專利名稱：紅發(fā)夫酵母中蝦青素的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從紅發(fā)夫酵母中提取蝦青素的方法，具體涉及到紅發(fā)夫酵母濕菌體在含抗氧化劑的有機酸或含酸酸性有機溶劑中在攪拌狀態(tài)下浸泡，蝦青素從胞內釋放到胞外的提取技術。
背景技術：
蝦青素(Astaxanthin，3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮)，屬于酮式類胡蘿卜素，結構如下蝦青素的結構式 生理研究表明，蝦青素具有很強的抗氧化功能，能清除體內由紫外線照射產(chǎn)生的自由基，調節(jié)降低這些由于光化學引起的傷害，對紫外線引起的皮膚癌有很好的治療效果。蝦青素的抗氧化功能高于角黃素(Canthaxanthin)、β-胡蘿卜素(β-Carotene)、玉米黃素(Zeaxanthin)等其它類胡蘿卜素，能抑制生物膜被氧化的作用。蝦青素還能顯著地促進淋巴結抗體的產(chǎn)生，特別是與體內T細胞相關抗原的抗體產(chǎn)生。
用紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)生產(chǎn)的蝦青素在酵母細胞內合成，是胞內物質。為了讓胞內蝦青素提取出來，必須使細胞破壁，或者通過其它方法使蝦青素通過細胞壁滲透出來。美國專利(US 5679567、US5712110、US 5709856、5972642)利用乙酸對紅發(fā)夫酵母進行了提取試驗，這些專利所使用的酵母菌體為干燥后的酵母菌體，這要求在提取前增加酵母干燥的工序，增加了蝦青素提取工藝的復雜性，這會導致蝦青素的損失較大，降低了提取收率，并且增加了能耗。因此，本發(fā)明的任務在于開發(fā)一種工業(yè)上可應用的、能直接從紅發(fā)夫酵母濕菌體中提取蝦青素的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是開發(fā)一種工業(yè)上可應用的、能直接從紅發(fā)夫酵母濕菌體中提取蝦青素的方法。
本發(fā)明的一種技術方案為將紅發(fā)夫酵母濕菌體與含抗氧化劑的有機酸攪拌進行分散，在40℃～90℃下保溫，攪拌1h～6h，胞內蝦青素通過細胞壁釋放到胞外溶劑中，經(jīng)固液分離后，得含蝦青素的有機相，然后經(jīng)親脂性有機溶劑萃取有機相，并經(jīng)水洗、低溫真空濃縮，獲得蝦青素濃縮液。
所述的有機酸為甲酸、乙酸中的任何一種，紅發(fā)夫酵母濕菌體的重量與有機酸的體積之比為1∶2～10(W/V)。
所述的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥四苯(BHT)、維生素E中的任何一種，抗氧化劑的重量與有機酸的體積比為0.1％～1.0％(W/V)。
萃取時添加的親脂性有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的任何一種，親脂性有機溶劑與含蝦青素的有機相的體積之比為1∶0.2～1.0。
本發(fā)明的另一種技術方案為將紅發(fā)夫酵母濕菌體與含抗氧化劑的含酸酸性有機溶劑攪拌進行分散，在40℃～90℃下保溫，攪拌1h～6h，胞內蝦青素通過細胞壁釋放到胞外溶劑中，經(jīng)固液分離后，得含蝦青素的有機相，然后經(jīng)親脂性有機溶劑萃取有機相，并經(jīng)水洗、低溫真空濃縮，獲得蝦青素濃縮液。
所述的含酸酸性有機溶劑中的有機溶劑為親水性有機溶劑，為乙醇、丙酮、甲醇、二甲基亞砜中的任何一種，紅發(fā)夫酵母濕菌體的重量與含酸酸性有機溶劑的體積之比為1∶2～10(W/V)。
含酸酸性有機溶劑中的酸為有機酸或無機酸，為乙酸、草酸、乳酸、硫酸、鹽酸、磷酸中的任何一種，有機溶劑中酸的濃度為0.1％～10.0％。
所述的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥四苯(BHT)、維生素E中的任何一種，抗氧化劑的重量與含酸酸性有機溶劑的體積比為0.1％～1.0％(W/V)。
萃取時添加的親脂性有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的任何一種，親脂性有機溶劑與含蝦青素的有機相的體積之比為1∶0.2～1.0。
以下對上述兩個方案的具體步驟進行詳細說明。
用有機酸從紅發(fā)夫酵母濕菌體中提取蝦青素將發(fā)酵結束后的發(fā)酵液經(jīng)處理制得含水量大于60％的紅發(fā)夫酵母濕菌體，在上述的紅發(fā)夫酵母濕菌體(即酵母泥)中，加入有機酸，有機酸體積與酵母泥重量的比例為2～10∶1(V/W，有機酸體積/酵母泥濕重)，同時加入抗氧化劑對蝦青素進行保護，在40℃～90℃下攪拌1h～6h，使酵母細胞改變通透性，并使蝦青素釋放到溶液中，經(jīng)固液分離，得到含蝦青素的有機相。
用含酸酸性有機溶劑從紅發(fā)夫酵母濕菌體中提取蝦青素將發(fā)酵結束后的發(fā)酵液經(jīng)處理制得含水量大于60％的紅發(fā)夫酵母濕菌體，在上述的紅發(fā)夫酵母濕菌體(即酵母泥)中，加入含酸酸性有機溶劑，含酸酸性有機溶劑體積與酵母泥重量的比例為2～10∶1(V/W，含酸酸性有機溶劑體積/酵母泥濕重)，同時加入抗氧化劑對蝦青素進行保護，在40℃～90℃下攪拌1h～6h，使酵母細胞改變通透性，并使蝦青素釋放到溶液中，經(jīng)固液分離，得含蝦青素的有機相。
從含蝦青素的有機相中萃取蝦青素將上述制得的含蝦青素的有機相中加入親脂性有機溶劑，進行萃取操作，親脂性有機溶劑與含蝦青素的有機相的體積之比為1∶0.2～1.0；經(jīng)水洗后，進行低溫真空蒸發(fā)濃縮操作，直至不再有溶劑蒸出為止，得到蝦青素濃縮液。
