專利名稱：減毒環(huán)狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒病毒、病毒疫苗組合物，特別是雞貧血癥病毒形式的減毒環(huán)狀病毒。
背景技術(shù)：
雞貧血癥病毒(CAV)是環(huán)狀病毒科(Circoviridae)家族中的一個(gè)成員。環(huán)狀病毒科病毒家族包括許多植物及動(dòng)物病毒，其特征為具有單鏈、負(fù)義、環(huán)狀DNA基因組。在CAV和其他表征的下列動(dòng)物環(huán)狀病毒之間的基因組序列和結(jié)構(gòu)中有最低的相似性鸚鵡喙羽病毒(PBFDV)，鴿環(huán)狀病毒，豬環(huán)狀病毒1及2。最近以人及其他物種為宿主的TT病毒(TTV)已被鑒定成單鏈、負(fù)義、環(huán)狀DNA病毒。對(duì)這組病毒進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)它們同CAV有著總體上最高的同源性，因此有人主張將TTV，SANBAN，YONBAN，TLMV(類TTV小病毒)以及CAV病毒歸類為副環(huán)狀病毒科(paracircoviridae)。但是，關(guān)于其發(fā)展史，還有很多爭(zhēng)論。在非編碼區(qū)和在TTV的可讀框(ORF2)與CAV的VP2序列之間可見和CAV基因序列的同源性最高。CAV同TTV之間高水平的同源性暗示VP2可能在病毒感染和致病方面具有重要的作用。
CAV只編碼三個(gè)蛋白，其三個(gè)ORF互相重疊。ORF3編碼病毒的主要蛋白45-52kDa的衣殼蛋白VP1，ORF2編碼11-13kDa的VP3蛋白，該蛋白在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表現(xiàn)出致凋亡活性，而ORF1編碼一個(gè)28kDa的非結(jié)構(gòu)性蛋白VP2，其功能不清。在感染發(fā)生時(shí)，VP2以痕量表達(dá)，但是VP2在病毒感染和在細(xì)胞中復(fù)制具有關(guān)鍵性的作用。VP2蛋白的低表達(dá)符合其作為一種涉及病毒復(fù)制和感染的非結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)性蛋白的特點(diǎn)。
CAV發(fā)病機(jī)理的特征為由于全骨髓萎縮及胸腺細(xì)胞衰竭而導(dǎo)致免疫抑制及全血細(xì)胞減少癥。免疫抑制又導(dǎo)致與共感染有關(guān)的死亡率和發(fā)病率上升，并導(dǎo)致CAV感染雞只中免疫接種失敗。CAV感染直接針對(duì)胸腺和脾臟兩種不同的T細(xì)胞群的細(xì)胞毒性。胸腺感染包括未成熟淋巴母細(xì)胞前體，而脾臟感染屬于受到高度激活的成熟T淋巴細(xì)胞。在未被感染的免疫效應(yīng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)存在著第二種間接免疫抑制的組分。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)巨噬細(xì)胞和APC效應(yīng)細(xì)胞功能和B細(xì)胞抗原反應(yīng)也下降。受感染細(xì)胞的有限細(xì)胞因子圖譜暗示總體上間接免疫抑制的基礎(chǔ)。在受感染家禽的淋巴細(xì)胞中，白介素2(IL-2)，干擾素γ(IFNγ)，淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，IL-1，T細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性，以及Fc受體水平都發(fā)生了下降。病毒對(duì)于細(xì)胞因子圖譜及間接免疫抑制的分子機(jī)理尚未知。
對(duì)CAV VP2序列同Genbank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行初步的比較表明，該蛋白同許多真核受體PTP酶(R-PTPaseα)有相似性。數(shù)據(jù)庫檢索表明人類、大鼠、小鼠和雞的R-PTPaseα前體同CAV VP2蛋白序列具有同源性?？赡嫘缘鞍琢姿峄饔迷诩?xì)胞調(diào)控過程中是普遍的，包括代謝、基因調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架組織及細(xì)胞附著。PTPase家族種類繁多，包括真核細(xì)胞受體類跨膜蛋白及可溶性胞質(zhì)蛋白，以及細(xì)菌PTPase，例如致病菌耶爾森氏菌(Yersinia)的YopH PTPase，和在牛痘病毒(痘病毒中的一種)中發(fā)現(xiàn)的PTPase VH1。在牛痘病毒感染中，VH1蛋白阻斷干擾素γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因而逃避了機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答。VH1 PTPase在感染中的作用，雖然是目前唯一的了具有表征的體內(nèi)功能的病毒性PTPase蛋白，但它仍突出了病毒編碼的PTPase蛋白在參與病毒的免疫逃避及病毒存留機(jī)制中的潛力。
家禽飼養(yǎng)商需要雞貧血癥病毒(CAV)疫苗，以降低由于該病毒臨床感染及亞臨床感染所造成的經(jīng)濟(jì)損失。要想清除成年雞中與CAV感染相關(guān)的亞臨床疾病，則需要克服由于感染造成的免疫抑制。CAV感染在小雞群中具有極大的經(jīng)濟(jì)意義。臨床及亞臨床感染對(duì)商業(yè)化養(yǎng)雞的效率及利潤(rùn)都有影響。臨床感染可以產(chǎn)生更明顯的績(jī)效參數(shù)方面的下降，而亞臨床感染隨著其發(fā)生率較高會(huì)造成更大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)損失。因此急需一種可以用于雛雞、小雞和種雞的疫苗。由于這種疫苗可能施用于產(chǎn)蛋期的禽類，因此該疫苗在垂直傳播給胚胎的事件中必須是安全的。
CAV疫苗的研發(fā)有國際申請(qǐng)。根據(jù)血清學(xué)調(diào)查，雞貧血癥病毒(CAV)全世界都有分布，在SPF及商業(yè)化肉雞群中區(qū)域性分布，但澳大利亞SPF雞群除外。檢測(cè)分離到的CAV病毒并對(duì)其全基因組測(cè)序的國家有德國、英國、美國、日本、澳大利亞以及荷蘭。使用多克隆抗血清進(jìn)行免疫熒光及中和試驗(yàn)，根據(jù)交叉反應(yīng)的情況，可以將所有的分離病毒株歸為一個(gè)單獨(dú)的血清型中?；蚪M序列保守性是所有CAV分離株的關(guān)鍵特征。所有的野外病毒分離株在感染試驗(yàn)中都表現(xiàn)出等同的致病性，而CAV接觸疾病的發(fā)病率及嚴(yán)重性的任何差異是由于病毒作用范圍及流行病學(xué)因素造成的。病毒劑量是影響野外CAV誘導(dǎo)疾病嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素。預(yù)計(jì)從任意一分離株開發(fā)的活減毒疫苗都有望給全世界的禽類養(yǎng)殖帶來福音。
CAV減毒株應(yīng)該是具有感染性，而同時(shí)其致病性下降。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一日齡感染的雞臨床疾病被表征最清楚。一日齡雞感染的臨床疾病表現(xiàn)為衰弱、萎靡、發(fā)育遲緩以及貧血。感染后7天時(shí)，因?yàn)槌珊思t細(xì)胞大量崩解，會(huì)發(fā)生一短暫、但是嚴(yán)重和特急性的貧血，以及由于皮質(zhì)淋巴細(xì)胞萎縮，會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷。感染后14-20天時(shí)，顯然會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓細(xì)胞減少、胸腺及淋巴組織萎縮以及血小板減少癥。因?yàn)樵l(fā)性凝血障礙，會(huì)出現(xiàn)瘀點(diǎn)、瘀斑性出血癥。免疫抑制是CAV誘導(dǎo)疾病的重要特征，并且因此常導(dǎo)致繼發(fā)性感染。受CAV感染的禽類發(fā)生惡性水腫、壞疽性皮炎、大腸桿菌感染以及肺曲霉感染的發(fā)病率增高。感染后14-35天進(jìn)入恢復(fù)期。在恢復(fù)期，紅細(xì)胞系生成過程要先于粒細(xì)胞系生成過程。感染后16天，有大量未成熟紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞，感染后28天血細(xì)胞比容完全恢復(fù)。21天時(shí)由于淋巴細(xì)胞的第三波移動(dòng)，胸腺細(xì)胞群重新增多。
CAV感染的禽類會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的骨髓萎縮性貧血。血細(xì)胞容積小于27％，通常在9-23％之間(正常的7-14日齡雞血細(xì)胞容積為32-37.5％)。在非覆羽皮膚及粘膜表面明顯發(fā)紺。因?yàn)楫愘|(zhì)性血細(xì)胞減少及淋巴細(xì)胞減少癥，而導(dǎo)致白細(xì)胞減少癥。凝血時(shí)間延長(zhǎng)與瘀點(diǎn)、瘀斑性出血相關(guān)，所述出血可出現(xiàn)于表皮、骨骼肌、胃粘膜，鮮見出現(xiàn)于心包。
因?yàn)槿撬栉s及代償性脂肪組織增生，骨髓呈黃色到白色，質(zhì)地含水。這種現(xiàn)象在股骨近端骨髓腔最常見。
胸腺表現(xiàn)嚴(yán)重萎縮?？蓽y(cè)量到受感染的胸腺重量下降，直徑也縮小2-4毫米。受感染胸腺表現(xiàn)為紅褐色，而不是正常的灰色，這是因?yàn)閷?shí)質(zhì)性淋巴細(xì)胞群減少，網(wǎng)狀細(xì)胞增生以及組織充血造成的。
在所有的組織中，存在廣泛的淋巴濾泡組分缺失?；夏?bursa ofFabricius)發(fā)生一短暫的中度萎縮，而不是腫脹或水腫。在出現(xiàn)臨床癥狀的受感染雞，囊萎縮現(xiàn)象為適度或不明顯。
感染后14天，肝臟、腎臟以及脾臟表現(xiàn)為廣泛性脫色及水腫。
病灶處皮膚的出血性損傷是最突出發(fā)生在翅上，但也發(fā)生在頭部、臀部、胸腹側(cè)壁、大腿、小腿及足。病損進(jìn)展為大的潰瘍，并由于下層的真皮缺血性壞死而伴有血性滲出。膿性滲出與繼發(fā)性感染有關(guān)。在商業(yè)化養(yǎng)雞的養(yǎng)殖單位中，常容易并發(fā)磨損及斷離損傷。
為對(duì)減毒效果進(jìn)行評(píng)估，需要建立CAV發(fā)病機(jī)理的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＿@一模型不需要代表野外感染中所觀察的全譜病理，但必須能在最嚴(yán)重病理變化方面是否有減毒效應(yīng)。用高劑量的病毒接種7日齡胚胎卵黃囊是可選用模型中最嚴(yán)格的一種。這種模型可以最好地模擬實(shí)際情況，其中將幼稚種雞在產(chǎn)蛋期時(shí)接觸CAV，并且介蛋傳播病毒。經(jīng)垂直傳播感染的雞具有最高的發(fā)病率(100％)和死亡率(10-70％)，其所發(fā)生的病變也是最嚴(yán)重的。目前文獻(xiàn)中還沒有報(bào)道通過實(shí)驗(yàn)大量研究7日齡卵黃囊接種感染的胚胎病理。
所有年齡段的雞都對(duì)CAV易感，但是14日齡以上的雞對(duì)該疾病的發(fā)生表現(xiàn)出日齡特異性的抗性。雞胚及1日齡雞對(duì)該疾病最易感。日齡抗性可能同雞產(chǎn)生血清中和體液反應(yīng)的能力提高相關(guān)。增效禽類病原體共感染，如IBFV共感染，會(huì)消除日齡相關(guān)抗性，并導(dǎo)致大齡雞急重癥的爆發(fā)。
大多數(shù)商業(yè)化飼養(yǎng)的雞已經(jīng)接觸過CAV并擁有長(zhǎng)效中和體液免疫力。抗體在血清轉(zhuǎn)化后可以持續(xù)至少20周。飼養(yǎng)雞的血清學(xué)調(diào)查表明97.5-100％的雞在感染后比較長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)仍可保留由血清陽性反應(yīng)。母源性抗體對(duì)于保護(hù)2周前的小雞免受疾病侵害具有重要的作用，并可持續(xù)至3周齡。母源性抗體呈線性下降，其半衰期大約為1周。低水平的母源性抗體對(duì)于防止感染臨床疾病是有效的。源自免疫的種雞孵化出的絕大多數(shù)小雞在母源性抗體衰減后會(huì)被橫向感染，產(chǎn)生亞臨床性疾病，并在感染后8-12周發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。在一個(gè)接觸病毒的雞群中，將近有10％的雞在接觸后的任何時(shí)段血清學(xué)檢查都表現(xiàn)為陰性。有一小部分雞會(huì)被垂直感染并分泌高滴度的病毒，因此成為其他人工孵化雞橫向感染的感染源。在免疫種雞的后代中，有16％-25％的雞為亞臨床感染。因此即使對(duì)于流行CAV地區(qū)、并產(chǎn)生持續(xù)性中和體液免疫的雞群，疫苗接種都會(huì)有更好的效果。
經(jīng)鑒定VP2蛋白是一種新的酪氨酸磷酸酶，其一些序列是發(fā)揮完全功能所必須的，基于這些認(rèn)識(shí)，本發(fā)明人研發(fā)了可以用于免疫接種小母雞、子雞、種雞的活的減毒CAV病毒及CAV DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
首先，本發(fā)明提供一個(gè)分離的減毒環(huán)狀病毒，在其編碼病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中有一個(gè)突變。
優(yōu)選的是，該環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。其中更優(yōu)選的環(huán)狀病毒是雞貧血癥病毒(CAV)。環(huán)狀病毒的定義欲包括CAV及其他病毒，這類病毒擁有單鏈、負(fù)義環(huán)狀DNA基因組，并表達(dá)功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
選擇突變點(diǎn)最好根據(jù)當(dāng)前對(duì)病毒功能的研究來進(jìn)行。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CAV VP2是進(jìn)行減毒的良好靶位點(diǎn)，通過突變，有可能改變病毒的毒性而同時(shí)保留其感染性及免疫原性。作為本發(fā)明的部分，CAV VP2作為PTPase建立精確的生化功能極大地推動(dòng)了合理減毒的方法，并為突變路線指明待突變的熱點(diǎn)位置。根據(jù)對(duì)PTPase體外催化影響的認(rèn)識(shí)，可以設(shè)計(jì)突變來調(diào)整感染過程中PTPase的功能。CAV VP2蛋白預(yù)測(cè)是一種多功能蛋白，是一種病毒復(fù)制及感染過程中關(guān)鍵性的非結(jié)構(gòu)蛋白。因?yàn)樵摰鞍资且环N非結(jié)構(gòu)性蛋白，所以突變不一定會(huì)影響對(duì)免疫原性所必需的表位。因?yàn)榱馨图?xì)胞是CAV感染的靶細(xì)胞，可能病毒的毒力同免疫原性反相關(guān)，條件是對(duì)抗原刺激能獲得足夠的病毒復(fù)制。降低病毒毒力以及因病毒感染造成的免疫抑制的突變，可能因此而提高病毒相對(duì)于野生型病毒的免疫原性特性。
在一優(yōu)選形式中，突變存在于編碼VP2蛋白特征基序的關(guān)鍵氨基酸殘基的核酸區(qū)域中。這些突變應(yīng)該會(huì)改變病毒感染時(shí)PTPase的功能。更優(yōu)選的情況是，在CAV VP2中突變的靶位點(diǎn)為第86，95，97，101，103和169位。第86位的氨基酸殘基正常情況下為C，被突變?yōu)镾(mut C 86 S)，其他經(jīng)證實(shí)的突變?yōu)閙ut C 95 S，mut C 97 S，mutR101 G，以及mut H 103 Y。突變mut C 95 S，mut C 97 S去除半胱氨酸，而半胱氨酸預(yù)測(cè)對(duì)PTPase活性是必需的，并且為催化半胱氨酸，在催化過程中參與形成半胱氨酰-磷酸(cysteinyl-phosphate)。突變mut R101 G去除堿性、正電的氨基酸殘基，預(yù)測(cè)該氨基酸對(duì)PTPase活性是必須的，并參與磷酸酪氨酸底物同催化性半胱氨酸殘基的協(xié)調(diào)過程。第103位和86位氨基酸殘基位于預(yù)測(cè)的特征基序的側(cè)翼，而且在TT病毒和CAV病毒中高度保守。
在另一個(gè)優(yōu)選的形式中，突變存在于編碼下列CAV VP2中兩個(gè)預(yù)測(cè)區(qū)域的核酸區(qū)殘基128-143位兩性分子α螺旋區(qū)，以及殘基151-158位兩性分子β折疊區(qū)。其他適合突變的區(qū)域包括CAV VP2的核酸殘基第80到110位，128到143位，151到1 58和160到170位。
優(yōu)選CAV構(gòu)建體選自mut C 86 R，mut C 95 S，mut C 97 S，mut R101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut Q 131 P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，mut K 102 E，mut E 186 G及其組合。
發(fā)現(xiàn)其中特別適合作候選疫苗的CAV包括mut C 86 R，mut R 101G，mut K 102 D，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，mut K 102 E以及mut E 186 G。
優(yōu)選的，CAV構(gòu)建體選自序列編號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25或27。
因?yàn)門TV的基因組結(jié)構(gòu)同CAV相似，所以本發(fā)明人對(duì)CAV研究獲得的減毒信息也將適用于TTV。這已得到下列本發(fā)明人所示的進(jìn)一步支持，TLMV的ORF2具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。因此，從本發(fā)明人對(duì)CAV研究所得的豐富信息，可以預(yù)測(cè)通過在TTV或其他病毒相應(yīng)的或類似的ORF2編碼區(qū)引入突變，可以形成減毒的TTV(或其他相似的環(huán)狀病毒)。
在第二方面，本發(fā)明提供一種環(huán)狀病毒疫苗組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述的減毒環(huán)狀病毒，以及可接受的載體或稀釋劑。
一個(gè)優(yōu)選的形式，病毒為CAV，動(dòng)物為禽類，優(yōu)選為雞。
另一個(gè)優(yōu)選的形式，病毒為TTV，動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。
疫苗組合物可配制成制劑，含有載體或稀釋劑以及一種或多種本發(fā)明的減毒病毒。適合的藥物學(xué)可接受的載體促進(jìn)施用病毒，但其生理學(xué)上為惰性的和/或?qū)邮苷邿o害。載體可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇。適宜用作載體的物質(zhì)包括滅菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油及水。此外，載體或稀釋劑可以包括延遲病毒釋放的物質(zhì)，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，可單獨(dú)或與石蠟組合使用。另外，還可選用緩釋多聚體制劑。
任選的，疫苗組合物還可含防腐劑、化學(xué)穩(wěn)定劑、其他抗原蛋白以及傳統(tǒng)的藥物成分?？梢杂糜谝呙缃M合物中與病毒結(jié)合的合適成分包括，例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸單鉀鹽、乳糖、乳清蛋白水解物以及奶粉。通常，將穩(wěn)定劑、佐劑以及防腐劑加以優(yōu)化以對(duì)目標(biāo)動(dòng)物或人類中的功效確定最佳劑型。合適的防腐劑包括氯代丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、石炭酸以及對(duì)氯酚。
本發(fā)明的疫苗組合物最優(yōu)選生產(chǎn)不含佐劑。當(dāng)需要時(shí)，一種或多種上述的疫苗組分可以與常規(guī)佐劑混合或吸附。佐劑是用于非特異性的刺激劑以吸引淋巴細(xì)胞或提高免疫應(yīng)答。這些佐劑包括礦物油和水、氫氧化鋁、Amphigen、阿夫立定(Avridine)、L121/角鯊烯、D-丙交酯-多聚丙交酯/糖苷，pluronic plyois、胞壁酰二肽、滅活的博德特氏菌、皂甙、以及Quil A。
另外，除了本發(fā)明的病毒，用于治療病毒感染的其他藥劑，諸如免疫刺激劑，預(yù)計(jì)用于減少和消除疾病癥狀，尤其在人中。憑借本發(fā)明的教導(dǎo)，開發(fā)含有這些藥劑的疫苗或治療組合物在本領(lǐng)域一名技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，通過施用有效劑量的上述的疫苗組合物，動(dòng)物或人可以對(duì)環(huán)狀病毒感染進(jìn)行免疫接種。有效量定義為該數(shù)量的環(huán)狀病毒疫苗能夠誘導(dǎo)接受對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)環(huán)狀病毒感染的保護(hù)。疫苗可以由任何適當(dāng)?shù)男问绞┯?。這種組合物可經(jīng)胃腸道外施用、優(yōu)選肌內(nèi)注射或皮下注射。不過，疫苗也配制成制劑通過任何其他合適的途徑施用，包括鼻內(nèi)、口、陰道內(nèi)、皮下或皮內(nèi)，或介蛋途徑。
適宜的有效量的本發(fā)明中環(huán)狀病毒可以由一位本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所需要的免疫反應(yīng)的程度而確定。這樣一種組合物可以一次施用，和/或也可施用一次強(qiáng)化免疫。不過，適宜的劑量可以由獸醫(yī)或大夫根據(jù)免疫接種動(dòng)物或人的年齡、性別、體重及總體健康情況加以調(diào)整。通常疫苗劑量的范圍在1-100百萬TCID50。優(yōu)選的劑量在1000TCID50上下。
類似的，本發(fā)明中疫苗組合物的合適劑量可以方便地由一位本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定下來。使用劑量可以根據(jù)在處理動(dòng)物物種，即體重、年齡和總體健康情況進(jìn)行調(diào)整。
在第三方面，本發(fā)明提供了一種使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括對(duì)動(dòng)物施用根據(jù)本發(fā)明第二方面的疫苗組合物。
在一個(gè)優(yōu)選的形式，病毒為CAV，動(dòng)物為禽類，優(yōu)選為雞。
在另一個(gè)優(yōu)選形式，病毒為TTV，動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。
疫苗可能以任何適當(dāng)?shù)耐緩绞┯?，包括?jīng)鼻內(nèi)、口、陰道內(nèi)、皮下或皮內(nèi)，或介蛋(in ovo)途徑。
對(duì)于禽類，如雞，優(yōu)選的施用途徑包括經(jīng)粘膜、氣霧劑或經(jīng)飲水施用。
施用的疫苗組合物也可用于防止環(huán)狀病毒感染臨床癥狀的出現(xiàn)。
施用的疫苗組合物還可以用于誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)環(huán)狀病毒的免疫反應(yīng)。
在第四方面，本發(fā)明提供一種由環(huán)狀病毒基因組中衍生或獲得的分離的核酸分子，該核酸分子包含至少一部分內(nèi)含突變的病毒蛋白2(VP2)的編碼區(qū)。
優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)。環(huán)狀病毒定義包括CAV及其他病毒，這類病毒具有單鏈負(fù)義環(huán)狀DNA基因組，并表達(dá)功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
優(yōu)選的，分離的核酸分子包括完整的內(nèi)含突變的環(huán)狀病毒基因組，突變可以發(fā)生在VP2翻譯起始區(qū)，或PTPase基序，或酸性α螺旋區(qū)，或堿性β折疊區(qū)。
優(yōu)選的，這種分離出的核酸分子選自序列號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，或27。
在第五方面，本發(fā)明提供一種環(huán)狀病毒疫苗組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明第四方面分離的核酸分子，和一種可接受的載體或稀釋劑。
在一個(gè)優(yōu)選的形式，病毒為CAV，動(dòng)物為禽類，優(yōu)選為雞。
在另一個(gè)優(yōu)選形式，病毒為TTV，動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。
在第六方面，本發(fā)明提供了一種使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫性的方法，該方法包括給動(dòng)物施用根據(jù)本發(fā)明第五方面的疫苗組合物。
在第七方面，本發(fā)明提供一種自環(huán)狀病毒獲得的分離的具有PTPase活性的病毒蛋白2(VP2)。
優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)。環(huán)狀病毒定義包括CAV及任何其他病毒，這類病毒擁有單鏈、負(fù)義、環(huán)狀DNA基因組，并表達(dá)功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
優(yōu)選的，分離的VP2經(jīng)過修飾以改變其PTPase活性。
優(yōu)選的，分離的VP2分子所含的氨基酸序列選自序列號(hào)2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，或28。
