專利名稱：Dna抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，尤其涉及一種利用DNA作為抗體的技術(shù)。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)的技術(shù)關(guān)鍵是制備特異性強(qiáng)、親合力大、效價(jià)高的結(jié)合特異性抗原的抗體。由于每種抗原都有幾個(gè)抗原決定族，由它免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體是針對(duì)多種抗原決定族產(chǎn)生的多個(gè)抗體，稱為多克隆抗體。單克隆抗體則在此動(dòng)物免疫基礎(chǔ)上，由該免疫動(dòng)物的單個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合所形成的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，是針對(duì)單個(gè)抗原決定族的，所以它的免疫球蛋白屬同一類別，質(zhì)地純一，因此特異性強(qiáng)，親和性一致。多克隆抗體則省去了單克隆抗體制作中的后期大部分工作，在免疫動(dòng)物后直接取血清純化即為多抗，但所得抗體混雜，交叉反應(yīng)多，且每次制備時(shí)都需大量抗原免疫動(dòng)物，耗時(shí)耗錢，無論是特異性、親和性都比單抗差許多，故多抗逐漸為單抗取代。
雜交瘤技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)在于它的兩大基本特點(diǎn)，第一、由分離的克隆產(chǎn)生的單克隆抗體是一種十分明確的化學(xué)制品而不是一種可隨每個(gè)免疫動(dòng)物，甚至隨替同一動(dòng)物的不同次采血而變化的不明確的非同質(zhì)混合物。永久培養(yǎng)可無限制地提供化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同的單克隆抗體。第二，雜交瘤技術(shù)是用不純抗原制備純抗體的理想方法。
雜交瘤-單克隆抗體技術(shù)和DNA重組技術(shù)所取得的成就促進(jìn)了基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，最初出現(xiàn)的基因工程抗體是八十年代初報(bào)道的人鼠嵌合抗體(chimeric antibody)，隨后出現(xiàn)人改型抗體(reshaped human antibody)、小分子抗體、抗體融合蛋白等在基因水平經(jīng)過改造的單克隆抗體。從八十年代未期進(jìn)入九十年代初期，在(1)大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段(2)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因以及(3)通過噬菌體表面表達(dá)系統(tǒng)(phage display〕進(jìn)行高效篩選等技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上建立了抗體庫技術(shù)，可通過基因工程手段在原核細(xì)胞體系直接克隆到特異性抗體的基因并生產(chǎn)該特異抗體。這一革命性的進(jìn)展對(duì)抗體的制備、改造及新型抗體的開發(fā)帶來了深刻的影響，標(biāo)志著抗體技術(shù)經(jīng)歷了第一代抗體——血清多克隆抗體，第二代抗體——單克隆抗體，發(fā)展到了第三代抗體--基因工程抗體。
基因工程抗體技術(shù)包括兩部分內(nèi)容；-是用DNA重組技術(shù)對(duì)已有的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括鼠單克隆抗體的人源化、小分子抗體及抗體融合蛋白的制備。二是用抗體庫技術(shù)篩選、克隆新的單克隆抗體。由于基因工程抗體技術(shù)尚處于發(fā)展階段。探索性較強(qiáng)，許多技術(shù)沒成熟規(guī)范化的操作程序，不同的實(shí)驗(yàn)室往往采用不同的技術(shù)方法。
真正以基因工程的方式制備抗體，始于1989年底英國(guó)劍橋winter小組與scrips研究所lerner小組創(chuàng)造性的工作。他們采用PCR方法克隆機(jī)體全部的抗體基因并重組于原核表達(dá)裁體，以標(biāo)記抗原即可篩選到相應(yīng)抗體，當(dāng)時(shí)稱為組合抗體庫技術(shù)。90年代初期，這一技術(shù)有了進(jìn)-步的發(fā)展，即將抗體基因(vH或Fd)與單鏈?zhǔn)删w的外殼蛋白融合并表達(dá)于噬菌體表面，以固相的抗原吸附相對(duì)應(yīng)的噬茵體抗體，經(jīng)多次“吸附-洗脫-擴(kuò)增”即可獲得所需抗體。這是抗體產(chǎn)生的又-次重大技術(shù)革命。