懸液，片劑，丸劑，膠囊，緩釋劑或粉末的形式。
以與劑型匹配的方式，并以治療有效性的、保護(hù)性的、并具有免疫原性的量來給藥疫苗。要給藥的量依賴于要治療的受試者，包括例如，個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體并產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的能力。需要給藥的活性成分的精確量依賴于醫(yī)師的判斷。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的劑量范圍，該劑量范圍可以是肽的微克級(jí)。起始給藥和加強(qiáng)劑量的合適方案也可改變，它可包括在起始給藥之后隨后給藥。疫苗的劑量也可依賴于給藥途徑并根據(jù)宿主的大小而改變。
也可將編碼文庫肽的核酸分子通過直接給藥核酸分子(例如通過注射)直接用于免疫接種，或通過先構(gòu)建活的載體，如沙門氏桿菌(Salmonella)，卡介苗，腺病毒，痘病毒，痘苗病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒，再給藥該載體。
在受試者暴露于病原體之前，疫苗可以是誘導(dǎo)受試者中的保護(hù)性免疫反應(yīng)的預(yù)防性疫苗。一般預(yù)防性的疫苗包括廣譜肽文庫。有時(shí)，例如在疫苗接種的受試者可能僅暴露于一種亞型的病原體時(shí)，預(yù)防性疫苗包括亞型特異性肽文庫。疫苗可以是治療性疫苗，設(shè)計(jì)它是為了誘導(dǎo)或加強(qiáng)在被病原體感染的受試者中的免疫反應(yīng)。如果已知該受試者被特定亞型的病原體感染，那么此治療性疫苗可被設(shè)計(jì)為針對(duì)那個(gè)亞型的免疫反應(yīng)的疫苗。
實(shí)施例基于HIV gp120的可變區(qū)V1-V5之一來設(shè)計(jì)肽文庫。用于產(chǎn)生文庫的序列來自HIV A，B，C，D，F(xiàn)，G亞型，或一起使用來自這些亞型的序列?？蓪H從一種亞型序列產(chǎn)生的肽文庫作為亞型特異性疫苗，而將從多個(gè)亞型產(chǎn)生的文庫作為廣譜疫苗。起始設(shè)計(jì)的每個(gè)文庫都包含少于200,000,000個(gè)序列。從起始文庫中將較小文庫設(shè)計(jì)為包含少于500,000個(gè)序列和少于50,000個(gè)序列。通過從較大文庫中去除出現(xiàn)不頻繁的殘基來設(shè)計(jì)較小的文庫，如下表3-37給出了殘基的性質(zhì)(identities)和相對(duì)頻率。例如，表3中，殘基X11在最大的文庫中可以是S，N或G；在下一個(gè)較小文庫中是S或N，在最小文庫中是S。此數(shù)字代表每個(gè)殘基在那個(gè)位置的相對(duì)頻率。在最大的文庫中，S，N或G以80∶13∶7的比率占據(jù)位置X11；在下一個(gè)較小文庫中S或N以80∶13的比率占據(jù)X11；并且在最小的文庫中每個(gè)肽在X11都有S。
嵌合肽文庫-HIV gp120的V1區(qū)基于來自A，B，C，D，F(xiàn)，和G亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-E-X18-K-N其中X1-X18如表3限定。
表3

基于來自A亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-E-X17-K-N其中X1-X17如表4限定。
表4

基于來自B亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-T-X1-X2-X3-N-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-E-X16-X17-E-X18-K-N其中X1-X18如表5限定。
表5

基于來自C亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-E-X18-K-N其中X1-X18如表6限定。
表6

基于來自D亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-T-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-E-X17-K-N其中X1-X17如表7限定。
表7

基于來自F亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-T-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-L-K-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-N其中X1-X20如表8限定。
表8

基于來自G亞型的HIV gp120的V1區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-T-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-N其中X1-X17如表9限定。
表9

嵌合肽文庫-HIV gp120的V2區(qū)基于來自A，B，C，D，F(xiàn)，和G亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-X1-N-X2-T-T-X3-X4-R-X5-K-X6-X7-X8-X9-X10-X11-L-F-Y-X12-L-D-V-V-X13-I-X14-X15-X16-X17-X18-X19-Y-X20-L-X21-X22-C其中X1-X22如表10限定。
表10

基于來自A亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-X1-X2-X3-T-T-X4-L-R-D-K-K-X5-X6-V-X7-X8-L-F-Y-R-L-D-V-V-X9-I-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Y-R-L-I-X19-C其中X1-X19如表11限定。
表11

基于來自B亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-F-X1-I-T-T-X2-X3-X4-X5-K-X6-X7-X8-X9-X10-A-X11-F-X12-X13-L-D-V-V-X14-I-X15-X16-X17-X18-T-X19-Y-X20-L-X21-X22-C其中X1-X22如表12限定。
表12

基于來自C亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-F-N-X1-T-T-E-L-R-D-K-X2-X3-X4-X5-X6-A-L-F-Y-R-X7-D-I-V-X8-L-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Y-X15-L-I-X16-C
其中X1-X16如表13限定。
表13

基于來自D亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-F-N-I-T-T-X1-V-X2-D-K-X3-X4-X5-X6-X7-A-L-X8-Y-R-X9-D-V-V-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Y-R-L-I-X19-C其中X1-X19如表14限定。
表14

基于來自F亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)
S-F-N-X1-T-X2-E-V-R-D-K-X3-X4-K-X5-X6-A-L-F-Y-R-L-D-I-X7-X8-I-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Y-R-L-X16-X17-X18其中X1-X18如表15限定。
表15

基于來自G亞型的HIV gp120的V2區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)S-F-N-X1-T-X2-X3-X4-X5-D-K-X6-K-X7-E-Y-A-L-F-Y-R-X8-D-V-V-X9-I-X10-X11-X12-X13-X14-X15-Y-X16-L-X17-X18-C其中X1-X18如表16限定。
表16p

嵌合肽文庫-HIV gp120的V3區(qū)基于來自A，B，C，D，F(xiàn)，和G亞型而設(shè)計(jì)的HIV gp120的V3區(qū)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-X8-G-X9-G-X10-X11-X12-X13-X14-T-G-X15-I-X16-G-X17-I-R-X18-A-X19-C-X20其中X1-X20如表17限定。
表17

