專利名稱：檢測或定量測定芬太尼的代謝物或芬太尼類似物的代謝物的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測或定量測定芬太尼的代謝物或芬太尼類似物的代謝物優(yōu)選去甲代謝物的方法和試劑盒，以及其中可用的免疫原、偶合物和抗體。
“檢測”是指定性分析物質存在或不存在。
“測定”是指定量分析存在物質的量。
“芬太尼”是指N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基丙酰胺。
“芬太尼類似物”是指具有類似于芬太尼的N-苯基-N-(4-哌啶基)胺結構和具有芬太尼藥理活性的物質。這類“芬太尼類似物”包括，但不限于，舒芬太尼、carfentanil、乙?；姨帷-氟芬太尼、芐基芬太尼、噻吩基芬太尼、α-甲基噻吩基芬太尼、丁酰基芬太尼和鹽酚芬太尼以及稱之為設計藥物∝-和p-甲基芬太尼和3-順/反-甲基芬太尼。
“代謝物”是指芬太尼和芬太尼類似物的體內分解產物。這樣，對芬太尼來說，它包括去甲-芬太尼(N-(丙酰基)-4-N-苯胺基哌啶)、去丙?；姨?N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-苯胺)、對羥基芬太尼(N-(對羥基苯基)-N-[1-(2-苯乙基)-4-哌啶基]丙酰胺)和對羥基去甲芬太尼(N-丙?；?4-N-(對羥基苯胺基)哌啶)。
本發(fā)明的目的是使芬太尼和芬太尼類似物的所有代謝物具有廣譜用途。本發(fā)明的目的是使芬太尼和芬太尼類似物的去甲代謝物具有特殊用途。本發(fā)明的目的是使芬太尼的去甲代謝物具有最佳用途。本發(fā)明的目的也是使芬太尼本身及其類似物具有廣譜用途。
芬太尼是具有嗎啡止痛劑功效至少80倍的有效合成的類嗎啡物質。它通常在手術前后用于導入和維持麻醉和手術后止痛。為了增加芬太尼的止痛和欣快作用，現(xiàn)在已經合成了它的類似物。由于它們的高效和麻醉止痛的快速起效，芬太尼及其類似物具有濫用的趨勢。芬太尼可以從血液中快速分布到肌體組織并且可以被全部代謝。在人體中，在72小時內大約80％的芬太尼劑量可以被分泌到尿液中，使尿液具有92％到98％的這種成分的代謝物。芬太尼在人體中的主要代謝途徑是氧化性N-脫烷基以形成去甲芬太尼(Silverstein等，1993)。N-脫烷基也似乎是芬太尼類似物如鹽酸芬太尼和舒芬太尼的特征(Camu等(1982)和Meuldermans等(1982))。相對來說，在馬中的主要代謝途徑是通過芬太尼丙?；鶄孺湹拇x性氧化以形成malonanilinic酸(Frincker等(1980))。芬太尼的化學結構表示如下 具有10分鐘半衰期的芬太尼至少在人體中的代謝主要得到 現(xiàn)在已有各種方法用來測定樣品中芬太尼及其類似物的代謝物的量。分析方法包括具有火焰離子化、電子捕獲和氮氣敏感性檢測的氣相色譜和氣相色譜/質譜(GC/MS)。例如，分析尿液中的芬太尼和3-甲基芬太尼的去甲代謝物的敏感性氣相色譜法公開于W.R.Hammargren和G.L.Henderson，1988。所公開的方法包括電子捕獲檢測器或質譜的測定。但是，這種色譜法用作篩選工具太昂貴和費時。
用于測定芬太尼及其類似物量的放射性免疫測定法也是非常敏感的，但需要放射性核素示蹤物例如125I和3H，并且在一些情況下，需要初級的提取步驟。例如，使用各種不同類型的放射性免疫測定法(RIAs)包括固相RIA來檢測芬太尼和相關類似物。Harnmargren和Henderson(1988)公開了使用由診斷產品所產生的125I的RIA。但是，發(fā)現(xiàn)使用該放射性免疫測定法去甲代謝物和脫丙?；x物不能顯著地交叉反應。此外，Watt和Caplan(1990)公開了芬太尼的RIA(也是來自診斷產品的125I的RIA)，證實了Harnmargren和Henderson(l988)的數(shù)據(jù)，也就是說，對于某些芬太尼代謝物交叉反應性差，具體來說對于去甲芬太尼小于5％(表IV反映了類似物/芬太尼)和對于2-羥基芬太尼14-30％(表IV反映了類似物/芬太尼)。關于2-羥基芬太尼，通常認為至少在人體中它不是芬太尼的主要代謝物，盡管參考于Watt和Caplan.Michies等(1977)公開了用羧基芬太尼作為半抗原在來自Janssen的芬太尼的3H RIA中沒有觀察到交叉反應的在人體中芬太尼的主要代謝物脫丙酰基芬太尼和去甲芬太尼。相似地，Henderson等(1975)公開了McNeil實驗室使用羧基芬太尼作半抗原的芬太尼RIA，但是所有芬太尼的去甲-和脫丙?；x物都沒有顯著交叉反應。
酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISAs)是沒有放射活性的另外一種選擇，已知它也用于測定芬太尼及其類似物的量。例如，在Werawan Ruangyuttikarn等1990公開了原型的ELISA使用羧基芬太尼半抗原用于檢測芬太尼的存在。當在抗芬太尼代謝物的交叉反應明顯沒有時，該公開教導了關于戲劇性地改變交叉反應性的哌啶部分的改良，它暗示了對去甲芬太尼可以預料到它的交叉反應性差。Gregory S.Makowski等1995公開了抗脫丙酰基芬太尼和去甲芬太尼代謝物的交叉反應性差的ELISA，具體來說，抗脫丙酰基芬太尼只有0.53％的交叉反應性而抗去甲芬太尼則小于0.03％的交叉反應性。
對發(fā)明人的知識而言，前面對芬太尼免疫測定法(不管是RIA還是ELISA)所報道的工作已經完全集中于通過芬太尼的丙酰胺基的游離端衍生芬太尼衍生物(通過羧基)。用-COOH作為交聯(lián)劑的這種衍生得到了羧基芬太尼(N-苯基-N-[1-(2-苯乙基)-4-哌啶基]羧基丙酰胺)作為半抗原，該半抗原公開于J.McDonald等，1987。J.McDonald等公開了用從羧基芬太尼-牛血清白蛋白(BSA)免疫原所制備的抗血清和結合b-藻紅蛋白的羧基芬太尼的顆粒濃度熒光免疫測定法(PCFIA)。相似地，M.Michiels等(1977)公開了羧基芬太尼-BSA免疫原。抗羧基芬太尼-牛血清γ-球蛋白(BGG)免疫原制備的抗體公開于GL Henderson等1975的論文。但是，抗羧基芬太尼半抗原所制備的抗體和偶合物具有缺點，很少或沒有檢測芬太尼代謝物和/或芬太尼類似物代謝物的能力。
本發(fā)明描述了芬太尼或去甲芬太尼的新的半抗原衍生物的結合，該半抗原是共價結合具有抗原性的載體物質從而生成免疫原或者結合可檢測的標示劑從而生成偶合物(或檢測劑)。本發(fā)明也描述了對這種免疫原所生產的抗體怎樣用于開發(fā)一般的測定法，該測定法能夠用于測定體液中優(yōu)選生物體液，更優(yōu)選人的生物體液中芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的量。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是充服現(xiàn)有技術的一些或所有缺點或提供另外一種可供選擇的方法。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的一個目的是提供一種檢測或定量測定芬太尼代謝物和/或芬太尼類似物代謝物的方法和試劑盒。本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案的目的是提供一種檢測或定量測定芬太尼代謝物和/或芬太尼類似物代謝物的方法和試劑盒，相對于芬太尼本身來說，對芬太尼代謝物和/或芬太尼類似物代謝物，更優(yōu)選去甲代謝物顯示出5％以上、優(yōu)選25％以上的交叉反應性。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案的另外一個目的是開發(fā)能夠與作為結構表位的N-苯基-N-(4-哌啶基)胺結合的抗體。
附圖的簡要說明

圖1是半抗原A和B的制備；圖1a示意說明用交聯(lián)劑衍生半抗原的位置；圖2是半抗原C、D和E的制備；圖3和4是半抗原F和免疫原F的制備；圖5是半抗原G和免疫原G的制備；圖6是BSA載體物質的分析；
圖7是MALDI-TOF分析；圖8-11是MALDI分析結果；圖12是去甲芬太尼和芬太尼競爭性ELISA的微量滴定板測定；圖13-16是化合物6，半抗原A，F(xiàn)和G的NMR數(shù)據(jù)。