首先該技術(shù)將抗體的基因型及表型密切連系起來。表達(dá)的噬菌體抗體(亦可為分泌型)可供功能檢測(cè)，擴(kuò)增噬菌體并抽提DNA即可獲得相應(yīng)抗體基因，便于測(cè)序或進(jìn)一步的基因操作。其次該技術(shù)容量大，效率高，一般建庫可達(dá)108，基本包容了抗體多樣性的信息。第三，“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程將抗體的選擇與再次擴(kuò)增有機(jī)地結(jié)合起來，每輪操作可使特異性抗體富集102-103倍。噬茵體抗體庫技術(shù)不僅擺脫了細(xì)胞融合等繁雜的操作，而且可不經(jīng)免疫劑備抗體，為制備人源抗體開辟了新途徑，這一點(diǎn)已為實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
以上所用的抗體都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即都是蛋白質(zhì)，不管是多克隆抗體、單克隆抗體還是基因工程抗體，其基本原理都是一致的即利用重輕鏈可變區(qū)與抗原表位的相對(duì)特異性結(jié)合，通過小鼠體內(nèi)篩選富集特異性抗體產(chǎn)生細(xì)胞或體外構(gòu)建工程抗體文庫并高效篩選生產(chǎn)特異性抗體的克隆的技術(shù)來制作各種特異抗體。
但是多抗、單抗和基因工程抗體其作為蛋白質(zhì)的本質(zhì)決定了其固有的缺點(diǎn)，因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)水平上的各種操作如表達(dá)、分離、純化以及診斷都需要較長(zhǎng)的周期、繁雜的程序和較高的成本，以下以單克隆抗體和基因工程抗體來說明1、周期長(zhǎng)單克隆抗體制作中動(dòng)物的免疫周期至少一月以上，融合與篩選鑒定加上細(xì)胞克隆化至少需一月，再加上腹水制備以及抗原抗體純化等如能在三月內(nèi)制備一個(gè)足夠高特異和靈敏的單抗的話，已經(jīng)是很順利了。基因工程抗體雖然周期相對(duì)單克隆抗體較短，但也需一月以上，且前提是足夠多樣化〔＞109〕的工程抗體庫構(gòu)建已成功，只需用特異抗原來篩選特異抗體?？贵w庫的構(gòu)建繁雜，至少一個(gè)月。但基因工程抗體的特異性和親和力都不如單抗。
2、程序冗長(zhǎng)、制備成本高單抗制備中的所需操作冗長(zhǎng)繁多，如動(dòng)物免疫中的抗原制備和純化、動(dòng)物房準(zhǔn)備和動(dòng)物飼養(yǎng)都有一定要求，定期取血檢測(cè)血清抗體效價(jià)；融合方案中骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備、細(xì)胞的融合和篩選、雜交細(xì)胞的克隆化、陽性克隆的篩選和維持、特異性和效價(jià)的鑒定、腹水的制備和抗體的純化等，可見一個(gè)單抗的制備需多少操作，其中所需的細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白純化等所需的試劑價(jià)格高昂，加上時(shí)間長(zhǎng)，成本自然就高。基因工程抗體抗體庫構(gòu)建繁雜，而且要建立一個(gè)多樣化庫〔＞109〕能夠真正代表脾細(xì)胞中數(shù)以億萬計(jì)的變化多端的抗體，確實(shí)是一個(gè)難題；再加上要從如許之多的抗體中篩選到少數(shù)幾個(gè)特異抗體，并且還要求特異性和親和性都高，以及抗原抗體的純化，這一切依然使其代價(jià)高昂，操作冗雜。單克隆抗體的其他不足1〕對(duì)免疫原性差的抗原很難得到特異抗體或雜交瘤細(xì)胞；針對(duì)免疫原性差的抗原唯一途徑是增加有用的抗體形成細(xì)胞數(shù)，可用改進(jìn)免疫方案或改造抗原以提高其免疫原件。但這些手段頗復(fù)雜，因還不完全清楚抗體形成細(xì)胞或其前體是否能形成好的雜交細(xì)胞。現(xiàn)有的資料提示，克服弱免疫原性的唯一途徑是聯(lián)合技術(shù)，即要有足夠的適宜B細(xì)胞，然后令其與骨髓瘤親代細(xì)胞融合，研究者采用此方法將B細(xì)胞數(shù)濃集5-10倍，其優(yōu)越性是減少了篩選量。但這樣改進(jìn)還不足以達(dá)到常規(guī)地獲得抗弱免疫原雜交瘤。濃集技術(shù)的實(shí)用價(jià)值得進(jìn)一步研究。
2〕生產(chǎn)小鼠和大鼠以外品系動(dòng)物，特別是家免和人的單克隆抗體存在的因難。
3〕目前尚無成功的人源化單克隆抗體，故不易用于藥物。基因工程抗體技術(shù)的不足1〕抗體庫的多樣化要求高〔＞109〕，構(gòu)建繁雜，構(gòu)建成本很高。
2〕作為蛋白抗體，仍然存在生產(chǎn)純化中的一系列問題，以及蛋白分子素有的免疫原性等問題，而且基因工程抗體在原核細(xì)胞表達(dá)模擬親本抗體結(jié)構(gòu)與功能，畢竟不如親本抗體的親和力和特異性。