基于來自A亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-N-N-X4-R-X5-X6-V-X7-I-G-P-G-X8-X9-F-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中X1-X19如表18限定。破折號(hào)“-”表示該位置無殘基。例如，如果X12用破折號(hào)代表，那么無殘基占據(jù)X12，并且X11的殘基直接結(jié)合到X13的殘基。
表18

基于來自B亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-X4-I-X5-X6-G-X7-G-X8-X9-X10-X11-X12-T-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中X1-X19如表19限定。
表19

基于來自C亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-I-G-P-G-Q-X8-F-X9-X10-T-X11-X12-I-X13-G-X14-I-R-X15-A-X16-C-X17其中X1-X17如表20限定。
表20

基于來自D亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-X4-X5-X6-R-X7-X8-X9-X10-I-G-X11-G-X12-X13-X14-X15-X16-T-X17-X18-G-X19-I-X20-X21-A-X22-C-X23其中X1-X23如表21限定。
表21

基于來自F亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)
X1-C-T-R-P-X2-N-N-X3-R-K-X4-I-X5-L-G-P-G-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-I-X14-G-X15-I-R-X16-A-X17-C-X18其中X1-X18如表22限定。
表22

基于來自G亞型的HIV gp120的V3區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-S-X4-X5-X6-G-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中X1-X19如表23限定。
表23

嵌合肽文庫-HIV gp120的V4區(qū)基于來自A，B，C，D，F(xiàn)，和G亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-N-T-T-X1-L-F-N-S-T-W-X2-X3-X4-X5-W-X6-T-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-I-X18-L-X19-C其中X1-X19如表24限定。
表24

基于來自A亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-X1-T-S-X2-L-F-N-X3-T-W-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-T-X12-X13-X14-X15-X16-I-X17-L-X18-C其中X1-X18如表25限定。
表25

基于來自B亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-N-T-T-X1-L-F-N-S-T-W-X2-X3-X4-X5-X6-X7-T-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-G-X15-X16-X17-I-X18-L-X19-G其中X1-X19如表26限定。
表26

基于來自C亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-N-T-S-X1-L-F-N-X2-T-Y-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-I-X16-L-X17-C其中X1-X17如表27限定。
表27

基于來自D亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-X1-T-S-X2-L-F-N-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-C其中X1-X15如表28限定。
表28

基于來自F亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-T-X3-X4-L-F-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-I-X14-L-X15-C其中X1-X15如表29限定。
表29

基于來自G亞型的HIV gp120的V4區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)C-N-T-S-X1-L-F-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-L-X16-C其中X1-X16如表30限定。
表30

嵌合肽文庫-HIV gp120的V5區(qū)基于來自A，B，C，D，F(xiàn)，和G亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-E-X7-F-R-P-X8
其中X1-X8如表31限定。
表31

基于來自A亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-R-P-X10其中X1-X10如表32限定。
表32

基于來自B亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-E-X7-F-R-P-G其中X1-X7如表33限定。
表33

基于來自C亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-E-X6-X7-X8-X9-X10其中X1-X10如表34限定。
表34

基于來自D亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-E-X8-X9-R-X10-X11其中X1-X11如表35限定。
表35

基于來自F亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-F-R-P-X8其中X1-X8如表36限定。
表36

基于來自G亞型的HIV gp120的V5區(qū)而設(shè)計(jì)的肽文庫。所述文庫具有如下結(jié)構(gòu)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12其中X1-X12如表37限定。
表37

VCPL的合成和抗原性質(zhì)設(shè)計(jì)模擬序列天然出現(xiàn)的多樣性的肽文庫，所述序列位于HIV-1(B亞型)gp 120包膜蛋白的主要高變V3區(qū)?；谛蛄斜葘?duì)和抗原相似性來選擇文庫中氨基酸的身份(identity)和頻率。從HIV Sequence Database(hiv-web.lanl.gov)可得HIV-1序列。所述肽文庫具有如下結(jié)構(gòu)N-N-N-T-R-K-X1-I-X2-X3-X4-X5-G-X6-X7-X8-Y-X9-T-G-X10-I-I-G-X11-I-R-Q其中X1-X11根據(jù)表38限定。
表38