在第八方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一方面的減毒環(huán)狀病毒在生產(chǎn)使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫性的疫苗中的應(yīng)用。
在第九方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第四方面的分離的核酸分子使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫性的疫苗中的應(yīng)用。
在第十方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)本發(fā)明第二方面的環(huán)狀病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其包括(a)將衍生或獲自環(huán)狀病毒基因組的分離的核酸分子接種到一個(gè)含胚卵的蛋黃囊中，其中這種核酸分子包括至少包含一部分內(nèi)含突變的病毒蛋白2(VP2)的編碼區(qū)；(b)使環(huán)狀病毒由分離的核酸開始復(fù)制；并且(c)從卵中收集病毒。
優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)或其他相似的病毒。更優(yōu)選的，環(huán)狀病毒為雞貧血癥病毒(CAV)。環(huán)狀病毒定義包括CAV及其他病毒，這類病毒擁有單鏈、負(fù)義、環(huán)狀DNA基因組，并表達(dá)功能上同CAV VP2蛋白具有同等活性的蛋白。
優(yōu)選的，分離的核酸分子包括完整的內(nèi)含突變的環(huán)狀病毒基因組，突變可以發(fā)生在VP2翻譯起始區(qū)，或PTPase基序，或酸性α螺旋區(qū)，或堿性β折疊區(qū)。
在本說明書全文中，除非上下文另有要求，“包含”，或其變體“含有”或“包括”將被理解為暗含所述的成分、整體或步驟，或者是一組成分，整體或步驟，而不包括其他任何成分、整體或步驟，或一組成分、整體及步驟。
任何本說明書中已包括的文件、法規(guī)、材料、設(shè)備、文獻(xiàn)等都只適用于本發(fā)明。與本申請(qǐng)各個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)之前在澳大利亞存在的不同，這些材料中的任何或全部不應(yīng)視為承認(rèn)其形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的常識(shí)。
為使本發(fā)明更清楚地加以理解，參照下列附圖和實(shí)施例，將對(duì)優(yōu)選形式進(jìn)行描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為Chou-Fasman圖，顯示VP2兩個(gè)預(yù)測(cè)的殘基128-143位兩性分子的α螺旋區(qū)，以及殘基151-158位兩性分子的β折疊區(qū)。
圖2顯示mut C 86 R轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖3顯示mut C 95 S轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖4顯示mut C 97 S轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖5顯示mut R 101 G轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖6顯示mut H 103 Y轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖7顯示mut R 129 G轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖8顯示mut Q 131 P轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖9顯示mut R/K/K 150/151/152 G/A/A轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖10顯示mut D/E 161/162 G/G轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞圖11顯示mut L 163 P轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖12顯示mut D 169 G轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞。
圖13顯示與CAV VP2氨基酸序列比對(duì)的R-PTPase同系物，使用ECLUSTALW軟件(WebANGIS)，并使用Seqvu軟件(Garvin Institute)通過圖形顯示。第一行雞α蛋白-酪氨酸磷酸酶(Z32749)，殘基302-306，同源性評(píng)分30％。第二行人類αR-PTPase(PP18433)，殘基301-353，同源性評(píng)分32％。第三行大鼠αR-PTPase(Q03348)，殘基295-347，同源性評(píng)分32％。第四行小鼠αR-PTPase(P18052)，殘基328-380，同源性評(píng)分32％。第五行人類αR-PTPase(17011300A)。第六行人類胎盤蛋白酪氨酸磷酸酶(CAA38065)，殘基292-345，同源性評(píng)分32％。第七行CAV VP2。
圖14顯示CAV VP2氨基酸序列與SANBAN TTV序列的比對(duì)，使用ECLUSTALW軟件(WebANGIS)，并使用Seqvu軟件(GarvinInstitute)通過圖形顯示。Genebank中TT病毒的登記號(hào)被顯示出來。
圖15顯示谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白在12.5％聚丙烯酰胺凝膠中的電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色。第一泳道寬范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)(Biorad)；第二泳道2.6μg CAV VP2-GST融合蛋白；第三泳道3.0μg GST。
圖16顯示W(wǎng)estern印跡結(jié)果，探針使用小鼠抗VP2的COOH-端區(qū)的多克隆抗血清。第一泳道寬范圍的分子量標(biāo)準(zhǔn)(Biorad)；第二泳道3.0μg GST；第三泳道2.6μg CAV VP2-GST融合蛋白。
圖17顯示W(wǎng)estern印跡結(jié)果，探針使用兔抗GST多克隆抗血清。第一泳道分子量標(biāo)準(zhǔn)(Biorad)；第二泳道3.0μg GST；第三泳道2.6μg雞貧血癥病毒VP2-GST融合蛋白。
圖18顯示磷酸鹽從ENDY(Pi)INASL釋放時(shí)間曲線，以VP2-GST融合蛋白或GST對(duì)照制劑催化。反應(yīng)在底物濃度為15nmol的條件下進(jìn)行?；钚訹V]以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所釋放的磷酸鹽nmol數(shù)來衡量。
圖19為在PTPase分析中VP2-GST融合蛋白及GST對(duì)照蛋白的PTPase活性。底物濃度為10nmol，反應(yīng)時(shí)間為1分鐘。起始活性[V0]以每種底物濃度下所釋放的磷酸鹽nmol數(shù)來衡量。測(cè)試中每個(gè)底物濃度均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0.101。
圖20顯示TLMV VP2 PTPase活性同CAV VP2活性的比較。
實(shí)施發(fā)明的方式試驗(yàn)步驟I.CAV疫苗CAV基因組分析及突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)稍后描述的研究(試驗(yàn)步驟-VP2)已經(jīng)建立了PTPase活性，并通過同已知的PTPase 特征基序的比較，對(duì)特征基序中預(yù)測(cè)的關(guān)鍵殘基已加以鑒定。這些殘基是在感染性全長(zhǎng)CAV基因組克隆中設(shè)計(jì)突變策略的基礎(chǔ)。根據(jù)突變對(duì)體外PTPase酶催化影響的了解，可以設(shè)計(jì)突變來修飾PTPase在感染中的作用。為了證明這一策略的實(shí)用性，位于CAV VP2上的突變靶位點(diǎn)為第86，95，97，101，以及103位。第86位殘基由正常狀態(tài)的C突變到S(mut C 86 S)，其他示范性突變?yōu)閙ut C 95 S，mut C 97 S，mut R 101 G和mut H 103 Y。突變mut C 95S和mut C 97 S將預(yù)測(cè)中認(rèn)為對(duì)PTPase活性起關(guān)鍵作用的半胱氨酸去除，這些半胱氨酸在催化過程中參與形成半胱氨酰-磷酸。突變mutR101 G去除堿性帶正電荷的殘基，預(yù)測(cè)這些殘基對(duì)PTPase活性是必須的，并參與磷酸酪氨酸底物同催化性半胱氨酸殘基的協(xié)同過程。第103位和86位殘基位于預(yù)測(cè)的特征基序的側(cè)翼，而且在TT病毒和CAV病毒中高度保守。
在ANGIS界面(WebANGIS，澳大利亞國立基因組信息服務(wù)(Australian National Genomic Information Service))上使用可獲得的軟件，對(duì)VP2蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。蛋白的一個(gè)高級(jí)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)被鑒定朝向VP2的C端。該區(qū)域的Chou-Fasman圖預(yù)測(cè)由α螺旋組成的酸性區(qū)，接著是一個(gè)由α螺旋和β折疊組成的堿性區(qū)，而后是第二個(gè)α螺旋的酸性區(qū)。二級(jí)結(jié)構(gòu)被一系列脯氨酸殘基進(jìn)一步細(xì)分。預(yù)測(cè)有兩個(gè)區(qū)，一個(gè)為128-143位殘基的兩性分子α螺旋區(qū)；另一個(gè)是151-158位殘基的兩性分子β折疊區(qū)(圖1)。高級(jí)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)計(jì)同功能蛋白結(jié)構(gòu)域有關(guān)聯(lián)。對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)可以指導(dǎo)在蛋白中引入突變，以破壞突變所在區(qū)域的結(jié)構(gòu)，因而修飾這一區(qū)域的功能。為顯示在預(yù)測(cè)的堿性兩性分子α螺旋的區(qū)域中引入突變的效應(yīng)，構(gòu)建了mut R 129 G和mut R/K/K 150/151/152 G/A/A突變體，以中和分布在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的極性堿性電荷。還在此區(qū)域中將mut Q 131 P引入α螺旋中，以破壞螺旋。使用同樣的方法，引入mut L 163 P突變可以破壞酸性α螺旋區(qū)域。在酸性α螺旋區(qū)域引入突變mut D/E 161/162 G/G和mut D 169G，試圖中和酸性電荷的分布。突變的CAV基因組核酸序列及VP2氨基酸序列列在序列號(hào)1-28中。
引物設(shè)計(jì)在所有的試驗(yàn)中，使用CAV的CAU269/7澳大利亞分離株。對(duì)于每個(gè)要引入突變的位點(diǎn)，都合成一對(duì)互相重疊的寡核苷酸，分別同CAV VP2序列的兩條鏈互補(bǔ)。設(shè)計(jì)寡核苷酸對(duì)引入編碼氨基酸改變的核苷酸替換。CAV基因組在3個(gè)不同的重疊開放讀碼框中編碼3個(gè)基因。CAV VP2突變靶區(qū)域同ORF1及ORF3重疊，這兩個(gè)讀碼框同VP2相比，讀碼框分別移動(dòng)一個(gè)和兩個(gè)堿基對(duì)。所有引入的突變都沒有改變由ORF2和ORF3讀碼框所編碼的氨基酸序列。表1列出了在CAVVP2中引入突變時(shí)所使用的引物。
表1.在CAV VP2序列內(nèi)引入編碼定向突變的堿基變化的引物。突變編號(hào)根據(jù)VP2氨基酸序列的編號(hào)設(shè)定。突變后的氨基酸殘基被標(biāo)示出來。
導(dǎo)入CAV VP2正義寡核苷酸 負(fù)義寡核苷酸的突變mut C 86 R ctgcgcgaaCgctcgc aacgcgagcGttcgcggttcccacgctaag cagccacacagcgamut C 95 S cgctaagatcAgcaact cgcagttgcTgatcttagcggcgtgmut C 97 S atctgcaacAgcggac attgtccgcTgttgcagaattc atcttagmut R 101 GctgcggacaattcGga cagtgttttcCgaattaaacactgg gtccgcagmut H 103Y cagaaaaTactggtttc gaaaccagtAttttctaagaatgtgccggacgaattgtccgcagmut R 129 GctgcgacccctcGgag ccctgtactcCgagggtacaggggtcgcaggatcgcmut Q131 P cgagtacCgggtaagc cgcttcccGgtactcgagctaaaag ggaggmut R/K/K 150/151/152 ccgaacGgcGCgGCgatacaccGCcGCgcCgG/A/A gtgtataag ttcggggtcmut D/E 161/162 G/GtaagatggcaagGcgtgcgagcCcgCcttgcGgctcgcagacc catcmut L 163 PgacgagcCcgcagacc ggcctctcggtctgcggagag Ggctcgtcmut D 169 GgagaggccgGttttac gcgtaaaaCcggcctcgccttcag tcggtcmut K 102 EctgcggacaattcagaGa gaaaccagtgttCtctacactggtttcgaattgtccgcagmut E 186 GgcgacttcgacgGaga tttatatctCcgtcgaagtataaatttc tcgc
重疊延伸PCR突變通過重疊延伸PCR的方法，將突變引入CAV VP2序列中。除非另有說明，下面的方法適用于所有突變的構(gòu)建體。PCR模板為CAV(pCAU269/7)在質(zhì)粒載體pGEX-4Z(Promega)上的全長(zhǎng)基因組克隆。模板DNA自E.Coli DH5α中制備，其含pCAU269/7克隆，在含50μg/mL的氨芐青霉素選擇下Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LA)中于37℃培養(yǎng)。使用Qiagen試劑盒，根據(jù)其生產(chǎn)商(Qiagen)提供的使用方法提取質(zhì)粒。引入突變的PCR反應(yīng)由兩個(gè)階段來實(shí)現(xiàn)。第一個(gè)階段包括2個(gè)PCR反應(yīng)一個(gè)反應(yīng)由上游側(cè)翼引物到負(fù)義突變引物；另一個(gè)反應(yīng)由下游側(cè)翼引物到正義突變引物。在第二個(gè)階段，來自第一對(duì)引物反應(yīng)的PCR產(chǎn)物作為模板，使用側(cè)翼引物完成縫合PCR反應(yīng)。所生成的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度由側(cè)翼序列限定，其兩條鏈上含有在第一階段PCR中引入模板的突變。
上游側(cè)翼引物CAV.1-5’CTATCGAATTCCGAGTGGTTACTAT3’和下游側(cè)翼引物CAV.10-5’TGCTCACGTATGTCAGGTTC 3’用于縫合PCR反應(yīng)，構(gòu)建mut C 95 S和C 97 S。在第一階段，100μL的反應(yīng)混合物中含dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各300μM，2mMMgSO4，每條引物各200μM，10μL 10×Platinum Pfu Taq DNA聚合酶緩沖液，2U Platinum Pfu Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反應(yīng)為95℃預(yù)熱2分鐘，而后是30圈循環(huán)95℃40秒，60℃60秒，68℃40秒，最后68℃孵育5分鐘。使用Dpn I限制性核酸酶(Life Technologies)消化去除第一階段的模板。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖(1％)凝膠電泳鑒定，切割對(duì)應(yīng)于第一階段PCR反應(yīng)的產(chǎn)物條帶，根據(jù)廠商說明書使用Qiaex II(Qiagen)凝膠回收試劑盒純化。對(duì)于縫合PCR反應(yīng)，100μL的反應(yīng)混合液中含dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各300μM，2mM MgSO4，每條引物各200μM，10μL 10×高保真TaqDNA聚合酶緩沖液，2U高保真Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反應(yīng)為95℃預(yù)熱2分鐘，而后是一圈循環(huán)95℃40秒，57℃90秒，68℃40秒；接著是15圈循環(huán)95℃40秒，57℃60秒，68℃40秒，最后68℃孵育5分鐘。
其他所有突變體的突變方法都按上述實(shí)施mut C 95 S和mm C 97S的方案實(shí)施，但C 86 R和H 103 Y突變除外。這后兩個(gè)反應(yīng)的上游側(cè)翼引物為CAV.2-5’GCGGAGCCGCGCAGGGGCAA 3’，下游側(cè)翼引物為CAV.10。在第二階段縫合PCR時(shí)反應(yīng)方案為96℃預(yù)熱2分鐘，而后是15圈循環(huán)96℃40秒，58℃60秒，72℃60秒，最后72℃孵育5分鐘。
在試圖對(duì)mut C 86 R和mut H 103 Y進(jìn)行PCR縫合突變產(chǎn)物中試驗(yàn)了各種PCR反應(yīng)條件都失敗了。因此在單個(gè)PCR反應(yīng)中，采用全循環(huán)重疊延伸突變的辦法同時(shí)引入mut C 86 R和mut H 103 Y突變。如前文所述設(shè)置100μL反應(yīng)混合物，不過僅使用相應(yīng)的突變引物。PCR反應(yīng)為96℃預(yù)熱2分鐘，而后是一圈循環(huán)96℃40秒，55℃90秒，68℃5分鐘；接著是40圈循環(huán)96℃40秒，60℃60秒，68℃5分鐘，最后68℃孵育5分鐘。使用Dpn I限制性核酸酶消化去除模板DNA，PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化按標(biāo)準(zhǔn)的酚，酚-氯仿，和酚-氯仿-異戊醇萃取，乙醇沉淀進(jìn)行。
突變構(gòu)建體的克隆除非另有說明，下面的方法適用于所有突變構(gòu)建體的克隆。含有突變序列的PCR產(chǎn)物被亞克隆到位于質(zhì)粒載體pGEX-4Z，pCAU269/7上的感染性CAV克隆中。使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割PCR產(chǎn)物，瓊脂糖(1％)凝膠電泳分析。一個(gè)長(zhǎng)357bp的條帶被切膠回收，并根據(jù)廠商的說明書通過Qiaex II(Qiagen)凝膠抽提純化。pCAU269/7同樣也使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割，去除將要由突變序列取代的357bp區(qū)域，自1％瓊脂糖凝膠中純化4687bp的條帶。然后遵照標(biāo)準(zhǔn)方案，將PCR產(chǎn)物連接到同經(jīng)上述兩內(nèi)切酶切割的CAV-pGEX-4T-2(Promega)骨架上。電穿孔法將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，并在含50μg/mL的氨芐青霉素的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LA)中于37℃培養(yǎng)。從選中的克隆中使用Qiagen試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商說明書提取質(zhì)粒。使用CAV.2正向引物和CAV.10反向引物通過PCR的方法對(duì)插入篩選陽性克隆。使用Taq染料脫氧循環(huán)測(cè)序試劑盒(Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin Elmer)對(duì)克隆DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為CAV.2和CAV.10。
構(gòu)建mut C 86 R和mut H 103 Y的方法如前所述，除了有下面的變化。根據(jù)廠商說明書，將純化的第二階段PCR產(chǎn)物首先克隆到pGEM-4T-2載體(Promega)中，而后使用StuI和BsmI限制性核酸酶切割，并亞克隆到pCAU269/7中(方法如前文所述)。mut C 86 R和mut H103 Y PCR產(chǎn)物在用DpnI限制性核酸酶消化后，按照標(biāo)準(zhǔn)方案加以連接，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌，在含50μg/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LA)中于37℃培養(yǎng)。而后使用前面描述過的方法篩選含有突變序列的克隆。
突變病毒基因組轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞pCAU269/7，pEGFP-C2作為對(duì)照，同構(gòu)建體mut C 86 R，mut C 95S，mut C 97 S，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G以及mut E 186分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。使用Qiagen質(zhì)粒純化試劑盒制備轉(zhuǎn)染用的CAV DNA。所有構(gòu)建體都使用EcoR I限制性核酸酶切割，以釋放基因組插入片段，1％瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠切割回收2298bp的條帶，用Qiaex II(Qiagen)質(zhì)粒純化試劑盒，根據(jù)廠商使用說明書加以純化。純化的CAV DNA重懸浮于滅菌的10mMTris(25℃時(shí)pH 8)中。制備轉(zhuǎn)染對(duì)照pEGFP-C2 DNA作為未消化的質(zhì)粒，其中在CMV啟動(dòng)子下游含有綠色熒光蛋白(GFP)基因。
Marek氏病病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞系MDCC-MSB1細(xì)胞系用于所有試驗(yàn)中。細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma Chemical公司，St.Loius，Misssouri，U.S.A)中生長(zhǎng)，內(nèi)補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺(Sigma)，2mM丙酮酸(Sigma)，0.2％NaHCO3，50μg/mL氨芐青霉素(CSL)，50μg/mL慶大霉素(CSL)以及10％胎牛血清(Flow Laboratories)(52℃熱滅活)(完全培養(yǎng)基稱為RF10)，37℃5％CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，以使細(xì)胞周期階段同步化。細(xì)胞在不含F(xiàn)CS的RPMI中漂洗兩次，重懸，使其終濃度為107細(xì)胞/mL，對(duì)每個(gè)樣品，將700μL等份細(xì)胞懸浮液與10μg相關(guān)DNA一起轉(zhuǎn)移到一個(gè)小離心管中，置冰上。在基因脈沖儀(Gene Pulser apparatus)(Bio Rad)中，用長(zhǎng)時(shí)間低電壓在0.4cm間隙電穿孔杯中脈沖通過電內(nèi)化作用實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。在400v，900μF，電阻∞，擴(kuò)展電容下產(chǎn)生脈沖。細(xì)胞在室溫下孵育5分鐘，而后重懸于5mL預(yù)先溫?zé)岬纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中。48小時(shí)后根據(jù)對(duì)照轉(zhuǎn)染組中GFP表達(dá)陽性的細(xì)胞比例評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。
突變CAV構(gòu)建體的復(fù)制能力及感染性的評(píng)估突變病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的感染性及復(fù)制能力的評(píng)估來自轉(zhuǎn)染有突變病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的MDCC-MSB1細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞每隔48小時(shí)以1/10稀釋連續(xù)傳代，共傳10代。根據(jù)表達(dá)VP3蛋白細(xì)胞的百分比，對(duì)樣品(每48小時(shí)取樣)的感染性進(jìn)行評(píng)估。使用免疫熒光法檢測(cè)VP3蛋白。受感染細(xì)胞漂洗兩次，重懸在200μL pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并施加到多孔載片上。在所有的孵育之間，細(xì)胞都用含有0.1％BSA和0.05％吐溫20的PBS溶液漂洗。細(xì)胞用冰冷的90％甲醇固定5分鐘，而后在37℃加濕室中用5％BSA/PBST溶液封閉1小時(shí)。一抗為小鼠抗VP3單克隆抗體(TropBio)，以1/200比例稀釋在0.1％BSA/PBST中，37℃加濕室中孵育1小時(shí)。二抗為羊抗小鼠單克隆抗體，交聯(lián)有異硫氰酸熒光素(Dako)，以1/100比例稀釋在0.1％BSA/PBST中，孵育1小時(shí)。不同傳代數(shù)的熒光細(xì)胞百分比可相對(duì)于對(duì)照MSB1細(xì)胞的背景熒光加以定量測(cè)定。
