專利名稱：治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)變態(tài)反應病的誘騙物、GATA3突變蛋白、和包含它們的藥 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的制劑，以及治療和/或預防同樣疾病的方法。
背景技術(shù)：
在發(fā)達國家，Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病占保健支出的一大部分。全球有超過1.5億人患有哮喘，相應地分別在日本和美國形成了每年2300億日元和7600億日元的哮喘治療劑市場。過敏性哮喘是一種在兒童和成人中都廣泛分布的慢性炎性肺疾病，其主要癥狀包括因呼吸道高反應性和呼吸道炎癥引起的通氣障礙，這可能會經(jīng)由體位性asthmaticus導致死亡。除了環(huán)境因素外，遺傳易感性也被認為與患該疾病有關(guān)。然而，患該疾病的詳細機理仍有待澄清。
目前用于哮喘的治療劑大致分為兩類1)以支氣管擴張為靶用于治療哮喘發(fā)作的黃嘌呤衍生物和β2激動劑(包括類固醇)；和2)可以用作長期施用的藥劑的具有抗炎癥效應的抗過敏劑，包括化學介質(zhì)釋放抑制劑例如色甘酸二鈉、組胺拮抗劑、血栓烷抑制劑和白三烯拮抗劑。真正意義上哮喘治療劑應該是能夠控制疾病的根本方面，即呼吸道炎癥反應的變態(tài)反應控制劑，而不是那些用于癥狀治療的治療劑。因此，本領(lǐng)域渴望開發(fā)屬于這一新類別的，能夠預防變態(tài)反應疾病發(fā)病的治療藥物。用于吸入或內(nèi)服的類固醇是目前所使用的最有效和強有力的藥品。它們通過抑制免疫細胞活性迅速地緩解呼吸道炎癥并發(fā)揮強效的抗哮喘效應。然而，因為其強烈的副作用，類固醇不適宜長期使用。絕大多數(shù)迄今為止所開發(fā)的抗變態(tài)反應劑抑制在不同水平上觸發(fā)哮喘發(fā)作的炎性細胞生成的化學介質(zhì)。最近發(fā)現(xiàn)2型輔助性T淋巴細胞(Th2)及其產(chǎn)生的細胞因子在變態(tài)反應的發(fā)病中扮演關(guān)鍵角色(參見，例如O′Garra，A.(1998)Immunity 8275；Glimcher，L.H.和Murphy，K.M.(2000)Genes Dev.141693；Murphy，K.M.，等(2000)Annu.Rev.Immunol.18451)。后來，抑制Th2細胞因子，例如IL-4，IL-5和IL-13功能的抗體等，已被開發(fā)做治療劑，目前正在進行臨床試驗。然而，很多變態(tài)反應疾病主要是反復地暴露于過敏原所導致的。因此，抑制靶向Th2細胞因子自身的過敏反應可能不是一種有效的治療方法。
多組研究人員已經(jīng)研究了Th2細胞的分化機理及該機理中涉及到的因子。結(jié)果，GATA3蛋白被揭示不僅具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，而且對Th2細胞的分化和定型起到重要作用。這一過程的抑制劑被認為可用作針對所有類型變態(tài)反應疾病，包括很難停用類固醇藥物的嚴重哮喘的完全新型的治療藥劑。
輔助性T淋巴細胞基于它們的細胞因子產(chǎn)生模式，至少被分為兩個亞型Th1和Th2。這一現(xiàn)象最初被認為是體內(nèi)克隆的T細胞所特有的。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對小鼠寄生蟲的敏感性和例如人類的麻風病這樣的實際疾病的預后是由這兩種亞型哪一種被激活所決定。因此，這些亞型被認為是決定傳染疾病預后的重要因子。產(chǎn)生IFNγ和淋巴毒素的Th1細胞被認為參與了細胞免疫，且對清除細菌和病毒這樣的細胞內(nèi)病原體很重要。Th1細胞的不適當活化誘導自身免疫疾病。另一方面，產(chǎn)生IL4、IL-5和IL-13等的Th2細胞與體液免疫有關(guān)，且在消滅寄生蟲中發(fā)揮作用。然而，已知Th2細胞的過度活化會引起變態(tài)反應疾病，例如哮喘和特應性皮炎。
基于這一新機理的用于控制Th2細胞的有效方法對于治療近年來增加的變態(tài)反應疾病的是必需的。Th2細胞由于抗原刺激而從初始T細胞分化，IL-4是誘導Th2細胞分化的主要的細胞因子。IL-4與其受體的結(jié)合激活了它下游的信號傳導途徑JAK/STAT，最終誘導Th2細胞特異的轉(zhuǎn)錄因子GATA3蛋白的表達。Th2細胞因子基因簇集于人第5號染色體(小鼠11號染色體)，編碼IL-4，IL-13和IL-5的基因存在于q23-31的160Kb的區(qū)域內(nèi)。很長一段時間，人們觀察到Th2細胞因子基因群的轉(zhuǎn)錄在Th2細胞分化以后同時開啟。然而，直到最近，其潛在的機理也還沒被揭示。沿著這一脈絡，本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)了在這一基因簇內(nèi)控制Th2細胞因子基因表達的區(qū)域(Takemoto，N.，等(1998)Int.Immunol.101981-1985；Takemoto，N.，等(2000)J.Immunol.1656687-6691)。
這一區(qū)域(HSS1，2和3)與在不同哺乳動物中核苷酸序列高度保守的CN-1至CN-15這15個區(qū)域中的CNS-1區(qū)域表現(xiàn)出良好對應性。在動物實驗中，這一位點的缺失削弱了IL-4，IL-5和IL-13的表達。因此，這表明這一區(qū)域有在球蛋白基因中被很好地加以研究的“位點控制區(qū)”(Locus ControlRegion，LCR)樣功能。本發(fā)明人還證明了(CNS-1/HSS1，2)區(qū)域有GATA3蛋白的識別序列，GATA3蛋白實際上與該序列相結(jié)合(Takemoto，N.al.等，(2000)同上)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的藥物組合物。特別是，本發(fā)明涉及GATA3誘騙物和GATA3突變蛋白。更進一步地，本發(fā)明提供在Th2細胞因子的產(chǎn)生所需要的Th2細胞因子基因簇所存在的染色體位點上特異性地抑制染色質(zhì)重構(gòu)的GATA3誘騙物和GATA3突變蛋白。此外，本發(fā)明還提供了一種篩選旨在抑制前述染色質(zhì)重構(gòu)的、用于治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的制劑的方法。
Th2細胞的體外誘導需要在IL-4存在的條件下對初始T細胞進行多重抗原刺激。通過這些反復刺激，Th2細胞分化達到最終階段，此后不再改變其表型。這種現(xiàn)象被稱做“細胞定型”，類似于造血干細胞定向成為分化的白細胞、而該白細胞絕不會轉(zhuǎn)變?yōu)榧t細胞的過程。在例如哮喘這樣的變態(tài)反應性疾病中被激活的Th2細胞從前被認為是處于這一最終階段；因此被推定為不可能改變其表型和其細胞因子產(chǎn)生活性。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報道了上述GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄因子改變細胞特性并通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)迫使細胞產(chǎn)生其它的細胞因子來完成向Th1細胞的再分化的誘導，這一行為在以前被認為是不可能的(Lee等，(2000)J.Exp.Med.192105；Takemoto，N.等，(2000)supra)。因此，特異性抑制GATA3轉(zhuǎn)錄因子蛋白功能的低分子化合物和誘騙物核苷酸使得作為變態(tài)反應基礎(chǔ)的Th2細胞轉(zhuǎn)化，相應地，它們代表了與涉及針對炎癥的癥狀治療或從總體上抑制免疫細胞的現(xiàn)有藥物(例如，類固醇)有所不同的新型治療劑的潛在候選物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GATA3蛋白的主調(diào)節(jié)物功能與伴隨初始(naive)T細胞向Th2細胞定型的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，更進一步地，他們還揭示，這一功能是通過GATA3蛋白的一個特定結(jié)構(gòu)域?qū)σ欢魏塑账嵝蛄械淖R別顯示出來的，這一核苷酸序列與GATA3蛋白的一般功能所需的DNA序列有所不同。最后，他們還發(fā)現(xiàn)了GATA3蛋白用作哮喘的新型治療劑的靶。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明詳細說明了GATA3蛋白所結(jié)合的DNA序列發(fā)揮其作為主調(diào)節(jié)物的功能(SEQ ID NO3顯示小鼠的有義鏈序列，SEQ IDNO6是人類的有義鏈序列，圖1的最上方也描述了小鼠的HSS2序列)。本發(fā)明還揭示相對于GATA3蛋白與IL-5基因和TCRα基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的其它GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，GATA3蛋白與這一序列的結(jié)合具有不同的結(jié)合方式。也就是說，我們發(fā)現(xiàn)與這一序列結(jié)合所需的GATA3蛋白內(nèi)的區(qū)域不同于與被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因(例如IL-5和TCRα基因)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的其它GATA3結(jié)合序列結(jié)合所需的區(qū)域。進一步地，還發(fā)現(xiàn)了結(jié)合親和力的差異。
因此，本發(fā)明包含可用于治療和/或預防哮喘的如下實施方案1-30[1]用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的GATA3誘騙物。
根據(jù)[1]所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物通過抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合抑制Th2細胞因子基因簇區(qū)域的染色質(zhì)重構(gòu)，并因而抑制T細胞中一種或多種Th2細胞因子的產(chǎn)生。
根據(jù)[2]所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物不抑制GATA3蛋白與被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。
根據(jù)[2]所述的GATA3誘騙物，其中與GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合相比，誘騙物在較低水平抑制GATA3蛋白與被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。
根據(jù)[1]所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物特異性抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合。