在Applied Biosystems 430A和Vega Coupler C250自動(dòng)合成儀上使用肽鏈延長的Boc/Bzl方案來合成文庫的肽。用苯乙烯與1％二乙烯基苯的共聚物作為聚合物支持物，并且苯甲酰酰胺甲基(phenacylamidomethyl)(PAM)基團(tuán)為錨定基團(tuán)(Sparrow，J.T.J.Org.Chem.1976，411350-1353，其全文引入作為參考)。使用之前用直接制備的1-羥基苯并三唑酯進(jìn)行縮合，其制備是通過混合相對(duì)于氨基酸Boc產(chǎn)物的聚合物三倍摩爾過量的1-羥基苯并三唑和二異丙基碳二亞胺。監(jiān)視縮合的完成(Kaiser，E.等，Anal.Biochem.1970，34395-398，其全文引入作為參考)。在水合茚三酮試驗(yàn)為陽性的情況下，在中和肽基聚合物后重復(fù)縮合過程。如果試驗(yàn)是陰性的，那么用未稀釋的三氟乙酸去除臨時(shí)性的Boc保護(hù)基團(tuán)，并通過向反應(yīng)混合物直接加入N，N′-二異丙基乙胺來進(jìn)行中和(Schnolzer，M.等Int.J Pept.Prot.Res.1992，40180-183，其全文引入作為參考)。去除Boc基團(tuán)后連接如下的氨基酸殘基。用作側(cè)鏈的永久保護(hù)性基團(tuán)為對(duì)于賴氨酸為2-氯基芐氧基羰基基團(tuán)，對(duì)于酪氨酸為二氯基芐基，對(duì)于天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸和蘇氨酸為對(duì)應(yīng)的芐基酯，對(duì)色氨酸為甲?；?，對(duì)精氨酸為甲苯磺?；?，而蛋氨酸以對(duì)應(yīng)的亞砜形式來引入。完成保護(hù)性多肽鏈的裝配后，由無水氟化氫輔助在凈除劑存在時(shí)從聚合物以一次方式斷裂(one-time cleavage)來使終產(chǎn)物解除封閉(Tam，J.P.等，J Am.Chem.Soc.1983，1056442-6444，其全文引入作為參考)。
合成肽文庫時(shí)，在可變異位置的縮合階段將被保護(hù)的氨基酸殘基混合物以相對(duì)于肽基聚合物的某種定量關(guān)系加入，它會(huì)將不同氨基酸殘基按給定摻入延長的多肽鏈。因?yàn)椴煌被岬陌被；俾什煌铣闪藬?shù)種模型化合物并得到反應(yīng)速率系數(shù)。按比例使用引入混合物的氨基酸的Boc產(chǎn)物來調(diào)整反應(yīng)速率系數(shù)，從而提供在可變異位置具有理想比率(如表38所示)的肽產(chǎn)物。
通過凝膠滲透色譜法用Sepharose G-50并用50％乙酸作為洗脫液來純化肽文庫。表征所合成的化合物是用分析性單光子(analytical single-photon)高效液相色譜法(Gilson chromatograph，F(xiàn)rance；XterraRP18柱，125，3.9×150mm，5μm，流速1mL/min，對(duì)于pentarphin和cyclopentarphin分別為在16分鐘內(nèi)洗脫液0.1％三氯乙酸，10-40％和20-40％的乙腈梯度)，和氨基酸分析(6NHCl水解24小時(shí)110℃；LKB氨基酸分析儀，Alpha Plus，Sweden)。根據(jù)分析性HPLC，終產(chǎn)物的純度不低于95％。肽水解產(chǎn)物的氨基酸組成(6N HCl，120℃，24小時(shí)，LKB 4151分析儀，Alpha Plus)和理論上的一致。
用有完全福氏佐劑(CFA)的磷酸鹽緩沖溶液稀釋的肽文庫在腹膜內(nèi)免疫接種5-6周齡BALB/c系小鼠三次。以劑量50μg/只將0.2mL的肽溶液給藥小鼠。在首次免疫接種后分別在2和4周進(jìn)行第二次和第三次免疫接種。將模擬蜱傳腦炎病毒的蛋白E的抗原性部分的肽溶液(肽序列KRDQSDRGWGNHAGLFGKGSIVT)以相同方案和相同劑量給藥對(duì)照組的動(dòng)物。最后一次免疫接種10天后，從動(dòng)物的眶后靜脈取血液樣本來確定血清中的特異性抗體的滴度。
將如下抗原固定在微滴板的分開的孔中來做酶免疫測定(Medpolimer，Moscow)嵌合-肽文庫，并且15個(gè)合成肽中的每個(gè)代表來自不同HIV-1亞型的gp120的V3區(qū)的氨基酸序列。所述15個(gè)合成肽代表適當(dāng)亞型的共有序列。當(dāng)存在來自一個(gè)亞型的若干肽時(shí)，它們代表了不同變體。
將抗原溶解在0.05M的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖溶液，pH9.6中至終濃度為10μg/mL，將0.1mL的量置于微滴板的每個(gè)孔中并在37℃的溫度溫育過夜。用含Tween 20的磷酸鹽緩沖溶液洗板3次，并用0.5％的牛血清白蛋白，級(jí)分5(Sigma)的溶液阻斷非特異性結(jié)合。將小鼠血清樣本在Tris-HCl緩沖溶液中系列稀釋兩倍，并將0.1mL的量置于固定了抗原的孔中并在37℃溫育30分鐘。溫育后用磷酸鹽緩沖溶液洗孔5次。通過加入量為0.1mL的辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG的抗體(Sigma)的磷酸鹽緩沖溶液來確定抗原-抗體復(fù)合體。在37℃溫育30分鐘后，加入含鄰苯二胺的底物混合物。通過加入硫酸溶液來中止酶反應(yīng)，并在492nm用Multiscan EX微滴板光度計(jì)來測量光密度。確定的小鼠血清中抗原-特異性抗體的滴度結(jié)果見表39。
用嵌合-肽文庫免疫接種小鼠產(chǎn)生血清抗體，該抗體對(duì)嵌合-肽文庫自身(免疫接種抗原)特異，對(duì)于形成一些已知HIV-1亞型的V3區(qū)上的抗原決定簇的肽也是特異的。特別是，對(duì)B亞型肽的抗體滴度比對(duì)其它亞型的高，這與預(yù)期為了模擬B亞型多樣性而不是其它亞型的肽文庫設(shè)計(jì)目的是一致的。所述嵌合肽文庫是免疫原性的，它誘導(dǎo)與廣譜HIV-1變體抗原決定簇相互作用的抗體形成。
表39

