專利名稱：?jiǎn)蝹€(gè)生物大分子的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種各種生物大分子的分離方法，特別是一種基于原子力顯微鏡納米操縱技術(shù)在固體表面分離單個(gè)生物大分子的方法。
背景技術(shù)：
生命科學(xué)和生物技術(shù)的迅猛發(fā)展需要更加高效、可靠的生物大分子分離純化方法。目前最常用的凝膠電泳和層析方法需要較多的生物樣品分子，且費(fèi)時(shí)和難以自動(dòng)化。新近發(fā)展起來(lái)的基于微制造(microfabricated)的各種分離設(shè)備(Hou-Puchou，Charles Spence，Axel Scherer，And Stephen Quake.Amicrofabricated device for sizing and sorting DNA molecules.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，9611-13；Chia-Fu Chou，Robert H.Austin，Olgica Bakajin，et al.Sorting biomolecules with microdevices.Electrophoresis，2000，2181-90；J.Han，H.G.Craighead.Separation of longDNA molecules in a microfabricated entropic trap array.Science，2000，2881025-1029)，雖然可以較快速地對(duì)較少量的樣品進(jìn)行分離，但對(duì)單個(gè)生物大分子的分離仍然是比較困難的，并且不能夠定位分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是克服上述已有技術(shù)的局限，提供一種可對(duì)單個(gè)生物大分子進(jìn)行分離的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案，概括地說，本發(fā)明單個(gè)生物大分子的分離方法就是采用納米操縱技術(shù)分離單個(gè)生物大分子的方法。具體地說一種分離單個(gè)生物大分子的方法，其特征在于該方法包括下列步驟
(1)將生物大分子樣品溶液滴加在原子級(jí)平整的基底表面；(2)利用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)樣品分子進(jìn)行成像；(3)在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域選定單個(gè)樣品；(4)用原子力顯微鏡的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”對(duì)樣品分子進(jìn)行“推”的操縱納米操縱，通過改變探針針尖對(duì)樣品分子所施力的大小使樣品粘著在探針上，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)生物大分子的分離。
所說的基底可以是云母，也可以是硅，也可以是化學(xué)修飾后的基底。
其中化學(xué)修飾后的基底為將新剝離的云母或硅表面用0.5～1％(重量)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)水溶液處理2-5分鐘，用雙蒸水洗滌后，在80℃～200℃環(huán)境下烘烤1～4小時(shí)。
該適當(dāng)區(qū)域?yàn)橹挥幸粋€(gè)樣品，且在其周圍一定距離內(nèi)沒有其他樣品存在的區(qū)域。
所說的原子力顯微鏡的探針的針尖可以經(jīng)過修飾或不經(jīng)修飾。
所說原子力顯微鏡的探針的針尖為單個(gè)，也可以是針尖陣列，從而可以進(jìn)行并行分離。
所說的原子力顯微鏡的探針可對(duì)處于空氣、液體或真空環(huán)境的樣品進(jìn)行分離。
所說的生物大分子可以為DNA、RNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物或其他復(fù)合物和聚集物。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明能夠?qū)蝹€(gè)生物大分子進(jìn)行分離，且能進(jìn)行定位分離。


圖1是利用原子力顯微鏡探針分離DNA片段的過程示意圖。
圖2是利用原子力顯微鏡探針分離DNA片段具體過程的原子力顯微鏡探測(cè)結(jié)果示意圖a為固定在基底上拉直的DNA分子；b為切割有1、2、3小片段的上述DNA；c為分離小片段3后余留的DNA片段；d為再分離小片段1后余留的DNA片段；e為繼之分離小片段2后殘留的DNA片段。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合圖1、2所示，下面著重以DNA分子為例來(lái)說明本發(fā)明的方法。
本發(fā)明利用原子力顯微鏡納米操縱技術(shù)分離單個(gè)生物大分子的方法，包括下列步驟1、將生物大分子樣品溶液滴加在原子級(jí)平整的基底表面。
為了使生物大分子在基底表面的有適中的吸附力以同時(shí)滿足AFM成像和可以分離的需要，必須根據(jù)生物大分子本身的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)幕谆驅(qū)走M(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?。為達(dá)到分離DNA的目的，我們選用了云母或硅作為固態(tài)基底，或采用硅烷化的云母或硅作為基底，即將新剝離的云母或硅用0.5～1％的APTES來(lái)處理其表面，時(shí)間為2～5分鐘，處理過的APTES-云母/硅表面用雙蒸水洗滌后，然后在80℃～200℃環(huán)境下烘烤1～4小時(shí)以控制基底對(duì)DNA分子的吸附能力，然后放置于干燥器中備用。(具體操作步驟，請(qǐng)參見我們的專利胡鈞，黃一波，張益，歐陽(yáng)振乾，李民乾。一種用于DNA操縱的云母襯底的制造方法。發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?0116715.4，申請(qǐng)日20000623)。
2、用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)樣品分子進(jìn)行成像。
首先進(jìn)行DNA樣品準(zhǔn)備和拉直操縱，λDNA購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，DNA用TE緩沖液(40mM tris-Hcl，1mM EDTA)稀釋至1～5ng/μl，取4μl上述DNA溶液滴加于潔凈的蓋玻片一端，接下來(lái)用“分子疏”將DNA拉直。具體做法是，首先將該蓋玻片反轉(zhuǎn)，先使帶有溶液的一端輕輕地接觸處理好的APTES-云母或APTES-硅表面，然后慢慢地將整個(gè)蓋玻片蓋在云母或硅表面上，在此過程中，水流彎液面將溶液中的DNA拉直，APTES對(duì)DNA的吸附力使DNA得以固定在基底上。樣品表面在空氣或液氮中干燥后，用AFM進(jìn)行探測(cè)和操縱。成像時(shí)，采用AFM輕敲模式(tapping mode)，在相對(duì)濕度為30～40％下的大氣條件下獲取。
