專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的提取方法，特別是從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法。
背景技術(shù)：
過(guò)氧化物酶是廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的一類(lèi)氧化酶，催化由過(guò)氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng)。植物過(guò)氧化物酶的研究可追溯到1809年用愈創(chuàng)樹(shù)脂為底物進(jìn)行的顏色反應(yīng)。但直到一個(gè)世紀(jì)之后才開(kāi)展此酶的分離和命名。已知的催化反應(yīng)底物超過(guò)200種，以及多種過(guò)氧化物和輔助因子。迄今被研究最深入的應(yīng)首推辣根過(guò)氧化物酶。早在1940年，Thorell即用電泳方法從部分純化的辣根組織中區(qū)分出2種不同的辣根過(guò)氧化物酶，之后此酶在植物正常和應(yīng)激反應(yīng)代謝中發(fā)揮重要作用而受到廣泛關(guān)注，并對(duì)此酶進(jìn)行了大量研究，涉及酶的種類(lèi)、等電點(diǎn)、氨基酸組成和序列、生理功能，以及基因表達(dá)和調(diào)控的分子機(jī)制等(Fujiyama等1988，Siegel等1993，Van Huyster等1987，Obinger等1996)。迄今此酶作為一種商品化試劑也廣泛用于免疫組織化學(xué)、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)反應(yīng)和免疫印跡等生物學(xué)研究，并成為重要的診斷試劑。
過(guò)氧化物酶在果實(shí)采后中的生理作用一般認(rèn)為是不斷清除細(xì)胞中產(chǎn)生的自由基和活性氧，減少膜脂過(guò)氧化，延緩衰老(陳新平等1994)。有研究認(rèn)為，采后貯藏過(guò)程中，過(guò)氧化物酶活性是上升的(韓冬梅等2002，許秀淡等1998，陳向明2001，孫秀蘭等2001，陳志宏等1997)，也有研究認(rèn)為采后貯藏過(guò)程中，過(guò)氧化物酶活性是下降的(葉茂宗等1997，陳彥等2002)，還有的研究認(rèn)為采后貯藏過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，伴隨著果實(shí)的衰老先上升然后下降(陳蔚輝等2000，寇曉虹等2000a，寇曉虹等2000b，文澤富等1998，檀建新等1997，田世平等2001，潘東明等1998 2001，宋虎衛(wèi)2001)。
過(guò)氧化物酶可作為果蔬成熟衰老的生理指標(biāo)，果實(shí)成熟和衰老則過(guò)氧化物酶的活性降低。過(guò)氧化物酶在果實(shí)成熟中的作用也因物種而異。因此，提取和純化過(guò)氧化物酶很有意義。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶，為利用生物技術(shù)培育耐貯藏的龍眼品種提供試驗(yàn)制劑。
本發(fā)明以龍眼果皮為原料，經(jīng)液氮處理3～5min，-20℃保存?zhèn)溆茫痪唧w提取方法經(jīng)粗酶抽提、(NH4)2SO4鹽析后，再由以下步驟完成1、Sephadex G-25 Medium柱脫鹽，以0.01M pH8.0 Tris-HCl洗脫，流速為2-6ml/min；2、DE-52柱層析，以0～0.3M NaCl梯度洗脫，流速為0.5-2ml/min；3、羥基磷灰石high resolution柱層析，以0.01M pH7.0磷酸緩沖液洗脫，流速為0.2-0.6ml/min；4、Sephacryl S-200 HR柱層析，以0.05M pH7.0磷酸緩沖液洗脫，流速為0.25-0.6ml/min。


附圖為過(guò)氧化物酶經(jīng)Sephacryl S-200 HR柱層析后的電泳檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例為充分公開(kāi)本發(fā)明的一種從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例加以說(shuō)明。
(1)選取無(wú)病蟲(chóng)害的龍眼果皮，洗凈，經(jīng)液氮處理后按照果皮質(zhì)量Tris-HCl緩沖液體積為1∶6加入4℃的0.1M pH7.0 Tris-HCl緩沖液；按照Trtiton X-100體積Tris-HCl緩沖液體積為1∶1000加入TrtitonX-100；再加入占果皮質(zhì)量15％的聚乙烯聚吡咯烷酮，勻漿；再用四層紗布過(guò)濾，19000×g 4℃離心20min，此時(shí)的上清液取名為上清液A(以下類(lèi)推)，棄去沉淀，獲得上清液A即為粗酶液；(2)在上清液A中加入(NH4)2SO4粉末，0℃條件下邊加邊攪拌至30％飽和度，攪拌0.5h后，19000×g 4℃離心20min，棄去沉淀，獲得上清液B；(3)在上清液B中加入(NH4)2SO4粉末，0℃條件下邊加邊攪拌至80％飽和度，攪拌1h，20000×g 4℃離心20min，棄去上清，獲得沉淀物A；(4)將沉淀物A用0.05M pH8.0 Tris-HCl懸浮，15000×g 4℃離心10min，棄沉淀，獲得上清液C；