3〕篩選困難，由一個(gè)未經(jīng)免疫的初級(jí)抗體庫中篩選出理想的抗體肯定不是一件輕松的事情，對(duì)許多抗原都無法篩選出理想的抗體。
4〕在靶藥物篩選應(yīng)用中，雖然人源化工程抗體可避免其免疫原性，但是抗體純度要求很高，且該人源化工程抗體庫不易構(gòu)建和篩選。

發(fā)明內(nèi)容
由此可見，作為蛋白質(zhì)的抗體所固有的矛盾是無法解決的，本發(fā)明創(chuàng)造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結(jié)合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決蛋白診斷中由于抗原的千變?nèi)f化總是缺乏相應(yīng)抗體以及抗體作為蛋白質(zhì)不易研發(fā)、篩選、生產(chǎn)、純化與保存引起的成本高、周期長(zhǎng)等一系列問題。
在研究DNA與蛋白的相互作用中，發(fā)現(xiàn)DNA與蛋白及其他大分子之間普遍存在著特異性的結(jié)合與互作，創(chuàng)造性的提出了DNA抗體的概念，意圖解決蛋白質(zhì)抗體中存在的固有問題，創(chuàng)造出了三種DNA抗體文庫構(gòu)建以及其高效篩選方法，以最終獲得DNA抗體。
上述的DNA抗體，按照以下步驟制備1)三種DNA多樣化工程抗體庫的構(gòu)建；2)DNA抗體庫的篩選；3)DNA抗體的標(biāo)記與擴(kuò)增。
本發(fā)明創(chuàng)造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結(jié)合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決以往蛋白抗體所固有的缺陷，以及由于抗原的多樣性總是缺乏相應(yīng)抗體以及抗體作為蛋白質(zhì)不易研發(fā)、篩選、生產(chǎn)、純化與保存引起的成本高、周期長(zhǎng)等一系列問題，因?yàn)樵诘鞍捉M學(xué)和基因功能研究以及各種免疫學(xué)科研實(shí)踐中，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生許多各種各樣的抗原需要臨時(shí)得到相應(yīng)特異性抗體，而無論是單克隆抗體還是基因工程抗體的制作周期相當(dāng)長(zhǎng)，生產(chǎn)純化過程繁多，成本很高，大大限制了科研開發(fā)工作的進(jìn)度和質(zhì)量，從這種意義上講，DNA抗體的制作周期短，成本低，生產(chǎn)出來后，客戶甚至可以自己生產(chǎn)擴(kuò)增，故將大大促進(jìn)當(dāng)今世界基因功能組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。
而且由于蛋白質(zhì)抗體分子量過大，免疫原性強(qiáng)，所以不易進(jìn)入細(xì)胞，且不易用于靶藥物；而DNA抗體分子小，免疫原性低，易穿透組織，恰好解決了這些缺點(diǎn)。
而且DNA抗體在保證其一定的特異性和親和性的前提下，其各式各樣的抗體庫非常容易構(gòu)建，且其篩選簡(jiǎn)單易行，因?yàn)楹Y選是通過結(jié)合——洗脫—-PCR富集過程進(jìn)行的，周期很短，而且DNA抗體的保存與復(fù)制擴(kuò)增更加簡(jiǎn)單，成本相當(dāng)?shù)土?；加上其易?biāo)記，分子小，經(jīng)過進(jìn)一步的優(yōu)化，更可以提高其特異性和靈敏性；其小分子還可以避免免疫原性，成為抗體與核酸藥物的首選靶藥物。
最主要的是，通過DNA抗體，可以把對(duì)蛋白質(zhì)的診斷和分析，轉(zhuǎn)移到對(duì)DNA的診斷和分析上來，從而為蛋白質(zhì)組學(xué)帶來一個(gè)嶄新的技術(shù)平臺(tái)。譬如把對(duì)蛋白水平上的消減雜交轉(zhuǎn)移到基因水平上的消減雜交?？梢哉f，DNA抗體將會(huì)為蛋白質(zhì)的診斷打開一個(gè)全新的局面，其應(yīng)用意義和前景是現(xiàn)在所無法預(yù)估的。三種抗體的優(yōu)劣性比較



具體實(shí)施例方式
一、DNA抗體技術(shù)的基本原理針對(duì)各種核酸尤其是DNA的單克隆抗體的產(chǎn)生，暗示對(duì)于不同構(gòu)象和序列的單鏈或雙鏈DNA，都有一個(gè)特異性結(jié)合的具不同構(gòu)象和序列的抗體多變區(qū)或抗原結(jié)合位點(diǎn)的存在，反過來，這一切意味著對(duì)于各種不同蛋白的抗原表位，都應(yīng)有一種可特異結(jié)合它的DNA單鏈或雙鏈DNA序列的存在。對(duì)核酸和蛋白相互作用的廣泛研究表明，體內(nèi)存在各式各樣與DNA特異性相互作用的蛋白和酶，以及RNA對(duì)蛋白和酶的特異調(diào)控?zé)o不顯示了核酸序列和蛋白間的特異性相互作用的普遍存在。一般而言，DNA與蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別在于堿基和氨基酸的氫鍵、靜電荷力、序列骨架構(gòu)象之間的吻合、范德華力等的綜合作用。研究顯示，蛋白DNA結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸突變會(huì)使這種特異性結(jié)合降低三個(gè)數(shù)量級(jí)。