在上述有機酸或含酸酸性有機溶劑提取過程中，其基本原理是利用有機酸或含酸酸性有機溶劑改變紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)的細胞壁結構，使蝦青素通過細胞壁滲透出來，并溶解在有機酸或含酸酸性有機溶劑中。有機酸可選擇甲酸或乙酸。
在有機溶劑中添加酸可以增加蝦青素在有機溶劑中的溶解度，添加的酸為有機酸或無機酸，可選擇乙酸、草酸、乳酸、硫酸、鹽酸、磷酸中的一種，有機溶劑中酸的濃度為0.1％～10.0％。
由于蝦青素與其他天然色素一樣，對光、熱、氧都比較敏感，易分解、破壞，因此在提取過程中，應盡量避免由這些因素而導致的分解和破壞，在提取過程中及時加入一些保護物質，如抗氧化劑，防止蝦青素的氧化。在提取過程中添加的抗氧化劑可選擇丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥四苯(BHT)、維生素E中的一種?？寡趸瘎┑氖褂昧浚鶕?jù)加入紅發(fā)夫酵母濕菌體中的有機酸或含酸酸性有機溶劑的添加量而定，以抗氧化劑的重量與有機酸的體積比為0.1％～1.0％(W/V)為宜；以抗氧化劑的重量與含酸酸性有機溶劑的體積比為0.1％～1.0％(W/V)為宜。
在含蝦青素有機相中用有機溶劑萃取時，加入有機溶劑后充分攪拌，靜置分層，取萃取相水洗，水洗至pH值5～6，然后進行低溫真空蒸發(fā)濃縮，直至不再有溶劑蒸出為止，得到蝦青素濃縮液。選擇的有機溶劑為親脂性有機溶劑，為二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一種。
本發(fā)明利用有機酸或含酸酸性有機溶劑在攪拌狀態(tài)下直接浸泡紅發(fā)夫酵母濕菌體，并采用抗氧化劑保護，蝦青素從胞內釋放到胞外，提取蝦青素，其提取率為90％以上，該方法適合工業(yè)化生產(chǎn)，還具有以下積極效果
1)本發(fā)明的工藝簡單，能耗低，操作容易，直接用濕菌種的原料，去除了提取前的干燥工序，提高了蝦青素的收率；2)紅發(fā)夫酵母中的蝦青素經(jīng)有機溶劑提取后，為游離態(tài)的蝦青素，可以簡化后續(xù)蝦青素酯化工藝，提高蝦青素在生物體內的利用和吸收率；3)有機酸或含酸的酸性有機溶劑破壁法可降低雜質，如核酸、蛋白質等生物大分子物質，可以簡化蝦青素的純化工序。
(四)具體實施方案下面，參照附隨的實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述，這些實施例決不是對本發(fā)明的限制。
實施例1(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體將發(fā)酵完畢的紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液進行固液分離，可采用離心法和過濾法離心法可用離心機進行離心分離；過濾法可用板框壓濾法和陶瓷膜過濾法，但在過濾前需將發(fā)酵液進行預處理，如進行凝聚、絮凝、加熱、加助濾劑等，以提高過濾的速度，要求這些操作對蝦青素的效價影響最小。
a.利用過濾法分離紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液中的菌體在發(fā)酵液700L中加入35kg的珍珠巖，經(jīng)充分攪拌后，邊攪拌邊用泵將混合液輸送到板框壓濾機中進行過濾，過濾完畢后，用自來水沖洗，再用壓縮空氣洗滌，得到含珍珠巖的酵母泥(即紅發(fā)夫酵母濕菌體)88kg，蝦青素含量為206μg/g。
b.利用離心法分離紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液中的菌體在發(fā)酵液中加入0.5％氯化鈣和磷酸鹽，攪拌反應生成磷酸鈣鹽沉淀物，同時使酵母菌體一起凝聚沉淀；再加入0.1％聚丙烯酰胺，攪拌使沉淀物絮凝，形成更大的沉淀。通過連續(xù)式臥螺離心機進行離心分離沉淀物。所得到的酵母菌體(即紅發(fā)夫酵母濕菌體)的含水率較上述a法的高。
(2)利用乙酸對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素225μg/g)中加入乙酸500L和丁基羥四苯(BHT)1kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在40℃～60℃下保溫2h～5h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液(含蝦青素的有機相)624L，其中蝦青素的含量為33μg/ml，利用乙酸提取胞內蝦青素的收率為91.5％。
(3)初提液經(jīng)過萃取和濃縮，得到蝦青素濃縮液。
以上述獲得的624L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在初提液624L(含蝦青素33μg/ml)中加入500L氯仿，經(jīng)充分攪拌后，靜置分層，若不能分層，可采取加入水來促使分層；取萃取相，水洗至pH為5～6，得到萃取液422L(蝦青素含量為46μg/ml)；將萃取液放入濃縮鍋，進行低溫真空蒸發(fā)濃縮操作，直至不再有溶劑蒸出為止，得到蝦青素濃縮液16.1L，其中蝦青素含量為1135μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率為81.2％。
實施例2(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體，步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)利用甲酸對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素213μg/g)中加入甲酸1000L和丁基羥四苯(BHT)10kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在50℃～65℃下保溫3h～6h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液1258L，其中蝦青素的含量為16μg/ml，利用甲酸提取蝦青素的收率為95％。