用上述肽文庫作為診斷試劑，對(duì)50個(gè)HIV感染的病人和30個(gè)健康供體的血清樣本進(jìn)行固相免疫酶分析(即ELISA)來確定特異性抗體。用數(shù)個(gè)可購試驗(yàn)系統(tǒng)輔助來分析HIV感染病人的原始(preliminarily)血清。另外，用抗-HIV-1系列010和系列007的標(biāo)準(zhǔn)血清組來輔助評(píng)估肽文庫檢測抗HIV-1抗體的能力。
將嵌合-肽文庫溶解在0.05M的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖溶液，pH 9.6至終濃度1.5微克/mL。將溶液以0.1mL的量加到微滴板的孔并在室溫溫育過夜，從而將肽固定在孔中。然后用FSB-T溶液(含Tween 20的磷酸鹽-鹽緩沖溶液)洗孔3-5次。從這以后，本方法與用DGUEPP“Vektor-BiAlgam”(Kol’tsovo，Novosibirsk Oblast)產(chǎn)生抗HIV-1抗體的免疫酶試驗(yàn)系統(tǒng)的說明書完全相符。
將血清樣本用含0.2％酪蛋白的FSB-T溶液稀釋20倍，以0.1mL的量置于微滴板的孔中，并在37℃溫育30分鐘來使抗體與已固定的肽結(jié)合。然后用FSB-T溶液洗孔5-7次。將量為0.1mL的(以1∶20在合0.2％酪蛋白FSB-T的溶液中稀釋的)抗IgG的單克隆抗體(與辣根過氧化物酶偶聯(lián))加入孔中。在37℃溫育微滴板30分鐘，然后用FSB-T溶液洗板5-7次。再之后，將量為0.1mL的0.05％TMB和0.005％過氧化氫的底物混合物在0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中的溶液，pH5.0，加入孔中。將微滴板避光在室溫(18-22℃)保持15-20分鐘。將量為0.05mL的2M硫酸溶液加到孔中來中止反應(yīng)。在Multiscan型自動(dòng)分光光度計(jì)上、用波長450nm測量樣本光密度來計(jì)算結(jié)果。
根據(jù)俄羅斯和國外第三代篩選試驗(yàn)系統(tǒng)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，使用底物混合物(BCP+底物)，和對(duì)照偶聯(lián)物(BCP+偶聯(lián)物+底物)，以及不含抗HIV抗體的對(duì)照血清作為排除反應(yīng)設(shè)定非特異性結(jié)果的對(duì)照。
如果孔中被試溶液(與被試血清對(duì)應(yīng))的光密度(OD)值根據(jù)如下公式計(jì)算超過了ODcrit臨界水平，那么判斷被測血清含有抗HIV-1抗體ODcrit＝OD(C’)均值+0.2其中OD(C’)均值表示陰性對(duì)照血清的光密度均值。
使用嵌合-肽文庫研究抗-HIV-1標(biāo)準(zhǔn)組血清系列010和007的結(jié)果顯示了81％的敏感性和93％的特異性。另外，用來自HIV感染病人的50份血清和來自健康供者的30份血清，來研究嵌合-肽文庫檢測抗血清樣本中抗HIV-1特異性抗體的有效性?；诳少彽牡谌囼?yàn)系統(tǒng)結(jié)果，本試驗(yàn)的結(jié)果表明檢測出了80％以上的含抗HIV-1抗原的特異性抗體的陽性樣品。
為檢測呈不同抗原形式的嵌合肽文庫的免疫原性，將文庫合成為線性肽，4條線性肽的多抗原肽(MAP4)，或8條線性肽的多抗原肽(MAP8)。將300微克的上述構(gòu)建體與完全福氏佐劑(第一次免疫接種)或不完全福氏佐劑(第二次和第三次免疫接種)混合、以12天間隔皮下免疫接種兔子。在第三次免疫接種后12天，給兔子放血并用抗線性、MAP4和MAP8抗原的ELISA來檢測所有血清。表40表明用呈不同抗原形式的HIV-1V3文庫免疫接種兔子會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)嵌合肽文庫的高可變異V3環(huán)序列的強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。
表40

對(duì)呈不同劑型的MAP4嵌合肽文庫的免疫原性進(jìn)行試驗(yàn)。在福氏佐劑，人工病毒樣顆粒(VLP)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中配制文庫。另外，用棕櫚酸修飾的MAP4構(gòu)建體(MAP4-P)并在脂質(zhì)體或微乳狀液中制制。所述脂質(zhì)體包括100微克的MAP4-P和250微克的dsRNA，所述微乳狀液包括100微克的MAP4-P和100微克的dsRNA。
VLPs包含被攜帶MAP4肽文庫的多肽覆蓋的DNA分子。將靶向的多肽暴露于顆粒表面，并通過亞精胺-polygluquine偶聯(lián)物連接到DNA。顆粒的大小(dimension)允許靶抗原以一到數(shù)百個(gè)拷貝數(shù)偶聯(lián)到表面上。VLP的核可包含大到10,000bp的DNA節(jié)段。見例如，Lebedev，L.R.等，(2000)Moleculargenetics，microbiology and virology(Russian)(3)，36-40；Lebedev，L.R.，等，(2000).Molecular Biology(Russian)34(3)，480-485；和Lebedev，L.R.等，(2001)Biotechnology(Russian)(1)，3-12；和Sizov，A.A.等，(2001)Biotechnology(Russian)(1)，13-18，其每篇引入本文作為參考。
用MAP4-P文庫制備脂質(zhì)體形式。用棕櫚酸修飾增加了肽的親脂性。肽的脂質(zhì)體組合物是通過增溶-注射制備的。脂質(zhì)體體積的大小在200nm以內(nèi)。
也用MAP4-P肽構(gòu)建體制備微乳狀液，該微乳狀液(在1mL中)包含100微克肽，250微克ridostin，和800微克可購的(ICN)陽離子兩親性二甲基雙十八烷溴化銨(cationic amphiphile dimethyldioctadecyl ammoniumbromide)(DDAB)。
用上述構(gòu)建體以12天間隔腹膜內(nèi)免疫接種小鼠(每組五只小鼠)3次。表41的數(shù)據(jù)指示了在常規(guī)小鼠的個(gè)體免疫反應(yīng)的高多樣性，但是在第三次免疫接種后所有系統(tǒng)都檢測到了強(qiáng)體液免疫反應(yīng)，除了肽文庫的PBS溶液之外。MAP4-P在脂質(zhì)體中的抗原制劑誘導(dǎo)了第二次免疫接種后的高水平抗體。
表41

為確定用MAP4文庫在上述不同呈遞系統(tǒng)中免疫接種小鼠的免疫反應(yīng)的極化作用(polarization)，在第3次免疫接種后第10天鑒定脾細(xì)胞。用線性肽的文庫體外刺激脾細(xì)胞。分別如ELISPOT測量，數(shù)個(gè)脾細(xì)胞分別產(chǎn)生IFN-γ或IL-4細(xì)胞因子，Th1或Th2免疫反應(yīng)的標(biāo)志物。記錄刺激后或無刺激時(shí)產(chǎn)生兩種細(xì)胞因子之一的細(xì)胞數(shù)(表42)。表42中的結(jié)果顯示用MAP4肽文庫和福氏佐劑的溶液免疫接種小鼠，不會(huì)導(dǎo)致受刺激細(xì)胞數(shù)與對(duì)照的測量值(無刺激)有顯著差異(顯著性水平0.05)，這證明用抗原與福氏佐劑的混合物免疫接種不會(huì)誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞應(yīng)答。我們注意到，在用含MAP4文庫的微乳狀液免疫接種的小鼠中，用線性肽文庫體外刺激后產(chǎn)生了最多數(shù)量的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞。用VLP免疫接種會(huì)形成不太明顯的(pronounced)Th1型免疫反應(yīng)。產(chǎn)生IL-4和IFN-γ的細(xì)胞數(shù)比較表明，用VLP中的MAP4文庫免疫接種小鼠會(huì)產(chǎn)生平衡的T輔助細(xì)胞應(yīng)答，即產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)無顯著不同。另一方面，用相同抗原的微乳狀液免疫接種小鼠會(huì)使用線性肽文庫刺激后的Th1型免疫反應(yīng)占顯著優(yōu)勢。因此，上述實(shí)施例顯示了用嵌合肽的MAP4文庫誘導(dǎo)強(qiáng)T輔助細(xì)胞應(yīng)答的可能性。
表42