DNA抗體技術(shù)基本上由三部分組成三種DNA多樣化工程抗體庫的構(gòu)建；DNA抗體庫的篩選；DNA抗體的標(biāo)記與擴(kuò)增。二、DNA抗體具體技術(shù)路線1〕三種多樣化隨機(jī)DNA序列工程抗體庫〔雙鏈DNA隨機(jī)序列庫、單鏈DNA隨機(jī)序列庫、雜化雙鏈DNA隨機(jī)序列庫〕的構(gòu)建DNA序列庫的多樣化是高效篩選出特異抗體的前提，故其DNA抗體庫的構(gòu)建是很重要的。通過構(gòu)建雙鏈DNA隨機(jī)序列庫、單鏈DNA隨機(jī)序列庫、雜化雙鏈DNA隨機(jī)序列庫來達(dá)到構(gòu)建足夠量的多樣化隨機(jī)DNA序列的目的。對(duì)于雜環(huán)雙鏈DNA，由于柄環(huán)狀結(jié)構(gòu)〔Stem-loop structure〕可穩(wěn)定該分子結(jié)構(gòu)并暴露可變序列，從而增加親和性和抗體的穩(wěn)定性。而多價(jià)抗體比單價(jià)抗體更具親和力。先篩選出多個(gè)單價(jià)抗體，再試圖通過一序列聯(lián)起來形成雙價(jià)或多價(jià)抗體，兩單價(jià)抗體較靈活的連接在一起?？紤]到其分子體積小，故抗原構(gòu)象可能對(duì)單價(jià)抗體無多大影響，但對(duì)雙價(jià)抗體應(yīng)有影響。
設(shè)計(jì)隨機(jī)序列5’-ggggggggggggatccaac-N59-CTGCAGGTCGACGCAT-3’及兩端帶特定引物(F1)ggggggggggggatccac和(R1)atgcgtcgacctgcag以供克?。豢蒔CR擴(kuò)增克隆到T載體文庫構(gòu)建得到隨機(jī)序列代表庫以保存?zhèn)溆谩?br> 用兩端引物F1和R1擴(kuò)增12個(gè)循環(huán)，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，即可得到雙鏈DNA隨機(jī)序列庫；以雙鏈DNA隨機(jī)序列庫為模板再用其中一條引物如F1引物做不平橫PCR擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，通過8％的PAGE膠分離純化，就可得到單鏈DNA隨機(jī)序列庫；以此單鏈DNA隨機(jī)序列庫為模板，在其3末端加oligo(dC)，75度中放10分鐘以去除單鏈DNA構(gòu)象，并滅活末端轉(zhuǎn)移酶，在4度重新退火形成雜化雙鏈，通過8％的PAGE膠純化可分別得到雜化雙鏈隨機(jī)DNA序列、單鏈隨機(jī)DNA序列庫。
為便于在篩選過程中高效富集具特異性結(jié)合抗原活性的雜化雙鏈DNA，亦可采用另一種構(gòu)建雜化雙鏈DNA隨機(jī)序列庫的方案，即在同一條DNA單鏈上自身折疊形成柄環(huán)狀雜化雙鏈結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)隨機(jī)序列5’-ggggggggggggggggatccaac-N50-cccccccccccccggggggggggggg -N50-CTGCAGGTCGACGCAT-3’，其中cccccccccccccggggggggggggg序列有利于雜化雙鏈構(gòu)象的形成，即由該序列連接其兩邊隨機(jī)DNA序列并折疊而成。同樣通過PCR富集，然后不平橫PCR并跑膠純化雜化雙鏈帶。
2〕多樣化隨機(jī)DNA序列抗體庫的篩選特異性抗原的準(zhǔn)備將已純化好的抗原如在(100mM PIPES pH6.9，1mMEGTA，0.5mM MgSO4；100uL)溶液中包被在15個(gè)微孔板〔用于蛋白包被，購于Corning公司〕中過夜，另15個(gè)微孔板用以包被BSA或脫脂奶粉用于預(yù)雜交，一共以備15輪篩選之用，每孔約1-10ug。用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗去多余的抗原，用3％BSA或5％的脫脂奶粉在PBS中封閉微孔板30分鐘，用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗三次，用篩選緩沖液(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，5mM MgSO4，100mM NaCl〕洗一次。
預(yù)雜交用以上準(zhǔn)備好的三種DNA隨機(jī)序列庫10ug在包被BSA或脫脂奶粉的微孔板中預(yù)雜交在篩選緩沖液中結(jié)合30分鐘。
雜交結(jié)合取已預(yù)雜交好的DNA隨機(jī)序列，轉(zhuǎn)移至包被好特異性抗原的微孔板中在篩選緩沖液中雜交，4℃，30分鐘。