3、在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域選定單個(gè)樣品。
為了更有效的分離樣品，最好是選擇那些在基底上只有一個(gè)樣品，且在其周圍一定距離內(nèi)沒有其他樣品存在的區(qū)域。選定樣品后，將其定位在盡可能小的區(qū)域內(nèi)的中心位置，然后執(zhí)行分離過程。
4、用原子力顯微鏡的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”(Jun Hu，Yi Zhang，Haibin Gao，Minqian Li，Uwe Hartmann.Artificial DNA patterns by Mechanicalnanomanipulation.Nano Letters，2(1)55-57.2002)對(duì)樣品分子進(jìn)行“推”的操縱納米操縱，通過改變探針針尖對(duì)樣品分子所施力的大小使樣品粘著在探針針尖上，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)生物大分子的分離。
“逐線反饋納米操縱”技術(shù)的具體過程為先用AFM輕敲模式(tapping)掃描一條線，獲得這條線的信息(力，或者它所轉(zhuǎn)換成的高度)，然后對(duì)同一條線進(jìn)行第二次接觸模式(contact)掃描時(shí)進(jìn)行監(jiān)視和調(diào)整(改變掃描力的大小)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這條線的操縱。整個(gè)成像和操縱過程不用退出AFM的反饋系統(tǒng)而連續(xù)進(jìn)行。這樣的操縱可以獲得很高的精確性，切割DNA時(shí)的空間精確度達(dá)到＜5nm，而這主要是受探針尺度的限制。在實(shí)行“切割”的納米操縱時(shí)，獲得一幅圖像，選定感興趣的區(qū)域；接下來(lái)，通過增加力來(lái)驅(qū)動(dòng)AFM探針與選定區(qū)域接觸，從而利用AFM探針的移動(dòng)(有時(shí)需要來(lái)回多次)將DNA切斷。對(duì)DNA小片段進(jìn)行分離的操作類似于“逐線反饋納米操縱”技術(shù)中的“切割”過程，不同的是所用的力要小于切割時(shí)的域值，通常要小于10nN(隨探針的不同而變化)，并且掃描的區(qū)域要盡量小(比要分離的目標(biāo)物體稍大即可)，然后執(zhí)行二維掃描過程，在此掃描過程中通過改變探針針尖對(duì)樣品分子所施力的大小，克服基底對(duì)樣品的吸附使樣品轉(zhuǎn)移吸附到探針針尖上，從而完成DNA小片段的分離。切割與分離兩者不同的是，切割時(shí)的AFM探針在一維方向上來(lái)回移動(dòng)，且用的力較大；而分離DNA小片段時(shí)，AFM探針在二維方向上運(yùn)動(dòng)，用的力也比切割時(shí)要小。
DNA單分子的AFM成像、切割與分離都是在NANOScope IIIa AFM系統(tǒng)(Digital Instrument，美國(guó))上完成的，其可在空氣、液體或真空環(huán)境下進(jìn)行。掃描頭為E或J型。AFM探針為硅探針(Silicon-MDT Ltd.，俄羅斯)或Forcemodulation探針(Digital Instrument，美國(guó))。
本實(shí)施例中原子力顯微鏡的探針的針尖可為單個(gè)，也可以是針尖陣列，從而可以進(jìn)行并行分離。
對(duì)其他單個(gè)生物大分子如RNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物或其他復(fù)合物和聚集物也可以采用上述基于原子力顯微鏡的納米操縱的方法得以分離，在此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將生物大分子樣品溶液滴加在原子級(jí)平整的基底表面；(2)利用原子力顯微鏡對(duì)樣品分子進(jìn)行成像；(3)在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域選定單個(gè)樣品；(4)用原子力顯微鏡的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”對(duì)樣品分子進(jìn)行“推”的納米操縱，通過改變探針針尖對(duì)樣品分子所施力的大小使樣品粘著在針尖上，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)生物大分子的分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該基底為云母、硅或化學(xué)修飾后基底。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該化學(xué)修飾后基底為將新剝離的云母或硅表面用0.5-1％的APTES水溶液處理2-5分鐘，用雙蒸水洗滌后，在80℃-200℃環(huán)境下烘烤1-4小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該適當(dāng)區(qū)域?yàn)橹挥幸粋€(gè)樣品，且在其周圍一定距離內(nèi)沒有其他樣品存在的區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該原子力顯微鏡的探針的針尖為經(jīng)過修飾的或不經(jīng)修飾的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該原子力顯微鏡的探針的針尖為單個(gè)或針尖陣列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該原子力顯微鏡的探針的分離樣品為處于空氣、液體或真空環(huán)境的樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的單個(gè)生物大分子的分離方法，其特征在于該生物大分子為DNA、病毒、RNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物或聚集物。
全文摘要
一種單個(gè)生物大分子的分離方法，該方法包括以下步驟①將生物大分子樣品溶液滴加在原子級(jí)平整的基底表面；②利用原子力顯微鏡對(duì)樣品分子進(jìn)行成像；③在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域選定單個(gè)樣品；④用原子力顯微鏡的“逐線反饋納米操縱”技術(shù)對(duì)樣品分子進(jìn)行“推”的納米操縱，通過改變探針針尖對(duì)樣品分子所施力的大小使樣品吸附在針尖上，從而實(shí)現(xiàn)單個(gè)生物大分子的定位分離。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1532203SQ0311594
公開日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者呂軍鴻, 胡鈞, 李民乾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所