根據(jù)[1]-[5]中任一所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物包含包含SEQID NO3、4、5或6中所示序列的雙鏈寡核苷酸或其衍生物。
根據(jù)[1]-[6]中任一所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物有效抑制GATA3蛋白與T細胞基因組中HSS2序列的結(jié)合，并且其中誘騙物可以被施用，所施用的濃度使得與GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合相比，誘騙物在較低水平抑制GATA3蛋白與被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。
GATA3突變蛋白或其衍生物，其中a)保留了野生型GATA3蛋白C指區(qū)域的氨基酸序列；或b)野生型GATA3蛋白C指區(qū)域的氨基酸序列中一或多個氨基酸被缺失、取代或插入，但仍保留與HSS2序列結(jié)合的能力。
根據(jù)[8]所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的一或多個氨基酸被缺失、取代或插入，使得GATA3蛋白誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力喪失。
根據(jù)[9]所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的至少10個氨基酸殘基被缺失。
根據(jù)[8]-[10]任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指區(qū)域的一或多個氨基酸進一步被缺失、取代或插入，使得與包含被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列的DNA結(jié)合的能力喪失。
根據(jù)[8]-[10]任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指區(qū)域的至少一個氨基酸殘基被缺失。
GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的至少10個氨基酸殘基被缺失，且N指區(qū)域的至少一個氨基酸殘基被缺失。
小鼠GATA3突變蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO1所述小鼠野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-168位氨基酸被缺失。
人GATA3突變蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO2所述人野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-169位氨基酸被缺失。
根據(jù)[14]所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中至少SEQ IDNO1所述小鼠野生型GATA3蛋白N指區(qū)域氨基酸序列的第280-287位氨基酸被進一步缺失。
根據(jù)[15]所述的人GATA3突變蛋白或其衍生物，其中至少SEQ IDNO2所述人野生型GATA3蛋白N指區(qū)域氨基酸序列的第281-288位氨基酸被進一步缺失。
根據(jù)[8]-[17]任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中蛋白或衍生物具有與HSS2序列結(jié)合、但抑制T細胞的Th2細胞因子產(chǎn)生的能力。
根據(jù)[18]所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中與包含被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列的DNA結(jié)合的能力喪失。
編碼根據(jù)[8]-[19]中任一所述的GATA3突變蛋白的核酸。
包含根據(jù)[20]的核酸的載體。
根據(jù)[21]的載體，其中的載體是表達載體。
包含根據(jù)[21]或[22]的載體的宿主細胞。
治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應性疾病的藥物組合物，其中的組合物在施用給哺乳動物后，通過抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合而抑制Th2細胞因子基因簇區(qū)域中的染色質(zhì)重構(gòu)，從而抑制一種或多種Th2細胞因子的產(chǎn)生。
根據(jù)[24]所述的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)[1]-[7]中任一的一種或多種GATA3誘騙物。
根據(jù)[24]的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)[8]-[19]中任一的一種或多種GATA3突變蛋白。
根據(jù)[24]的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)[20]的一種或多種編碼GATA3突變蛋白的核酸。
根據(jù)[24]的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)[21]或[22]的一種或多種載體。
篩選用于治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的藥物的方法，該方法包括如下步驟a)在允許野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物結(jié)合的條件下，將野生型GATA3蛋白或具有與HSS2序列結(jié)合的能力的GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，有或者沒有測試化合物存在；b)檢測野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物的結(jié)合；和c)鑒定能抑制所述結(jié)合的測試化合物。
和[30]根據(jù)[29]所述的方法，其中方法進一步還包括下列步驟d)在允許野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物結(jié)合的條件下，將野生型GATA3蛋白或具有與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列結(jié)合的能力的GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其包含所述基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列的衍生物一起孵育，有或者沒有測試化合物存在；
e)檢測野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物的結(jié)合；和f)鑒定測試化合物，與步驟b)中的結(jié)合相比，該化合物在較低水平抑制步驟e)的結(jié)合。
本文術(shù)語“Th2細胞因子”包含Th2細胞產(chǎn)生的白細胞介素(IL)-4，IL-13和IL-5。產(chǎn)生這些細胞因子是Th2細胞的特性，在Th1細胞中沒有發(fā)現(xiàn)。
本文術(shù)語“Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應(allergic)疾病”包含前面所述的Th2細胞因子的產(chǎn)生與這些疾病的發(fā)作機制相關(guān)的變態(tài)反應性疾病，例如哮喘，特應性皮炎(atopic dermatitiss)，變應性哮喘(atopic asthma)和花粉癥。
本文術(shù)語“GATA3誘騙物(decoy)”包含所有能特異性拮抗GATA3蛋白的DNA結(jié)合位點的化合物。這些化合物包括但不僅限于核酸及其衍生物。GATA3誘騙物的優(yōu)選例子包括包含IL-5基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO4所示的來源于小鼠的寡核苷酸及相應的人類寡核苷酸)；包含TCRα基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO5所示的來源于小鼠的寡核苷酸及相應的人類寡核苷酸)；包含HSS2序列中的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO3所示的來源于鼠的寡核苷酸及相應的SEQ ID NO6所示的人類寡核苷酸)。如以下實施例所示，包含IL-5基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO4所示寡核苷酸)或包含TCRα基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)中的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO5所示的寡核苷酸)與GATA3蛋白的結(jié)合特異性高于GATA3蛋白與HSS2序列內(nèi)GATA3蛋白序列的結(jié)合特異性。因此，抑制GATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合可以在較低濃度下完成。這意味著當高結(jié)合親和力的、含GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸或其衍生物或修飾物被用做誘騙物對患者施用時，GATA3蛋白與HSS2序列的低親和力結(jié)合被抑制。然而，相比于對HSS2序列與GATA3蛋白的低親和力結(jié)合的抑制，GATA3蛋白與其它GATA3結(jié)合序列的高親和力結(jié)合由于其高親和力而很難被抑制。因為染色質(zhì)重構(gòu)所必需的HSS2序列與GATA3蛋白間的結(jié)合，相比于其它GATA3結(jié)合序列與GATA3蛋白之間的結(jié)合具有較低親和力，誘騙物濃度應達到一定水平，使能夠選擇性地抑制HSS2序列與GATA3蛋白之間的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用例如凝膠移位分析(gel shift assay)和細胞培養(yǎng)這樣的技術(shù)通過一般的體外試驗程序很容易地估計出這一濃度。