從最早代次的CAV感染率顯示至少50％的受感染細(xì)胞培養(yǎng)物中制備突變的病毒。培養(yǎng)細(xì)胞凍融三次，而后6000g離心10分鐘收集上清。使用該病毒制備液重新感染MDCC-MSB1細(xì)胞。通過這種方法制備病毒并再次感染細(xì)胞培養(yǎng)物，每種情況下重復(fù)至少三次病毒傳代。通過免疫熒光分析表明復(fù)制全能病毒的回收(如上文所述)，PCR檢測(cè)感染細(xì)胞裂解液，之后用CAV特異性探針進(jìn)行Southern印跡，以及Western印跡檢測(cè)感染細(xì)胞裂解液。在突變CAV感染后48小時(shí)自MDCC-MSB1細(xì)胞純化細(xì)胞DNA制備物，使用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細(xì)胞，酚/氯仿抽提。參考文獻(xiàn)見Meehan，B.M.，Todd，D.，Creelan，J.L，Earle，J.A.，Hoey，E.M.和McNulty，M.S.(1992)。自感染有雞貧血癥介質(zhì)的細(xì)胞中表征病毒DNA克隆基因組片段的克隆復(fù)制形式的序列分析和轉(zhuǎn)染能力(Characterization of viralDNAs from cells infected with chicken anaemia agentsequence analysisof the cloned replicative form and transfection capabilities of clonedgenome fragments).Arch Virol 124，301-319。使用CAV.2和CAV.10引物對(duì)，根據(jù)前文所述的相應(yīng)的PCR反應(yīng)條件，對(duì)突變序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并使用毛細(xì)轉(zhuǎn)移法，轉(zhuǎn)移到Hybond-N(Amersham)尼龍膜上(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989).Molecular Cloning，A Laboratory Mnual，(C.Nolan編).NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press)。轉(zhuǎn)移后，將尼龍膜在6×SSC緩沖液中漂洗10分鐘，并在透射儀上曝露于紫外線照射10分鐘。使用商業(yè)化試劑盒(Boehringer Mannheim)，按使用說明書用隨機(jī)六聚體引發(fā)DNA合成，從CAV基因組克隆DNA制備放射性標(biāo)記的CAV特異性探針。該尼龍膜在含5×SSC、5×Denhart氏溶液、100μg/mL變性鮭魚精子DNA及0.5％SDS的預(yù)雜交緩沖液中浸泡，并向其中加入預(yù)先制備的放射標(biāo)記探針。探針同吸附在膜上的DNA 50℃過夜雜交。膜上的印跡用含2×SSC及0.1％SDS的溶液68℃漂洗三次，每次20分鐘，而后將放射成像膠片于-70℃曝光印跡4小時(shí)。
使用103受突變CAV感染的MDCC-MSB1細(xì)胞的裂解液進(jìn)行Western印跡分析。蛋白在含12.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺膠中電泳，考馬斯亮藍(lán)染色(Laemmli，U.K(1970)噬菌體T4頭部組裝過程中結(jié)構(gòu)蛋白切割(Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4).Nature 227，680-685)。蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜(PVDFImmobilon，Millipore)上。Western印跡先用探針小鼠抗CAV VP3單克隆抗體(TropBio)，以1/2000比例稀釋在0.1％BSA/PBST中，孵育1小時(shí)，接著再用二級(jí)羊抗小鼠單克隆抗體辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物，1/2000比例稀釋，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色(Amersham Pharmacia)。
顯示突變CAV病毒的體外表型對(duì)突變病毒的生長(zhǎng)特性及細(xì)胞致病性進(jìn)行了研究。根據(jù)由pCAU269/7制備的對(duì)照病毒，通過平板來估計(jì)CAV突變病毒的滴度。在8×12多孔板(Nunc)上每孔加200μL濃度為5×105MSB1細(xì)胞/mL，進(jìn)行滴度測(cè)定。病毒儲(chǔ)液進(jìn)行一系列的10倍稀釋，重復(fù)6次，其最終稀釋因素從0.05到0.5×10-10。每隔48小時(shí)，受感染細(xì)胞按1∶4比例連續(xù)傳代至新鮮培養(yǎng)基中。每個(gè)孔按細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)(CPE)的表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分。CPE的指標(biāo)是細(xì)胞腫大、胞核呈空泡狀及染色質(zhì)凝集、細(xì)胞片段化及培養(yǎng)基堿化。細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)傳代，直到在終點(diǎn)或最低稀釋的情況下，連續(xù)傳代之間檢測(cè)沒有差別，此時(shí)有50％的孔中觀察CPE現(xiàn)象。CPE觀察經(jīng)終點(diǎn)稀釋的免疫熒光檢測(cè)證實(shí)。使用Karber法，滴度計(jì)算為50％感染的組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50/mL)。通常需要傳5-7代，才可達(dá)到終點(diǎn)。
通過平板滴度試驗(yàn)測(cè)定的病毒儲(chǔ)液滴度由熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)進(jìn)行證實(shí)，親本病毒作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。將病毒儲(chǔ)液在0.5mL體積的RPMI中從100到10-4以十倍逐級(jí)稀釋。病毒稀釋液而后吸附到4×106的MSB1-MDCC細(xì)胞上，并重懸于4mL RF10中，轉(zhuǎn)移至一個(gè)6孔板上。感染48小時(shí)后，取2mL細(xì)胞以1500g離心5分鐘形成沉淀。這些受感染細(xì)胞經(jīng)固定、透化處理、封閉非特異性表面反應(yīng)性后準(zhǔn)備進(jìn)行免疫熒光染色。所有沖洗使用5mL體積的1％FCS和1mM疊氮鈉(NaN3)的PBS。更換緩沖液需經(jīng)離心，1500g離心5分鐘。細(xì)胞于4℃在1mL 3％超純甲醛及1mM NaN3的PBS中孵育45分鐘而加以固定。固定的細(xì)胞而后用5mL 0.1M的甘氨酸及1mM NaN3漂洗，接著在0.5mL 0.1％Triton-X100和1mM NaN3的PBS中重懸而透化處理5秒，最后用4.5mL的漂洗緩沖液稀釋，隨后漂洗兩次。透化處理后，后面所有的步驟都要在冰上操作細(xì)胞。4℃在10％FCS及1mM NaN3的PBS孵育15分鐘，封閉非特異性反應(yīng)，而后漂洗兩次。一抗為50μL小鼠抗VP3單克隆抗體(TropBio)，以1/50比例稀釋在漂洗緩沖液中，細(xì)胞在此于4℃孵育45分鐘。二抗為羊抗小鼠單克隆抗體，交聯(lián)有FITC(Dako)，以1/50比例稀釋在漂洗緩沖液中，并將細(xì)胞在此于4℃孵育45分鐘。免疫染色的細(xì)胞在200μL 1％超純甲醛及1mMNaN3的PBS中存儲(chǔ)多達(dá)16個(gè)小時(shí)。
pCAU269/7病毒儲(chǔ)液已在前面三次情形下通過平板進(jìn)行了滴度測(cè)試，被用作各個(gè)FACS分析的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。使用Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。流式細(xì)胞儀設(shè)置見表2。
表2 流式細(xì)胞儀設(shè)置參數(shù)探測(cè)器電壓增益模式P1 FSC E01 1.81線性P2 SSC 366 1.00線性P3 FL1 469 1.00對(duì)數(shù)門控的淋巴細(xì)胞群依賴于熒光強(qiáng)度的變化，以柱狀圖顯示?？梢钥吹絻蓚€(gè)分開的正常分布的細(xì)胞群一個(gè)因背景染色和自發(fā)熒光產(chǎn)生的低熒光強(qiáng)度峰，另一個(gè)特異性高熒光強(qiáng)度峰。設(shè)置了一個(gè)可視標(biāo)記物，從而包括高熒光密度染色的細(xì)胞，特別是CAV VP3，以及含有＜0.05％陰性對(duì)照未感染的樣品中的細(xì)胞。標(biāo)記區(qū)中病毒稀釋對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建自病毒儲(chǔ)液。根據(jù)三次試驗(yàn)各自獨(dú)立建立該曲線。測(cè)試病毒儲(chǔ)液的相對(duì)稀釋度通過并行標(biāo)準(zhǔn)曲線而來的FACS曲線轉(zhuǎn)換計(jì)算得出。
如前文所述，使用特異于VP3的單克隆抗體，通過相差顯微鏡以及固定細(xì)胞的染色來對(duì)體外細(xì)胞病理學(xué)進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞在Hoescht中復(fù)染2分鐘。免疫熒光染色(IFA)的進(jìn)行也使用針對(duì)VP2 C端區(qū)的小鼠多克隆抗血清，稀釋度為1/100，二抗為羊抗小鼠多克隆抗體，交聯(lián)有FITC(Dako)，再次以1/100比例稀釋在0.1％BSA/PBST中。
含胚卵的攻擊模型在含胚卵中開發(fā)了攻擊模型，以評(píng)估突變CAV病毒的感染力和體內(nèi)表型。該模型最初用于證實(shí)pCAU269/7 DNA(克隆病毒)轉(zhuǎn)染而得到的病毒和親本CAV病毒株CAU269/7病毒(親本病毒)之間的等效性。親本病毒pCAU269/7和模擬MSB1接種體接種7日齡胚胎的蛋黃囊單獨(dú)重復(fù)3次。而后用病毒mut C 86 R，mut R 101 G，mut H 103Y，mut R 129 G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G，以及mut E 186 G在該模型上進(jìn)行測(cè)試并同克隆病毒及未感染的MSB1細(xì)胞對(duì)照接種體進(jìn)行比較。在兩個(gè)單獨(dú)場(chǎng)合中重復(fù)突變體的攻擊試驗(yàn)。
含胚卵的接種從400mL受MDCC-MSB1感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中制備用于接種的病毒儲(chǔ)液，方法采自Todd，D.，Mackie，D.P.，Mawhinney，K.A.，Conner，T.J.，McNeilly，F(xiàn).和McNulty，M.S(1990).開發(fā)酶聯(lián)免疫吸附分析以檢測(cè)對(duì)雞貧血?jiǎng)┑难蹇贵w(Development of an enzyme-linkedimmunosorbent assay to detect serum antibody to chicken anemia agent).Avian Dis 34，359-363。簡(jiǎn)而言之，400mL細(xì)胞培養(yǎng)物在冰浴中以低頻方式超聲破碎，加入SDS至5％，細(xì)胞裂解液在37℃中孵育30分鐘。10000g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片。15℃、80000g超速離心3小時(shí)收集病毒。病毒沉淀在RPMI培養(yǎng)基中漂洗，再次以80000g離心3小時(shí)。根據(jù)前文描述對(duì)病毒儲(chǔ)液進(jìn)行滴度測(cè)定，將其重懸，終滴度為104.5TCID50/mL。
由SPAFAS Australia Pty.Ltd，James Rd(PO Box641)，WoodendVIC 3442，Australia處獲得無特定病原體的(SPF)受精雞蛋。雞蛋在Multiplo Brooder孵化器中培養(yǎng)，容量為300個(gè)雞蛋，手工轉(zhuǎn)動(dòng)。利用24號(hào)針頭，將0.5mL病毒接種量或104TCID50接種到7日齡含胚卵的蛋黃囊中。
評(píng)估突變病毒的感染性和體內(nèi)表型通過免疫熒光法在分離自骨髓、胸腺、脾臟及粘液囊的細(xì)胞中檢測(cè)病毒蛋白VP3來評(píng)估病毒的感染性。由股骨髓腔中移出的骨髓制備壓片制備物。使用上述對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的免疫熒光檢測(cè)方法，檢測(cè)骨髓中的CAV VP3蛋白。根據(jù)21日齡胚胎的體重、淋巴器官重量、總的病理損害評(píng)分對(duì)體內(nèi)表型進(jìn)行評(píng)估。對(duì)全胚胎、分離的胸腺、脾臟及滑氏囊稱重。Vitteline靜脈穿刺或心臟穿刺采集血液，對(duì)壓縮細(xì)胞的體積(PCV)進(jìn)行測(cè)量。使用一個(gè)CAV感染靶器官損害評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)，對(duì)總的病理損害進(jìn)行評(píng)價(jià)。
損害評(píng)分建立了一套分級(jí)評(píng)分系統(tǒng)，以使得與CAV感染有關(guān)的損害嚴(yán)重性分類相符。發(fā)生在胸腺、骨髓、脾臟、滑氏囊的病理損害，以及出血發(fā)生率評(píng)估為1到4級(jí)。從上述所有損害評(píng)分中對(duì)病理的總嚴(yán)重性得出損害累計(jì)分?jǐn)?shù)，其中胸腺和骨髓損害分?jǐn)?shù)值要乘二，因?yàn)樗鼈兪歉腥镜年P(guān)鍵性器官。在所有的病例中，如果評(píng)分值為1，表示沒有病理損害發(fā)生。表3-8列出對(duì)總的病理損害的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。
表3 胸腺損害評(píng)分

表4 骨髓損害評(píng)分

表5 脾臟損害評(píng)分

表6 滑氏囊損害評(píng)分

表7 出血損害評(píng)分

表8 總累計(jì)損害評(píng)分

結(jié)果1.CAV疫苗含有突變表型的CAV的構(gòu)建通過PCR介導(dǎo)突變的方法，制備構(gòu)建體mut C 86 R，mut C 95 S，mut C 97 S，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129 G，mut Q 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G和mut E 186 G，并將構(gòu)建體亞克隆到全長(zhǎng)基因組CAV克隆pCAU269/7中。通過對(duì)最終的構(gòu)建體從兩個(gè)方向越過突變位點(diǎn)進(jìn)行兩次測(cè)序，證實(shí)每個(gè)構(gòu)建體存在突變。將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物，得到含有突變基因型的病毒。通過對(duì)照質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)染眾多細(xì)胞后表達(dá)GFP的情況來評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率是可變的，并在感染后48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)1到40％的細(xì)胞對(duì)表達(dá)GFP是陽性的。pCAU269/7轉(zhuǎn)染導(dǎo)致CAV VP3瞬時(shí)表達(dá)的最初階段，正如由IFA所觀測(cè)的結(jié)果。瞬時(shí)表達(dá)不必代表病毒的活躍復(fù)制。需要進(jìn)行次數(shù)不等的傳代，才會(huì)出現(xiàn)IFA法證實(shí)對(duì)對(duì)照VP3表達(dá)為陽性的細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象。1/10稀釋連續(xù)傳代。因此CAV VP3陽性細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)代表病毒處于活躍復(fù)制和高感染活性的狀態(tài)，而不僅僅是維持轉(zhuǎn)染的DNA構(gòu)建體。當(dāng)采用pCAU269/7和模擬對(duì)照進(jìn)行平行評(píng)價(jià)時(shí)，所有分析的CAV VP2突變構(gòu)建體都表現(xiàn)出有感染性，并能夠在體外進(jìn)行一定程度的復(fù)制(圖2到12)。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體，病毒復(fù)制能力不依賴于細(xì)胞結(jié)合，這一點(diǎn)可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物再感染后的細(xì)胞裂解及澄清得到證實(shí)。這些過程連續(xù)重復(fù)四代以上。通過檢測(cè)CAV VP3 western印跡；使用CAV特異探針進(jìn)行Southern印跡；用Dpn I限制性核酸內(nèi)切酶消化細(xì)胞培養(yǎng)物去除殘余的轉(zhuǎn)染DNA再進(jìn)行PCR，可證實(shí)病毒的存在。通過對(duì)細(xì)胞裂解物中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可以確認(rèn)突變基因型。
盡管所有的突變構(gòu)建體都可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒，但突變體mut C 95 S和mut C 97 S病毒產(chǎn)生的最大log病毒滴度(TCID50/mL)分別為1.5和1.7，反復(fù)嘗試優(yōu)化培養(yǎng)條件后也是如此。這些病毒滴度過低，無法接種胚胎，故沒有對(duì)突變體mut C 95 S和mut C 97 S進(jìn)行進(jìn)一步的研究。突變體mut C 86 R，mut R 101 G，mut H 103 Y，mut R 129G，mut N 131 P，mut R/K/K 150/151/152 G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L 163 P，mut D 169 G和mut E 186 G在傳代4代以上制備在感染培養(yǎng)物的終體積400mL中、超速離心濃縮、以等效滴度重懸操作后，都獲得了4.5的log病毒滴度(TCID50/mL)(表9)。這些病毒滴度足夠接種胚胎，通常使用0.5mL的儲(chǔ)液或104.2TCID50。
表9.用于胚胎接種的濃縮病毒儲(chǔ)液的滴度。滴度的確定通過平板效價(jià)以及通過克隆病毒標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的FACS分選得出。儲(chǔ)液下評(píng)價(jià)通過PCR及測(cè)序確證其突變基因型。FACS滴度估計(jì)準(zhǔn)確范圍是+/-100.5TCID50/mL。

含胚卵中的感染模型進(jìn)行了一系列的感染試驗(yàn)。試驗(yàn)1和2建立了由克隆構(gòu)建體pCAU269/7(克隆病毒)生成的病毒與親本病毒之間等效的感染性及毒性。在親本病毒及克隆病毒處理組中所有的試驗(yàn)雞都發(fā)生了可歸為嚴(yán)重CAV病理損害的胸腺、骨髓、脾臟的病變及出血癥狀。正如MannWhitney檢驗(yàn)所確定，兩組病毒感染試驗(yàn)雞的胸腺、骨髓、脾、出血癥狀的損害評(píng)分沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組損害評(píng)分同未感染試驗(yàn)雞組相比在所有情形下有顯著差異，但克隆病毒感染組的骨髓評(píng)分除外。同野生型病毒(親本病毒或克隆病毒)相關(guān)的嚴(yán)重病理可以總結(jié)如下所有試驗(yàn)雞或胚胎的筋膜和皮下組織都可發(fā)現(xiàn)輕度到中度瘀點(diǎn)。脾臟體積減小50-80％，總體外觀呈異常蒼白狀，并有囊下出血。在所有的試驗(yàn)雞中，胸腺葉的體積減小，損害歸類為嚴(yán)重級(jí)，大部分脾臟外觀上可見葉出血或囊下出血，葉中可見凝膠狀血性滲出物，與急性細(xì)胞溶解相符。骨髓內(nèi)容物減少，或者表現(xiàn)為蒼白油性外觀，或者出現(xiàn)嚴(yán)重的急性出血和裂解。一小部分試驗(yàn)雞的滑氏囊體積減小，囊腔和實(shí)質(zhì)皺褶表現(xiàn)為總體塌陷。
試驗(yàn)3-12涉及突變病毒和克隆病毒以及未感染對(duì)照的感染試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析感染突變病毒的胚胎組、感染野生型病毒的胚胎組及對(duì)照組中胸腺淋巴細(xì)胞群、滑氏囊、脾臟的損害評(píng)分、體重、淋巴器官重量，結(jié)果列在表10-17。簡(jiǎn)而言之，感染突變病毒的胚胎組中的損害評(píng)分要明顯低于野生病毒感染組，并在大多數(shù)試驗(yàn)雞的淋巴器官中，損害也明顯比較輕(表10)。同樣，在體重、胸腺/體重比值、及脾臟/體重比值、囊/體重比值方面，突變病毒感染組同克隆野生型病毒CAU269/7感染組之間發(fā)現(xiàn)有顯著差異(表11)。
表10.在CAV感染的胚胎中，淋巴組織的損害評(píng)分，出血評(píng)分以及累計(jì)評(píng)分。
中值損害評(píng)分#累計(jì)評(píng)分胸腺 脾臟囊 骨髓出血S RnP1P2S R nP1P2S Rn P1P2S Rn P1P2S R n P1P2S R n P1P2CAU269/73 1-4 24 NA *** 3 1-4 14 NA *** 1 1-3 24 NA 1 3 1-4 24 NA *** 2 1-4 24 NA *** 13 3-18 14 NA ***Mut C87R2 1-4 23 *** *** 2 1-4 23 *** *** 1 1-2 24   2 1-4 13 *** *** 1 1-2 23 ***  6 2-8 13 *** ***Mut R101G1 1-3 11 *** **2 1-2 11 ** *** 1 1-2 11   2 1-2 11 *** *** 2 1-2 11 ** *** 5 3-8 13 *** ***Mut H103Y2 1-4 22 *** **1 1-3 22 *** *** 1 1-3 14   2 1-4 13 *** *** 1 1-2 22 **  6 1-17 13 *** ***Mut R129G3 1-4 20 *** *** 1 1-3 18 *** *1 1-2 18   1 1-2 10 *** 1 1-2 19 ** *4 2-9 10 *** ***Mut Q131P2 1-4 14 *** *** 2 1-4 14 **** 1 1-2 14   2 1-2 7 *** *** 1 1-2 14 * 6 2-8 6 *** ***Mut R/K/K150/151/152G/A/A2 1-3 19 *** *** 1 1-3 19 *** *** 1 1-2 18   2 1-4 9 ***2 1-3 19  *** 7 1-14 9 ** ***Mut D/E161/162G/G3 1-3 5***1 1-2 5**  1 1-2 5   1 1-2 5 ** 1 1-1 5 * 6 1-7 5 ** ***Mut L163P 2 1-5 20 *** *** 1 1-4 20 *** *1 1-2 20   2 1-3 10 ***1 1-3 20 **  9 1-12 10 ** ***Mut D169G 3 2-4 10  *** 3 1-4 10  *** 1 1-2 10   2 1-4 10  *** 2 1-3 10  *** 9 6-13 10 ****Mut E186G 2 1-2 6*** * 1 1-2 6**  1 1-2 6   1 1-2 6 ** 1 1-2 6 **  3 2-5 6 *** **未感染 1 1-1 17 *** NA1 1-1 17 *** NA 1 1-1 17   1 1-1 28 *** NA1 1-1 18 *** NA 1 1-1 17 *** NA 病毒接種E7胚胎# 中值損害評(píng)分S 中值評(píng)分n 試驗(yàn)組大小R 范圍P1 CAU269.7與處理組之間的Mann Whitney檢驗(yàn)P值P2 對(duì)照陰性組與處理組之間的Mann Whitney檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)表11.感染CAV的胚胎的體重，胸腺體重，脾臟體重和囊體重。