發(fā)明的詳細描述第一方面，本發(fā)明提供了含有結合具有抗原性載體物質的半抗原的免疫原，半抗原是在1，2或4位，優(yōu)選1或2位用交聯(lián)劑衍生的，條件是當半抗原是在1位衍生時，交聯(lián)劑不是羧基。
1位被定義為芬太尼的丙酰胺基的游離或終端。2位被定義為芬太尼的苯乙基對位。3位被定義為芬太尼的N-苯基的對位。4位被定義為去甲芬太尼的哌啶基-N位。1-4位在附圖1a中分別被稱為R1-R4。
本發(fā)明所述的半抗原的1、2、3和4位衍生如下所示具有芬太尼或去甲芬太尼的結構通式 更具體地說，在第一方面，本發(fā)明提供了如下通式的免疫原 其中Z1是結合具有抗原性載體物質的交聯(lián)劑或氫；Z4選自N-苯乙基、結合具有抗原性載體物質的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，條件是當Z1是氫時，Z4是結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，并且當Z4是N-苯乙基時，Z1是結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑不是-COOH。優(yōu)選，該載體物質是蛋白、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。
另一方面，本發(fā)明含有下列通式的偶合物 其中Z1是共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑或氫；Z4選自N-苯乙基、共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，條件是當Z1是氫時，Z4是共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，并且當Z4是N-苯乙基時，Z1是共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑不是-COOH。優(yōu)選，該標示劑選自酶、發(fā)光物質、放射活性物質或其混合物。更具體地說，該標示劑是酶，優(yōu)選是過氧化酶，最好優(yōu)選辣根過氧化物酶。另外，發(fā)光物質可以是生物發(fā)光、化學發(fā)光或熒光性物質。
應該認識到在本發(fā)明所述的半抗原中Z1、Z2和Z4位中僅一個是交聯(lián)劑并且在本發(fā)明的免疫原和偶合物中Z1、Z2和Z4位中僅一個包括分別共價結合具有抗原性載體物質或可檢測的標示劑的交聯(lián)劑。
應該認識到當Z1是氫和Z4是N-苯乙基時，所得到的化合物是芬太尼，當Z1和Z4分別是氫時，所得到的化合物是去甲芬太尼。
以下表1總結了用于本發(fā)明所述的半抗原中的一些和用于本發(fā)明免疫原和偶合物中的一些交聯(lián)劑和衍生位 表1衍生于芬太尼和其代謝物去甲芬太尼的某些半抗原的化學結構優(yōu)選，Z2的交聯(lián)劑是在對位。
優(yōu)選Z1、Z2或Z4的交聯(lián)劑在其游離端用-CO-R終止，其中R是羥基或短鏈、直鏈或支鏈烷基?！岸替溚榛笔侵窩1-5烷基。更具體地說，短鏈烷基是直鏈基團。更優(yōu)選的是，短鏈烷基是C1-2烷基，優(yōu)選C1-2直鏈烷基。
更優(yōu)選的是，Z1、Z2或Z4的交聯(lián)劑含有-(NH)a-(CO)b-Xc-(CH2)d-Se-CO-R其中a是0或1；b是0或1；X是氧或硫；c是0或1；d是選自1-5的整數(shù)；e是0或1并且R是短鏈烷基，優(yōu)選C1-5直鏈或支鏈烷基，或羥基。更優(yōu)選，該烷基是C1-5直鏈烷基。更優(yōu)選的是，該烷基是C1-2直鏈基團。最優(yōu)選，該烷基是甲基。
在本發(fā)明描述的最廣的方面中，對本發(fā)明的免疫原或偶合物，即Z1交聯(lián)劑不是共價結合具有抗原性的載體物質或可檢測的標示劑的羧基(-COOH)來說最后的條件分別是指上述交聯(lián)劑通式排除了當Z1是交聯(lián)劑時其中a、b、c、d和e是0而R是羥基的交聯(lián)劑。
優(yōu)選，當e是1時，c是0。