(3)以1258L初提液為基數(shù)經(jīng)過萃取和濃縮，得到蝦青素濃縮液。
在初提液1258L(含蝦青素16μg/ml)中加入800L二氯甲烷，其余過程同實施例1中的第(3)步，得到蝦青素濃縮液13.8L，其中蝦青素含量為1255μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率為81.3％。
實施例3(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體，步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)利用鹽酸-乙醇溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素215μg/g)中加入1M鹽酸-乙醇混合溶劑(1M鹽酸與乙醇的體積比為1∶4)500L和丁基羥基茴香醚(BHA)1kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在40℃～50℃下保溫4h～6h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液636L，其中蝦青素的含量為31μg/ml，利用鹽酸-乙醇溶液提取蝦青素的提取收率為91.7％。
(3)以上述獲得的636L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在初提液636L(含蝦青素31μg/ml)中加入600L二硫化碳，經(jīng)充分攪拌后，靜置分層，若不能分層，可采取加入水來促使分層；取萃取相，水洗至pH為5～6，得到萃取液522L(蝦青素含量為35μg/ml)；將萃取液放入濃縮鍋，進行低溫真空蒸發(fā)濃縮操作，直至不再有溶劑蒸出為止，得到蝦青素濃縮液16.9L，其中蝦青素含量為1021μg/ml，總提取率為80.2％。
實施例4(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體，步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)利用硫酸-甲醇溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素218μg/g)中加入1M硫酸∶甲醇＝1∶4的硫酸-甲醇混合溶劑500L和維生素E 1.2kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在50℃～70℃下保溫1h～5h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液620L，其中蝦青素的含量為32μg/ml，利用硫酸-甲醇溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取的收率為91％。
(3)以上述獲得的620L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在上述初提液620L(含蝦青素32μg/ml)中加入500L石油醚，其余過程同實施例1中的第(3)步，得到蝦青素濃縮液16.8L，其中蝦青素含量為1056μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率為81.4％。
實施例5(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體，步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素234μg/g)中加入10M磷酸∶丙酮＝1∶9的磷酸-丙酮混合溶劑500L和丁基羥基茴香醚(BHA)1kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在50℃～80℃下保溫4h～6h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液618L，其中蝦青素的含量為35μg/ml，利用磷酸-丙酮溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取收率為92.4％。
(3)以上述獲得的618L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在上述初提液618L(含蝦青素35μg/ml)中加入500 L乙酸乙酯，其余過程同實施例1中的第(3)步，得到蝦青素濃縮液16.9L，其中蝦青素含量為1141μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率為82.4％。
實施例6(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體。步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)利用乳酸-丙酮溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素208μg/g)中加入80％乳酸∶丙酮＝1∶8的乳酸-丙酮混合溶劑500L和丁基羥基茴香醚(BHA)1kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在80℃～90℃下保溫5h～6h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液622L，其中蝦青素的含量為31μg/ml，利用乳酸-丙酮溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取為92.7％。