體重# 胸腺體重 脾臟體重 囊體重μSEM n P1P2μ SD nP1P2μSD n P1P2μ SDnP1P2CAU269/7 24.8 1.9 24NA ***5.75 2.4 9NA *** 0.21 0.06 9 NA *** 0.64 0.30 9NA**Mut C87R 34.601.4 20*** 9.85 3.3 23 ***  0.34 0.123**  0.91 0.40 23 * **Mut R101G37.951.9 8 *** 10.542.0 7***  0.37 0.07 7 *** 1.01 0.24 7**Mut H103Y35.021.5 10*** 9.94 3.5 22 ***  0.33 0.13 22**  0.78 0.26 22 ***Mut R129G34.131.8 14**  10.683.5 19 ***  0.39 0.12 19*** 1.03 0.35 19 **Mut Q131P36.951.6 10*** 9.38 3.4 13 **  0.39 0.213**  1.08 0.69 13 * Mut R/K/K150/151/152G/A/A31.331.8 16**  10.112.4 18 ***  0.32 0.118**  0.82 0.36 18 **Mut D/E161/162G/G34.383.8 5 *  11.353.4 5***  0.39 0.05 5 *** 0.78 0.36 5*Mut L163P32.211.5 18*  10.183.4 20 ***  0.42 0.120*** 1.01 0.37 20 **Mut D169G33.103.5 10*  9.15 2.5 9**  0.28 0.19 * *1.40 1.10 9* Mut E186G42.940.8 6 *** 10.032.7 6**  0.36 0.16 *** 1.06 0.14 6**未感染 37.122.4 11***NA 10.994.2 16 *** NA 0.39 0.116***NA 1.23 0.52 16 **NA 病毒接種E7胚胎μ 平均重量#(g)，或，平均器官重量(mg)體重(g)SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差n 處理組中的數(shù)目P1 CAU269/7和處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 對(duì)照陰性組和處理組之間的t檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)淋巴細(xì)胞群的檢測(cè)評(píng)估病毒感染對(duì)主要淋巴器官的淋巴細(xì)胞群的影響。由胚胎切除胸腺、脾臟和囊，將其置于冰冷的含1％BSA和1mM NaN3的PBS漂洗緩沖液中。組織經(jīng)初步浸泡并用50mm孔尼龍網(wǎng)過濾。濾器用冰冷的PBS漂洗緩沖液沖洗，收集組織勻漿并將其充分混合。在濾器上的殘余組織的重量通過同濾器最初重量進(jìn)行比較而得出。抽提的細(xì)胞在2000g離心7分鐘，并重懸于4ml PBS漂洗緩沖液中。細(xì)胞懸浮液在一個(gè)Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)梯度以1000g離心5分鐘，收集的細(xì)胞用PBS漂洗緩沖液漂洗兩次。采集三重Coulter計(jì)數(shù)器和血球計(jì)讀數(shù)。
檢查胸腺、脾臟和囊的淋巴細(xì)胞群的體積(表12)，發(fā)現(xiàn)所有的突變病毒同野生型病毒相比，對(duì)淋巴細(xì)胞群的損耗明顯降低。
淋巴細(xì)胞群的熒光激活細(xì)胞分離(FACS)將mAbs小鼠抗雞TCR1抗體(Southem Biotechnology)，小鼠抗雞TCR2抗體(Southem Biotechnology)，小鼠抗雞TCR3(SouthernBiotechnology)，小鼠抗雞CD4-FITC結(jié)合物(Southern Biotechnology)，小鼠抗雞CD8-FITC結(jié)合物(Southem Biotechnology)，以及小鼠抗雞AvBu-1(Fred Davidson博士惠贈(zèng)，Compton Laboratories，UK)的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。兩只White Leghorn雞(SPAFAS)在CO2柜中無痛處死，死后切除胸腺、脾臟和囊，并置于PBS中。如前文所述，純化收集的淋巴細(xì)胞。為確定用于FACS分析的最佳抗體濃度，小鼠抗雞TCR1單抗以1/100，1/1000以及1/5000稀釋度進(jìn)行評(píng)價(jià)。小鼠抗雞TCR2單抗以1/50，1/100以及1/1000稀釋度進(jìn)行評(píng)價(jià)。小鼠抗雞TCR3單抗和小鼠抗雞AvBu-1單抗以1/20，1/50，1/100稀釋度進(jìn)行評(píng)價(jià)。小鼠抗雞CD4-FITC結(jié)合物和小鼠抗雞CD8-FITC結(jié)合物單抗以1/20，1/50，1/100，1/200以及1/500稀釋度進(jìn)行滴度測(cè)定。根據(jù)最高抗體稀釋度確定最佳稀釋，在此最高稀釋度可以最清晰地定義FACS分析上背景染色和信號(hào)染色，以及特定染色的波峰強(qiáng)度。
從每個(gè)胚胎的胸腺和脾臟中分離的淋巴細(xì)胞群使用雙染色技術(shù)，對(duì)TCR1，TCR2，TCR3，CD4，CD8細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行FACS分析以確定陽性細(xì)胞的比例。對(duì)每個(gè)胚胎，雙份樣品(106個(gè)淋巴細(xì)胞)都實(shí)施8種染色處理。在染色的第一階段，細(xì)胞同下面的一種抗體4℃孵育30分鐘小鼠抗雞TCR1單抗以1/1000稀釋在PBS沖洗緩沖液中，或小鼠抗雞TCR2單抗，稀釋度為1/100，或小鼠抗雞TCR3單抗，稀釋度為1/100，或者全部三種單抗的組合。漂洗細(xì)胞，加入兔抗小鼠藻紅蛋白(PE)交聯(lián)的二抗(Sigma Aldrich)，以1/1500稀釋，4℃孵育30分鐘，而后用10％正常小鼠血清(Sigma Aldrich)的PBS 4℃孵育30分鐘封閉。在第三步染色步驟中，每套4種處理用以下抗體4℃下孵育30分鐘1/100稀釋的小鼠抗雞CD4-FITC結(jié)合物，1/100稀釋的小鼠抗雞CD8-FITC結(jié)合物。
由試驗(yàn)雞的胸腺、脾臟和囊收集的淋巴細(xì)胞樣品對(duì)B細(xì)胞標(biāo)記物禽Bu-1(AvBu-1)進(jìn)行染色及分析。含106個(gè)淋巴細(xì)胞的樣品同1/200稀釋的AvBu-1小鼠抗雞單抗孵育，而后用1/1500稀釋的兔抗小鼠PE交聯(lián)二抗4℃孵育30分鐘。
使用流式細(xì)胞儀對(duì)雙陽性和單陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行分析。
數(shù)據(jù)使用Cellquest軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行分析。含10E8個(gè)細(xì)胞的樣品按密度圖表示，F(xiàn)ITC染色強(qiáng)度顯示在X軸上，PE染色強(qiáng)度顯示在Y軸上。由對(duì)照細(xì)胞圖形成的象限用來描繪陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群。計(jì)算該淋巴細(xì)胞子集的總淋巴細(xì)胞庫的絕對(duì)規(guī)模和比例。
使用熒光激活細(xì)胞分離法，分析胸腺、脾臟和囊中不同淋巴細(xì)胞子集，發(fā)現(xiàn)突變病毒對(duì)CD4+TCR-，CD4+TCR1+，CD4+TCR2+的細(xì)胞數(shù)降低明顯減少；在一些病例中CD4+TCR3+、胸腺細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)降低顯著減少(表13)，CD8TCR-的細(xì)胞數(shù)降低顯著減少，而在一些病例是CD8+TCR1+，CD8+TCR2+，CD8+TCR3+，胸腺細(xì)胞的數(shù)目降低顯著減少(表14)?？傮w上，突變也導(dǎo)致脾臟細(xì)胞這些子集中的降低減少(表15及16)。在一些病例，與野生型相比，突變病毒對(duì)B淋巴細(xì)胞群的影響明顯降低(表17)。這些發(fā)現(xiàn)說明VP2突變顯著降低了CAV的免疫抑制效應(yīng)。
表12.由野生型病毒、VP2突變體CAU269/7感染的E21胚胎的胸腺、脾臟和囊中分離的淋巴細(xì)胞群。
平均淋巴細(xì)胞群(×106)#胸腺 脾臟 囊μSEM n P1P2μSEM n P1P2μ SEM n P1P2CAU269/7 760229 ** NA27 29  NA13 29 *** NAMut C87R 4002 7810  **27 410  49 10 10  **Mut R101G1969 427  **93 22 7 ** **355 30 7 ****Mut H103Y4374 619  *** 102 41 9  * 751 24 9  **Mut R129G6080 287  * 155 64 7 ** 118 67  *Mut Q131P3735 855  *** 36 25  73 35  **Mut R/K/K150/151/152G/A/A2452 745  **105 23 5 ** *** 120 95 ** ***Mut D/E161/162G/G5664 370 7  * 110 34 7 ***60 27  **Mut L163P1838 227  **163 57 ** *** 107 37  **Mut D169G4678 173 9  * 248 89 ** *** 341 82 9 ** ***Mut E186G1938 9410 **** 80 210  * 105 210 ****未感染 3824 117 NA **31 27 NA 62 17 NA *** 病毒接種E7胚胎 * P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)#通過coulter細(xì)胞計(jì)測(cè)量的群體大小 ** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)μ 平均值 *** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí)SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差  P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與處理組之間的t檢驗(yàn)P值表13.由VP2突變體及野生型CAU269/7感染的E21胚胎的CD4+胸腺細(xì)胞群。
平均CD4+胸腺細(xì)胞群(×106)#TCR-TCR1+TCR2+TCR3+μ SEM nP1P2μ SEMnP1P2μ SEM nP1P2μ SEM n P1P2CAU269/7133 29 19 *** NA 7 2 7**NA 3524 7**NA 2915 7 NA*Mut C87R728 25118 ** 110 28 10 ** 222 85 11 * * 6633 10**Mut R101G4008 1362 11 *****121 23 8***355 151 7* 167 80 7 *Mut H103Y1985 21 22 * 202 48 8** 332 64 8***295 75 8 **Mut R129G9529 1839 20 *** ***323 1347** 2060 577 7* ** 1311 418 7 * ***Mut Q131P2747 36618 *** ***8732 6** 143 45 6* * 9950 6 Mut R/K/K885 18415 ***8931 5***177 70 5* * 214 82 5 **150/151/152G/A/AMut D/E 161/162G/G524 17012 ** 105 66 5* 1291 114 5  * 869 77 5 Mut L163P8392 1546 8*** ***7516 7***544 277 7  * 501 238 7 *Mut D169G3204 1027 18 *** ***248 1535***1315 530 5  ** 639 287 7 ***Mut E186G8495 9008*** ***195 32 8* ***2911 926 8 ** ** 1427 492 8 * **未感染 977 17819 NA***9835 7NA** 692 213 7 NA ** 409 165 7 * NA 病毒接種E7胚胎# 免疫染色和通過FACS測(cè)量的細(xì)胞群μ 平均值SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與治療組之間的t檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)表14.由VP2突變體及CAU269/7感染的E21胚胎的CD8+胸腺細(xì)胞群。
平均CD8+胸腺細(xì)胞群(×106)#TCR-TCR1+TCR2+TCR3+μ SEM nP1P2μ SEMnP1P2μ SEMnP1P2μ SEMnP1P2CAU269/71904919 *** NA154 7** NA 2822 7*** NA2015 7NA*Mut C87R5604918 * 348 10  ***259 72 11 **147 33 10 *Mut R101G5127 1237 11 * *** 461 2498 * 609 7*** 255 80 7*Mut H103Y2016 174 22 * *** 229 33 8* ***115 64 8313 75 8**Mut R129G12893 2153 20 ***** 503 1487** ** 172 50 7**691 4187*Mut Q131P2830 479 18 *** *** 6635 6  6432 6*** 6150 6* **Mut R/K/K595101 15 ***** 174 1115 * 4918 5*** 258 82 5**150/151/152G/A/AMut D/E 161/162G/G816153 12 *** 188 1155  258 10351704 77 5Mut L163P 8356 808***** 121 28 7 ***150 41 7**619 2387**Mut D169G 4162 1027 18 *** *** 189 64 5 ** 9634 5* 333 2877*Mut E186G 10172 1203 8*** *** 230 18 8** ***505 1168***** 1919 4928未感染1370 288 19 NA*** 118 93 7NA ** 159 14 7NA*** 9325 7* NA 病毒接種E7胚胎# 免疫染色和通過FACS測(cè)量的細(xì)胞群μ 平均值SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與處理組之間的t檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)表15.VP2突變體及CAU269/7感染的E21胚胎的CD4+脾細(xì)胞群。
平均CD4+脾細(xì)胞群(×104)#TCR-TCR1+TCR2+TCR3+μ SEMnP1P2μ SEM n P1P2μ SEMn P1P2μSEM nP1P2CA U269/721 24 ***NA 116 8 * NA7848 8 * NA133 95 8NA *MutC87R32 31 *** 519 30 11  * 307 10111* 417 18 11  Mut R101G20 8 11  ** 176 8  * 321 7 * **17 6 7***Mut H103Y56 25 27  * 122 6 8 * * 7058 2917 * **11192 61 8***Mut R129G61 5* ** 210 190 7  * 142 1197 97 72 7 mut Q131P23 8 18  ***385 17 6  * 155 71 5 93 74 6 mut R/K/K14 5 15  ***2319 13 5  * 2223 55 5 * *** 3860142 5** **150/151/152G/A/AMut D/E 161/162G/G40 9 12  ***134 5  *** 168 5 **13 5 5 **Mut L163P24 12 10  * 121 83 7  * 6428 6 * **57 19 7 *** ***Mut D169G 241 14 29   4363 3 10  * 3226 27310* 3071263 10  *Mut E186G 71 10 ** ** 200 10 8  401 8 * 50 10 8  **未感染17 4 19 NA ***9835 7 NA** 771 42 8 NA* 506 217 7 *NA 病毒接種E7胚胎# 免疫染色和通過FACS測(cè)量的細(xì)胞群μ 平均值SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與處理組之間的t檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)表16.VP2突變體及CAU269/7感染的E21胚胎的CD8+脾細(xì)胞群。
平均CD8+脾細(xì)胞群(×104)#TCR-TCR1+TCR2+TCR3+μSEM n P1P2μ SEMn P1P2μ SEMn P1P2μ SEMn P1P2CA U269/762 24* NA 45 24 8 **NA 152 11 8 * NA 997 8 **NAMutC87R52 32* *** 289 10 11* 755 28 11* 967 73 8 *Mut R101G16 7 10* 23 7 8 * ** 164 7 * ** 259 7 * **Mut H103Y63 4 27 1870 95 9 * * 6417 28 9 * * 7805 28 9 ****MutR129G136 99 * ** 128 1077  4518 7 * ** 6235 7 * **MutQ131P28118** 503 416  621 32 6 * 954 57 5 *Mut R/K/K8 315 2246 645 ** *** 1312 3835 * ** 1410 36 5 *****150/151/152G/A/AMut D/E39610*** 205 5 ** *** 133 5 *****2311 5 * **161/162G/GMut L163P22511** 38137 ** *** 326 8  5424 6 * **Mut D169G141 730* 1922 6910 * 1538 96 10* 801 55 10*Mut E186G5 210 40108  **4010 8  7020 8 **未感染 2024 10NA* 412 147 NA **508 11 8 NA* 295 15 8 NA** 病毒接種E7胚胎* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)# 免疫染色和通過FACS測(cè)量的細(xì)胞群** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)μ平均值*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí)SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差 P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與處理組之間的t檢驗(yàn)P值表17.由野生型和VP2突變體CAU269/7感染的E21胚胎的胸腺、脾臟和囊中分離的B淋巴細(xì)胞群。
平均AvBul+淋巴細(xì)胞群(×106)#胸腺 脾臟 囊μSEM nP1P2μ SEM nP1P2μ SEMnP1P2CAU269/744 20 3* NA9.5 0.3 3*** NA0.7 0.33*NAMut C87R213 40 9* 2.5 0.5 9**2.9 0.79 **Mut R101G120 39 78.3 0.3 753 1.87 *Mut H103Y77 16 97.7 1.4 945 2.49 Mut R129G116 45 82.9 1.5 824 1.28 Mut R/K/K150/151/152G/A/A556 219 5* 143.4 5* 45 7.35***Mut D/E161/162G/G198 155 5240.9 5* 17 1 5 Mut L163P 191 92 86.4 0.2 813 0.68 *Mut D169G 103 32 9* 190.8 964 2.59 Mut E186G 118 13 10 **.3.3 0.8 10 *** *** 8.9 0. 8**未感染 119 76 2NA*6.5 0.3 2 NA*** 29 1.92NA * 病毒接種E7胚胎# 免疫染色和通過FACS測(cè)量的細(xì)胞群μ 平均值SEM 均值標(biāo)準(zhǔn)誤差n 樣品規(guī)模P1 未感染組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值P2 CAU269/7與處理組之間的t檢驗(yàn)P值* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)
II.CAV VP2翻譯起始信號(hào)的突變構(gòu)建在VP2 ATG密碼子周圍含有突變的CAV基因組所有的CAV DNA序列最初來自質(zhì)粒pCAU269/7。使用重疊PCR延伸法，產(chǎn)生含有所需要核苷酸改變的DNA序列。通過PCR擴(kuò)增，使用合成寡核苷酸對(duì)(CAV1/CAV20，CAV19/CAV11，CAV1/CAV22，CAV21/CAV11)，產(chǎn)生CAV基因組的ApaI/BstBI DNA片段，參見表18。
表18.PCR引物

N/A-不適用寡核苷酸對(duì)CAV1/CAV20，CAV19/CAV11，CAV1/CAV22和CAV21/CAV11含有所需要的核苷酸改變，單獨(dú)用于第一輪PCR擴(kuò)增(25圈)，分別生成347bp，495b，347bp和495bp長(zhǎng)度的產(chǎn)物。通過凝膠電泳分析產(chǎn)物確證產(chǎn)物的大小和數(shù)量，并隨后稀釋至25ng/μL，備用(或者是CAV1/CAV20和CAV19/CAV11的PCR產(chǎn)物，或者是CAV1/CAV22和CAV21/CAV11的PCR產(chǎn)物)，而后進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)(20圈)，其中只利用寡核苷酸對(duì)CAV1/CAV11。由此重疊延伸PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物與片段CAV1/CAV11相同，除了在VP2 ATG密碼子周圍引入所需的核苷酸改變(或者是-3位由T變?yōu)锳，對(duì)于pCAU283-3而言；或者是+4位由C變?yōu)镚，對(duì)于pCAU283+4而言)。重疊延伸PCR產(chǎn)物使用ApaI/BstBI切割，分離跨越VP2 ATG密碼子的153bp片段，并分別同用相同酶消化的質(zhì)粒pCAU269/7相連。得到的構(gòu)建體命名為pCAU283-3和pCAU283+4，經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序證實(shí)新引入了突變序列。
序列分析使用雙脫氧末端終止法，在BigDye Terminator測(cè)序儀(ABI Prism)上確定DNA序列，測(cè)序引物使用載體特異引物(T7和SP6)，以及CAV序列特異合成引物(CAV12，2，10，3，9，4，7，5)。
DNA制備及轉(zhuǎn)染使用10μg不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA制備轉(zhuǎn)化用病毒DNA，TritonX-100純化，用EcoR I切割釋放插入的CAV基因組片段。酶切產(chǎn)物使用酚—氯仿抽提，乙醇沉淀，以1μg/μL的濃度重懸。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查等份試樣證實(shí)插入片段的釋放和回收效率。
MSB1細(xì)胞漂洗3次，重懸于700μL溫?zé)岬臒o添加物的RPMI-1640培養(yǎng)基中，至終濃度為4×106。細(xì)胞在0.4cm間隙杯(BioRad)中，通過電穿孔以400V 375μF電轉(zhuǎn)化細(xì)胞。脈沖細(xì)胞在室溫(RT)孵育5分鐘，而后轉(zhuǎn)移到含有3mL預(yù)先溫?zé)岬腞F10的6孔組織培養(yǎng)板中，37℃5％CO2孵育。轉(zhuǎn)染效率(CMV-GFP表達(dá)-pEGFPC2，Clonetech)由對(duì)照孔電轉(zhuǎn)化24小時(shí)后進(jìn)行評(píng)估。觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)(cpe)，并嘗試使用熒光染色檢測(cè)VP3表達(dá)。
間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞漂洗兩次，重懸于PBS中，以每孔約30-50,000個(gè)細(xì)胞涂在12孔載玻片上，空氣干燥，用冰冷丙酮∶甲醇(90∶10)固定。細(xì)胞涂片用5％BSA的PBS/0.05％吐溫20封閉，而后與小鼠來源的CAV VP3特異性單克隆抗體JCU/CAV/1C1(JCU TropBio，Townsville，Queensland)，在37℃加濕室中反應(yīng)60分鐘，并且與熒光素異硫氰酸交聯(lián)的兔抗小鼠IgG抗體反應(yīng)，條件同上。漂洗三次后，涂片使用VectaShield封固，并使用熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果構(gòu)建在VP2 ATG密碼子周圍含有突變的CAV基因組質(zhì)粒pCAU269/7可以用來產(chǎn)生活的感染性CAV病毒顆粒。在此研究中，本發(fā)明人檢測(cè)了突變的CAV-DNA基因組pCAU283-3和pCAU283+4是否同樣可以產(chǎn)生復(fù)制有效的病毒。為達(dá)到這一目的，將這些修飾的CAV基因組和對(duì)照野生型CAV DNA(pCAU269/7)轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞。