清洗用篩選緩沖液洗去非特異未結(jié)合的隨機(jī)DNA序列，洗三次，每次30分鐘。
注意對(duì)不同的的抗原，應(yīng)摸索其最佳的結(jié)合雜交與清洗條件。
3〕特異性DNA抗體的洗脫與PCR富集用等體積苯酚抽提獲取DNA，離心后吸取上清〔DNA部分〕，用乙醇和乙酸鈉沉淀DNA，以此DNA為模板，先用F1和R1引物PCR擴(kuò)增富集雙鏈DNA，然后以其為模板不平橫PCR擴(kuò)增單鏈DNA序列，用此單鏈DNA序列為模板在其末端加oligo-dC，75度去除構(gòu)象、4度復(fù)性，以上皆跑PAGE膠純化相應(yīng)富集了的雙鏈DNA、單鏈DNA序列、雜化雙鏈DNA序列。其PCR與不平橫PCR反應(yīng)體系同。
4〕如上重復(fù)預(yù)雜交—雜交—清洗—洗脫-PCR富集的過程達(dá)15輪，最后得到三種特異性結(jié)合抗原的DNA序列〔單鏈DNA序列、雙鏈DNA、雜化雙鏈DNA序列〕。
5〕特異性DNA抗體的測(cè)序、保存與擴(kuò)增一邊構(gòu)建PCR-T克隆挑10個(gè)測(cè)序，選取看看哪種序列最多的幾個(gè)克隆，一邊直接送測(cè)序選取最高峰者作為DNA序列，如峰高明顯、背景較低，意味著該DNA抗體較特異、相對(duì)其他DNA隨機(jī)序列親和力較高。所得的克隆或DNA序列可用來作為模板保存，以備直接用來制備并標(biāo)記DNA抗體。
有時(shí)候需要幾種DNA抗體的混合物，它們互相結(jié)合成的一種構(gòu)象才能高效特異穩(wěn)定結(jié)合抗原分子，故一般以篩選出來的序列作為模板直接進(jìn)行擴(kuò)增而無需分離出個(gè)別的序列；對(duì)于該特異序列混合物的保持，可利用結(jié)合在固相上的引物合成固定的模板，從而可以反復(fù)使用，又不會(huì)顯著改變?cè)璂NA隨機(jī)序列的組成比例。當(dāng)然，可以進(jìn)一步篩選出單純的幾種序列，通過測(cè)序確定其最終組成。
6〕DNA抗體的標(biāo)記和生產(chǎn)用以上篩選出來的特異性DNA序列為模板，以帶標(biāo)記〔如地高辛、生物素、放射性元素如P32〕引物PCR擴(kuò)增已篩選出來的特異性DNA序列，通過PAGE膠純化制備出相應(yīng)的三種DNA抗體。如用地高辛或生物素標(biāo)記，用二抗擴(kuò)大信號(hào)也可?；蛑苯佑媚z體金、放射性元素或其他可直接顯色或熒光激發(fā)標(biāo)記〔注意用來標(biāo)記的分子要盡可能小〕。
7〕DNA抗體特異性鑒定選取血清和類似抗原作對(duì)照，比較該特異DNA抗體對(duì)特異抗原及非特異抗原之間交叉反應(yīng)的程度。方法可用ELISA、IFA法等。
8〕DNA抗體親和力鑒定親和力表示抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，以親和常數(shù)表示。方法可用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)等。
9〕DNA抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)序列的鑒定利用光化學(xué)交聯(lián)、蛋白酶切以及氨基酸測(cè)序來確定與該DNA抗體特異結(jié)合的抗原表位序列。
將抗原與DNA抗體混合在TE溶液中〔選用不同濃度NaCl〕，在冰上孵育20分鐘，以0.25ml轉(zhuǎn)移至硅化玻璃板上，在15瓦的滅菌紫外燈下〔距離8cm〕照射20分鐘，紫外照射可導(dǎo)致特異性結(jié)合的復(fù)合物中分子間的交聯(lián)，因此可增強(qiáng)DNA抗體的親和力和特異性。加TCA至終濃度10％，離心把蛋白抗原和DNA抗體的交聯(lián)復(fù)合物和其余蛋白抗原沉淀下來，其余未結(jié)合DNA部分不會(huì)沉淀下去。用10％TCA洗一次，用預(yù)冷丙酮洗三次，空氣干燥。加8M尿素0.2ml至沉淀，用超聲儀溶解沉淀〔每次超聲10秒，最大功率，三次〕，待溶解后，繼續(xù)加NH4HCO3至終濃度2M尿素、0.1MNH4HCO3。按1∶25〔胰酶∶蛋白抗體復(fù)合物〕的質(zhì)量比加入胰酶，37＂C，消化24小時(shí)。消化產(chǎn)物過離子交換柱，選取放射性最高的部分〔即DNA抗體特異結(jié)合的抗原表位肽段或氨基酸序列〕去測(cè)序〔注意該DNA抗體用放射元素P32標(biāo)記〕。
10〕DNA抗體親和性和特異性及檢測(cè)靈敏度的提高a、通過增加篩選輪數(shù)從三種DNA隨機(jī)抗體庫中篩選出幾種特異性和親和性較高的抗體，由于每種DNA抗體所特異識(shí)別的是不同的抗原表位，可以聯(lián)合應(yīng)用來提高特異性。如要提高DNA抗體的檢測(cè)靈敏度，可用P32標(biāo)記該抗體。
b、每一種抗原的DNA抗體的產(chǎn)生，都必需同時(shí)給出一個(gè)最佳的結(jié)合和清洗條件，以提高該DNA抗體對(duì)特異抗原的特異性和親和力，并降低非特異性背景。