優(yōu)選，a是0；b是0；而c是0。更優(yōu)選的是，d是0，e是1而R是甲基，或者另外一種選擇，d是1，c是0而R是羥基。更優(yōu)選，Z1或Z4是這種交聯(lián)劑。另外一種選擇是Z2是這種交聯(lián)劑。
另外一種選擇，a是1，b是1，c是0并且d是2。優(yōu)選，e是1而R是甲基，或另外一種選擇，e是0而R是羥基。更優(yōu)選Z2是在鄰位、對位或間位優(yōu)選對位的這類交聯(lián)劑。另外一種選擇，Z1或Z4是這種交聯(lián)劑。
還有一種選擇是a是0；b是0；e是0；X是0；而c是1。優(yōu)選d是3而R是羥基。Z1、Z2或Z4是這種交聯(lián)劑。
本發(fā)明還提供了一種制備該抗體的方法，該方法包括通過反復將本發(fā)明第一方面所述的免疫原給藥使動物，優(yōu)選脊椎動物，最優(yōu)選哺乳動物免疫接種并從免疫接種過的動物收集所得到的血清的步驟。優(yōu)選，該方法還包括將所述血清抗體固定到本底，優(yōu)選固體載體，更優(yōu)選聚乙烯固體載體。按照該方法制備的抗體是多克隆。
在另外一方面，本發(fā)明涉及抗本發(fā)明的免疫原所制備的抗體，該抗體能夠與芬太尼代謝物或其類似物的代謝物的至少一個結構表位結合。優(yōu)選，至少一個結構表位包括芬太尼的N-苯基-N-(4-哌啶基)胺結構。更優(yōu)選，該抗體是固定在本底上。
本發(fā)明優(yōu)選涉及芬太尼的代謝物和芬太尼類似物的代謝物所需的多克隆抗血清的生產，其中所述的抗血清最優(yōu)選也具有一些與芬太尼及其類似物的交叉反應性。
在另一方面，本發(fā)明包括檢測或定量測定樣品中芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的方法，該方法包括將樣品與本發(fā)明的偶合物或其混合物以及本發(fā)明的抗體或其混合物接觸；檢測或定量測定結合的偶合物的量，并且從樣品中存在芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物或其量的校準曲線中推出。
在又一方面，本發(fā)明包括用于檢測或定量測定芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的量的試劑盒。該試劑盒包括本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物。該試劑盒可以任選包括使用所述偶合物和所述抗體進行檢測或定量測定樣品中芬太尼的代謝物和芬太尼類似物的代謝物的說明書。
優(yōu)選樣品是溶液，如生理體液。更優(yōu)選，樣品是血清或尿液。最優(yōu)選樣品是來自人患者的溶液或懸浮液。
本發(fā)明的方法或試劑盒包括偶合物或其混合物，其中每個偶合物是由其中Z1、Z2或Z4之一優(yōu)選Z2或Z4之一是交聯(lián)劑的半抗原或其混合物制備的，其中各抗體是由其中Z1、Z2或Z4之一優(yōu)選Z2或Z4之一是交聯(lián)劑的半抗原或其混合物產生的。各組分的半抗原可以相同或者各組分的半抗原可以在相同位置使用不同交聯(lián)劑衍生，后者是優(yōu)選的。但是，優(yōu)選各組分的半抗原優(yōu)選是在不同位置使用相同交聯(lián)劑或使用不同交聯(lián)劑衍生。更優(yōu)選的是源于其中Z2是交聯(lián)劑的半抗原的免疫原與源于其中Z2或Z4之一是交聯(lián)劑的半抗原的偶合物用于本發(fā)明的方法或試劑盒，其中各交聯(lián)劑(免疫原和偶合物中的)是相同的或者更優(yōu)選是不同的。優(yōu)選源于其中Z2是交聯(lián)劑的半抗原的免疫原與源于其中Z4是交聯(lián)劑的半抗原的偶合物用于本發(fā)明的方法或試劑盒，其中各交聯(lián)劑(免疫原和偶合物中的)是相同的或者更優(yōu)選是不同的。
同樣包括了源于其中Z2或Z4是交聯(lián)劑的半抗原的偶合物與源于其中Z2或Z4之一是交聯(lián)劑的半抗原的免疫原用于本發(fā)明的方法或試劑盒，其中各交聯(lián)劑(免疫原和偶合物中的)是相同的或者更優(yōu)選是不同的。更為優(yōu)選的是，源于其中Z2或Z4是交聯(lián)劑的半抗原的偶合物與源于其中Z2或Z4之一是交聯(lián)劑的半抗原的免疫原用于本發(fā)明的方法或試劑盒。最優(yōu)選，源于其中Z2或Z4是交聯(lián)劑的半抗原的偶合物與源于其中Z2是交聯(lián)劑的半抗原的免疫原用于本發(fā)明的方法或試劑盒，其中各交聯(lián)劑(免疫原和偶合物中的)是相同的或者更優(yōu)選是不同的。