VLP-人工病毒樣顆粒CFA/IFA-完全福氏佐劑/不完全福氏佐劑具有30個(gè)肽、每個(gè)肽長度為28個(gè)殘基的RCPL，模擬了HIV-1的B亞型變體的抗原多樣性，該RCPL是以MAP4形式合成的。RCPL的抗原性特性與VCPL是相當(dāng)?shù)?，VCPL也模擬了HIV-1的B亞型變體的抗原性多樣性。
RCPL序列(省略號(hào)‘.’表示殘基與所列的第一個(gè)序列相同)NNNTRKSIHIGPGQAFYATGDIIGDIRQ.....T..RL...RT..T..E......KS.....GV.......W....Q.......
S.......R....R..FR......N...
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S....T.VP....R......Q......K........RL.W..T..T.........K..K..R..........H...........
S.....R..L...R...T..E...N...
..............T...R.Q.T.....
.....TG.P....R.W.T..Q.......
用MAP4 VCPL和CFA(第一次免疫)或IFA(第二次免疫)免疫接種兔子3次。用免疫抗原或MAP4 RCPL作為固定的肽來通過ELISA檢測血清的抗體滴度。ELISA中的兔血清滴度，對(duì)于固相上的MAP4 VCPL為1∶204,800，對(duì)于固相上的MAP4 RCPL為1∶102,400。
已描述數(shù)個(gè)實(shí)施方案。然而，可理解可對(duì)它作多種修改。例如，可設(shè)計(jì)嵌合肽文庫來模擬其它HIV蛋白的抗原多樣性，或來自其它可變異病原體的蛋白的抗原多樣性。因此，其它實(shí)施方案也在如下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生抗原肽的家族的方法，其包括在病原體蛋白的區(qū)域內(nèi)定位多個(gè)可變異位置；選擇包含所述多個(gè)可變異位置的病原體蛋白的肽序列；基于與在所述病原體蛋白可變異位置上天然出現(xiàn)的氨基酸殘基的抗原相似性，為所述可變異位置之一選擇一或多個(gè)取代物氨基酸殘基；并產(chǎn)生基于所述肽序列、并包含所述取代物氨基酸殘基的抗原肽的家族。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述選擇包括用抗原相似性矩陣來確定抗原相似性。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其還包括指定所述抗原肽的家族中每個(gè)取代物氨基酸殘基的頻率。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述制備包括基于指定的頻率來權(quán)重所述抗原肽的家族中的取代物氨基酸殘基。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述指定還包括考慮到天然出現(xiàn)變異的頻率。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病原體蛋白包括高變區(qū)。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病原體蛋白與病毒相關(guān)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒是HIV。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病原體蛋白是HIV gp120。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述區(qū)域選自由V1，V2，V3，V4和V5區(qū)組成的組。
11.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
12.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
13.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒是登革熱病毒。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病原體蛋白與瘧疾病原體相關(guān)。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病原體蛋白與結(jié)核病原體相關(guān)。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其還包括確定所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其還包括如確定所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性超過預(yù)確定的閾值，那么在制備所述家族之前從所述抗原肽的家族中去除此肽。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原肽的家族包括多個(gè)成員，致使所述成員一起與每個(gè)在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原肽的家族包括多個(gè)成員，致使所述成員一起與在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)非天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其還包括鑒定所述家族的肽序列，其中所鑒定的肽序列代表了整個(gè)家族的序列多樣性。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中鑒定少于500個(gè)序列。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述鑒定包括計(jì)算所述家族的肽序列之間的距離。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述計(jì)算距離包括使用抗原相似性矩陣。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中制備所述抗原肽的家族包括通過化學(xué)合成所述肽的家族。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述化學(xué)合成包括組合合成，其中形成的所述肽為不同序列的混合物。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述化學(xué)合成包括平行合成，其中每個(gè)肽與其它肽分開形成。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其還包括混合所述分開的肽。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中制備所述抗原肽的家族包括用宿主生物體表達(dá)所述肽的家族。
29.包含抗原肽的家族的組合物，所述抗原肽具有的氨基酸序列與病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列有抗原相似性，其中所述家族中的每個(gè)抗原肽具有至少一個(gè)相對(duì)于家族中其它抗原肽變異的氨基酸位置。
30.權(quán)利要求29所述的組合物，其中在變異的位置一個(gè)氨基酸殘基比另一個(gè)出現(xiàn)得更頻繁。
31.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的抗原肽。
32.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含多于1,000個(gè)彼此獨(dú)特的抗原肽。
33.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的抗原肽。
34.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含少于50,000個(gè)彼此獨(dú)特的抗原肽。
35.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含在1,000個(gè)到50,000個(gè)之間的彼此獨(dú)特的抗原肽。
36.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述病原體蛋白是HIV gp120。
37.權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述可變區(qū)選自由V1區(qū)，V2區(qū)，V3區(qū)，V4區(qū)和V5區(qū)組成的組。
38.權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述抗原肽的家族包含與HIV亞型的序列具有抗原相似性的序列。
39.權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述亞型選自由如下組成的組A亞型，B亞型，C亞型，D亞型，F(xiàn)亞型，G亞型，重組亞型，N組HIV的亞型，O組HIV的亞型，及它們的組合。
40.權(quán)利要求29所述的組合物，其中混合了所述抗原肽的家族的至少兩個(gè)成員。
41.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述抗原肽的家族根據(jù)序列分開。
42.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述家族包含多個(gè)抗原肽。
43.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-X8-G-X9-G-X10-X11-X12-X13-X14-T-G-X15-I-X16-G-X17-I-R-其中每個(gè)X4-X17均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
44.權(quán)利要求43所述的肽文庫，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
45.權(quán)利要求44所述的肽文庫，其中所述家族與A，B，C，D，F(xiàn)和G亞型HIV的所述HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
46.權(quán)利要求43所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-X8-G-X9-G-X10-X11-X12-X13-X14-T-G-X15-I-X16-G-X17-I-R-X18-A-X19-C-X20其中每個(gè)X1-X20均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
47.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，V，T或E。
48.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T或I。
49.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為N，S，G或Y。
50.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為K，Q或T。
51.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為S，G或R。
52.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為I，T或M。
53.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為H，R，P，S或N。
54.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為I或M。
55.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為P或L。
56.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為R或Q。
57.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為A，T或V。
58.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為F或W。
59.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H。
60.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為A或T。
61.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為D，Q，A或R。
62.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為I或T。
63.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為D或N。
64.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為Q或K。
65.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X19獨(dú)立為H或Y。