c、可用紫外交聯(lián)與蛋白酶切來確定該DNA抗體結(jié)合位點(diǎn)是否該抗原的特異性非保守序列，并且可以通過測(cè)序直接分析其結(jié)合的抗原表位的氨基酸序列。
d、可改變一系列條件以加大DNA抗體的濃度，從而加強(qiáng)DNA抗體與該抗原的親和力，應(yīng)可以降低該抗原的最低檢測(cè)濃度。
e、可用紫外照射使特異性結(jié)合的DNA抗體與抗原之間產(chǎn)生交聯(lián)，SDS與鹽洗滌去非特異結(jié)合的DNA抗體，并且用標(biāo)記引物原位PCR富集顯色來進(jìn)一步提高該DNA抗體檢測(cè)的靈敏度和特異性。
f、通過把單價(jià)抗體改造成多價(jià)抗體，應(yīng)可成倍增加抗體親和力和特異性。
g、重新構(gòu)建DNA抗體文庫，如換用另一種DNA抗體文庫，增加隨機(jī)序列的長(zhǎng)度等。
h、柄環(huán)結(jié)構(gòu)與多價(jià)DNA抗體可提高其DNA單價(jià)抗體的親和性和特異性，雜化雙鏈的柄環(huán)結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定并適當(dāng)調(diào)節(jié)DNA抗體中抗原結(jié)合部位的構(gòu)象，從而更好的和抗原特異結(jié)合；而通過把多個(gè)單價(jià)DNA抗體聯(lián)結(jié)成多價(jià)抗體，都會(huì)成倍增加DNA抗體的親和性和特異性。
i、對(duì)于雜化雙鏈DNA序列抗體庫，中間的GC序列可試用AT序列。四、應(yīng)用該DNA抗體技術(shù)可廣泛應(yīng)用于免疫印記、免疫組化、蛋白水平上的特異性基因調(diào)控、蛋白追蹤、抗體靶藥物篩選、親和層析、蛋白消減雜交等免疫學(xué)領(lǐng)域。
在免疫印記、免疫組化、蛋白水平上的特異性基因調(diào)控與蛋白追蹤、抗體靶藥物篩選的領(lǐng)域的應(yīng)用，該DNA抗體的使用基本類似一般的抗體的使用方法。由于DNA的容易獲得，無論在時(shí)間上，還是在成本上，以上應(yīng)用都被大大簡(jiǎn)化了。如親和層析，如用蛋白抗體來作親和柱，其價(jià)格之高，有目共睹，而且如要自己做親和柱，從抗體的制備到親和柱子，這是一個(gè)漫長(zhǎng)而又成本很高的過程。
而且DNA抗體同樣可如同其他抗體一樣應(yīng)用于各領(lǐng)域(1)免疫原性組織相容性抗原或分化抗原，(2)分化抗原、腫瘤抗原或其他細(xì)胞表面抗原，這些抗原缺乏多形性，在同種系統(tǒng)中無免疫原性，但在異種免疫中卻可以被識(shí)別。(3〕病毒和細(xì)菌抗原；〔4)各種蛋白質(zhì)、核酸和糖表面的單一抗原決定族。這類抗體使我們能夠鑒定和分離細(xì)胞亞群、區(qū)分細(xì)胞發(fā)育的不同階段、更為精確地進(jìn)行組織分型、提純較小的表面抗原、精細(xì)地鑒定微生物以供診斷和流行病學(xué)研究，以及對(duì)各種生物大分子進(jìn)行更可靠的各種免疫學(xué)分析和診斷。
蛋白消減雜交是一種新的在蛋白水平上系統(tǒng)尋找蛋白表達(dá)差異的方法，由于這些在病理細(xì)胞和正常細(xì)胞間有表達(dá)差異的蛋白之間必然存在某種信號(hào)通路或聯(lián)系，從而為細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)各種復(fù)雜的信號(hào)通路和大分子相互作用提供了直接在蛋白水平上的真實(shí)數(shù)據(jù)。以往研究基因的表達(dá)差異，大部分都是在RNA水平上，由于忽略了其轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯水平和翻譯后水平的變化，故不能真實(shí)的反映其最終在蛋白水平上的變化；至于在蛋白水平上的差異顯示的研究，由于蛋白操作的困難，現(xiàn)在多半是用抗體芯片的方法，只能尋找已知蛋白的表達(dá)差異變化，無法尋找到新的蛋白，而且目前抗體芯片成本極高，其使用要求精密儀器，普通科研院所買不起，并且抗體芯片所含抗體數(shù)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如基因芯片的數(shù)量，并不能真正達(dá)到高通量篩選的目的。而本方法卻通過把在蛋白水平上的表達(dá)差異，通過DNA抗體轉(zhuǎn)移至DNA水平上的差異顯示，從而簡(jiǎn)捷的達(dá)到了開放式的高通量篩選表達(dá)差異蛋白的目的，為蛋白相互關(guān)系的系統(tǒng)研究和基因功能的系統(tǒng)探索提供了一條捷徑，而且該技術(shù)普遍適用于各大中小科研院所及公司。蛋白消減雜交技術(shù)其基本原理是通過DNA隨機(jī)序列抗體庫進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)結(jié)合特異性抗原蛋白分子，如果某蛋白分子有表達(dá)數(shù)量差異，那么其結(jié)合的特異性DNA序列也會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)的數(shù)量變化來，從而把在蛋白水平上的消減雜交轉(zhuǎn)移到對(duì)DNA序列的消減雜交上來。