用做誘騙物的寡核苷酸可以是DNA或RNA，也可以包含修飾的核苷酸和其它化合物。進一步地，寡核苷酸可以包含突變體，例如在一或多個位點的序列缺失、取代和/或添加，只要誘騙物寡核苷酸沒有丟失結(jié)合GATA3蛋白的能力。此外，該寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈，線性或環(huán)狀。更優(yōu)選地，誘騙物寡核苷酸是雙鏈寡核苷酸并包含一或多個GATA3結(jié)合序列。SEQID NO3，4，5和6給出了各序列的有義鏈，當被用作雙鏈時，使用與其互補鏈退火的每一寡核苷酸。為了抑制施用前與施用后的降解，可以用硫原子取代磷酸二酯位點的氧原子產(chǎn)生硫代磷酸二酯鍵，以此來對該寡核苷酸進行修飾。此外，磷酸二酯位點可以用不帶電荷的甲基磷酸取代。也可以進行烷化，?；蚱渌幕瘜W修飾。本發(fā)明的GATA3誘騙物可以用傳統(tǒng)的化學或生物化學方法來合成。當誘騙物是核酸時，它可以用任何基因操縱技術(shù)(包括限制性酶切和基因重組方法)、PCR方法或核酸合成儀來合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地操作這些方法。
這里所用的HSS2序列是包含在位于基因組的IL-4和IL-13基因之間CNS-1區(qū)域內(nèi)的DNase I高敏感位點(HSS2位點)(該位點很容易被DNase I切開)附近的GATA3結(jié)合序列的序列。例如，圖1頂部HSS2列所示的序列(有義鏈如SEQ ID NO3所示)是小鼠HSS2序列。人HSS2序列如SEQ ID NO6所示(僅示出了有義鏈)。如同所述那樣，HSS2序列能結(jié)合到GATA3蛋白上，這樣的結(jié)合對于染色質(zhì)重構(gòu)是必需的，染色質(zhì)重構(gòu)進而是T細胞中Th2細胞因子產(chǎn)生所必需的。
本文術(shù)語“GATA3結(jié)合序列”是指被GATA3蛋白特異性結(jié)合、包含GATA3蛋白結(jié)合共有序列(A/T)GATA(A/G)的DNA序列。GATA3蛋白是一個影響到很多基因的轉(zhuǎn)錄因子。已知被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)含有GATA3結(jié)合序列，且GATA3蛋白與該序列的結(jié)合對于該基因的轉(zhuǎn)錄激活來說是必需的。這樣的基因的例子包括但不僅限于IL-5基因，TCRα基因和CD8。前面所述的對染色質(zhì)重構(gòu)所必需的GATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合，也是依靠GATA3蛋白與HSS2序列內(nèi)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。對GATA3蛋白來說，與HSS2序列的結(jié)合相比于與前述的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，結(jié)合親和力較低。此外，它據(jù)信只是通過染色質(zhì)重構(gòu)對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進行修飾，而不是對特定基因進行轉(zhuǎn)錄激活。因此，HSS2序列中的GATA3結(jié)合序列不包括在說明書中的上下文中所使用的術(shù)語“位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列”中。
本文術(shù)語“染色質(zhì)重構(gòu)”指T細胞中，由于GATA3蛋白與染色體上Th2細胞因子基因簇所在區(qū)域結(jié)合所引起的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾，這種修飾導致Th2細胞因子基因通過基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制被轉(zhuǎn)錄。也就是說，當GATA3蛋白與基因組HSS2序列的結(jié)合受到抑制或阻遏時不發(fā)生染色質(zhì)重構(gòu)，Th2細胞因子也不能穩(wěn)定地或足量地產(chǎn)生。
來自不同動物物種的GATA3蛋白的氨基酸序列是已知的。例如SEQ IDNO1和2分別示出小鼠和人的野生型GATA3蛋白的氨基酸序列。這些序列是高度保守的；僅人類的第38位氨基酸丙氨酸在小鼠中缺失，這導致第38位氨基酸C-末端一側(cè)的單個氨基酸位移。GATA3蛋白的基本結(jié)構(gòu)在所有的物種中都是保守的，并在N-末端包含反式激活區(qū)，該區(qū)含兩個反式激活域，反式激活域I(人氨基酸序列第30-74位，小鼠氨基酸序列第30-73位)和反式激活域II(人氨基酸序列第131-214位，小鼠氨基酸序列第130-213位)。所述序列的C-末端一側(cè)含有兩個鋅指(zinc finger)區(qū)域。靠近N-末端的鋅指區(qū)被稱為N指(人氨基酸序列第264-288位，小鼠氨基酸序列第263-287位)，另一個靠近C-末端，被稱為C指(C指人氨基酸序列第305-326位，小鼠氨基酸序列第304-325位)。這些鋅指區(qū)域的每一個含有4個半胱氨酸殘基，其中任一半胱氨酸殘基的缺失或取代都能導致功能的喪失。與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列結(jié)合既需要N指區(qū)也需要C指區(qū)，而且，進一步的，反式激活區(qū)是誘導結(jié)合后的轉(zhuǎn)錄激活所必需的。另一方面，染色質(zhì)重構(gòu)所必需的GATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合僅需C指區(qū)；N指區(qū)不是必需的。因此，本發(fā)明包含GATA3突變蛋白，其C指區(qū)的氨基酸序列不變或發(fā)生一或多個氨基酸的缺失、取代或添加，只要在缺失、取代或添加后還保留誘導染色質(zhì)重構(gòu)所必需的蛋白質(zhì)與HSS2結(jié)合的能力。因此，盡管N指區(qū)發(fā)生一或多個氨基酸殘基的缺失、取代或插入可能導致突變蛋白喪失結(jié)合到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列上的能力，突變體蛋白結(jié)合到HSS2序列上的能力不受這樣的缺失、取代或插入的影響。優(yōu)選的能結(jié)合到HSS2序列上但不具有結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列上的能力的GATA3突變蛋白包含在N指區(qū)的氨基酸序列中的至少一個殘基，優(yōu)選5個殘基或更多，更優(yōu)的是8個殘基或更多，再優(yōu)的是10個殘基或更多的缺失、取代或插入。例如在實施例中所用的小鼠的delN GATA3突變蛋白已經(jīng)失去了與IL-5和TCRα基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合能力，但能誘導染色質(zhì)重構(gòu)因為它保留了結(jié)合到HSS2序列上的能力。
此外，反式激活區(qū)域是誘導結(jié)合后的染色質(zhì)重構(gòu)所必需的，因此，在這個區(qū)域有一或多個氨基酸(優(yōu)選10個或更多殘基)的缺失、取代或添加的GATA3突變蛋白可能喪失誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力但保留了結(jié)合到GATA3結(jié)合序列的能力。優(yōu)選的能結(jié)合到GATA3結(jié)合序列上但不能誘導染色質(zhì)重構(gòu)的GATA3突變蛋白包含反式激活區(qū)域內(nèi)氨基酸序列的至少一個、優(yōu)選10個或更多、更優(yōu)選50個或更多、甚至更優(yōu)選100個殘基或更多殘基的缺失、取代或插入。例如，在實施例中所用的小鼠的delTA GATA3突變蛋白有結(jié)合到GATA3結(jié)合序列的能力，但喪失了誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力。
因此，GATA3突變蛋白在N指區(qū)氨基酸序列中包含一或多個殘基、優(yōu)選5個或更多殘基、更優(yōu)選8個或更多殘基、甚至更優(yōu)選10個或更多殘基的缺失、取代或插入，并且此外，在反式激活區(qū)域的氨基酸序列有一或多個殘基、優(yōu)選10個或更多殘基、更優(yōu)選50個或更多殘基、最優(yōu)選100個殘基或更多殘基的缺失、取代或插入時，可能喪失了與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合能力，并且此外，可能保留了與HSS2序列結(jié)合的能力但喪失了誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力。當這種GATA3突變蛋白被外源引入細胞核時(通過基因操縱方法或蛋白質(zhì)注射方法)，它們通過與HSS2序列結(jié)合但不誘導染色質(zhì)重構(gòu)來抑制內(nèi)源GATA3蛋白與HSS2序列結(jié)合。而且，這些GATA3突變蛋白不與包括IL-5和TCRα基因在內(nèi)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的GATA3結(jié)合序列結(jié)合。因此，這些GATA3突變蛋白不抑制內(nèi)源GATA3突變蛋白與它們結(jié)合。也就是說有可能在GATA3蛋白的功能中選擇性地抑制對染色質(zhì)重構(gòu)的誘導，從而抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生。這種GATA3突變蛋白的一個例子是小鼠的GATA3突變蛋白，其中SEQ ID NO1所示小鼠野生型GATA3蛋白氨基酸序列的第29-168位的氨基酸殘基和N指區(qū)的至少氨基酸殘基第280-287位(例如第263-287位)發(fā)生缺失。另一例子包括小鼠GATA3突變蛋白，其中與上述缺失的氨基酸殘基相對應的人氨基酸殘基，即SEQ ID NO2所示人GATA3蛋白氨基酸序列的第29-169位氨基酸殘基和至少N指區(qū)的氨基酸殘基第281-288位(例如264-288)發(fā)生缺失。
上述可抑制Th2細胞因子產(chǎn)生的GATA3突變蛋白及其衍生物可被用做治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的藥物組合物。因此，包含上述GATA3突變蛋白的藥物組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此，術(shù)語“GATA3突變蛋白衍生物”包含經(jīng)修飾的或改變的GATA3突變蛋白，其保留GATA3突變蛋白的活性，如與HSS2序列結(jié)合的能力、基因轉(zhuǎn)錄活性和誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員參照已報道的GATA3蛋白的氨基酸序列(參見SEQ IDNO1和SEQ ID NO2分別所示的小鼠和人類的GATA3蛋白)很容易地實現(xiàn)產(chǎn)生本發(fā)明的GATA3突變蛋白的方法。這樣的蛋白質(zhì)可以按照產(chǎn)生編碼特定氨基酸序列的核酸的常規(guī)技術(shù)來產(chǎn)生。多種遺傳學操縱技術(shù)，例如PCR方法、各種誘變方法、限制性酶消化及用DNA連接酶進行連接都可以被適當?shù)剡\用。(參見，例如，Sambrook等，分子克隆實驗指南，第2版，1989紐約冷泉港，冷泉港實驗室出版)。例如，編碼野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的核酸可通過PCR或雜交的方法從源自相應動物種的cDNA文庫中克隆出來。核酸可以通過上述技術(shù)加以改變來編碼所想得到的突變體。突變體可以通過將編碼所想要的突變體的核酸克隆到合適的表達載體并轉(zhuǎn)化合適的宿主(例如大腸桿菌和哺乳動物細胞)中而被表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地從轉(zhuǎn)化細胞中獲得突變蛋白。因此，包含上述核酸的載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)和包含載體的宿主也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的突變體能夠通過將表達載體與編碼突變體的核酸功能性連接、再以能被導入T細胞的形式引入來在T細胞中表達。