66.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X20獨(dú)立為N或T。
67.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，V，T或E；X2獨(dú)立為T或I；X3獨(dú)立為N，S，G或Y；X4獨(dú)立為K，Q或T；X5獨(dú)立為S，G或R；X6獨(dú)立為I，T或M；X7獨(dú)立為H，R，P，S或N；X8獨(dú)立為I或M；X9獨(dú)立為P或L；X10獨(dú)立為R或Q；X11獨(dú)立為A，T或V；X12獨(dú)立為F或W；X13獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H；X14獨(dú)立為A或T；X15獨(dú)立為D，Q，A或R；X16獨(dú)立為I或T；X17獨(dú)立為D或N；X18獨(dú)立為Q或K；X19獨(dú)立為H或Y；并且X20獨(dú)立為N或T。
68.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
69.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
70.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
71.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
72.權(quán)利要求46所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
73.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-X4-R-X5-X6-V-X7-I-G-P-G-X8-X9-F-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-其中每個(gè)X4-X16均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
74.權(quán)利要求73所述的肽文庫，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
75.權(quán)利要求74所述的肽文庫，其中所述家族與A亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
76.權(quán)利要求73所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-N-N-X4-R-X5-X6-V-X7-I-G-P-G-X8-X9-F-X10-X11-X12-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中每個(gè)X1-X19均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
77.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，T或D。
78.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T或I。
79.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為N，G或S。
80.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為T或K。
81.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為K，T或Q。
82.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為S，G，R或N。
83.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為R或H。
84.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為Q或R。
85.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為A，T或V。
86.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H。
87.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為A或T。
88.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為T，R，A或無殘基。
89.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為G，D或無殘基。
90.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為D，A，N，R或V。
91.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為I或T。
92.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為D或N。
93.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為Q，K或E。
94.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為H或Y。
95.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X19獨(dú)立為N，T或E。
96.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，T或D；X2獨(dú)立為T或I；X3獨(dú)立為N，G或S；X4獨(dú)立為T或K；X5獨(dú)立為K，T或Q；X6獨(dú)立為S，G，R或N；X7獨(dú)立為R或H；X8獨(dú)立為Q或R；X9獨(dú)立為A，T或V；X10獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H；X11獨(dú)立為A或T；X12獨(dú)立為T，R，A或無殘基；X13獨(dú)立為G，D或無殘基；X14獨(dú)立為D，A，N，R或V；X15獨(dú)立為I或T；X16獨(dú)立為D或N；X17獨(dú)立為Q，K或E；X18獨(dú)立為H或Y；并且X19獨(dú)立為N，T或E。
97.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
98.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
99.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
100.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
101.權(quán)利要求76所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
102.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-T-R-K-X4-I-X5-X6-G-X7-G-X8-X9-X10-X11-X12-T-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-其中每個(gè)X4-X16均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
103.權(quán)利要求102所述的肽文庫，其中其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
104.權(quán)利要求103所述的肽文庫，其中所述家族與B亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
105.權(quán)利要求102所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-X4-I-X5-X6-G-X7-G-X8-X9-X10-X11-X12-T-X13-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中每個(gè)X1-X19均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
106.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，T或H。
107.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T或I。
108.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為N，S或G。
109.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為S，G或R。
110.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為H，P，N，T或Y。
111.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為I或M。
112.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為P，L或W。
113.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為R，Q，G或S。
114.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為A，V或T。
115.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為F，W或V。
116.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H。
117.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為T或A。
118.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為G，E或R。
119.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為E，Q，R或G。
120.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為I或T。
121.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為D或N。
122.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為Q或K。
123.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為H或Y。
124.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X19獨(dú)立為N或T。
125.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，T或H；X2獨(dú)立為T或I；X3獨(dú)立為N，S或G；X4獨(dú)立為S，G或R；X5獨(dú)立為H，P，N，T或Y；X6獨(dú)立為I或M；X7獨(dú)立為P，L或W；X8獨(dú)立為R，Q，G或S；X9獨(dú)立為A，V或T；X10獨(dú)立為F，W或V；X11獨(dú)立為Y，F(xiàn)或H；X12獨(dú)立為T或A；X13獨(dú)立為G，E或R；X14獨(dú)立為E，Q，R或G；X15獨(dú)立為I或T；X16獨(dú)立為D或N；X17獨(dú)立為Q或K；X18獨(dú)立為H或Y；并且X19獨(dú)立為N或T。
126.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
127.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
128.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
129.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
130.權(quán)利要求105所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
131.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-I-G-P-G-Q-X8-F-X9-X10-T-X11-X12-I-X13-G-X14-I-R-其中每個(gè)X4-X14均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
132.權(quán)利要求131所述的肽文庫，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
133.權(quán)利要求132所述的肽文庫，其中所述家族與C亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