分析突變CAV同野生型CAV的復(fù)制速率的差異為確定突變病毒基因組的復(fù)制能力，跟蹤檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的MDCC-MSB1細(xì)胞中CAV蛋白VP3的合成。在轉(zhuǎn)染后40小時(shí)，取一份經(jīng)感染的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品，使用抗VP3的mAB JCU/CAV/1C1進(jìn)行間接熒光免疫分析。同時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物傳代(1∶10)到新鮮的培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染后40小時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同野生型(wt)CAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，經(jīng)轉(zhuǎn)染CAV突變體的細(xì)胞表現(xiàn)出相近的VP3蛋白表達(dá)率。在VP3表達(dá)的細(xì)胞中，可以觀察到病理損傷效應(yīng)，其特征在于外觀為增大、畸形細(xì)胞，并與其他一些文獻(xiàn)報(bào)道的CAV分離株的外觀一致。感染96小時(shí)內(nèi)，這些細(xì)胞明顯呈現(xiàn)總體細(xì)胞退化的現(xiàn)象。
熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VP3染色在野生型或突變基因組中的熒光強(qiáng)度和在細(xì)胞中的定位沒有明顯不同。在感染后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)傳代病毒感染的培養(yǎng)物取樣檢測(cè)是否有活的感染性CAV病毒顆粒產(chǎn)生。在六天內(nèi)，在用突變基因組pCAU283-3或pCAU283+4轉(zhuǎn)化的MDCC-MSB1細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)VP3陽性細(xì)胞。而且，從用這些基因組轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中所采集的培養(yǎng)基當(dāng)傳代到新鮮MDCC-MSB1細(xì)胞時(shí)，不會(huì)造成細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)。
這些結(jié)果表明突變DNA同野生型pCAU269/7相比，在MDCC-MSB1細(xì)胞中的細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)明顯降低，并且只是在轉(zhuǎn)染后瞬時(shí)表達(dá)CAV蛋白。這種突變病毒可以用作雞的DNA疫苗，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒，但卻能夠瞬時(shí)表達(dá)病毒蛋白。
III病毒蛋白2免疫抑制性環(huán)狀病毒-雞貧血癥病毒(CAV)的病毒蛋白2(VP2)已顯示在病毒感染性和復(fù)制過程中起關(guān)鍵性的作用，但是其功能還沒有被完全了解。CAV VP2蛋白的氨基酸序列同許多真核細(xì)胞受體、蛋白酪氨酸磷酸酶α蛋白以及與SANBAN組中的一簇TT病毒具有顯著的同源性。通過PCR擴(kuò)增編碼VP2的ORF，并將其克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pGEX4T-2上。表達(dá)VP2-GST融合蛋白，親和層析純化蛋白。使用通用化的肽底物ENDY(Pi)INASL，測(cè)定了純化的VP2-GST的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性，并用孔雀綠比色分析檢測(cè)游離磷酸根。VP2-GST表現(xiàn)出蛋白酪氨酸磷酸酶活性，Vmax為14280U/mg.min，Km為16.95μM。pH6-7時(shí)具有最佳活性，可被0.01mM原釩酸鹽特異性抑制活性。CAV VP2 PTP唯一的特征基序?yàn)镮CNCGQFRK，對(duì)應(yīng)其94到102位氨基酸殘基。
試驗(yàn)步驟-VP2序列分析使用NCBI界面上的BLASTX軟件(Basic Local Alignment SearchTool)，通過檢索Genebank數(shù)據(jù)庫對(duì)與CAV VP2同源的蛋白序列進(jìn)行鑒定。通過這一方法查到的序列而后使用EclustalW軟件(WebANGIS，Australian National Genomic Information)同CAV序列進(jìn)行比對(duì)。
CAV病毒蛋白2和TLMV ORF2的分子克隆澳大利亞CAV分離株CAU269/7用于所有的試驗(yàn)。使用PCR法，以雙鏈復(fù)制型CAV基因組為模板，擴(kuò)增CAV ORF1(VP2)。CAV感染MDCC-MSB1細(xì)胞后48小時(shí)，使用蛋白酶K和SDS裂解細(xì)胞，酚/氯仿抽提，制備細(xì)胞DNA，所用方法參考下列文獻(xiàn)Meehan，B.M.，Todd，D.，Creelan，J.L.，Earle，J.A.，Hoey，E.M.和McNulty，M.S.(1992).來自感染有雞貧血癥介質(zhì)的細(xì)胞的病毒DNA的表征克隆基因組片段的克隆復(fù)制型序列分析和轉(zhuǎn)染能力(Characterization of viral DNAs fromcells infected with chicken anaema agetsequence analysis of the clonedreplicative form and transfectioncapabilities of cloned genome fragments).Arch Virol 124，301-319。合成正向寡核苷酸引物CAV.1-5’CGGTCCGGATCCATGCACGGAAACGGCGGACAAC 3’和反向引物CAV.2-5’GGTTTGGAATTCTCACACTATACGTACCGGGGC 3’，其中在各自的5’端引入BamHI和EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。100μL的反應(yīng)混合液中含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各300μM，2mMMgCl2，每條引物各200μM，10μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液，2UTaq DNA聚合酶(Promega)，和2μL模板DNA。PCR反應(yīng)為95℃預(yù)熱2分鐘，而后是40圈循環(huán)96℃40秒，60℃40秒，72℃40秒，最后72℃孵育5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1％)電泳分析，切膠回收667bp的PCR產(chǎn)物條帶，使用Qiaex II(Qiagen)凝膠抽提試劑盒根據(jù)其使用說明純化PCR產(chǎn)物，使用BamHI和EcoRI核酸內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，并同適當(dāng)消化的pGEX-4T-2(Promega)載體相連。電穿孔法將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，并在含50μg/mL的氨芐青霉素的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LA)中于37℃培養(yǎng)。使用Taq Dye DeoxyTerminator Cycle Sequencing試劑盒(Perkin Elmer)對(duì)克隆DNA序列測(cè)序，測(cè)序引物為特異于pGEX-4T-2的商業(yè)化測(cè)序引物。
從TLMV株CBD231的引物M-1360到M-1363(258bp-886bp)獲得的純化嵌套式PCR產(chǎn)物由Shunji Mishiro惠贈(zèng)。TLMV ORF2由M-1360到M-1363模板通過PCR擴(kuò)增。
合成正向寡核苷酸引物TLMV.1-5’TTGGATCCATGAGCAGCTTTCTAACACCATC 3’，和反向引物TLMV.2-5’GGCGAATTCTTACCCATCGTCTTCTTCGAAATC 3’，在各自的5’端引入獨(dú)特的BamHI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。
50μL的反應(yīng)混合液中含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各300μM，2mM MgCl2，每條引物各200μM，5μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液，1U Taq DNA聚合酶(Promega)和1μL模板DNA。PCR反應(yīng)為96℃預(yù)熱2分鐘，而后是40圈循環(huán)96℃40秒，56℃40秒，72℃40秒，最后72℃孵育5分鐘。295bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后按上文對(duì)CAV病毒蛋白2所述，克隆到pGEM-T質(zhì)粒載體(Promega)中。插入片段而后亞克隆到pGEX-4T-2質(zhì)粒載體中，測(cè)序證實(shí)插入片段的序列和可讀框。
蛋白表達(dá)與純化CAV VP2產(chǎn)生作為C端與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合。1L含CAVVP2 pGEX-4T-2構(gòu)建體的E.Coli DH5α培養(yǎng)物在含50μg/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基(LA)中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到600nm光密度0.6時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，培養(yǎng)細(xì)胞再孵育一小時(shí)而后收集。6000g離心30分鐘收集菌體，沉淀用PBS漂洗兩次。將細(xì)胞懸浮于25mL含0.3M EDTA、200mg融菌酶、100μg苯甲基磺酰氟(PMSF)/mL(Sigma)的PBS中，10秒鐘低頻超聲沖擊裂解細(xì)胞。裂解物在0.1％Triton X-100中溶解，4℃進(jìn)一步孵育10分鐘，10,000g離心30分鐘去除細(xì)胞碎片。使用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂(Promega)，根據(jù)生產(chǎn)商提供的方案，通過親和層析純化融合蛋白。在含137mM NaCl、2.7mM KCl和25mM TrisHCl(TBS)pH 7.4的緩沖液中將洗脫液充分透析。
從用pGEX-4T-2轉(zhuǎn)化的E.Coli DH5α中純化陰性對(duì)照谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，方法與用于純化GST-VP2融合蛋白的相同。
純化的蛋白通過12.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色(Laemmli，U.K(1970)在噬菌體T4的頭部的組裝中切割結(jié)構(gòu)蛋白(Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4).Nature 227，680-685)。將蛋白電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜(PVDFImmobilon，Millipore)。Western印跡使用兔抗GST多克隆抗體作為探針，以1/500比例稀釋，接著是二抗豬抗兔辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物(Dako)，稀釋度為1/1000，使用Sigma Fast 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Sigma)根據(jù)使用說明進(jìn)行顯色。第二次Western印跡用收集的免疫雞血清作為探針，接著是兔抗雞HRP結(jié)合物，稀釋度為1/500，然后用DAB底物顯色。使用Bradford分析法(BioRad)對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，以胎牛血清蛋白(BSA)(Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)。
從用TLMV ORF2 pGEX-4T-2克隆轉(zhuǎn)化的E.Coli DH5α中純化TLMV ORF2，按照用于純化GST-VP2融合蛋白相同的方法。但是蛋白表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間僅為30分鐘。
肽底物的合成通用的蛋白酪氨酸磷酸酶底物描述于下列文獻(xiàn)，參見Daum，G.，Solca，F(xiàn).，Diltz，C.D.，Zhao，Z.，Cool，D.E.和Fischer，E.H.(1993)。用于蛋白酪氨酸磷酸酶的一般性肽底物(A general peptide substrate forprotein tyrosine phosphatases).Anal Biochem 211，50-54，可用于所有酶分析中。磷酸肽的序列為H-Glu-Asn-Asp-Tyr(PO3H2)-Ile-Asn-Ala-Ser-Leu-OH。簡(jiǎn)而言之，該九肽是使用Fmoc化學(xué)，在固相中手工合成的。肽合成所用到的所有化合物為分析純級(jí)。芴甲氧基羰基(Fmoc)在合成過程中保護(hù)氨基酸殘基(Auspep，Melbourne，Australia)。用于合成的氨基酸殘基為Fmoc-L-Leu-OH，F(xiàn)moc-L-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-L-Ala-OH，F(xiàn)moc-L-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-L-Ile-OH，F(xiàn)moc-L-Tyr(MDSPE)，F(xiàn)moc-L-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-L-Asn(Trt)-OH以及Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH。合成使用載體樹脂PAC-PEG-PS(Perspective Biosystems，容量0.18mmol/g)。氨基酸通過與等摩爾的鄰苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-六氟磷酸尿鹽(O-benzotriazole-N，N，N’，N’-tetra methyl-uronium-hexafluorophosphate(HBTU))(Auspep)以及1-羥基苯并三唑(HoBt)(Auspep)，以及2當(dāng)量的二異丙基乙胺(DIPEA)(Auspep)共同孵育而激活。偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行60分鐘，而后進(jìn)行三硝基苯磺酸測(cè)試。每步偶聯(lián)反應(yīng)后，2.5％1，8-二氮雜雙環(huán)-[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)漂洗以去除Fmoc基團(tuán)。對(duì)于偶聯(lián)4到9位氨基酸殘基，每個(gè)循環(huán)重復(fù)兩次。使用88％三氟乙酸(TFA)、5％酚、2％三-異丙基硅烷(Aldrich，Milwauke，WI)的水溶液處理，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)被去除，肽從樹脂上切割下來。粗制肽在冷二乙醚中沉淀，而后進(jìn)行反相柱高效液相色譜(RP-HPLC)純化，使用0.1％三氟乙酸Vydac C4半制備柱，2％/分鐘梯度乙腈洗脫。使用質(zhì)譜儀鑒定肽。
蛋白酪氨酸磷酸酶檢測(cè)所有蛋白酪氨酸磷酸酶反應(yīng)采用的方法參見Tonks，N K.，diltz，CD.和Fischer，E.H(1991)。純化和分析CD45完整膜蛋白—酪氨酸磷酸酶(Purification and assay of CD45an integral membrane protein-tyrosine phosphatase).Methods Enzymol 201，442-451。除非另外說明，下面的反應(yīng)條件用于所有的檢測(cè)。制備分析緩沖液(AB)，含50mMTris(25℃時(shí)pH 7)，1mM EDTA，50mM 2-巰基乙醇和1％(w/v)BSA。制備第二緩沖液(TB)，含50mM Tris(25℃時(shí)pH 7)和0.01％w/v Brij35(Sigma)。所有的反應(yīng)在微滴定板中的200μL反應(yīng)體系進(jìn)行。AB緩沖液中加入1mM的磷酸肽底物。將15毫微摩爾底物加入每個(gè)1∶1AB和TB緩沖液的三重反應(yīng)混合物中，共14個(gè)。添加9μg VP2-GST或GST啟動(dòng)反應(yīng)。室溫下振蕩孵育反應(yīng)0，1，2，3，4，5或10分鐘，并添加孔雀綠終止反應(yīng)。所有的檢測(cè)反應(yīng)至少重復(fù)三次，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活性平均值繪制曲線。活性值乘以系數(shù)0.52，以說明24kDa GST融合標(biāo)記的質(zhì)量，活性值以每微克酶催化底物的nmol數(shù)來表示。
孔雀綠檢測(cè)可溶性磷酸根釋放到溶液中的磷酸根以孔雀綠比色反應(yīng)來檢測(cè)。簡(jiǎn)而言之，孔雀綠儲(chǔ)液制備方法如下將60mL濃硫酸加入到300mL水中，而后冷卻到室溫，接著加入0.44g孔雀綠(Fisher Scientific)。比色反應(yīng)液顯色前從10mL孔雀綠儲(chǔ)液，3％(w/v)(NH4)3MoO3(Sigma)和0.15％吐溫20(Sigma)中現(xiàn)配。
50微升比色試劑添加到微滴度板的200μL反應(yīng)體系中，在室溫下平衡20分鐘。620nm讀取吸光度數(shù)值，磷酸釋放根據(jù)磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得以校正。
對(duì)磷酸值0，2.5，5，7.5，10，15，20，25，30，40和45nmol，繪制磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。磷酸溶液制備在AB和TB緩沖液以1∶1混合的緩沖液中，微滴定板上的三個(gè)孔每孔加200μL。對(duì)于每種濃度，加50微升比色試劑，室溫下平衡20分鐘。然后620nm讀取吸光度值。
酶動(dòng)力學(xué)和抑制試驗(yàn)將底物加到一式三份的反應(yīng)混合物中，其量為0，2.5，5，7.5，10，15，20，25，30，40nmol。孵育1分鐘，其他所有反應(yīng)條件如前文所述。對(duì)于每個(gè)底物濃度，至少要重復(fù)6次計(jì)算活性，并對(duì)各個(gè)值計(jì)算活性均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。從雙倒數(shù)圖進(jìn)行線性回歸分析得出Vmax和Km值，從該曲線上根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤差及P值得出1/Vmax常數(shù)和Km/Vmax系數(shù)。
用蒸餾水制備1mM Na3VO3·10H2O儲(chǔ)液，并用硫酸調(diào)整到pH10。一旦溶解，Na3VO3·10H2O儲(chǔ)液加入到AB和TB緩沖液中，比例為1∶1∶1，調(diào)整到pH 7。抑制試驗(yàn)用0.1mM，0.01mM和0.001mM的原釩酸鈉進(jìn)行。其他所有反應(yīng)條件如上文所述。試驗(yàn)在10nmol底物和9μg CAV VP2-GST的條件下進(jìn)行，每個(gè)濃度的抑制劑重復(fù)三次。
酶最佳pH設(shè)置反應(yīng)pH值為pH4，pH5，pH6，pH7，pH8及pH9，每個(gè)pH值重復(fù)三次測(cè)定。試驗(yàn)采用10nmol底物和9μg CAV VP2-GST，其他所有反應(yīng)條件如上文所述。在添加孔雀綠之前，使用硫酸或氫氧化鈉將pH值中和到pH7。
TLMV VP2 GST融合蛋白檢測(cè)TLMV-GST融合蛋白根據(jù)前文描述的對(duì)CAV VP2的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)重復(fù)4次。
結(jié)果-VP2序列分析對(duì)CAV VP2蛋白序列通過檢索數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)許多來源于人、大鼠、小鼠和雞的受體蛋白酪氨酸磷酸酶α(R-PTPase)蛋白的序列同CAV VP2具有同源性。CAV VP2蛋白同源性位于所有R-PTPase同系物P環(huán)側(cè)翼的WPD環(huán)上。WPD環(huán)涉及PTPase活性。P環(huán)含有一個(gè)催化位點(diǎn)和特征基序。CAV VP2和R-PTPase之間的相似性在30-32％。R-PTPase同系物和CAV VP2氨基酸序列的比對(duì)見圖13。
從Genebank數(shù)據(jù)庫中還發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)同CAV VP2高度同源的氨基酸序列簇。TT病毒SANBAN組同CAV VP2有顯著的同源性。在所有的SANBAN病毒序列中，同源性區(qū)域延伸自由推定ORF1編碼的氨基酸序列54到80位殘基。對(duì)于PTPase同系物，同源性序列位于蛋白相同的區(qū)域，但是，同源性殘基的模式發(fā)生了變化。CAV VP2同SANBAN病毒序列之間的同源性為48％。CAV VP2序列和SANBAN病毒的比對(duì)見圖14。
蛋白表達(dá)與純化CAV ORF1由CAV澳大利亞分離株CAU269/7進(jìn)行擴(kuò)增。CAU269/7分離株的致病力和感染性同其他CAV分離株所述的等效。將PCR產(chǎn)物克隆到載體pGEX 4T-2上，并在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中將VP2-GST融合蛋白在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中生成與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶重組融合蛋白。12.5％SDS PAGE電泳證實(shí)蛋白的大小和同一性，而后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和western印跡分析(圖15到17)。親和層析純化蛋白，而后經(jīng)SDS-PAGE電泳證實(shí)一個(gè)分子量為58kDa的條帶，對(duì)應(yīng)于CAV VP2-GST融合蛋白。該蛋白帶同抗GTS標(biāo)記的抗血清反應(yīng)，并同混合的超敏雞血清反應(yīng)。經(jīng)透析的蛋白容易地溶于TBS緩沖液中，直接用于PTPase活性檢測(cè)。蛋白濃度通過同標(biāo)準(zhǔn)BSA曲線對(duì)比，利用Bradford檢測(cè)法得出。
肽底物的合成肽底物是在固相支持物上使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)進(jìn)行合成的。在加入磷酸酪氨酸殘基之后，所有隨后的循環(huán)都要重復(fù)兩次，以抵消可能的位阻對(duì)大磷酸基團(tuán)偶聯(lián)的影響?？梢栽诜治鲂蚏P-HPLC上見到單個(gè)峰與純磷酸肽相符，質(zhì)譜分析證實(shí)其分子量為1116.3。
蛋白酪氨酸磷酸酶檢測(cè)以磷酸根濃度為函數(shù)對(duì)分析條件建立620nm吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？兹妇G比色探測(cè)的靈敏度為2.5nmol磷酸根，在磷酸根濃度為0到45nmol的范圍內(nèi)，log[Pi]同620nm光吸收值呈線性關(guān)系。磷酸根濃度大于45nmol會(huì)導(dǎo)致磷鉬酸鹽沉淀，從而破壞了線性關(guān)系。
VP2-GST融合蛋白清晰地顯示出蛋白酪氨酸磷酸酶活性。CAVVP2-GST蛋白與對(duì)照GST蛋白比較，磷酸釋放——時(shí)間曲線見圖18。根據(jù)該曲線線性區(qū)域所對(duì)應(yīng)的時(shí)間范圍，在所有以后的反應(yīng)中，V0在1分鐘時(shí)測(cè)量。VP2-GST蛋白表現(xiàn)出Michaelis-Mentin動(dòng)力學(xué)特性，V0和[S]之間的關(guān)系為1/[V0]＝(1.292)·1/[S]+0.060。VP2-GST及GST對(duì)照蛋白的活性曲線見圖19。VP2-GST的Linewever-Burk雙倒數(shù)圖見圖20。從Linewever-Burk雙倒數(shù)圖，通過線性回歸，得出1/Vmax為0.060(標(biāo)準(zhǔn)偏差＝0.1085，P＜0.0001)。根據(jù)這些結(jié)果，Vmax估計(jì)為14280U/mg min，Km值為16.95μM。所有的試驗(yàn)都使用兩個(gè)不同VP2-GST蛋白制品，重復(fù)三次，每個(gè)底物濃度至少重復(fù)4次。
反應(yīng)pH對(duì)酪氨酸磷酸酶活性的影響和原釩酸鹽對(duì)酪氨酸磷酸酶活性的抑制作用在不同的反應(yīng)pH值下(表19)，對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶活性進(jìn)行了測(cè)量。pH6-pH7時(shí)，VP2-GST PTPase活性最佳。
原釩酸鈉對(duì)VP2-GST PTPase活性的抑制作用見表20。原釩酸鈉的濃度為0.001，0.01，0.1mM可以完全抑制VP2-GST的PTPase活性。