1〕以上3種DNA隨機(jī)序列庫與經(jīng)過處理固定了的對(duì)照細(xì)胞和靶細(xì)胞〔活體〕〔細(xì)胞數(shù)量以及其他條件盡可能一致〕孵化，在一定條件下該DNA隨機(jī)序列庫將進(jìn)入細(xì)胞并特異性結(jié)合其對(duì)應(yīng)分子，然后洗去未進(jìn)入細(xì)胞序列或非特異結(jié)合細(xì)胞蛋白的DNA抗體。
2〕用苯酚氯仿裂解細(xì)胞并抽提蛋白質(zhì)，取上清〔含DNA序列〕DNA，用真空干燥機(jī)濃縮DNA或酒精沉淀DNA從而得到可反應(yīng)蛋白水平變化的DNA隨機(jī)序列庫。
3〕對(duì)靶細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的隨機(jī)DNA序列庫進(jìn)行消減雜交〔用試劑盒〕后，注意在消減之前加一已標(biāo)記內(nèi)對(duì)照序列以檢測(cè)消減雜交效果；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測(cè)序，選取幾個(gè)到幾十個(gè)克隆，用標(biāo)記引物擴(kuò)增制備相應(yīng)類型的DNA抗體，并用血清檢測(cè)其特異性，去掉非特異結(jié)合血清的DNA序列。
4〕用此DNA抗體在該細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記結(jié)合相應(yīng)蛋白分子并形成復(fù)合物，先用紫外照射數(shù)十分鐘以形成共價(jià)交聯(lián)，然后跑SDS-PAGE膠分離檢測(cè)已標(biāo)記DNA-蛋白復(fù)合物，切下條帶，純化測(cè)序?；蛘呷绶悄さ鞍祝易贤庹丈湫纬山宦?lián)復(fù)合物的效率低下，可溫和裂解，并用相應(yīng)的引物-cellulose進(jìn)行親和層析來分離純化DNA-蛋白復(fù)合物，亦可跑PAGE膠分離純化，測(cè)序獲得蛋白序列。
5〕如是膜蛋白，先用紫外照射交聯(lián)DNA分子和抗原分子，跑SDS-PAGE膠分離純化已標(biāo)記DNA-蛋白復(fù)合物，切下條帶，純化測(cè)序?；蛉缟嫌糜H和層析。五、具體制備實(shí)施例子微管蛋白為抗原篩選其特異性DNA抗體1〕選用單鏈DNA隨機(jī)序列工程抗體庫來進(jìn)行微管蛋白的DNA抗體篩選設(shè)計(jì)隨機(jī)序列5’-ggggggggggggatccaac-N59-CTGCAGGTCGACGCAT-3’及兩端帶特定引物(F1)ggggggggggggatccac和(R1)atgcgtcgacctgcag以供克??；可PCR擴(kuò)增克隆到T載體文庫構(gòu)建得到隨機(jī)序列代表庫以保存?zhèn)溆?。N59指59個(gè)核甘酸組成的隨機(jī)序列。
用兩端引物F1和R1擴(kuò)增12個(gè)循環(huán)，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，即可得到雙鏈DNA隨機(jī)序列庫；以雙鏈DNA隨機(jī)序列庫為模板再用其中一條引物如F1引物做不平橫PCR擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，通過8％的PAGE膠分離純化，就可得到單鏈DNA隨機(jī)序列庫；2〕多樣化隨機(jī)DNA序列工程抗體庫的篩選將已純化好的微管蛋白抗原加在(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，0.5mM MgSO4；100uL)溶液中包被在20個(gè)微孔板〔用于蛋白包被，購于Corning公司〕中過夜，另20個(gè)微孔板用以包被BSA或脫脂奶粉用于預(yù)雜交，一共以備20輪篩選之用，每孔約1-10ug。用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗去多余的抗原，用3％BSA或5％的脫脂奶粉在PBS中封閉微孔板30分鐘，用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗三次，用篩選緩沖液(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，5mM MgSO4，100mM NaCl)洗一次。
預(yù)雜交用以上準(zhǔn)備好的單鏈DNA隨機(jī)序列庫10ug在包被BSA或脫脂奶粉的微孔板中預(yù)雜交，在篩選緩沖液中結(jié)合30分鐘。
雜交結(jié)合取已預(yù)雜交好的DNA隨機(jī)序列，轉(zhuǎn)移至包被好特異性抗原的微孔板中在篩選緩沖液中雜交，4℃，30分鐘。
清洗用篩選緩沖液洗去非特異未結(jié)合的隨機(jī)DNA序列，洗三次，每次30分鐘。