134.權(quán)利要求131所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-X4-X5-X6-X7-I-G-P-G-Q-X8-F-X9-X10-T-X11-X12-I-X13-G-X14-I-R-X15-A-X16-C-X17其中每個(gè)X1-X17均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
135.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為V，N，E，T，M或R。
136.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T，I或A。
137.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為N，G，S或H。
138.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為K，E或Q。
139.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為S或G。
140.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為I或M。
141.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為R或G。
142.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為T，A或V。
143.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為Y或F。
144.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為A或T。
145.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為G，N，D，K或T。
146.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為D，G，N，S或I。
147.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為I或T。
148.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為D或N。
149.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為Q，K，E，L或H。
150.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為H，Y或N。
151.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為N，T，I，D或H。
152.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為V，N，E，T，M或R；X2獨(dú)立為T，I或A；X3獨(dú)立為N，G，S或H；X4獨(dú)立為K，E或Q；X5獨(dú)立為S或G；X6獨(dú)立為I或M；X7獨(dú)立為R或G；X8獨(dú)立為T，A或V；X9獨(dú)立為Y或F；X10獨(dú)立為A或T；X11獨(dú)立為G，N，D，K或T；X12獨(dú)立為D，G，N，S或I；X13獨(dú)立為I或T；X14獨(dú)立為D或N；X15獨(dú)立為Q，K，E，L或H；X16獨(dú)立為H，Y或N；并且X17獨(dú)立為N，T，I，D或H。
153.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
154.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
155.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
156.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
157.權(quán)利要求134所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
158.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-R-P-X3-X4-X5-X6-R-X7-X8-X9-X10-I-G-X11-G-X12-X13-X14-X15-X16-T-X17-X18-G-X19-I-其中每個(gè)X3-X19均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
159.權(quán)利要求158所述的肽文庫，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
160.權(quán)利要求所述的肽文庫159，其中所述家族與D亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
161.權(quán)利要求158所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-X4-X5-X6-R-X7-X8-X9-X10-I-G-X11-G-X12-X13-X14-X15-X16-T-X17-X18-G-X19-I-X20-X21-A-X22-C-X23其中每個(gè)X1-X23均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
162.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N或T。
163.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T或I。
164.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為Y或N。
165.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為N或K。
166.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為N或K。
167.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為T，I或K。
168.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為Q或R。
169.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為S，R或G。
170.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為T或I。
171.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為H，P，S或R。
172.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為P，L，S或Q。
173.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為Q或R。
174.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為A或T。
175.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為L或Y。
176.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為Y或F。
177.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為T或A。
178.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為I或K。
179.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為I，T或K。
180.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X19獨(dú)立為D或N。
181.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X20獨(dú)立為R或G。
182.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X21獨(dú)立為Q或K。
183.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X22獨(dú)立為H或Y。
184.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X23獨(dú)立為N，T或K。
185.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N或T；X2獨(dú)立為T或I；X3獨(dú)立為Y或N；X4獨(dú)立為N或K；X5獨(dú)立為N或K；X6獨(dú)立為T，I或K；X7獨(dú)立為Q或R；X8獨(dú)立為S，R或G；X9獨(dú)立為T或I；X10獨(dú)立為H，P，S或R；X11獨(dú)立為P，L，S或Q；X12獨(dú)立為Q或R；X13獨(dú)立為A或T；X14獨(dú)立為L或Y；X15獨(dú)立為Y或F；X16獨(dú)立為T或A；X17獨(dú)立為I或K；X18獨(dú)立為I，T或K；X19獨(dú)立為D或N；X20獨(dú)立為R或G；X21獨(dú)立為Q或K；X22獨(dú)立為H或Y；并且X23獨(dú)立為N，T或K。
186.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
187.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
188.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
189.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
190.權(quán)利要求161所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
191.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-X3-R-K-X4-I-X5-L-G-P-G-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-I-X14-G-X15-I-R-其中每個(gè)X3-X15均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
192.權(quán)利要求所述的肽文庫191，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
193.權(quán)利要求所述的肽文庫192，其中所述家族與F亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
194.權(quán)利要求所述的肽文庫191，其中所述家族的肽具有式子X1-C-T-R-P-X2-N-N-X3-R-K-X4-I-X5-L-G-P-G-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-I-X14-G-X15-I-R-X16-A-X17-C-X18其中每個(gè)X1-X18均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
195.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N或T。
196.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為N或S。
197.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為T或I。
198.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為S，G或R。
199.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為H，R，Q，P，Y或S。
200.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為Q，R或H。
201.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為A，V或T。
202.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為F或I。
203.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為Y，H或F。
204.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為A或T。
205.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為T或A。
206.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為G，D或S。
207.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為D，A或N。
208.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為I或T。