表19反應(yīng)pH對(duì)CAV VP2-GST PTPase活性的影響pH S 平均V0(nmol)SD(nmol)4 101.7460.0075 101.4740.0186 105.6360.1567 105.6120.0418 101.8290.0499 100.0000.000表20 原釩酸鈉對(duì)VP2-GST PTPase活性的抑制作用[原釩酸鹽]mMol[S]nmol V0- 10 5.6120.001 10 0.0020.01 10 0.0000.1 10 0.000TLMV ORF2產(chǎn)物的PTPase活性TLMV VP2-GST融合蛋白的PTPase活性與CAV VP2-GST對(duì)照蛋白進(jìn)行了比較。穩(wěn)態(tài)活性等效于CAV VP2所示(圖20)。
III.VP2
本研究的目的之一是探討CAV VP2蛋白是否是一種新的病毒PTPase。本研究最初設(shè)想來源于發(fā)現(xiàn)CAV VP2同許多PTPase具有同源性，以及VP2序列中的PTPase特征基序。PTPase的特征是具有最小的PTPASE特征基序CXXXXXR，利用半胱氨酰磷酸酶中間體可以催化脫磷酸化作用。蛋白周圍的結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)蛋白活性及底物特異性。VP2作為一種非結(jié)構(gòu)性蛋白，表達(dá)水平很低但是對(duì)感染性至關(guān)重要，且在CAV和TT病毒間高度保守，這些特征都同重要的調(diào)節(jié)蛋白，如PTPase的性質(zhì)相吻合。
本研究首次確認(rèn)VP2蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)VP2蛋白是一種新的PTPase。這些酶(PTPase)的定義是指具有從磷酸蛋白底物的磷酸化酪氨酸殘基上特異性去除磷酸根的能力。PTPase發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同蛋白底物復(fù)合物具有不同的特異活性。上文已描述了通用肽底物ENDY(Pi)INASL，可以用于這些分析中。許多PTPase使用這一底物，因而可以對(duì)它們的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。時(shí)間曲線及動(dòng)力學(xué)研究清晰地顯示CAV VP2具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。對(duì)PTPase家族還已定義了一系列其他特征。作為一個(gè)家族，這些酶對(duì)EDTA的抑制活性作用有抗性，并在中性pH值(pH 5.5-7)時(shí)有最佳活性。CAV VP2的研究發(fā)現(xiàn)，分析緩沖液中添加EDTA對(duì)于酶的活性是必須的，活性在pH6-7時(shí)最佳。這些結(jié)果同該蛋白家族的共性相吻合。
PTPase催化反應(yīng)過程中，催化中心激活的半胱氨酸形成半胱氨酰磷酸中間體，從而催化去除磷酸酪氨酸中的磷酸根。催化機(jī)制獨(dú)特于PTPase家族，并可被低濃度的原釩酸鹽抑制。原釩酸鹽化合物是磷酸根的結(jié)構(gòu)類似物，同樣可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制半胱氨酰-磷酸中間體。PTPase家族成員在發(fā)生抑制作用所需的原釩酸鹽濃度方面有差異。對(duì)CAV VP2的活性而言，在原釩酸鹽濃度低至0.001mM時(shí)即可達(dá)到最大抑制效應(yīng)。
在前文所述的反應(yīng)條件下，CAV VP2的Vmax為14280U/mg min，Km值為16.95μM。CAV VP2活性處于高分子量和低分子量(Mr)PTPase之間的中等水平。低分子量PTPase具有高特異性活性。例如PTP1B，Vmax為20000U/mg min。高分子量PTPase總體上具有低的特異性活性，雖然這一活性取決于底物的特異性。例如人脾臟來源的CD45的Vmax為1000U/mg min。
已詳細(xì)研究了一些蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)的晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。從高分子量PTPase的研究中，已將共有特征基序定義為(I/V)HCXAGXGR(S/T)。半胱氨酸殘基在結(jié)合磷酸根方面具有關(guān)鍵性的作用，以及精氨酸協(xié)調(diào)催化中心中的磷酸酪氨酸。PTPase超家族的最小特征基序限定為CXXXXXR。得出這一結(jié)論是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)一小組低分子量PTPase沒有同源于PTPase保守區(qū)的整個(gè)序列，但是含有該最小特征基序。同樣在很廣的pH值范圍內(nèi)低分子量PTPase的特征也具有活性。提出的CAV VP2催化基序?yàn)镮CNCGQFRK，由94到102位氨基酸殘基組成。推論的CAV VP2特征基序同高分子量PTPase所見的高度保守的共有基序不同。但是，CAV VP2在延伸區(qū)同高分子量PTPase具有序列同源性，這一點(diǎn)沒有在低分子量PTPase上觀察到。此外，諸如最適pH的動(dòng)力學(xué)特性也是高分子量PTPase亞組的特征。
對(duì)數(shù)據(jù)庫同源性檢索發(fā)現(xiàn)，許多真核受體PTPase(R-PTPase)與CAV VP2蛋白在將近53個(gè)氨基酸殘基的延伸區(qū)內(nèi)的同一性評(píng)分為30-32％，所述延伸區(qū)包括提出的特征基序。這一組R-PTPase相互之間具有顯著的同源性。矛盾的是，CAV VP2同真核PTPase間的序列同源性部分位于真核PTPase蛋白催化基序的上游區(qū)域。真核PTPase的蛋白結(jié)構(gòu)域已顯示為PTPase蛋白的組織模型，在許多PTPase中有兩個(gè)串聯(lián)的保守催化區(qū)，但只有其中一個(gè)具有功能?；钚訴P2催化折疊與位于同樣功能的真核基序側(cè)翼的蛋白折疊之間顯著的同源性可以說明真核蛋白功能上的冗余性。PTPase的冗余性可能不僅以上述已經(jīng)了解的整個(gè)區(qū)域存在，而且還可能表現(xiàn)在蛋白折疊內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上。
另一個(gè)令人感興趣的發(fā)現(xiàn)是CAV VP2和TT病毒中的SANBAN亞組間的相同區(qū)域上有顯著同源性。TT病毒最近已從人類宿主中分離出來，特征為一異源簇的單鏈、負(fù)義環(huán)狀DNA病毒。這組病毒的序列分析顯示它們總體上同CAV有最大的同源性。同CAV序列同源性最高的部位位于非編碼區(qū)以及在TTV病毒的ORF2和CAV VP2之間。所有的TTV，SANBAN，YONBAN及TLMV病毒(類TTV迷你病毒(mini virus))具有同CAV ORF2內(nèi)的序列WX7HX3CXCX5H共同的序列。這一同源序列對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)的PTPase特征基序的5’端。但是SANBAN分離株同CAV VP2具有更廣泛的同源性，提出的特征基序的整個(gè)序列都具有同源性。最近有人建議將TTV，SANBAN，YONBAN，TLMV以及CAV歸類為副環(huán)狀病毒科。當(dāng)前在TT病毒中對(duì)ORF的命名只是根據(jù)序列分析而制定的，因?yàn)檫@些病毒還沒有在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，或者這些病毒蛋白的表達(dá)模式也不清楚。
以上分析結(jié)果明確提示，TLMV ORF2是第二個(gè)新的病毒PTPase。TLMV ORF2顯示的PTPase活性指示一種普遍的存在于CAV和TT病毒感染和復(fù)制過程中的機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)同在基因組結(jié)構(gòu)中所發(fā)現(xiàn)的密切相似性以及TTV和CAV間的序列同源性相吻合。
蛋白酪氨酸磷酸酶已知在有絲分裂、基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)以及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)中起作用。CAV感染多達(dá)21日齡的雞的T淋巴細(xì)胞及成血細(xì)胞群，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制及貧血癥。感染過程中的VP2 PTPase活性可代表一種通過在受感染淋巴細(xì)胞群中病毒誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)變化的病毒毒性機(jī)理。所有前述的病毒編碼的調(diào)節(jié)蛋白中都含有大的基因組以及大量的編碼容量的病毒。這表明這些病毒可以在表達(dá)關(guān)鍵病毒結(jié)構(gòu)和復(fù)制蛋白的同時(shí)，還保留有細(xì)胞調(diào)控蛋白。這些蛋白包括上文描述的牛痘病毒的VH1PTPase。因此本發(fā)現(xiàn)具有不一般的意義，因?yàn)镃AV病毒具有極小的基因組(2.3kb)，從重疊的開放讀碼框中只表達(dá)3個(gè)病毒蛋白。所以CAV高度依賴于宿主功能，以完成其復(fù)制周期，有可能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞周期是該病毒的一個(gè)關(guān)鍵性的功能。我們目前所知道的是，CAV VP2 PTPase僅僅是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的PTPase，而且是這類病毒中唯一的PTPase。
IV.單鏈及雙鏈CAV基因組DNA接種胚胎前言通過雙鏈DNA轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞，由CAV基因組制備感染性病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法見Noteborn，M.H.，de Boer，G.F.，van Roozelaar，D.J.，Karreman，C.，Kranenburg，O.，Vos，J.G.，Jeurissen，S.H.，Hoeben，R.C.，Zantema，A.和Koch，G.(1991)。含有傳染性復(fù)制周期所有元件的克隆雞貧血癥病毒DNA的表征(Characterisation of cloned chickenanemia virus DNA that contains all elements for the infectious replicationcycle).J Virol 65，3131-3139。其他由基因組制備CAV病毒粒的方法還未見報(bào)道，也沒有將任何病毒的裸基因組接種雞蛋黃囊的文獻(xiàn)報(bào)道?？梢杂寐鉊NA基因組介蛋生成感染性病毒，將允許不經(jīng)轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞的中間步驟即可得到疫苗病毒。這一方法具有提高生物安全性的潛力，因?yàn)榻?jīng)轉(zhuǎn)化的MDCC-MSB1細(xì)胞系含有潛伏的Marek氏病病毒基因組，而且細(xì)胞傳代也要冒因疏忽導(dǎo)致的疫苗病毒污染的危險(xiǎn)。
雞貧血癥病毒，同其他環(huán)狀病毒科成員一樣，具有一個(gè)環(huán)形、負(fù)義單鏈DNA基因組，包裹在非衣殼蛋白中。有人研究過該病毒的正常感染周期，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制經(jīng)歷一段雙鏈的復(fù)制中間體。雙鏈的復(fù)制形式為2.3kbp，1.3kbp和0.8kbp，開放或封閉環(huán)狀，已在感染有CAV的MDCC-MSB1細(xì)胞中得到鑒定。雙鏈的復(fù)制中間體、轉(zhuǎn)錄本以及衣殼化的單鏈病毒基因組合成的順序現(xiàn)在還不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用雙鏈形式的基因組轉(zhuǎn)化MDCC-MSB1細(xì)胞，可以容易地從中回收到感染性病毒。因此，2319bp克隆的CAV DNA序列含有宿主細(xì)胞中生成感染性病毒所需的所有遺傳信息。從轉(zhuǎn)染單鏈DNA基因組中回收復(fù)制能力的病毒還未加以研究。對(duì)于由單鏈DNA基因組轉(zhuǎn)化開始進(jìn)行的病毒復(fù)制而言，病毒需要從胞質(zhì)中單鏈基因組合成具復(fù)制能力的雙鏈形式。
本研究的目的是探討病毒復(fù)制是否可以從用不同CAV基因組的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的MDCC-MSB1細(xì)胞中進(jìn)行。研究從單鏈或雙鏈形式的基因組、線性或環(huán)狀、正義鏈或負(fù)義鏈中進(jìn)行病毒復(fù)制的能力。進(jìn)一步的目標(biāo)是研究將這些DNA構(gòu)建體接種到蛋黃囊后，病毒復(fù)制是否可以在體內(nèi)進(jìn)行，并研究不同形式的基因組構(gòu)建體在接種到蛋黃囊后產(chǎn)生感染性病毒的相對(duì)效率。
CAV基因組雙向克隆到M13.t130噬菌體中為獲得正義鏈和負(fù)義鏈、單鏈CAV基因組，將病毒基因組由pGEX-4Z質(zhì)粒載體亞克隆到M13.t130噬菌體中。在pGEX-4Z載體中構(gòu)建pCAU269/7基因組克隆的方法參見下列文獻(xiàn)Brown，H.K.，Browning，G.F.，Scott，P.C.和Crabb，B.S.(2000)。全長(zhǎng)感染性克隆雞貧血癥病毒的致病性澳大利亞分離株(Full-length infectious clone of apathogenic Australian isolate of chicken anaemia virus).Aust Vet J 78，637-640。將CAU269/7基因組由pGEX-4Z質(zhì)粒載體雙向克隆到M13.t130噬菌體中。在M13.t130噬菌體載體中插入基因組的方向通過PstI酶切模式分析而得以確定。PstI酶切含有插入正義鏈方向?yàn)?’-3’的CAV基因組的M13.t130克隆(命名為CAV.M13.pos)后，可看到將近8.9kbp和0.6kbp的條帶。PstI酶切含有插入負(fù)義鏈方向?yàn)?’-3’的CAV基因組的M13.t130克隆(命名為CAV.M13.neg)后，可看到將近7.8kbp和1.8kbp的條帶。這些克隆中CAV基因組的方向經(jīng)雙向測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，測(cè)序引物可與位于克隆位點(diǎn)側(cè)翼的序列雜交。
使用CAV基因組構(gòu)建體轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞不同CAV基因組構(gòu)建體轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后，對(duì)病毒生長(zhǎng)效率進(jìn)行了評(píng)估。制備了單鏈及雙鏈形式的CAV基因組。雙鏈CAVDNA由pCAU269/7質(zhì)粒的培養(yǎng)物制備。通過EcoRI酶切pCAU269/7克隆，釋放出CAV基因組，從中得到大小正確的條帶，而后經(jīng)1％凝膠電泳純化及重新連接成環(huán)狀。1％凝膠電泳純化大小正確的由CAV.M13.pos和CAV.M13.neg噬菌體克隆培養(yǎng)物中制備的單鏈CAVDNA的條帶。通過使用特異性消化單鏈DNA的綠豆核酸內(nèi)切酶消化所有DNA，證明制備物中只有單鏈DNA。將與位于克隆位點(diǎn)兩側(cè)的序列雜交的引物與單鏈的CAV.M13.pos以及CAV.M13.neg制備物退火，而后使用EcoRI內(nèi)切酶消化。DNA經(jīng)連接反應(yīng)重新環(huán)化，而后通過光譜定量分析。
在用這些DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后的病毒再生經(jīng)依序細(xì)胞培養(yǎng)物傳代后，通過免疫熒光法加以評(píng)價(jià)，從細(xì)胞裂解物中收集無細(xì)胞的病毒制備液。使用下面的基因組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，回收病毒(i)由CAV.M13.pos克隆制備的環(huán)狀、正義、單鏈CAV DNA(ii)由CAV.M13.pos克隆制備的線性、正義，單鏈CAV DNA(iii)由CAV.M13.neg克隆制備的環(huán)狀、負(fù)義、單鏈CAV DNA；(iv)由CAV.M13.neg克隆制備的線性、負(fù)義、單鏈CAV DNA；以及(v)pCAU269/7經(jīng)EcoRI消化后釋放的雙鏈、環(huán)狀CAV DNA。
在用對(duì)照質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后，沒有回收到病毒。使用pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48小時(shí)檢測(cè)熒光細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA的轉(zhuǎn)染效率為10％。
同感染有雙鏈形式的DNA構(gòu)建體相比，用所有單鏈構(gòu)建體轉(zhuǎn)染導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例顯著提高。在用各種單鏈形式的基因組轉(zhuǎn)染后，通過第二次培養(yǎng)物傳代，MDCC-MSB1細(xì)胞中至少有50％受到病毒感染。但是，在雙鏈CAV基因組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，只有經(jīng)過第四次傳代后，才可觀測(cè)到50％的感染率。正義或負(fù)義單鏈基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的效果沒有區(qū)別，線性和環(huán)狀基因組轉(zhuǎn)染效果也沒有區(qū)別。
胚胎中接種DNA不同CAV基因組構(gòu)建體介蛋(in ovo)接種后，對(duì)病毒生長(zhǎng)效率進(jìn)行了評(píng)估。將不同CAV基因組構(gòu)建體接種到7日齡胚胎(E7)組的蛋黃囊中。整個(gè)E18雞胚的勻漿上清中的病毒滴度通過接種MDCC-MSB1細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估(表21)。從接種有下面基因組DNA構(gòu)建體E18胚胎勻漿中回收病毒(表21)(i)由CAV.M13.pos克隆制備的環(huán)狀、正義、單鏈CAV DNA；(ii)由CAV.M13.pos克隆制備的線性、正義，單鏈CAV DNA；(iii)由CAV.M13.neg克隆制備的環(huán)狀、負(fù)義、單鏈CAV DNA；(iv)由CAV.M13.neg克隆制備的線性、負(fù)義、單鏈CAV DNA；以及(v)pCAU269/7經(jīng)EcoRI消化后衍生的，雙鏈、環(huán)狀CAV DNA。
從用對(duì)照質(zhì)粒DNA接種的E18胚勻漿物中沒有回收到病毒(表21)。在用正義、環(huán)狀、單鏈基因組接種的胚中，病毒生長(zhǎng)的效率很低，僅從五分之一的胚胎中回收到病毒(表21)。使用環(huán)狀、負(fù)義、單鏈基因組接種的雞胚具有最高的病毒生長(zhǎng)效率，這也是基因組在病毒粒中存在的形式。環(huán)狀、負(fù)義、單鏈基因組接種后所得到的平均滴度在0.001的水平，高于雙鏈基因組接種的平均滴度。
用仍含在質(zhì)粒載體中的克隆突變病毒基因組接種孵育6天后的雞蛋黃囊中，以證實(shí)本研究的發(fā)現(xiàn)。三個(gè)突變基因組為mut C86R，mutH103Y，以及mut Q13P。在孵育16天時(shí)，從胚胎中獲取標(biāo)本，制備尿囊絨膜和骨髓涂片，而后用抗CAV VP3免疫熒光抗體染色。在所有的接種的雞蛋中，都可觀察到病毒復(fù)制的證據(jù)，如特異性VP3染色所表明。
V.使用單鏈或雙鏈CAV基因組DNA接種胚胎本研究中開發(fā)了一項(xiàng)新的方法，即使用裸DNA基因組接種E6或E7雞胚后，介蛋(in ovo)培養(yǎng)CAV。這是第一次研究表明，使用DNA接種后，CAV可以在體內(nèi)生長(zhǎng)，這也是第一次報(bào)道將任何禽類病毒病原體的裸病毒基因組接種到蛋黃囊。
本研究已表明了DNA接種到蛋黃囊中用于培養(yǎng)CAV病毒的效率。將CAV DNA傳遞到胚胎的蛋黃囊或通過其他介蛋(in ovo)途徑可用作免疫接種的途徑。
這一方法代表顯著的生物安全性方面的進(jìn)展，因?yàn)樵摲椒軌驈臒o細(xì)胞系統(tǒng)的操作基因組中制備具有感染力的病毒。操作基因組轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞的方法培養(yǎng)病毒，用這樣的方法制備的疫苗可能混有細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的成分，而這些成分可能帶來生物安全方面的問題。用基因組DNA接種胚胎蛋黃囊制備病毒的能力因此可以顯著提高生物安全性。從MDCC-MSB1細(xì)胞中獲得的CAV病毒滴度通常局限在105到106TCID50這一較低的水平?？梢酝ㄟ^多輪蛋黃囊接種有可能增加病毒的滴度。
對(duì)于單鏈、負(fù)義、環(huán)狀基因組而樣，蛋黃囊接種的效率最高(表21)。單鏈、負(fù)義、環(huán)狀基因組接種可以獲得高滴度的感染性病毒，雙鏈、環(huán)狀基因組接種的蛋黃囊中可以獲得中等滴度的感染性病毒(表21)。從單鏈、負(fù)義、環(huán)狀基因組接種中獲得的病毒滴度比雙鏈基因組接種的高3log倍(表21)。環(huán)狀、負(fù)義基因組和線性、負(fù)義基因組接種所獲得的滴度顯著不同。從負(fù)義、線性基因組，正義、環(huán)狀基因組或正義、線性基因組接種獲取的病毒滴度低。假設(shè)在MDCC-MSB1細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率中，單鏈DNA構(gòu)建體不同形式之間轉(zhuǎn)染效率沒有差異，蛋黃囊接種后效率的差異可能是由于病毒基因組一旦在胞質(zhì)中加工后影響其上游而造成的。將DNA構(gòu)建體胞外接種到蛋黃囊后必須保持不被降解，并進(jìn)入宿主靶細(xì)胞用于開始病毒復(fù)制。因此，在正義和負(fù)義構(gòu)建體之間觀察到的差異很可能同蛋黃囊接種后的構(gòu)建體穩(wěn)定性有關(guān)，還和其吸收到靶細(xì)胞的能力有關(guān)。負(fù)義、環(huán)狀鏈的折疊形式及確證可能是造成這種差異的原因。
單鏈基因組轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞后可以得到有感染性的病毒。在正義鏈和負(fù)義鏈之間的效果沒有不同，環(huán)狀結(jié)構(gòu)和線性結(jié)構(gòu)之間也沒有差異。這很可能是因?yàn)橐坏┱x鏈或負(fù)義鏈進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就可合成環(huán)狀、雙鏈復(fù)制型中間體。單鏈、負(fù)義基因組轉(zhuǎn)染與雙鏈基因組相比，在更早傳代時(shí)，可以導(dǎo)致感染性更高。
CAV雙鏈基因組轉(zhuǎn)染MDCC-MSB1細(xì)胞的方法參見文獻(xiàn)Noteborn，M.H.，de Boer，G.F.，van Roozelaar，D.J.，Karreman，C.，Kranenburg，O.，Vos，J.G.，Jeurissen，S.H.，Hoeben，R.C.，Zantema，A.和Koch，G.(1991)。含有感染性復(fù)制周期的所有元件的克隆雞貧血癥病毒DNA的表征(Characterisation of cloned chicken anemia virus DNA thatcontains all elements for the infectious replication cycle).J Virol 65，3131-3139，這一技術(shù)已經(jīng)在多篇出版的文獻(xiàn)中重復(fù)使用。使用這一技術(shù)，DNA基因組可以容易地在體外進(jìn)行操作，并可以精確地加以改變，而后再通過細(xì)胞培養(yǎng)生成病毒粒。單鏈構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染可提高這一過程的效率。轉(zhuǎn)染效率提高的方法特別有利于病毒突變株的培養(yǎng)，這種突變株可以改變其生長(zhǎng)特性，如延長(zhǎng)潛伏期或降低爆發(fā)病毒量。在M13噬菌體克隆系統(tǒng)中引物突變只包括單個(gè)突變步驟，以產(chǎn)生單鏈突變基因組，因此在技術(shù)上更快速更簡(jiǎn)單。M13噬菌體載體因此是合適的質(zhì)粒增殖的替代系統(tǒng)，可用于CAV基因組的操作。
進(jìn)一步的研究顯示，使用在質(zhì)粒載體上的克隆基因組，也能夠接種到含胚卵的蛋黃囊中作為產(chǎn)生感染性病毒的方法。因此這一過程可以用于回收突變基因組，也用于疫苗的生產(chǎn)。研究還顯示，直接將克隆的突變CAV基因組接種到卵中，可以用作一種免疫接種的方法，特別是突變病毒對(duì)雞胚為減毒的情形。
表21.不同基因組構(gòu)建體接種蛋黃囊后E18胚胎中CAV的平均滴度。
DNA接種SDP值#對(duì)照陰性 0 0 NAdsa2.90.6***(-ve)bssccircd5.50.7***(-ve)ss line1.30.9**(+ve)fss circ 0.60.9(+ve)ss lin1.60.3*** 平均滴度，以log10TCID50/胚胎表示SD 標(biāo)準(zhǔn)偏差# 對(duì)照陰性組與處理組之間的t檢驗(yàn)P值a 雙鏈b 負(fù)義c 單鏈d 環(huán)狀基因組e 線性基因組f 正義NA 不適用* P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.05級(jí)** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.01級(jí)*** P值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0.001級(jí) P值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05級(jí)VI.對(duì)選中的突變CAV病毒的減毒和誘導(dǎo)日齡雞的保護(hù)性免疫力的評(píng)估目的為了評(píng)估選中的CAV突變病毒施用于日齡雞的安全性，并評(píng)估日齡雞接種CAV突變體后誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫力。