注意對(duì)不同的的抗原，應(yīng)摸索其最佳的結(jié)合雜交與清洗條件。
3〕特異性DNA抗體的洗脫與PCR富集用等體積苯酚抽提獲取DNA，離心后吸取上清〔DNA部分〕，用乙醇和乙酸鈉沉淀DNA，以此DNA為模板，如上先用F1和R1引物PCR擴(kuò)增富集雙鏈DNA，然后以其為模板不平橫PCR擴(kuò)增單鏈DNA序列，跑8％的PAGE膠純化。
4〕如上重復(fù)預(yù)雜交—雜交—清洗—洗脫-PCR富集的過程達(dá)20輪，最后得到特異性結(jié)合抗原的DNA序列。
5〕特異性DNA抗體的測(cè)序
把以上所篩選得到的特異DNA抗體作為模板，以F1和R1來擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物構(gòu)建入T載體，隨機(jī)挑選20個(gè)克隆測(cè)序，作同源性比較。所得的克隆或DNA序列可用來作為模板保存。測(cè)序篩得以下序列〔不含引物序列〕ATGCTCGCGCCTGCTGTGTTGTTGCTTGGTTTGGTCTTTTTTTGGTTTGTTTTGGGTT；GAATTCGTTTGTGTGCGGAGGTGGTTGTTTGTTTTTTTGTTTCTTTGTTTTGTTTG；AGATATGGTTTTGTTGTGCGTTATGTTGTGTTTTTGGGGTCTCTTTTTGGGTGTTTTGT；TTGGTGGGTTGTAGGCAGGCGTGGGCACTGTTTGAGAAGGACGTGTTTGGTCTAT；6〕DNA抗體的標(biāo)記和擴(kuò)增用以上篩選出來的特異性DNA序列為模板，以帶標(biāo)記〔如地高辛、生物素、放射性元素如P32〕引物PCR擴(kuò)增已篩選出來的特異性DNA序列，通過PAGE膠純化制備出相應(yīng)的DNA抗體。
7〕DNA抗體特異性鑒定親和力鑒定由于微管蛋白是從小牛腦里純化出來的，故選取小牛血清和類似抗原如肌動(dòng)蛋白、纖維蛋白作為非特異抗原對(duì)照，比較該特異DNA抗體對(duì)特異抗原及非特異抗原反應(yīng)的特異性；同時(shí)選用篩選之前的單鏈DNA隨機(jī)序列作對(duì)照，比較篩選所得特異DNA抗體序列和篩選之前的隨機(jī)DNA序列對(duì)微管蛋白的特異結(jié)合。用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明篩選所得特異DNA抗體對(duì)微管蛋白的結(jié)合力顯著大于篩選之前的隨機(jī)序列，也顯著大于對(duì)非特異抗原的結(jié)合。同時(shí)，對(duì)于非特異抗原的結(jié)合，特異DNA抗體和篩選之前的DNA隨機(jī)序列沒有明顯差別。
8)親和力鑒定親和力表示抗體結(jié)合抗原的能力，用DNA抗體—抗原復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)的倒數(shù)來表示。KD為引起50％最大效應(yīng)時(shí)(50％受體被占領(lǐng))的摩爾濃度。以上DNA抗體解離常數(shù)為20-45uM。通過提高DNA序列抗體濃度，可以提高親和力。
權(quán)利要求
1.一種DNA抗體，其特征在于其按照以下步驟制備1)DNA多樣化抗體庫的構(gòu)建；2)DNA抗體庫的篩選；3)特異性DNA抗體的標(biāo)記與擴(kuò)增。
2.按權(quán)利要求1所述的DNA抗體，其特征在于所述的DNA多樣化抗體庫的構(gòu)建包括雙鏈DNA隨機(jī)序列庫、單鏈DNA隨機(jī)序列庫、雜化雙鏈DNA隨機(jī)序列庫的構(gòu)建。
3.按權(quán)利要求1所述的DNA抗體，其特征在于DNA抗體庫的篩選包括把DNA抗體庫的隨機(jī)DNA序列與抗原進(jìn)行特異性雜交結(jié)合后，洗脫非特異結(jié)合的隨機(jī)DNA序列，并對(duì)特異性DNA抗體進(jìn)行洗脫和PCR富集。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA抗體。所述的抗體按照以下步驟制成1)三種DNA多樣化工程抗體庫的構(gòu)建；2)DNA抗體庫的篩選；3)DNA抗體的標(biāo)記與擴(kuò)增。本發(fā)明創(chuàng)造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結(jié)合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決蛋白診斷中由于抗原的千變?nèi)f化總是缺乏相應(yīng)抗體以及抗體作為蛋白質(zhì)不易研發(fā)、篩選、生產(chǎn)、純化與保存引起的成本高、周期長(zhǎng)等一系列問題。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1482258SQ0313986
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者文劍, 文 劍 申請(qǐng)人:文劍, 劉輝, 文 劍