本發(fā)明的“藥物組合物”可以包含藥學上可接受的載體，需要的時候可以加入添加劑例如增稠劑、穩(wěn)定劑和/或增溶劑。這樣的載體和添加劑的例子包括但不僅限于乳糖、檸檬酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、蔗糖、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、植物油和1，2-亞乙基二醇。此外，依施藥方法而定，也可在需要時加入調(diào)味劑、防腐劑、著色劑、甜味劑等。術(shù)語“藥學上可接受的”可以很容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，它指被每個國家的權(quán)威機構(gòu)認可，或列入每一國家的藥典或涉及動物、哺乳動物、尤其是人用的被廣泛接受的藥典。治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的有效量可以通過很多合適的途徑施用，包括但不僅限于口吸、鼻吸、口服，非口腔施藥如靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、經(jīng)皮注射和連續(xù)輸注，和包括局部敷用在內(nèi)的局部給藥。此外，還可以與運輸載體一起施用，以利于輸送到特定的組織或細胞類型(本發(fā)明優(yōu)選胸腺或T細胞)。本發(fā)明的藥物組合物針對不同的應用配制成合適的形式，例如溶液、混懸劑、乳劑、糖漿、脂質(zhì)體、片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、氣霧劑、噴霧、油膏(ointment)和乳膏(cream)。此外，組合物可以與含無菌水、生理鹽水或注射用緩沖液的安瓿劑一起提供。這些溶液與組合物混合制備成單劑量或多劑量的凍干粉末或小球，以便在施用前制成預期濃度的組合物。本發(fā)明的用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)變態(tài)反應疾病的藥物組合物的有效劑量能由醫(yī)療人員通過標準的臨床技術(shù)來決定。此外，利用疾病模型動物或類似的體內(nèi)試驗或體外試驗可被自由地用于決定最佳劑量范圍。所用的確切劑量也依賴于給藥途徑和疾病的嚴重程度，應由執(zhí)行者根據(jù)每個患者的癥狀來決定。這里所用術(shù)語“患者”是指任何哺乳動物，優(yōu)選是人。
優(yōu)選的藥物組合物配制劑包含用做活性成分的、是核酸和/或其衍生物或修飾物的GATA3誘騙物、和/或GATA3突變蛋白，這種配制劑包括被廣泛用于基因治療的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可由數(shù)量眾多的文獻所記載的方法來制備，例如Szoka，F(xiàn).等(Biochim.Biophys.Acta，Vol.601 559(1980)和Brunner，J.等(Biochim.Biophys.Acta，Vol.455 322(1976))。
此外，本發(fā)明還包括用能抑制GATA3蛋白與HSS2序列結(jié)合的化合物作靶來篩選用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)變態(tài)反應疾病的藥物的方法。被篩選的化合物包括任何物質(zhì)，包括活體內(nèi)存在的物質(zhì)，例如核酸和蛋白質(zhì)，而不考慮其分子量。也就是說，本發(fā)明的誘騙物和GATA3突變蛋白及其衍生物也能被篩選。在該方法中，通過在有或沒有測試化合物的情形下，在允許野生型GATA3蛋白與dsDNA或其衍生物結(jié)合的條件下(該條件可以是那些用于一般凝膠移位分析等的條件，參見Lee等，(1998)J.Immunol.1602343)將野生型GATA3蛋白和dsDNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，并檢測野生型GATA3蛋白與dsDNA或其衍生物的結(jié)合，來鑒定能抑制野生型GATA3蛋白與HHS2序列結(jié)合的測試化合物。在這一方法中，擁有與HSS2序列結(jié)合的能力的GATA3突變蛋白(例如，本說明書中的delTA和delN GATA3突變蛋白，但本發(fā)明不限于此)能代替野生型GATA3蛋白被使用。
根據(jù)上述方法，不抑制野生型GATA3蛋白與IL-5和TCRα基因(盡管本發(fā)明不限于此)等被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)GATA3結(jié)合序列結(jié)合的測試化合物，或相比于對野生型蛋白與HSS2序列結(jié)合的抑制，在較低水平抑制的測試化合物，能進一步通過將包含位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的GATA3結(jié)合序列的dsDNA或其衍生物和野生型GATA3蛋白質(zhì)一起孵育，在有或沒有測試化合物的情形下，在允許野生型GATA3蛋白與dsDNA或其衍生物結(jié)合的條件下，被鑒定出來。因此，在眾多GATA3結(jié)合序列中，能只特異性地抑制GATA3蛋白與HSS2序列結(jié)合的化合物能被鑒定出來。在這一過程中，具有與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列結(jié)合的能力GATA3突變蛋白(例如，本說明書中的delTA GATA3突變蛋白，盡管本發(fā)明不限于此)，能代替野生型GATA3蛋白被使用。
通過對用于上述方法的dsDNA或其衍生物用各種標記化合物，例如放射性、熒光和化學發(fā)光化合物進行標記，可以很容易地進行上述方法中的結(jié)合抑制程度的檢測和比較。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用各種方法，例如常規(guī)的凝膠移位分析或?qū)ATA3蛋白固定于固體支持物上的方法，很容易地進行選擇合適的標記化合物和標記及比較結(jié)合抑制水平的方法。此外，包含HSS2序列的dsDNA衍生物包括上述誘騙物中所述的衍生物和修飾物。


圖1是一系列描述凝膠移位分析結(jié)果的圖片和圖表。每一分析中所用的DNA指示在頂部。delN突變蛋白能與IL-5啟動子和TCRα增強子區(qū)域的GATA3結(jié)合序列相結(jié)合，但不能與HSS2內(nèi)的GATA3結(jié)合序列相結(jié)合。delC突變蛋白不與任何GATA3結(jié)合序列結(jié)合，delTA突變蛋白與所有GATA3結(jié)合序列結(jié)合。
圖2是一系列圖片和圖表，描述對表達每一GATA3突變蛋白的轉(zhuǎn)化的T細胞中IL-13和IL-4基因之間的區(qū)域的DNase I高敏感分析結(jié)果。
圖3是一系列圖片和圖表，描述表達每一GATA3突變蛋白的轉(zhuǎn)化的T細胞中的IL-4基因編碼區(qū)的DNase I高敏感分析結(jié)果。
圖4描述了通過在表達每一GATA3突變蛋白的轉(zhuǎn)化的Th1細胞中用免疫化學流式細胞光度的方法來測量IFNγ、IL-4和IL-5的表達。對于所有被測試的細胞因子的表達模式而言，delTA和delC突變體顯示出與Th1細胞相似。然而，在被轉(zhuǎn)化的delN表達細胞中，與未感染細胞中IFNγ和IL-4的表達相比，IFNγ的表達被抑制，IL-4的表達增加。這與野生型GATA3蛋白表達細胞相似，這種趨勢也與在Th2中所觀察到的相同。
圖5描述HSS2序列和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的GATA3結(jié)合序列與GATA3蛋白相結(jié)合的競爭分析結(jié)果。左圖描述用自表達GATA3的COS細胞收集來的細胞提取物和包含HSS2序列(HSSGATA序列)的探針進行電泳遷移移位分析(EMSA)的結(jié)果。右圖描述用自表達GATA3的COS細胞收集來的細胞提取物和包含基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的GATA3結(jié)合序列(TCRα GATA序列)的探針進行電泳遷移率變動分析(EMSA)的結(jié)果。
圖6是一系列照片，描述比較GATA3蛋白與HSS2序列(CNS-1)和與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(TCRα增強子序列)內(nèi)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合親和力的凝膠移位分析的結(jié)果。
發(fā)明的最佳實施方式以下以實施例的方式對本發(fā)明進行詳細描述，但這并不能解釋為對發(fā)明的限制。
構(gòu)建編碼野生型GATA3蛋白和GATA3突變蛋白的基因制備野生型GATA3蛋白和各種GATA3突變蛋白。小鼠GATA3蛋白cDNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXI和哺乳動物細胞表達載體pME18S分別由山本教授(筑波大學)、北村教授(東京大學醫(yī)科學研究所)和丸山副教授(東京醫(yī)科齒科大學)提供。為了將基因引入T細胞，將野生型和突變型GATA3cDNAs以雙順反子的方式插入表達綠色熒光蛋白(GFP)的pMXI的EcoRI和NotI位點之間。為了在COS細胞中表達cDNA，將cDNA也插入pME18S的EcoRI和NotI位點。
delTA突變體在轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域有缺失(缺少氨基酸29-168)。使用編碼GATA3蛋白的cDNA作為模板，制備包含這一缺失的兩種PCR片段。反應中使用引物組合引物15′-GGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTG-3′(SEQ ID NO7)/引物25′-ACCCGGCGGATCCCGGGTGGTGCGTGTCTGGGTG-3′(SEQ ID NO8)和引物35′-AGACACGCACCACCCGGGATCCGCCGGGTCGGCCAGG-3′(SEQ ID NO9)/引物45′-GTGGGAGGTITTTTCTCTAGACTAGTCT-3′(SEQ ID NO10)。所得到的兩種PCR片段通過用引物1和引物4進行擴增而加以連接。這一PCR片段通過測序進行確認，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