方法有六個(gè)試驗(yàn)組組 處理第1天 處理第211培養(yǎng)基 培養(yǎng)基2培養(yǎng)基 野生型CAV3野生型CAV 野生型CAV4突變體169 野生型CAV5突變體101 野生型CAV6變體161/162野生型CAV每個(gè)試驗(yàn)組由10只雞組成，每個(gè)組關(guān)在一個(gè)單獨(dú)分開的正壓纖維玻璃隔離室中飼養(yǎng)，該隔離室所有進(jìn)出空氣都要經(jīng)過高效顆?？諝膺^濾器過濾，所有的食物及飲水在進(jìn)入隔離室之前都經(jīng)過消毒。所有的試驗(yàn)雞都配有各自的翅膀標(biāo)識(shí)環(huán)。
一半試驗(yàn)雞在第14天時(shí)無痛處死，用于評(píng)估突變病毒的安全性。剩余的試驗(yàn)雞繼續(xù)在隔離室再呆21天。
試驗(yàn)雞皮下接種0.5mL CAV，含104中值組織培養(yǎng)物的感染劑量的病毒；或接種0.5mL未受感染的MSB1細(xì)胞裂解液。
在第14天，每個(gè)試驗(yàn)組的5只試驗(yàn)雞用氟烷無痛處死。處死后測(cè)量體重，檢查所有的淋巴器官、骨髓、肝臟、脾臟以及真皮(尋找出血證據(jù))，用于總的病理學(xué)分析。切除胸腺串(thymic chain)并稱重。
在第21天，每組剩余的試驗(yàn)雞皮下接種0.5mL CAV，含104中值組織培養(yǎng)物的感染劑量的病毒；或接種0.5mL未受感染MSB1的細(xì)胞裂解液。
在第35天，剩余的試驗(yàn)雞用氟烷無痛處死。處死后測(cè)量體重，檢查/照相所有的淋巴器官、骨髓、肝臟、脾臟以及真皮(尋找出血證據(jù))，用于總的病理學(xué)分析。切除胸腺串并稱重。
結(jié)果及討論沒有證據(jù)顯示在第14天時(shí)，受病毒感染雞比未受感染雞的體重要低；并且沒有證據(jù)顯示任何試驗(yàn)組之間在第35天時(shí)，體重指標(biāo)有任何差異。
第14天時(shí)，沒有證據(jù)顯示在胸腺重量及胸腺/體重比值這兩個(gè)指標(biāo)上，感染有突變病毒101和161/162的雞和未感染的雞之間存在差異。但是同未感染雞相比，感染有野生型惡性病毒的試驗(yàn)雞的胸腺重量及胸腺/體重比值這兩個(gè)指標(biāo)明顯降低。同未感染雞及野生型惡性病毒感染雞相比，感染有突變體169的雞的胸腺重量及胸腺/體重比值這兩個(gè)指標(biāo)沒有明顯的差異。
第14日試驗(yàn)結(jié)果組 處理第1天 胸腺重量(g) 胸腺/體重比值(mg/g)1未感染 1.3±0.3a8.8±1.6a2未感染 1.1±0.3ab8.4±1.6a3野生型CAV 0.8±0.3b4.9±2.0b4變體1691.1±0.3ab7.1±2.1ab5突變體101 1.3±0.4a8.9±2.3a6突變體161/162 1.3±0.3a8.3±1.5a在同一欄中的值如果有相同的上標(biāo)字母，表示它們之間無顯著性差異這些結(jié)果顯示對(duì)雞胚表現(xiàn)出減毒的突變病毒同樣也對(duì)日齡雞表現(xiàn)出減毒，其中突變體169同突變體101及161/162相比，減毒效果居中。
保護(hù)試驗(yàn)在第35天時(shí)，沒有證據(jù)表明免疫接種有突變病毒169并在21天用野生型惡性病毒攻擊的雞、未受感染的雞、1日齡時(shí)接種有野生型惡性CAV并在21天用野生型惡性CAV攻擊的雞之間的胸腺重量及胸腺/體重比值這兩個(gè)指標(biāo)有任何差異。但是，在一日齡時(shí)沒有接觸CAV而在21日齡時(shí)用野生型惡性病毒感染的雞，胸腺重量及胸腺/體重比值這兩個(gè)指標(biāo)明顯低于這些試驗(yàn)組。免疫接種有突變體101或161/162并用野生型惡性病毒攻擊的雞，表現(xiàn)出中等水平的保護(hù)作用。
第35天的試驗(yàn)結(jié)果組 處理第1天 處理第21天 胸腺重量(g) 胸腺/體重比值(mg/g)1未感染 未感染 4.1±0.8a9.5±1.4a2未感染 野生型CAV 1.3±0.3b3.3±0.9b3野生型CAV 野生型CAV 5.1±1.2a10.5±1.9a4突變體169 野生型CAV 3.5±0.4a9.0±0.8a5突變體101 野生型CAV 2.2±0.4c5.0±1.4b6突變體161/162 野生型CAV 2.0±1.0bc5.2±2.1b在同一欄中的值如果有相同的上標(biāo)字母，表示它們之間無顯著性差異這些結(jié)果顯示免疫接種突變病毒可以保護(hù)試驗(yàn)雞免于CAV感染的影響。
因此，突變CAV病毒不僅是減毒的，而且同樣能夠誘導(dǎo)1日齡雞產(chǎn)生保護(hù)性免疫。
討論I.CAV疫苗本發(fā)明人開發(fā)了CAV活的減毒DNA疫苗，適用于接種雛雞、小雞和種雞。本發(fā)明方法包括以下眾多步驟
- 建立一種體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，用于分析病毒的生長(zhǎng)情況；- 分析病毒適合進(jìn)行突變的位點(diǎn)，并研究病毒的功能；- 使用PCR法，在病毒全長(zhǎng)基因組克隆上進(jìn)行定點(diǎn)突變；- 突變病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并評(píng)估其感染性、細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng)及病毒功能特異性變化；- 使用SPF雞胚在攻擊模型中，測(cè)試具有疫苗潛力的突變病毒；以及- 評(píng)估在攻擊模型中，突變病毒的表型和體內(nèi)感染性。
雞胚致病性測(cè)試的結(jié)果可以清晰地顯示，在所鑒定的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵區(qū)對(duì)VP2進(jìn)行突變，能夠用于開發(fā)適用于免疫接種的減毒病毒，或者是減毒病毒形式，或者是DNA疫苗形式。根據(jù)總的病理損害評(píng)分，除mut163突變體外，所有的突變體都可以顯著地減毒。但是，從胸腺及脾臟病理損害評(píng)分看，mut163突變體顯著地得以減毒。
值得注意的是，殘基突變預(yù)計(jì)直接參與VP2的PTPase功能，具有最明顯的減毒效果，但是發(fā)生在VP2蛋白C端的酸性和堿性區(qū)域的突變也可以達(dá)到同樣的減毒效果。
另外，VP2基因翻譯起始位點(diǎn)Kozac氏序列突變，導(dǎo)致產(chǎn)生更多VP2，使得該構(gòu)建體不再能夠多產(chǎn)復(fù)制。這樣的構(gòu)建體雖然不適合用于開發(fā)活的減毒疫苗，卻可以用作DNA疫苗。
這些研究顯示，VP2蛋白具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。突變VP2因此可用于實(shí)施免疫系統(tǒng)中不太強(qiáng)烈的變化。
II.CAV VP2翻譯起始信號(hào)的突變這些研究表明了一種通用方法，即對(duì)CAV的VP2基因進(jìn)行突變，以及對(duì)其他環(huán)狀病毒的同系物進(jìn)行突變，從而獲得用作活疫苗的減毒株或DNA疫苗和產(chǎn)生可以用作DNA疫苗的非復(fù)制型基因組克隆。
另外，本發(fā)明人已清楚地顯示，VP2蛋白在CAV感染過程具有免疫調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)VP2及其同系物可以影響免疫系統(tǒng)的功能。
利用復(fù)制缺陷型突變體還具有一定應(yīng)用潛力，pCAU283-3和pCAU283+4可以用作雞的DNA疫苗，因?yàn)樗矔r(shí)表達(dá)VP2/VP3可足夠引發(fā)免疫反應(yīng)。
總結(jié)本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，直接突變是一種生產(chǎn)減毒病毒株的有效策略。首先，因?yàn)镃AV基因組較小，易于進(jìn)行分子生物學(xué)操作；其次，單獨(dú)轉(zhuǎn)染基因組即可容易地獲得病毒顆粒。直接突變可以在一個(gè)無細(xì)胞及病毒的系統(tǒng)中導(dǎo)入到基因組中，并且可以在產(chǎn)生病毒之前精確地加以表征。因此這一策略是高效的，在應(yīng)用上具有最佳的生物安全性。減毒活疫苗應(yīng)用的一個(gè)限制因素是病毒體外生長(zhǎng)的滴度低，以及在含胚SPF雞蛋中培養(yǎng)病毒所要求的小的不便。開發(fā)DNA疫苗可以規(guī)避因細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物帶來的生物安全方面的風(fēng)險(xiǎn)，以及病毒滴度低這樣的限制因素，因此證明可以有效地應(yīng)用于介蛋(in ovo)接種。另一種獲得減毒活疫苗的方法是經(jīng)過細(xì)胞傳代得到的滅活疫苗或減毒活疫苗。接種試驗(yàn)雞，共表達(dá)VP1和VP2蛋白可以使試驗(yàn)雞產(chǎn)生中和性血清抗體，對(duì)病毒攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用。但是，減毒活疫苗通常具有更大的免疫原性能力，因?yàn)榭梢酝瑫r(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。經(jīng)傳代而獲得的減毒株不是用作疫苗的最好選擇，因?yàn)樗鼈內(nèi)员Ａ粲械退降闹虏⌒?。此外，?jīng)傳代獲得的減毒株在試驗(yàn)雞中傳代后迅速回復(fù)其毒力形式。因此，在重組基因組上使用定點(diǎn)突變策略，用作DNA疫苗或衍生減毒活疫苗具有明顯的優(yōu)勢(shì)。疫苗接種程序可以將DNA疫苗施用到含胚卵以及將減毒活疫苗施用到較大齡的雞只中。
CAV基因組的結(jié)構(gòu)特征使其在應(yīng)用突變策略制造減毒活疫苗的同時(shí)保持其感染性和免疫原性的過程中既有優(yōu)勢(shì)又有劣勢(shì)。CAV病毒極其經(jīng)濟(jì)地利用它的編碼容量。其基因組只有2.3kb，編碼三個(gè)重疊的ORF，這給突變的選擇帶來了限制。一個(gè)ORF的突變必須設(shè)計(jì)成不會(huì)破壞重疊的ORF。所有的三個(gè)病毒蛋白的功能對(duì)于病毒的感染性都是必須的，因此突變的引入必須保證其蛋白功能可以保留。減毒的穩(wěn)定性可以通過多因子途經(jīng)而得以增強(qiáng)。依賴簡(jiǎn)單的點(diǎn)突變制備的減毒株，病毒會(huì)發(fā)生低頻率的毒性恢復(fù)。在CAV病毒所有表征的分離株中，含有重疊讀碼框的編碼區(qū)具有極高的保守性。這提示在野外條件下，該病毒容許自發(fā)突變的幾率遠(yuǎn)小于預(yù)計(jì)的與聚合酶系統(tǒng)錯(cuò)誤率相關(guān)的天然發(fā)生的突變率。這很可能是由于重疊框中同時(shí)變化是有害的，結(jié)果在一個(gè)框中限制強(qiáng)加在密碼子改變上。上述討論還提示通過傳代獲得減毒株的過程將非常漫長(zhǎng)，而且可能無法得到由靶突變獲得的優(yōu)化減毒株。自然發(fā)生的突變只有在一定條件下才是耐受的，即以可測(cè)量的頻率突變發(fā)生在重疊讀碼框具有密碼子搖擺的密碼子中。定點(diǎn)突變因此可以進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，它不需要依賴低頻發(fā)生的突變事件，而且可以通過仔細(xì)的設(shè)計(jì)，其中重疊ORF具有最低密碼子搖擺的位點(diǎn)可容易地得以突變。通過定點(diǎn)突變體外導(dǎo)入的突變保留了重疊讀碼框，這將會(huì)降低毒性回復(fù)發(fā)生的頻率，因?yàn)椴《拘枰ＷC其重疊編碼區(qū)序列的保守性。減毒突變需要進(jìn)行仔細(xì)、合理的設(shè)計(jì)，以利用定點(diǎn)突變構(gòu)建突變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，在不背離本發(fā)明所述的實(shí)質(zhì)或范圍的情形下，可對(duì)本發(fā)明所示的具體實(shí)施方案進(jìn)行各種改變和/或修改。本發(fā)明的實(shí)施方案因而在所有方面應(yīng)該看作是說明性的，而不是限制性的。
序列表<110>墨爾本大學(xué)(The University of Melbourne)<120>減毒環(huán)狀病毒(Attenuated Circovirus)<130>SCT033795-47<150>PR5674<151>2001-06-14<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pCAU269/7的DNA序列<400>1ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500
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<223>pCAU269/7的VP2的蛋白序列<400>2Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala15 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser
130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val2l0 215<210>3<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut C 86 R<400>3ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa cgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut C 86 R<400>4Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Arg Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125
Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>5<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut C 95 S<400>5ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatcagcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mutC 95 S<400>6Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Ser Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu
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<223>雞貧血癥病毒基因組的mut C 97 S<400>7ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360atggacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac agcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut C 97 S<400>8Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Ser Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110
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<223>雞貧血癥病毒基因組的mut R 101 G<400>9ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcggaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagc aaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut R 101 G<400>10Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 4045Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut H 103 Y<400>12Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn
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<223>雞貧血癥病毒基因組的mut R 129 G<400>13ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctcggag 840
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut R 129 G<400>14Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80
Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Gly Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>15<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut Q 131 P<400>15ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720
cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840taccgggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>16<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut Q 131 P<400>16Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60
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gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacg 900gcgcggcggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>18<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut R/K/K<400>18Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser
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<223>雞貧血癥病毒基因組的mut D/E 161/162 G/G<400>19ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480
ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aaggcgggct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>20<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut D/E 161/162 G/G<400>20Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45
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<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut L 163 P<400>22Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala15 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30
Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Pro Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>23<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut D 169 G<400>23ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240
caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccggtt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>24<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut D 169 G<400>24Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15
Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 2530Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Gly Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>25<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut K 102 E<400>25ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60
caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagagaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgaa gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>26<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut K 102 E<400>26Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala
1 5 1015Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Glu His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Glu Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>27<211>2286<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒基因組的mut E 186 G