209.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為D或N。
210.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為K或Q。
211.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為H或Y。
212.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為N，I，D或K。
213.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中對(duì)于所述家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N或T；X2獨(dú)立為N或S；X3獨(dú)立為T或I；X4獨(dú)立為S，G或R；X5獨(dú)立為H，R，Q，P，Y或S；X6獨(dú)立為Q，R或H；X7獨(dú)立為A，V或T；X8獨(dú)立為F或I；X9獨(dú)立為Y，H或F；X10獨(dú)立為A或T；X11獨(dú)立為T或A；X12獨(dú)立為G，D或S；X13獨(dú)立為D，A或N；X14獨(dú)立為I或T；X15獨(dú)立為D或N；X16獨(dú)立為K或Q；X17獨(dú)立為H或Y；并且X18獨(dú)立為N，I，D，K或X。
214.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
215.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
216.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
217.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
218.權(quán)利要求194所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
219.包含一族肽的肽文庫，其包含片段-N-N-T-R-K-S-X4-X5-X6-G-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-X14-I-X15-G-X16-I-R-其中每個(gè)X4-X16均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
220.權(quán)利要求219所述的肽文庫，其中所述家族與HIV gp120的V3區(qū)具有抗原相似性。
221.權(quán)利要求220所述的肽文庫，其中所述家族與G亞型HIV的HIVgp120的V3區(qū)具有抗原相似性
222.權(quán)利要求219所述的肽文庫，其中所述家族的肽具有式子X1-C-X2-R-P-X3-N-N-T-R-K-S-X4-X5-X6-G-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-T-X14-I-X15-G-X16-I-R-X17-A-X18-C-X19其中每個(gè)X1-X19均為長度為0，1，2或3個(gè)氨基酸殘基的片段。
223.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，I，T，M或R。
224.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X2獨(dú)立為T或I。
225.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X3獨(dú)立為N或S。
226.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X4獨(dú)立為I或K。
227.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X5獨(dú)立為T，R，H，P或N。
228.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X6獨(dú)立為F或I。
229.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X7獨(dú)立為P，T或L。
230.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X8獨(dú)立為G或R。
231.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X9獨(dú)立為Q，R，H或G。
232.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X10獨(dú)立為A，T或V。
233.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X11獨(dú)立為F，I或S。
234.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X12獨(dú)立為Y或H。
235.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X13獨(dú)立為A或T。
236.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X14獨(dú)立為G，D或S。
237.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X15獨(dú)立為I或T。
238.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X16獨(dú)立為D或N。
239.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X17獨(dú)立為Q，L，K或P。
240.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X18獨(dú)立為H，Y或F。
241.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X19獨(dú)立為N，K或T。
242.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中對(duì)于該家族的每個(gè)肽，X1獨(dú)立為N，I，T，M或R；X2獨(dú)立為T或I；X3獨(dú)立為N或S；X4獨(dú)立為I或K；X5獨(dú)立為T，R，H，P或N；X6獨(dú)立為F或I；X7獨(dú)立為P，T或L；X8獨(dú)立為G或R；X9獨(dú)立為Q，R，H或G；X10獨(dú)立為A，T或V；X11獨(dú)立為F，I或S；X12獨(dú)立為Y或H；X13獨(dú)立為A或T；X14獨(dú)立為G，D或S；X15獨(dú)立為I或T；X16獨(dú)立為D或N；X17獨(dú)立為Q，L，K或P；X18獨(dú)立為H，Y或F；X19獨(dú)立為N，K或T。
243.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中所述肽的家族的至少兩個(gè)成員混合在一起。
244.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中所述肽的家族根據(jù)序列分開。
245.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中所述家族包含多于150個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
246.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中所述家族包含少于100,000個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列。
247.權(quán)利要求222所述的肽文庫，其中所述家族包含少于500個(gè)彼此獨(dú)特的肽序列，所述序列代表了可得到的整個(gè)序列多樣性。
248.在受試者體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的方法，其包括給予所述受試者包含抗原肽的家族的組合物，所述抗原肽具有的氨基酸序列與病原體的病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列有抗原相似性。
249.權(quán)利要求248所述的方法，其中用抗原相似性矩陣確定抗原相似性。
250.權(quán)利要求248所述的方法，其中可在受試者被所述病原體感染前給予其所述組合物。
251.權(quán)利要求250所述的方法，其中所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列與所述病原體蛋白亞型的氨基酸序列有抗原相似性。
252.權(quán)利要求250所述的方法，其中所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列與所述病原體蛋白一種以上的亞型的氨基酸序列有抗原相似性。
253.權(quán)利要求248所述的方法，其中將所述組合物給予被所述病原體感染的受試者。
254.權(quán)利要求253所述的方法，其中所述受試者被所述病原體的亞型感染
255.權(quán)利要求254所述的方法，其中所述抗原肽的家族具有的氨基酸序列與該受試者所感染亞型的氨基酸序列有抗原相似性。
256.設(shè)計(jì)肽序列家族的方法，其包括在病原體蛋白的區(qū)域內(nèi)定位多個(gè)可變異位置；選擇包含所述可變異位置的病原體蛋白的肽序列；并基于與在所述病原體蛋白的可變異位置上天然出現(xiàn)的氨基酸殘基的抗原相似性，為所述肽的可變異位置之一選擇一或多個(gè)取代物氨基酸殘基，從而形成肽序列家族。
257.權(quán)利要求256所述的方法，其中所述選擇包括用抗原相似性矩陣來確定抗原相似性。
258.權(quán)利要求256所述的方法，其還包括指定抗原肽序列家族的每個(gè)取代物氨基酸殘基的頻率。
259.權(quán)利要求258所述的方法，其中所述指定還包括考慮天然出現(xiàn)變異的頻率。
260.權(quán)利要求256所述的方法，其還包括確定所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性。
261.權(quán)利要求260所述的方法，其還包括如果計(jì)算所述家族的肽和人類蛋白的區(qū)域之間的抗原相似性超過了預(yù)確定的閾值，那么從所述肽序列的家族中去除此肽序列。
262.權(quán)利要求256所述的方法，其中所述抗原肽的家族包括多個(gè)成員，致使所述成員一起與每個(gè)在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。
263.權(quán)利要求256所述的方法，其中所述肽序列家族包括多個(gè)成員，致使所述成員一起與在所述病原體蛋白區(qū)域內(nèi)非天然出現(xiàn)的序列具有抗原相似性。
264.權(quán)利要求256所述的方法，其還包括鑒定所述家族的肽序列，其中所鑒定的肽序列代表了整個(gè)家族的序列多樣性。
265.權(quán)利要求264所述的方法，其中鑒定少于500個(gè)序列。
266.權(quán)利要求264所述的方法，其中所述鑒定包括計(jì)算所述家族的肽序列之間的距離。
267.權(quán)利要求266所述的方法，其中所述計(jì)算距離包括使用抗原相似性矩陣。
268.權(quán)利要求256所述的方法，其還包括鑒定與所述病原體蛋白亞型有抗原相似性的所述家族的肽序列。
269.權(quán)利要求256所述的方法，其中所述病原體蛋白包含高變區(qū)。
270.權(quán)利要求256所述的方法，其中所述病原體是病毒。
271.權(quán)利要求270所述的方法，其中所述病毒是HIV。
272.權(quán)利要求271所述的方法，其中所述病原體蛋白是gp120。
273.權(quán)利要求272所述的方法，其中所述區(qū)域選自由VI區(qū)，V2區(qū)，V3區(qū)，V4區(qū)和V5區(qū)組成的組。
274.診斷感染的方法，其包括使樣品與肽的家族接觸，所述肽的氨基酸序列與病原體蛋白可變區(qū)的氨基酸序列具有抗原相似性，其中所述家族中的每個(gè)肽至少有一個(gè)相對(duì)于家族中其它肽變異的氨基酸位置。
275.權(quán)利要求274所述的方法，其中用抗原相似性矩陣確定抗原相似性。
276.權(quán)利要求274所述的方法，其中所述肽的家族與病原體亞型在抗原上相似。
277.權(quán)利要求274所述的方法，其中所述肽的家族與一個(gè)以上的病原體亞型在抗原上相似。
278.權(quán)利要求274所述的方法，其還包括在接觸前將所述肽的家族固定在基質(zhì)上。
279.權(quán)利要求274所述的方法，其還包括確定所述樣品是否包含與所述肽的家族特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
根據(jù)來自可變異病原體的一組蛋白序列的天然出現(xiàn)和潛在的變異性來設(shè)計(jì)抗原肽文庫的方法。所述肽文庫能誘發(fā)對(duì)一系列病原體變體的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1714100SQ03825537
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月3日
發(fā)明者埃米爾·Z·馬克休托夫, 亞歷山大·B·賴齊科夫, 亞歷山大·A·科洛博夫, 扎基·A·馬克休托夫 申請(qǐng)人:國家病毒及生物技術(shù)"載體"研究中心