delN突變體在N指有缺失(缺少氨基酸263-287)。使用GATA3 cDNA作為模板，制備包含這一缺失的兩種PCR片段。反應中使用引物組合引物1/引物55′-GGTAGAGTCCCTCCCTGCCTTCTGTGCTG-3′(SEQ ID NO11)和引物65′-GCAGGGAGGGACTCTACCATAAAATGAATGGGCAG-3′(SEQ ID NO12)/引物4。兩種PCR片段通過用引物1和引物4進行擴增而加以連接。這一PCR片段通過測序進行確認，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
delC突變體在C指有缺失(缺少氨基酸304-325)。使用GATA3 cDNA作為模板，制備包含這一缺失的兩種PCR片段。反應中使用引物組合引物1/引物75′-TTCATAGTCAGGGGTCGACAGCCTTCGCTTGGGCT-3′(SEQID NO13)和引物85′-AAGCGAAGGCTGTCGACCCCTGACTATGAAGAAAGAAGG-3′(SEQ ID NO14)/引物4。兩種PCR片段通過用引物1和引物4進行擴增而加以連接。這一PCR片段通過測序進行確認，用EcoRI和NotI消化，插入pMXI和pME18S。
上述生成的、包含編碼GATA3和GATA3突變蛋白基因的載體在COS細胞中進行表達。對細胞提取物進行SDS-PAGE電泳。每一野生型GATA3和GATA3突變蛋白可以在預計的分子量位置檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)。
GATA3蛋白對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中HSS2序列和GATA3結(jié)合序列的特異性使用包含HSS2序列((HSSGATA序列)的探針對表達GATA3的COS細胞的提取物進行電泳遷移率變動分析(EMSA)。結(jié)果如圖5所示。過量加入具有相同序列的非標記DNA或基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列(TCRαGATA序列T細胞受體α鏈增強子的GATA序列)后，由于競爭性抑制的存在，導致與包含HSS2序列的探針結(jié)合的蛋白復合物消失。突變的HSS2序列不誘導抑制，表明特異的序列被識別。觀察到抗-GATA3抗體特異的遷移率巨大變動(super shift)，顯示復合物中的蛋白是GATA3。
使用包含基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中GATA3結(jié)合序列的探針進行EMSA，也檢測到GATA3復合物。加入與探針相同的、包含GATA序列的HSS2序列和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的GATA3結(jié)合序列，導致復合物競爭性消失。突變的HSS2序列不引起抑制，顯示GATA3復合物所識別的是特異序列。
鑒定對GATA3結(jié)合序列的結(jié)合所需要的GATA3蛋白區(qū)域使用實施例1中獲得的在COS細胞中表達的GATA3突變蛋白和野生型GATA3蛋白和雙鏈寡核苷酸進行凝膠移位分析，所述雙鏈寡核苷酸包含HSS2序列(圖1上欄中的HSS2，SEQ ID NO3中所示的有義鏈)、含GATA3結(jié)合序列的IL-5啟動子序列(圖1上欄中的IL-5啟動子，SEQ ID NO4中所示的有義鏈)、以及含GATA3結(jié)合序列的TCRα增強子序列(圖1上欄中的TCRα增強子，SEQ ID NO5中所示的有義鏈)。
用傳統(tǒng)方法對上述合成寡核苷酸用32P進行放射性標記，以進行凝膠移位分析。結(jié)果如圖1所示。野生型(WT)GATA3蛋白和delTA突變蛋白可與上述三種類型的GATA3結(jié)合序列結(jié)合；然而delN突變蛋白只與HSS2序列結(jié)合。此外，delC突變蛋白與三種GATA3結(jié)合序列中任何一種都不結(jié)合。這些結(jié)果顯示，GATA3蛋白與HSS2序列之外的GATA3結(jié)合序列結(jié)合既需要GATA3蛋白的C指區(qū)域，也需要GATA3蛋白的N指區(qū)域。這與先前所報道過的結(jié)果相一致。另一方面，這些結(jié)果還進一步顯示，GATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合必需有GATA3蛋白的C指區(qū)域，這相應地還顯示，這一結(jié)合行為不同于其它GATA3結(jié)合序列的行為。
本發(fā)明人所進行的進一步研究還顯示，根據(jù)用凝膠移位分析進行親和力測定實驗所獲得的結(jié)果，GATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合相比于GATA3與其它GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，具有較低親和力(圖6)。除了本發(fā)明人的這一發(fā)現(xiàn)以外，并沒有其它的報道描述過一種GATA3結(jié)合序列與其它GATA3結(jié)合序列相比具有不同的結(jié)合親和力。從而，這一發(fā)現(xiàn)顯示，在GATA3結(jié)合序列中，只有HSS2序列(它參與染色質(zhì)重構(gòu)的控制)是低親和力結(jié)合序列。
因此，具有高親和力的GATA3結(jié)合序列(例如IL-5啟動子序列內(nèi)的序列，SEQ ID NO4；TCRα增強子序列內(nèi)的序列，SEQ ID NO5)能夠在低濃度被有效地用作GATA3誘騙物，誘騙物能夠特異性抑制GATA3蛋白與HSS2序列的低親和力結(jié)合，而這種結(jié)合參與染色質(zhì)重構(gòu)；該誘騙物不抑制GATA3蛋白與HSS2序列之外的GATA3結(jié)合序列的高親和力結(jié)合。
如上述制備的GATA3蛋白和其突變體對染色質(zhì)重構(gòu)的影響用DNA酶I高敏感分析檢測GATA3蛋白和其突變體對染色質(zhì)重構(gòu)的影響。DNA酶I高敏感分析基于這樣一個事實染色質(zhì)重構(gòu)發(fā)生后，DNA酶I得以接近其在基因組中的作用位點，因而可以測出特異片段。
在此，按照Takemoto，N.等描述過的方法(1998，同上)進行DNA酶I高敏感分析。Phoenix Eco包裝細胞系由北村博士提供(東京大學醫(yī)科學研究所)。使用“l(fā)ipofectamine plus”(Gibco BRL)將質(zhì)粒引入Phoenix Eco包裝細胞系。
以CD4表達作為指標，用細胞分揀器(見Takemoto，N.，et al.，Int.Immunol.101981(1998))從DO11.10 TCRαβ-轉(zhuǎn)基因小鼠(Murphy，K.M.，etal.，Science 2501720(1990))收集初始T細胞。所得到的初始T細胞用源自雞卵清蛋白的肽抗原和用抗原呈遞細胞(經(jīng)照射的小鼠脾細胞)加以刺激。一天后，被激活的T細胞在補充有polyburene(0.5μg/ml)的含逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。同時，培養(yǎng)板在32℃、1800rpm離心1小時。上述步驟于次日重復一次。在有抗IL-4抗體和IL-12(IL-12可誘導向Th1分化)存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)?？乖碳?天后用細胞分揀器分離表達GFP的細胞。培養(yǎng)物在有IL-12和抗IL-4抗體存在的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，每周用抗原進行刺激。
所獲得的經(jīng)感染的初始T細胞懸浮于0.5％的含NP-40的RSB緩沖液(10mM Tris，pH7.4，10mM NaCl，和5mM MgCl2)中，用勻漿器破碎，得到細胞裂解液。從裂解液中提取細胞核。所得到的細胞核(1×107每份)懸浮于100μl RSB緩沖液，加入DNA酶I(Worthington Biochemical，F(xiàn)reehold，NJ)至濃度為0、5、10、15和20μg/ml，37℃孵育12分鐘，以進行DNA酶I反應。加入100μl 2x反應終止緩沖液(1％SDS，20mM Tris，pH7.4，600mMNaCl，10mM EDTA，和50μg/ml蛋白酶K)以終止反應，反應混合物在37℃劇烈搖晃過夜，以消化混合物中的蛋白質(zhì)。用醋酸銨沉淀、酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法從混合物中純化DNA。DNA用ScaI消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，轉(zhuǎn)移至膜上。DNA在DNA印跡法常用的條件下與α32P ATP-標記的探針(用BamHI和NspV消化的基因組DNA片段，相應于IL-4基因轉(zhuǎn)錄起始位點的大約7.0kb和大約6.7kb)進行雜交。結(jié)果如圖2所示。在所有獲自非感染細胞、表達野生型GATA3蛋白的細胞和所有表達GATA3突變蛋白的細胞的基因組DNA中均檢測到HSS3的消化片段。然而，特異于進行染色質(zhì)重構(gòu)的Th2細胞的、Th2特異性DNA酶I高敏感序列HSS2和HSS1消化片段在非感染細胞的基因組DNA中沒有檢測到；在表達野生型GATA3蛋白的細胞中卻檢測出來。此外，考慮到表達GATA3突變蛋白的感染細胞，在表達delN突變體的細胞中可以檢測到HSS2和HSS1消化片段，其方式與表達野生型GATA3蛋白的細胞相類似。然而，在表達delTA和delC GATA3突變蛋白的細胞中卻沒有檢測到這些片段。這些結(jié)果與實施例2的凝膠移位分析的結(jié)果相吻合，即在GATA3蛋白中，對結(jié)合HSS2序列所必需的、負責染色質(zhì)重構(gòu)的區(qū)域是C指區(qū)域。雖然曾顯示delTA突變體可與HSS2序列結(jié)合，但其中染色質(zhì)重構(gòu)所需要的區(qū)域卻丟失了，因為在表達delTA突變體的細胞中沒有檢測到HSS2和HSS1消化片段。也就是說，這顯示，delTA突變體可以作為GATA3蛋白與HSS2序列結(jié)合所誘導的染色質(zhì)重構(gòu)中的顯性失活突變體。
此外，使用32P-標記的、針對IL-4編碼區(qū)域的探針進行了類似實驗，以檢測每一IL-4編碼區(qū)域內(nèi)的DNA酶I高敏感區(qū)域。同樣，獲自delN GATA3突變蛋白的結(jié)果與獲自野生型GATA3蛋白的結(jié)果相類似，而delTA和delCGATA3突變蛋白表現(xiàn)出的結(jié)果與野生型GATA3蛋白的有所不同(圖3)。這些結(jié)果還顯示，雖然delTA GATA3突變蛋白丟失了染色質(zhì)重構(gòu)所需要的區(qū)域，但仍能與HSS2序列結(jié)合。相應的，這些結(jié)果支持上面所提到的設(shè)想，即delTA突變體可以作為GATA3蛋白與HSS2序列結(jié)合所誘導的染色質(zhì)重構(gòu)中的顯性失活突變體，而delC GATA3突變蛋白由于其無法與HSS2序列結(jié)合而無法誘導染色質(zhì)重構(gòu)。