<400>27ccccccttga acccccccct gggggggatt cccccccaga cccccccttt ataaagcact 60caataaacgc agctaattcg ttcaccgcac aatcgctttc cgagtggtta ctattccatc 120accattctag cctgtacaca aaaagtaaag atggacgaat cgctcgactt cgctcgcgat 180tcgtcgaagg cggggggccg gaggcccccc ggtggccccc tccaaggagt ggagcgtgta 240caggggggta cgtcatccgt acaggggggg tacgtcacaa gaaggcgttc ccgtacaggg 300gggtacgtaa catgttcagg ggggtacgtc acaaccaatc aggagctgcc acgttgcgaa 360agtgacgttt cgaaaatggg cggcgcaaga ctccctatat attgcgcgca cataccggtc 420ggcagtaggt atacgcaagg cggtccgggt ggatgcacgg aaacggcgga caaccggccg 480ctgggggcag tgaatcggcg cttagccgag aggggcaacc tgggcccagc ggagccgcgc 540aggggcaagt aatttcaaat gaacgctcac caagaagata ctccaccagg accatcaacg 600gtgttcaggc caccaacaag ttcacggccg ttggaaaccc ctcactgcag agagatccgg 660attggtatcg ctggaattac agtcactcta tcgctgtgtg gctgcgcgaa tgctcgcgtt 720cccacgctaa gatctgcaac tgcggacaat tcagaaaaca ctggtttcaa gaatgtgccg 780gacttgagga ccgatcaacc caagcctccc tcgaagaagc gatcctgcga cccctccgag 840tacagggtaa gcgagctaaa agaaagcttg attaccacta ctcccagccg accccgaacc 900gcaagaaggt gtataagact gtaagatggc aagacgagct cgcagaccga gaggccgatt 960ttacgccttc agaagaggac ggtggcacca cctcaagcga cttcgacgga gatataaatt 1020tcgacatcgg aggagacagc ggtatcgtag acgagctttt aggaaggcct ttcacaaccc 1080ccgccccggt acgtatagtg tgaggctgcc aaacccccag tccacgatga ctatccgctt 1140ccaaggagtc atctttctca ccgaaggact cattctacct aaaaacagca cagctggggg 1200ctatgcggac cacatgtacg gggcgagagt cgccaagatc tcagtgaacc tgaaagagtt 1260cctcctagca tcaatgaacc tgacatacgt gagcaagata ggaggcccca tcgccggtga 1320gttgattgcg gacgggtcta aatcgcaagc cgcggagaac tggccaaatt gctggctgcc 1380gctagataat aacgtgccct ccgctacacc atctgcatgg tggagatggg ctttaatgat 1440gatgcagcca acggactcct gccggttttt taatcaccct aagcaaatga ccctgcaaga 1500catgggtcgg atgtttgggg gctggcatct gttccgacac attgaaaccc gctttcagct 1560ccttgccact aagaatgagg gatccttcag ccccgtggcg agtcttctct cccagggaga 1620gtacctcacg cgccgcgacg atgttaagta cagcagcgac caccagaacc ggtggcgaaa 1680aggcgagcaa ccgatgacgg gggggattgc ttacgcgacc ggtaaaatga gactcgacga 1740gcaacaatac cctgctatgc ccccggaccc cccgatcatc accactacca ctgcgcaagg 1800cacgcaagtc cgctgcatga atagcacgca agcttggtgg tcgtgggaca catatatgag 1860ctttgcaaca ctcacagcac tcggtgctca atggtctttt cctccagggc aacgttcagt 1920ttctagacgg tccttcaacc atcacaaggc ccgaggagcc ggggacccca agggccagag 1980gtggcacacg ctggtgccgc tcggcacaga gaccataacc gacagctaca tgagagcacc 2040ggcatcagag ctggacacga atttcttcac gctttacgta gcgcaaggca ctaataaatc 2100gcagcaatac aagttcggca cagcaacata cgcgctaaag gaacccgtaa tgaagagcga 2160ttcatgggca gtggtgcgcg tccagtccgt ctggcaactg ggtaacaggc aaaggccata 2220cccgtgggac gttaactggg ccaacagcac catgtactgg gggtcgcagc cctgaaaagg 2280gggggg 2286<210>28<211>216<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>雞貧血癥病毒的VP2的mut E 186 G
<400>28Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Ser His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Gly Asp Ile Asn Phe Asp Ile180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val210 215<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C 86 R+寡核苷酸<400>29ctgcgcgaac gctcgcgttc ccacgctaag 30<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C 86 R-寡核苷酸<400>30aacgcgagcg ttcgcgcagc cacacagcga 30<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C95 S+寡核苷酸<400>31cgctaagatc agcaactgcg 20<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C 95 S-寡核苷酸<400>32cgcagttgct gatcttagcg tg 22<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C 97 S+寡核苷酸
<400>33atctgcaaca gcggacaatt c 21<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut C 97 S-寡核苷酸<400>34attgtccgct gttgcagatc ttag 24<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut R 101 G+寡核苷酸<400>35ctgcggacaa ttcggaaaac actgg 25<210>36<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut R 101 G-寡核苷酸<400>36cagtgttttc cgaattgtcc gcag 24<210>37<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut H 103 Y+寡核苷酸
<400>37cagaaaatac tggtttcaag aatgtgccgg ac 32<210>38<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut H 103 Y-寡核苷酸<400>38gaaaccagta ttttctgaat tgtccgcag 29<210>39<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mutR 129 G+寡核苷酸<400>39ctgcgacccc tcggagtaca ggg 23<210>40<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut R 129 G-寡核苷酸<400>40ccctgtactc cgaggggtcg caggatcgc29<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut Q 131 P+寡核苷酸<400>41
cgagtaccgg gtaagcgagc taaaag26<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut Q 131 P-寡核苷酸<400>42cgcttacccg gtactcggag g 21<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut R/K/K 150/151/152 G/A/A+寡核苷酸<400>43ccgaacggcg cggcggtgta taag 24<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut R/K/K 150/151/152 G/A/A-寡核苷酸<400>44atacaccgcc gcgccgttcg gggtc 25<210>45<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut D/E 161/162 G/G+寡核苷酸<400>45taagatggca aggcgggctc gcagacc 27
<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut D/E 161/162 G/G<400>46tgcgagcccg ccttgccatc20<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut L 163 P+寡核苷酸<400>47gacgagcccg cagaccgaga g 21<210>48<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut L 163 P-寡核苷酸<400>48ggcctctcgg tctgcgggct cgtc 24<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut D 169 G+寡核苷酸<400>49gagaggccgg ttttacgcct tcag 24
<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut D 169 G-寡核苷酸<400>50gcgtaaaacc ggcctctcgg tc 22<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut K 102 E+寡核苷酸<400>51ctgcggacaa ttcagagaac actggtttc 29<210>52<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut K 102 E-寡核苷酸<400>52gaaaccagtg ttctctgaat tgtccgcag29<210>53<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut E 186 G+寡核苷酸<400>53gcgacttcga cggagatata aatttc 26
<210>54<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mut E 186 G-寡核苷酸<400>54tttatatctc cgtcgaagtc gc 22<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV.1引物<400>55ctatcgaatt ccgagtggtt actat25<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV.10引物<400>56tgctcacgta tgtcaggttc20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV.2引物<400>57gcggagccgc gcaggggcaa 20<210>58
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 19寡核苷酸<400>58cggtccggga ggatgcacgg aaacgg26<210>59<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 20寡核苷酸<400>59gtgcatcctc ccgaccgcct tgcgt 25<210>60<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 21寡核苷酸<400>60cggtccgggt ggatggacgg aaacgg26<210>61<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 22寡核苷酸<400>61gtccatccac ccggaccgcc ttgcgt 26<210>62<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 1寡核苷酸<400>62ctatcgaatt ccgagtggtt actat25<210>63<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV 11寡核苷酸<400>63agctcgtctt gccatcttac agtcttatac 30<210>64<211>9<212>PRT<213>雞貧血癥病毒—特征基序CAV VP2 PTP<400>64Ile Cys Asn Cys Gly Gln Phe Arg Lys1 5<210>65<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CAV.1引物<400>65cggtccggat ccatgcacgg aaacggcgga caac 34<210>66<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>CAV.2引物<400>66ggtttggaat tctcacacta tacgtaccgg ggc 33<210>67<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TLMV.1引物<400>67ttggatccat gagcagcttt ctaacaccat c 31<210>68<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TLMV.2引物<400>68ggcgaattct tacccatcgt cttcttcgaa atc 3權(quán)利要求
1.一種分離的減毒環(huán)狀病毒，其在編碼病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表達(dá)VP2蛋白的病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述突變存在于編碼VP2特征基序的核酸區(qū)域中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述突變改變病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋區(qū)或堿性β折疊區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述突變存在于CAV VP2的核酸殘基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的區(qū)域中。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中在CAVVP2內(nèi)突變靶位點(diǎn)選自第86，95，97，101，103以及169位。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其中所述突變選自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其包含mut D169G。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的分離的減毒環(huán)狀病毒，其含有選自序列號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的核酸序列。
11.一種環(huán)狀病毒疫苗組合物，其包括一種減毒的環(huán)狀病毒和可接受的載體或稀釋劑，所述減毒的環(huán)狀病毒在編碼病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述減毒的環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表達(dá)VP2蛋白的病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述減毒的環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述突變存在于編碼VP2特征基序的核酸區(qū)域中。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述突變改變病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋區(qū)或堿性β折疊區(qū)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述突變存在于CAV VP2的核酸殘基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的核酸殘基區(qū)域中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中在CAVVP2中突變靶位點(diǎn)選自第86，95，97，101，103以及169位。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其中所述突變選自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其包含mut D169G。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-19中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀病毒疫苗組合物，其包括一種選自序列號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的核酸序列。
21.一種賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其包括給動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求11-20中任一項(xiàng)所述的環(huán)狀病毒疫苗。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中所述動(dòng)物為禽類。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中禽類為雞。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗的施用途徑為腸胃外、肌內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)鼻、或介蛋。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中動(dòng)物為禽類，疫苗的施用途徑為粘膜給藥、氣霧劑給藥或經(jīng)飲用水給藥。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中禽類為雞。
27.根據(jù)權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗施用的劑量范圍是1-100百萬TCID50。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中疫苗施用的劑量范圍為約1000TCID50。
29.一種分離的核酸分子，其衍生自或得自一種環(huán)狀病毒基因組，所述核酸分子包括至少部分病毒蛋白2(VP2)的編碼區(qū)，其中含有突變。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的分離的核酸分子，其中環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表達(dá)VP2蛋白的病毒。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的分離的核酸分子，其中環(huán)狀病毒衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)。
32.根據(jù)權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子，其中所述突變存在于編碼VP2特征基序的核酸區(qū)中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離的核酸分子，其中所述突變改變病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋區(qū)或堿性β折疊區(qū)。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分離的核酸分子，其中所述突變存在于CAV VP2的核酸殘基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的區(qū)域中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的分離的核酸分子，其中在CAV VP2內(nèi)突變靶位點(diǎn)選自第86，95，97，101，103以及169位。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的分離的核酸分子，其中所述突變選自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的分離的核酸分子，其包含mut D169G。
38.根據(jù)權(quán)利要求29-37中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子，其包括一種選自序列號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27的序列。
39.一種疫苗組合物，其包括權(quán)利要求29-38中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子以及可接受的載體或稀釋劑。
40.一種賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其包括給動(dòng)物施用權(quán)利要求39所述的疫苗組合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中環(huán)狀病毒感染是CAV感染。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中動(dòng)物是禽類。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的方法，其中禽類是雞。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的分離的減毒環(huán)狀病毒在制備用于賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的疫苗中的應(yīng)用。
45.根據(jù)權(quán)利要求29-38中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子在制備用于賦予動(dòng)物對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力的疫苗中的應(yīng)用。
46.一種生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其包括(a)將一種衍生自或得自環(huán)狀病毒基因組的分離的核酸分子接種到含胚卵的蛋黃囊中，其中所述核酸分子包括至少部分病毒蛋白2(VP2)的編碼區(qū)，其中含有突變；(b)使環(huán)狀病毒從分離的核酸中復(fù)制；以及(c)從所述卵中收集所述環(huán)狀病毒。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中所述的分離的核酸分子衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)，TT病毒(TTV)，或其他相似的表達(dá)VP2蛋白的病毒。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中分離的核酸分子衍生自或得自雞貧血癥病毒(CAV)。
49.根據(jù)權(quán)利要求46-48中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中所述突變存在于編碼VP2特征基序的核酸區(qū)域中。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中所述突變改變病毒PTPase活性、PTPase基序、酸性α螺旋區(qū)或堿性β折疊區(qū)。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中所述突變存在于CAV VP2的核酸殘基第80到110，128到143，151到158以及160到170位的區(qū)域中。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中CAVVP2內(nèi)突變靶位點(diǎn)選自第86，95，97，101，103以及169位。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其中所述突變選自mut C86R，mut C95S，mut C97S，mut R101G，mut K102E，mut H103Y，mut R129G，mut Q131P，mut R/K/K 150/151/152G/A/A，mut D/E 161/162 G/G，mut L163P，mut D169G，mut E186G及其組合。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其包含mut D169G。
55.根據(jù)權(quán)利要求46-54中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)環(huán)狀病毒疫苗的方法，其含有的核酸序列選自序列號(hào)1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25以及27。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的減毒環(huán)狀病毒，其在編碼病毒蛋白2(VP2)的病毒核酸中含有突變。所述減毒環(huán)狀病毒特別適用于賦予動(dòng)物，具體是禽類對(duì)環(huán)狀病毒感染的免疫力。
文檔編號(hào)C07K14/04GK1537162SQ02815146
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者格倫·弗朗西斯·布朗寧, 米歇爾·阿爾瑪·彼得斯, 凱利·安·蒂文戴爾, 彼得·克里斯托弗·斯科特, 海利·凱·布朗, 布倫丹·斯科特·克拉布, 斯科特 克拉布, 阿爾瑪 彼得斯, 克里斯托弗 斯科特, 凱 布朗, 安 蒂文戴爾, 格倫 弗朗西斯 布朗寧 申請(qǐng)人:墨爾本大學(xué)