(5)將上清液C上Sephadex G-25 Medium柱，用0.01M pH8.0Tris-HCl以流速3ml/min洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液A；(6)將洗脫液A上DE-52柱，以0～0.3M NaCl梯度洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液B；(7)將洗脫液B用PEG20000濃縮，獲得洗脫液C，再用0.01M pH7.0磷酸緩沖液透析，獲得洗脫液D；(8)將羥基磷灰石high resolution柱，以0.01M pH7.0磷酸緩沖液平衡，再將洗脫液D上羥基磷灰石high resolution柱層析，流速為0.5ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液E；(9)將洗脫液E用PEG20000濃縮，獲得洗脫液F，再用0.05M pH7.0磷酸緩沖液透析，獲得洗脫液G；將Sephacryl S-200 HR柱以0.05MpH7.0磷酸緩沖液平衡，再將洗脫液G上Sephacryl S-200 HR柱層析，流速為0.5ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液H；(10)超濾濃縮洗脫液H，即可獲得龍眼過(guò)氧化物酶的純酶。
(11)活性檢測(cè)，其反應(yīng)混合液由50ml 0.2M PBS(pH6.0)加H2O2(34％)0.028ml再加愈創(chuàng)木酚0.019ml混合而成；測(cè)定時(shí)取10μL酶液加反應(yīng)混合液3ml混勻，反應(yīng)5分鐘，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)470nm時(shí)的吸光值變化以表示過(guò)氧化物酶活性。
(12)電泳檢測(cè)，如附圖所示，P為酶染、Q為銀鹽染色、M為NativeMarker。銀鹽染色(附圖中Q)顯示，經(jīng)Sephacryl S-200 HR柱層析后得到的過(guò)氧化物酶酶活組分中，含有4種不同分子量的蛋白質(zhì)。而酶染(附圖中P)的結(jié)果也表明，其中含有4條酶帶，并且其遷移率與銀鹽染色(附圖中Q)顯示的4個(gè)組分的遷移率完全一致。說(shuō)明經(jīng)Sephacryl S-200HR柱層析后分離得到的過(guò)氧化物酶中已沒(méi)有其他雜蛋白組分存在。
本發(fā)明的一種從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法，具有取材方便、方法簡(jiǎn)單、成本低且酶的活性高等優(yōu)點(diǎn)，可以獲得高純度的過(guò)氧化物酶。另外，以罐頭廠生產(chǎn)龍眼罐頭廢棄的果皮為原料，不僅更降低了提取過(guò)氧化物酶的成本，而且還減少了廢果皮造成的環(huán)境污染。
權(quán)利要求
1.一種從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法，其特征在于由以下方法組成(1)選取無(wú)病蟲(chóng)害的龍眼果皮，洗凈，經(jīng)液氮處理后按照果皮質(zhì)量Tris-HCl緩沖液體積為1∶6加入4℃的0.1M pH7.0 Tris-HCl緩沖液；按照Trtiton X-100體積Tris-HCl緩沖液體積為1∶1000加入Trtiton X-100；再加入占果皮質(zhì)量15％的聚乙烯聚吡咯烷酮，勻漿；再用四層紗布過(guò)濾，19000×g 4℃離心20min，棄去沉淀，獲得上清液A；(2)在上清液A中加入(NH4)2SO4粉末，0℃條件下邊加邊攪拌至30％飽和度，攪拌0.5h后，19000×g 4℃離心20min，棄去沉淀，獲得上清液B；(3)在上清液B中加入(NH4)2SO4粉末，0℃條件下邊加邊攪拌至80％飽和度，攪拌1h，20000×g 4℃離心20min，棄去上清，獲得沉淀物A；(4)將沉淀物A用0.05M pH8.0 Tris-HCl懸浮，15000×g 4℃離心10min，棄沉淀，獲得上清液C；(5)將上清液C上Sephadex G-25 Medium柱，用0.01M pH8.0 Tris-HCl以流速為2-6ml/min洗脫，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液A；(6)將洗脫液A上DE-52柱，以0～0.3M NaCl梯度洗脫，流速為0.5-2ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液B；(7)將洗脫液B用PEG20000濃縮，獲得洗脫液C，再用0.01M pH7.0磷酸緩沖液透析，獲得洗脫液D；(8)將羥基磷灰石high resolution柱，以0.01M pH 7.0磷酸緩沖液平衡，再將洗脫液D上羥基磷灰石high resolution柱層析，流速為0.2-0.6ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液E；(9)將洗脫液E用PEG20000濃縮，獲得洗脫液F，再用0.05M pH7.0磷酸緩沖液透析，獲得洗脫液G；將Sephacryl S-200 HR柱以0.05M pH7.0磷酸緩沖液平衡，再將洗脫液G上Sephacryl S-200 HR柱層析，流速為0.25-0.6ml/min，收集洗脫液，檢測(cè)并合并有酶活性的洗脫液，獲得洗脫液H；(10)超濾濃縮洗脫液H。
全文摘要
一種從龍眼果皮中提取過(guò)氧化物酶方法，包括粗酶液的提取、(NH
文檔編號(hào)C07K1/00GK1488752SQ0315780
公開(kāi)日2004年4月14日 申請(qǐng)日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者潘東明, 林琳, 郭志雄 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)