如上制備的GATA3蛋白及其突變體對Th2細胞分化的影響初始T細胞用與實施例3相似的方法獲取，用IL-11進行刺激，使之分化成Th1細胞(見Takemoto N，et al.，Int.Immunol.101981(1998))。分化的Th1細胞用上面所提到的每一種編碼GATA3突變體或野生型GATA3蛋白的病毒進行感染，感染方式與實施例3類似。用流式細胞光度分析測量感染細胞中的IFNγ、IL-4和IL-5表達水平。收集感染細胞，用PMA(50ng/ml)和離子霉素(500ng/ml)激活6小時?；厥占毎?小時加入莫能菌素(2μM)，培養(yǎng)細胞。細胞在37℃用4％低聚甲醛固定5分鐘，清洗。然后，將細胞重懸于含0.5％Triton X-100的裂解緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，5mM EDTA，0.02％NaN3，pH7.5)，冰上孵育10分鐘，以使細胞膜通透。用含3％BSA和0.1％NaN3的PBS進行阻斷(在冰上孵育30分鐘)，以抑制抗體的非特異性吸附。細胞用FITC標記的抗IFNγ抗體(XMG1.2)、藻紅蛋白標記的抗IL-4抗體(11B11，R&D Systems，Minneapolis，MN)、或PE標記的抗IL-5抗體(TRFK5；Pharmingen)染色60分鐘。洗去未結(jié)合的抗體，然后進行流式細胞光度分析。分析結(jié)果如圖4所示。圖4的最右欄顯示獲自Th2細胞的結(jié)果，該細胞經(jīng)IL-4刺激而分化，并經(jīng)上面描述的方法進行處理和分析。結(jié)果顯示，與獲自從非感染細胞分化來的Th1細胞的結(jié)果(左欄)相比，IFNγ在Th2細胞中不表達，而IL-4和IL-5則以較高水平表達。另一方面還顯示，Th1具有高IFNγ表達和非常低的IL-4和IL-5表達。此外，與Th1細胞相比，表達野生型GATA3蛋白的Th1細胞具有較低的IFNγ表達，同時IL-4和IL-5的表達也受誘導。因此，我們發(fā)現(xiàn)，野生型GATA3蛋白在Th1細胞中的表達誘導Th2細胞因子的表達，導致Th1細胞表型變?yōu)門h2細胞表型。
在本實驗所用34種GATA3突變蛋白中，delN GATA3突變蛋白在IFNγ和IL-4方面具有與野生型GATA3蛋白相同的功能，導致Th2細胞表型的呈現(xiàn)。與野生型GATA3蛋白不同，這一突變蛋白無法誘導IL-5，這可能是由于足夠的IL-5表達需要GATA3蛋白與啟動子序列內(nèi)GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。前面曾經(jīng)說過，delN突變蛋白喪失了上面所描述過的與啟動子區(qū)域內(nèi)GATA3結(jié)合序列結(jié)合的能力。另一方面，表達delC和delTA GATA3突變蛋白后卻沒有觀察到這樣的表型改變，即IFNγ、IL-4和IL-5表達模式的改變。獲自凝膠移位分析和DNA酶I高敏感分析的結(jié)果顯示，delC GATA3突變蛋白由于無法與HSS2序列結(jié)合，因此無法誘導染色質(zhì)重構(gòu)；delTA GATA3突變蛋白雖然可以與HSS2序列結(jié)合，但不能誘導染色質(zhì)重構(gòu)。因此，上述流式細胞光度分析再次證實了染色質(zhì)重構(gòu)對分化成Th2細胞是必需的。
此外，一種在N指區(qū)域具有部分缺失的GATA3突變蛋白(缺乏氨基酸殘基280-288)也可以用上面描述過的所有實驗進行檢測，它表現(xiàn)出與delN突變蛋白相同的結(jié)果(雖然數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在N指區(qū)域內(nèi)具有一個氨基酸殘基取代的突變體(V264G)(在GATA-1蛋白中的相應殘基對于介導與FOG-1的接觸是必需的(Crispino，J.D.et al.，Mol.Cell.3219(1999))則顯示出與野生型GATA3蛋白所得到的結(jié)果相同的結(jié)果。另一方面，位于N指區(qū)域和C指區(qū)域間的第304-306位的三個氨基酸殘基被AAA取代，所得到的突變體其IL-5的產(chǎn)生降低，但在IFNγ和IL-4方面其結(jié)果與獲自野生型GATA3蛋白的結(jié)果相同。此外，缺乏第309-345位氨基酸(該區(qū)域包含C指區(qū)域)的突變體也表現(xiàn)出與獲自delC GATA3突變蛋白的結(jié)果相同的結(jié)果。
總結(jié)上面的結(jié)果，delC GATA3突變蛋白缺乏與染色質(zhì)重構(gòu)所需要的HSS2序列結(jié)合的能力，也缺乏與HSS2之外的其它GATA3結(jié)合序列結(jié)合的能力。相應地，GATA3蛋白的C指區(qū)域不僅對于與HSS2序列的結(jié)合是必需的，而且對于與所有GATA3結(jié)合序列的結(jié)合都是必需的。由于delNGATA3突變蛋白能夠與HSS2序列結(jié)合和誘導Th2細胞所特有的表型改變，GATA3蛋白的N指區(qū)域不參與與HSS2序列的結(jié)合或染色質(zhì)重構(gòu)，但對于與HSS2序列以外的其它GATA3結(jié)合序列的結(jié)合是必需的。相應地，在GATA3結(jié)合序列中，單獨HSS2序列只需要GATA3蛋白的C指區(qū)域用來與GATA3蛋白結(jié)合，而其它GATA3結(jié)合序列則既需要C指區(qū)域、也需要N指區(qū)域。此外，delTA GATA3突變蛋白與包括HSS2在內(nèi)的所有被檢測的GATA3結(jié)合序列相結(jié)合，然而卻不誘導染色質(zhì)重構(gòu)或Th2細胞表型改變。相應地，delTA GATA3突變蛋白是GATA3蛋白在染色質(zhì)重構(gòu)方面的顯性失活突變體。delTA GATA3突變蛋白丟失了反式激活區(qū)域的部分區(qū)域，這一丟失的區(qū)域包含與HSS2序列結(jié)合后進行染色質(zhì)重構(gòu)所必需的區(qū)域。這一討論使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易考慮到如下幾點由于在反式激活區(qū)域和N指區(qū)域都有缺失的GATA3突變蛋白與HSS2序列結(jié)合但不誘導染色質(zhì)重構(gòu)，而且它不與HSS2之外的其它GATA3結(jié)合序列相結(jié)合，這一突變體可以是這樣一種GATA3突變體，它對除染色質(zhì)重構(gòu)以外的由GATA3蛋白誘導的細胞內(nèi)機制(例如，IL-5、TCRα等的轉(zhuǎn)錄激活)沒有影響，它是只特異性地有效抑制Th2細胞分化的顯性失活突變體。
C指區(qū)域和N指區(qū)域?qū)τ谂c其它GATA3結(jié)合序列結(jié)合都是必需的，只有GATA3蛋白內(nèi)的C指區(qū)域?qū)τ贕ATA3蛋白與HSS2序列的結(jié)合是必需的，而且這一結(jié)合具有相對低的親和力。因此，這進一步提示，包含具有較高結(jié)合親和力的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸作為誘騙物將非常有用，該誘騙物特異性抑制參與染色質(zhì)重構(gòu)的、GATA3蛋白與HSS2序列的較低親和力結(jié)合。
使用凝膠移位分析比較GATA3蛋白與HSS2序列(CNS-1)、以及GATA3蛋白與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域(TCRα增強子序列)內(nèi)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合親和力使用獲自實施例1的在COS細胞中表達的野生型GATA3蛋白、包含HSS2序列的雙鏈寡核苷酸(“HSS2”，圖6的右上欄，有義鏈示于SEQ ID NO3)和包含含有GATA3結(jié)合序列的TCRα增強子序列的雙鏈寡核苷酸(“TCRα增強子，圖6左上欄，有義鏈示于SEQ ID NO5)進行凝膠移位分析以進行競爭性結(jié)合抑制實驗。使用用32P標記的上述合成寡核苷酸探針依照傳統(tǒng)方法進行凝膠移位分析(圖6)。野生型GATA3蛋白與含有GATA3結(jié)合序列的32P標記的TCRα增強子序列形成復合物，該復合物用電泳進行檢測(圖6的左上圖，泳道1)。包含TCRα增強子序列(該增強子序列具有探針的GATA3結(jié)合序列)的非標記DNA以探針的50倍和100倍的量加入反應混合物。以50、100、200、400、800倍的量加入包含HSS2序列的非標記DNA(圖6的左下圖)。與之形成對照的是，通過使用32P標記的HSS2序列探針進行凝膠移位分析，加入5、10、20、50、100倍的包含TCRα增強子序列的非標記DNA(圖6的右上欄)和5、10、20、50、100倍的包含HSS2序列的非標記DNA(圖6的右下欄)，來進行結(jié)合的競爭性抑制。
結(jié)果是，使用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的GATA3結(jié)合序列作為探針進行凝膠移位分析，除HSS2序列之外的同樣序列在50倍的量即表現(xiàn)出競爭性抑制，而HSS2序列即使在200倍的量時仍不能完全抑制。與之形成對照的是，使用HSS2序列作為探針，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的GATA3結(jié)合序列在50倍量的時候抑制幾乎所有結(jié)合，而HSS2序列即使在100倍量的時候仍不能完全抑制。這些結(jié)果顯示，GATA3蛋白與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域內(nèi)的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合親和力高于與HSS2序列的結(jié)合親和力。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供用于治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的GATA3誘騙物和GATA3突變蛋白。本發(fā)明的誘騙物和GATA3突變蛋白選擇性抑制Th2細胞因子基因簇內(nèi)的染色質(zhì)重構(gòu)，并在不影響GATA3蛋白的除Th2細胞因子之外的細胞內(nèi)功能的情況下有效抑制Th2細胞因子表達。因此，包含這類誘騙物或突變蛋白作為治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的有效成分的藥物組合物、以及包含施用這種組合物的用于治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的方法是極其有用的。