在又一方面，本發(fā)明包括本發(fā)明偶合物或其混合物與本發(fā)明抗體或其混合物在測試樣品如生物體液從而檢測或定量測定芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的量的用途。
本發(fā)明涉及了新的半抗原，它可通過與常規(guī)使具有抗原性的載體物質偶合來用于制備新的免疫原。然后將所得到的免疫原給藥予動物，優(yōu)選脊椎動物宿主，最優(yōu)選哺乳動物宿主從而引起需要的多克隆抗血清的產生，然后將這種抗血清用于開發(fā)一種使用偶合物(半抗原-可檢測的標示劑)作檢測劑的芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的一般免疫測定法。
本發(fā)明的重點是對芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的特異性抗體的制備。為了實現(xiàn)這種廣泛的特異性，用Z1或Z2作為交聯(lián)劑改良芬太尼或者用Z4作為交聯(lián)劑改良去甲芬太尼來制備半抗原和免疫原。
半抗原的制備按照圖1所示的反應圖解1進行半抗原A的制備。按照圖2所示的圖解2進行半抗原C、D和E的制備。按照圖3和4所示的圖解3和4進行半抗原F和免疫原F的制備。并且按照圖5所示的圖解5進行半抗原G和免疫原G的制備。
參照圖1，按照圖解1制備半抗原N-[1-(對-乙酰硫基丙酰胺基)苯乙基-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(A)和N-[1-(對琥珀酰胺基)苯乙基-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(B)。在1，2-二氯乙烷、乙酸和NaBH(OAc)3存在下，通過Schiff堿在苯胺和N-甲基-4-哌啶酮之間進行縮合反應生成化合物1。在甲苯存在下并進行回流將該化合物與丙酸酐反應生成化合物2。在兩步工藝中，第一步在1，2-氯乙烷存在下用氯甲酸1-氯乙基酯(ClCO2CHClCH3)回流2小時，第二步用甲醇，通過化合物2的N-去甲基化制備去甲芬太尼(化合物4)。在4-甲基-2-戊酮和K2CO3存在下并回流將對硝基苯基溴化物與化合物4反應；接著在HCOONH4和CH3OH存在下用Pd-C將硝基還原成氨基從而生成中間化合物6。半抗原A是在EDPA和二惡烷存在下通過化合物6與3-(乙酰硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SATP)反應生成的并且半抗原B是通過化合物6與琥珀酸酐反應生成的。
參考圖2，按照反應圖解2制備半抗原N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基(S-乙酰硫基丙酰胺)(C)、N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基琥珀酰胺(D)和N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基戊二酰胺(E)。1-苯乙基-4-哌啶酮與苯胺反應接著還原Schiff堿來制備脫丙酰芬太尼(化合物7)。然后在EDPA和惡烷存在下將所產生的化合物與N-琥珀酰亞胺基3-(乙酰硫)丙酸酯(SATP)反應得到半抗原C，與琥珀酸酐反應得到半抗原D或者與戊二酸酸酐反應得到半抗原E。
參考圖3和4，在制備半抗原N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-(對-O-羧基丙基)-苯基丙酰胺(F)前，按照圖3的反應圖解3制備[乙基-對(O-羧基丙基)]苯胺(化合物9)。在氫化鈉存在下用4-溴丁酸乙基酯將對硝基苯酚烷基化生成化合物8。然后用Pd-C將化合物8的硝基還原成氨基，得到化合物9。