(3)以上述獲得的622L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在上述初提液622L(含蝦青素31μg/ml)中加入500L甲苯，其余過程同實施例1中的第(3)步，得到蝦青素濃縮液16.9L，其中蝦青素含量為998μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率為81.1％。
實施例7(1)發(fā)酵液的前處理，獲得含水量60％以上的紅發(fā)夫酵母濕菌體。步驟同實施例1中的第(1)步。
(2)利用草酸-二甲基亞砜溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取。
在100kg紅發(fā)夫酵母濕菌體(含蝦青素216μg/g)中加入0.5M草酸∶二甲基亞砜＝1∶3的草酸-二甲基亞砜混合溶液800L和維生素E1kg，攪拌，使菌體均勻分散，然后在60℃～70℃下保溫2h～6h，板框壓濾，水洗，得到蝦青素的初提取液903L，其中蝦青素的含量為22μg/ml，利用草酸-二甲基亞砜溶劑對紅發(fā)夫酵母細胞進行破壁和蝦青素提取收率為92％。
(3)以上述獲得的903L初提液為基數(shù)，進行萃取和濃縮操作。
在上述初提液903L(含蝦青素22μg/ml)中加入500L苯，其余過程同實施例1中的第(3)步，得到蝦青素濃縮液17.1L，其中蝦青素含量為1038μg/ml，從酵母泥到濃縮液的總提取率82.2％。
權利要求
1.一種紅發(fā)夫酵母中蝦青素的提取方法，其特征是將紅發(fā)夫酵母濕菌體與含抗氧化劑的有機酸攪拌混合，保溫提取，然后經(jīng)親脂性有機溶劑萃取，水洗，低溫真空濃縮，獲得蝦青素濃縮液。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征是所述的有機酸為甲酸、乙酸中的一種，紅發(fā)夫酵母濕菌體的重量與有機酸的體積之比為1∶2～10。
3.根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征是所述的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚、丁基羥四苯、維生素E中的一種，抗氧化劑的重量與有機酸的體積比為0.1％～1.0％。
4.根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征是所述的親脂性有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一種，親脂性有機溶劑與含蝦青素的有機相的體積之比為1∶0.2～1.0。
5.一種紅發(fā)夫酵母中蝦青素的提取方法，其特征是將紅發(fā)夫酵母濕菌體與含抗氧化劑的含酸酸性有機溶劑攪拌混合，保溫提取，然后經(jīng)親脂性有機溶劑萃取，水洗，低溫真空濃縮，獲得蝦青素濃縮液。
6.根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征是紅發(fā)夫酵母濕菌體的重量與含酸酸性有機溶劑的體積之比為1∶2～10。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的提取方法，其特征是所述的含酸酸性有機溶劑中的酸為有機酸或無機酸，為乙酸、草酸、乳酸、硫酸、鹽酸、磷酸中的一種，有機溶劑中酸的濃度為0.1％～10.0％。
8.根據(jù)權利要求5或6所述的提取方法，其特征是所述的含酸酸性有機溶劑中的有機溶劑為親水性有機溶劑，為乙醇、丙酮、甲醇、二甲基亞砜中的一種。
9.根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于所述的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚、丁基羥四苯、維生素E中的任何一種，抗氧化劑的重量與含酸酸性有機溶劑的體積比為0.1％～1.0％。
10.根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征是所述的親脂性有機溶劑，為二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、乙醚、二硫化碳中的一種，親脂性有機溶劑與含蝦青素有機相的體積之比為1∶0.2～1.0。
全文摘要
一種紅發(fā)夫酵母中蝦青素的提取方法，紅發(fā)夫酵母濕菌體與含抗氧化劑的有機酸或酸性有機溶劑攪拌混合提取蝦青素，紅發(fā)夫酵母濕菌體的重量與含酸和含抗氧化劑的有機酸或酸性有機溶劑的體積之比為1∶2～10，胞內蝦青素通過細胞壁釋放到胞外溶液中，然后經(jīng)萃取、水洗和低溫真空濃縮后獲得蝦青素濃縮液產(chǎn)品，本發(fā)明用有機酸或含酸酸性有機溶劑提取蝦青素的提取收率達到90％以上，從酵母泥到蝦青素濃縮液的總提取收率達到80％以上，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07C403/00GK1548420SQ0311703
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月17日 優(yōu)先權日2003年5月17日
發(fā)明者鄭裕國, 陳小龍, 汪釗, 沈寅初, 胡忠策 申請人:浙江工業(yè)大學