序列表<110>株式會社金科生物醫(yī)學研究所(Ginkgo Biomedical Research Institute Co.，Ltd.)<120>治療和/或預防Th2細胞因子相關(guān)變態(tài)反應病的誘騙物、GATA3突變蛋白、和包含它們的藥物組合物<130>G2-A0204Y1P<150>JP 2002-123019<151>2002-04-24<150>JP 2002-368545<151>2002-12-19<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>443<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>1Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro1 5 10 15Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Gly20 25 30His Ser Tyr Met Glu Ala Gln Tyr Pro Leu Thr Glu Glu Val Asp Val35 40 45Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Ser Tyr Tyr Gly50 55 60Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His Gly65 70 75 80Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp Leu85 90 95Asp Gly Gly Lys Ala Leu Ser Ser His His Thr Ala Ser Pro Trp Asn
100 105 110Leu Ser Pro Phe Ser Lys Thr Ser Ile His His Gly Ser Pro Gly Pro115 120 125Leu Ser Val Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ala Gly His130 135 140Ser Ser Pro His Leu Phe Thr Phe Pro Pro Thr Pro Pro Lys Asp Val145 150 155 160Ser Pro Asp Pro Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala Arg165 170 175Gln Asp Glu Lys Glu Cys Leu Lys Tyr Gln Val Gln Leu Pro Asp Ser180 185 190Met Lys Leu Glu Thr Ser His Ser Arg Gly Ser Met Thr Thr Leu Gly195 200 205Gly Ala Ser Ser Ser Ala His His Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Pro Tyr210 215 220Val Pro Glu Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Leu Gly225 230 235 240Gly Ser Pro Thr Gly Phe Gly Cys Lys Ser Arg Pro Lys Ala Arg Ser245 250 255Ser Thr Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Thr Ser Thr Pro260 265 270Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys Gly275 280 285Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Gln Asn Arg Pro Leu Ile Lys Pro Lys290 295 300Arg Arg Leu Ser Ala Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ser Cys Ala Asn Cys305 310 315 320Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Asn Gly Asp Pro325 330 335
Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Tyr Lys Leu His Asn Ile Asn Arg340 345 350Pro Leu Thr Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Asn Arg Lys Met355 360 365Ser Ser Lys Ser Lys Lys Cys Lys Lys Val His Asp Ala Leu Glu Asp370 375 380Phe Pro Lys Ser Ser Ser Phe Asn Pro Ala Ala Leu Ser Arg His Met385 390 395 400Ser Ser Leu Ser His Ile Ser Pro Phe Ser His Ser Ser His Met Leu405 410 415Thr Thr Pro Thr Pro Met His Pro Pro Ser Gly Leu Ser Phe Gly Pro420 425 430His His Pro Ser Ser Met Val Thr Ala Met Gly435 440<210>2<211>444<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Val Thr Ala Asp Gln Pro Arg Trp Val Ser His His His Pro1 5 10 15Ala Val Leu Asn Gly Gln His Pro Asp Thr His His Pro Gly Leu Ser20 25 30His Ser Tyr Met Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Leu Pro Glu Glu Val Asp35 40 45Val Leu Phe Asn Ile Asp Gly Gln Gly Asn His Val Pro Pro Tyr Tyr50 55 60Gly Asn Ser Val Arg Ala Thr Val Gln Arg Tyr Pro Pro Thr His His65 70 75 80Gly Ser Gln Val Cys Arg Pro Pro Leu Leu His Gly Ser Leu Pro Trp
85 90 95Leu Asp Gly Gly Lys Ala Leu Gly Ser His His Thr Ala Ser Pro Trp100 105 110Asn Leu Ser Pro Phe Ser Lys Thr Ser Ile His His Gly Ser Pro Gly115 120 125Pro Leu Ser Val Tyr Pro Pro Ala Ser Ser Ser Ser Leu Ser Gly Gly130 135 140His Ala Ser Pro His Leu Phe Thr Phe Pro Pro Thr Pro Pro Lys Asp145 150 155 160Val Ser Pro Asp Pro Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ala Gly Ser Ala165 170 175Arg Gln Asp Glu Lys Glu Cys Leu Lys Tyr Gln Val Pro Leu Pro Asp180 185 190Ser Met Lys Leu Glu Ser Ser His Ser Arg Gly Ser Met Thr Ala Leu195 200 205Gly Gly Ala Ser Ser Ser Thr His His Pro Ile Thr Thr Tyr Pro Pro210 215 220Tyr Val Pro Glu Tyr Ser Ser Gly Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Leu225 230 235 240Gly Gly Ser Pro Thr Gly Phe Gly Cys Lys Ser Arg Pro Lys Ala Arg245 250 255Ser Ser Thr Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Thr Ser Thr260 265 270Pro Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys275 280 285Gly Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Gln Asn Arg Pro Leu Ile Lys Pro290 295 300Lys Arg Arg Leu Ser Ala Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ser Cys Ala Asn305 310 315 320
Cys Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Asn Gly Asp325 330 335Pro Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Tyr Lys Leu His Asn Ile Asn340 345 350Arg Pro Leu Thr Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Asn Arg Lys355 360 365Met Ser Ser Lys Ser Lys Lys Cys Lys Lys Val His Asp Ser Leu Glu370 375 380Asp Phe Pro Lys Asn Ser Ser Phe Asn Pro Ala Ala Leu Ser Arg His385 390 395 400Met Ser Ser Leu Ser His Ile Ser Pro Phe Ser His Ser Ser His Met405 410 415Leu Thr Thr Pro Thr Pro Met His Pro Pro Ser Ser Leu Ser Phe Gly420 425 430Pro His His Pro Ser Ser Met Val Thr Ala Met Gly435 440<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gaggcctcat tatcttcatt catttctc 28<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>4gttagagata gcatcgcccc a21<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gaggtgtcct ctatctgatt gttagcaa 28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6aagccccatt atcttcattc atttctca 28<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7ggaagtgtta cttctgctct aaaagctg 28<210>8<211>34<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8acccggcgga tcccgggtgg tgcgtgtctg ggtg 34<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9agacacgcac cacccgggat ccgccgggtc ggccagg 37<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10gtgggaggtt ttttctctag actagtct 28<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11ggtagagtcc ctccctgcct tctgtgctg29