按照圖4的反應圖解4三步制備N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-(對-O-羧基丙基)-苯基丙酰胺(半抗原F)。在1，2-二氯乙烷中有三乙酰氧基氫硼化鈉和醋酸存在下將N-(1-苯乙基)-4-哌啶酮與[乙基-對-(O-羧基丙基)]苯胺(化合物9)反應生成化合物10。在甲苯中回流下將化合物10與丙酸酐反應得到化合物11。半抗原F是在甲醇中由化合物11與2N氫氧化鈉皂化生成的。
參照圖5，按照反應圖解5四步制備半抗原N-(1-羧甲基-4-哌啶基)N-苯基丙酰胺(G)。在DMF中在有氫化鈉存在下4-哌啶酮單水化合物單鹽酸鹽與溴乙酸乙酯反應得到乙基-N-羧甲基-4-哌啶酮(化合物12)。然后在三乙酰氧基氫硼化鈉和醋酸存在下將化合物12與苯胺反應生成N-(乙基-1-羧甲基-4-哌啶基)-N-苯基丙氨酸(化合物13)。
在甲苯中回流下用丙酸酸酐處理化合物13得到化合物14。半抗原G是在甲醇中用氫氧化鈉(2N)將化合物14皂化產生的。
免疫原和偶聯(lián)物的制備盡管芬太尼半抗原提供了限定的結構表位，但是它們不是自身免疫原，所以需要結合到載體物質上，當將其注射給宿主動物時，它將引起免疫原反應。適當?shù)妮d體物質包括蛋白質類如白蛋白、血清蛋白類如球蛋白、眼鏡晶狀體蛋白類和脂蛋白類。蛋白載體的例子包括牛血清蛋白、蛋卵清蛋白、牛γ球蛋白、甲狀腺素結合的球蛋白、鎖眼糾纏的血藍蛋白等。另外一種選擇，也可以使用具有足夠數(shù)量的可用的氨基酸合成聚(氨基酸類)如賴氨酸，這樣可以使其他合成或天然聚合物具有反應性功能基團。尤其是，可以將碳水化合物、酵母或多糖結合到半抗原上生成免疫原。
每個半抗原也能夠共價結合到標記基團如酶(例如馬辣根過氧化酶)，一種具有熒光特性或放射標記的物質從而生成用于免疫測定的偶聯(lián)物(也稱為檢測劑)。例如熒光物質可以是熒光素或其衍生物的單價殘基。
為了確認半抗原與載體物質足夠的結合已經實現(xiàn)，在免疫前，用基質-輔助的UV激光解析/離子化時間-飛行質譜(MALDI-TOF MS)評價各免疫原。在優(yōu)選的載體物質牛血清蛋白中，優(yōu)選每個載體分子最小6個分子半抗原。
在制備含半抗原的偶聯(lián)物或免疫原中，交聯(lián)劑中的e是1如半抗原A和C，必須首先用不同的雙功能結合劑分別將馬來酰亞胺、鹵素、巰基吡啶基或乙烯基砜導入標記的試劑或載體物質，其中的結合劑例如但不限于N-(γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS)；琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)；(間-馬來酰亞胺基苯甲?；?-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)；琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB)；N-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙?；?氨基苯甲酸酯(SIAB)；溴代乙?；拾彼酦-羥基琥珀酰亞胺；N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)；乙烯基砜(Pierce化學公司，美國)。然后用硫羥基將這樣改良的標示劑或載體物質結合在半抗原上，其中e是1，如半抗原A和C。對半抗原，其中在交聯(lián)劑中e是0，如半抗原B、D、E、F和G來說，進行結合時沒有用前面改良的標示劑或載體物質，如果適當?shù)脑?，使用標準的結合方法如EDC或混合酸酐。
抗血清的制備為了生成多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合并且將混合物注射給宿主動物如兔、羊、小鼠、豚鼠或馬。進一步注射(強化)并將血清取樣用于評價抗體效價。當達到理想的效價時，然后將宿主動物放血得到適當體積的特殊抗血清。所需抗體純化的程度取決于所要應用。對許多目的來說，全不需要純化，但是，在另外情況，如抗體在固體支持物上固定時，進行純化步驟除去不需要的物質和消除非特異性結合。