<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12gcagggaggg actctaccat aaaatgaatg ggcag 35<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13ttcatagtca ggggtcgaca gccttcgctt gggct 35<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14aagcgaaggc tgtcgacccc tgactatgaa gaaagaagg 39
權(quán)利要求
1.用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的GATA3誘騙物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物通過抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合而抑制Th2細胞因子基因簇區(qū)域內(nèi)的染色質(zhì)重構(gòu)，并因此抑制T細胞中一種或多種Th2細胞因子的產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物不抑制GATA3蛋白與GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，該序列是被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的GATA3結(jié)合序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GATA3誘騙物，其中相比于GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合，誘騙物在較低水平抑制GATA3蛋白與GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，所述GATA3結(jié)合序列是被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的GATA3結(jié)合序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物特異性抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物包含雙鏈寡核苷酸或其衍生物，該雙鏈寡核苷酸或其衍生物包含SEQ ID NO3、4、5或6中所示序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的GATA3誘騙物，其中誘騙物有效抑制GATA3蛋白與T細胞基因組中HSS2序列的結(jié)合，并且其中誘騙物可以被施用，所施用的濃度使得相比于GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合，誘騙物在較低水平抑制GATA3蛋白與被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的GATA3結(jié)合序列的結(jié)合。
8.GATA3突變蛋白或其衍生物，其中a)保留了野生型GATA3蛋白C指區(qū)域的氨基酸序列；或b)野生型GATA3蛋白C指區(qū)域的氨基酸序列中一或多個氨基酸被缺失、取代或插入，但仍保留與HSS2序列結(jié)合的能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的一或多個氨基酸被缺失、取代或插入，使得GATA3蛋白誘導染色質(zhì)重構(gòu)的能力喪失。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的氨基酸序列有至少10個氨基酸殘基被缺失。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指區(qū)域的氨基酸序列有一或多個氨基酸進一步被缺失、取代或插入，使得與DNA結(jié)合的能力喪失，所述DNA包含被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-10任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白N指區(qū)域的氨基酸序列有至少一個氨基酸殘基被缺失。
13.GATA3突變蛋白或其衍生物，其中野生型GATA3蛋白反式激活區(qū)域的氨基酸序列有至少10個氨基酸殘基被缺失，且N指區(qū)域的氨基酸序列有至少一個氨基酸殘基被缺失。
14.小鼠GATA3突變蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO1所述小鼠野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-168位氨基酸被缺失。
15.人GATA3突變蛋白或其衍生物，其中SEQ ID NO2所述人野生型GATA3蛋白的氨基酸序列的第29-169位氨基酸被缺失。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中進一步缺失SEQ ID NO1所述小鼠野生型GATA3蛋白N指區(qū)域氨基酸序列的至少第280-287位氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的人GATA3突變蛋白或其衍生物，其中進一步缺失SEQ ID NO2所述人野生型GATA3蛋白N指區(qū)域氨基酸序列的至少第281-288位氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求8-17任一所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中所述蛋白或衍生物具有與HSS2序列結(jié)合、但抑制T細胞的Th2細胞因子產(chǎn)生的能力。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的GATA3突變蛋白或其衍生物，其中與DNA結(jié)合的能力喪失，所述DNA包含被GATA3蛋白轉(zhuǎn)錄激活的基因中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列。
20.編碼根據(jù)權(quán)利要求8-19中任一所述的GATA3突變蛋白的核酸。
21.包含根據(jù)權(quán)利要求20的核酸的載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的載體，其中的載體是表達載體。
23.包含根據(jù)權(quán)利要求21或22的載體的宿主細胞。
24.用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應性疾病的藥物組合物，其中的組合物在施用給哺乳動物后，通過抑制GATA3蛋白與基因組中HSS2序列的結(jié)合而抑制Th2細胞因子基因簇區(qū)域中的染色質(zhì)重構(gòu)，從而抑制一種或多種Th2細胞因子的產(chǎn)生。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一的一種或多種GATA3誘騙物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求8-19中任一的一種或多種GATA3突變蛋白。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求20的一種或多種編碼GATA3突變蛋白的核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物組合物，其中藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求21或22的一種或多種載體。
29.篩選用于治療和/或預防與Th2細胞因子相關(guān)的變態(tài)反應疾病的藥物的方法，其中方法包括如下步驟a)在允許野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物結(jié)合的條件下，將野生型GATA3蛋白或具有與HSS2序列結(jié)合的能力的GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其包含HSS2序列的衍生物一起孵育，有或者沒有測試化合物存在；b)檢測野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物的結(jié)合；和c)鑒定能抑制所述結(jié)合的測試化合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中該方法還包括下列步驟d)在允許野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物結(jié)合的條件下，將野生型GATA3蛋白或具有與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列結(jié)合的能力的GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其包含所述基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域中的GATA3結(jié)合序列的衍生物一起孵育，有或者沒有測試化合物存在；e)檢測野生型GATA3蛋白或GATA3突變蛋白與雙鏈DNA或其衍生物的結(jié)合；和f)鑒定測試化合物，與步驟b)中的結(jié)合相比，該化合物在較低水平抑制步驟e)的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明通過抑制GATA3蛋白與Th2細胞因子基因簇中低親和力GATA3結(jié)合序列的結(jié)合，并因此抑制Th2細胞因子穩(wěn)定且充分表達所需要的染色質(zhì)重構(gòu)，提供了能特異性抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生的GATA3誘騙物和GATA3突變蛋白，以及包含它們的藥物組合物。
文檔編號C07K14/47GK1662262SQ03814859
公開日2005年8月31日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月24日
發(fā)明者新井賢一, 官武昌一郎, 竹本直史 申請人:株式會社金科生物醫(yī)學研究所