本發(fā)明的特殊抗體可用作生化測定試驗的試劑或用于測定生物液體中芬太尼代謝物及其類似物代謝物的量。
在下表中，列出了下列實施例4、6-11和13-15中所制備的化合物的特征數(shù)據(jù)
免疫原的MALDI-TOF分析的一般方法使用聯(lián)有延遲提取的Voyager STR生物光譜研究站激光解吸質譜儀進行MALDI-TOF質譜。被分析的各樣品的等分試樣用0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液稀釋制成1mg/ml的樣品溶液。用Sinapinic酸基質分析等分試樣(1μl)并用牛血清白蛋白(Fluka)作為外標。附圖6顯示了BSA載體物質的分析。正如所看到的，出現(xiàn)的主要信號表示m/z 66,525樣品的被質子化的平均質量。在m/z 33,273處的信號與雙電荷形式的主要成分一致并且觀察到其他信號包括m/z13,641的信號。
在下列實施例中，除非另外說明，所有的百分數(shù)都是v/v。
實施例1反應圖解1N-(1-甲基)-4-(苯基胺)哌啶(化合物1)的制備向100ml無水二氯乙烷中的4-N-甲基-1-哌啶酮(7g，0.0062mol)溶液中加入苯胺(12.7g，0.14mol)和醋酸(4ml)，接著加入三乙酰氧基氫硼化鈉(13.1g，0.062mol)。在室溫氮氣下攪拌混合物過夜。
減壓蒸發(fā)溶劑后，加水(100ml)并加NaOH(1N)使該溶液成堿性到pH9。然后用甲苯(2×100ml)提取該溶液，合并有機相并用水(150ml)、鹽水(50ml)沖洗，在硫酸鈉上干燥，過濾并減壓濃縮。將殘余物色譜純化(硅膠，5％MeOH/氯仿)并從乙酸乙酯中重結晶得到9.4g(收率80％)的化合物1白色固體。
實施例2反應圖解1
N-(1-甲基-4-哌啶基)-N-苯基丙酰胺(化合物2)的制備向實施例1的化合物1(9.0g，0.047mol)的無水甲苯(150ml)溶液中加入丙酸酐(15.4g，0.118mol)。將該混合物回流攪拌過夜。真空除去溶劑并將殘余物從乙酸乙酯/己烷中重結晶得到10g化合物2白色固體(收率86％)。
實施例3反應圖解1N-[1-(1’-乙基氯甲酸)-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(化合物3)的制備在氮氣氛下將10g(0.04mol)實施例2的化合物2溶于無水1，2-二氯乙烷(100ml)，并在冰浴中冷卻到0℃。向該溶液滴加氯甲酸1-氯乙基酯(6.6g，0.046mol)并將該溶液加熱回流2小時(當反應完成時薄層色譜顯示)。將該溶液冷卻到室溫并減壓除去溶劑。將粘稠的油狀殘余物通過柱色譜(硅膠，10％乙酸乙酯/90％正己烷)純化得到題目化合物白色非晶形的固體(10g，收率74％)。
實施例4反應圖解1去甲芬太尼(化合物4)的制備將10g(0.03mol)實施例3的化合物3溶于無水甲醇(150ml)并在室溫攪拌過夜。將該溶液減壓濃縮得到定量收率的題目化合物白色粉術。
實施例5反應圖解1N-[1-(對硝基苯乙基)-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(化合物5)的制備在氮氣下，向實施例4的去甲芬太尼(6.71g，0.029mol)、對硝基苯乙基溴化物(7.178g，0.0372g)、碳酸鉀(19g，0.14mol)和少許碘化鈉結晶在4-甲基-2-戊酮(200ml)中的懸浮液攪拌回流過夜。冷卻到室溫后，用過濾除去沉淀并將溶液減壓濃縮。將暗色殘余物溶于乙酸乙酯(200ml)并用水洗滌(2×100ml)，在硫酸鈉上干燥，過濾并真空除去溶劑。將該殘余物通過柱色譜(硅膠，10％MeOH/90％CHCl3，v/v)純化得到題目的黃色固體標題化合物(5.33g，56％收率)。
實施例6反應圖解1N-[1-(對氨基苯乙基)-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(化合物6)的制備在氮氣氛下，在攪拌下向實施例5的化合物5(5g，0.013mol)的無水甲醇(200ml)溶液加入10％Pd-C(650mg)，接著加入甲酸銨(5g，0.063mol)。將該混合物在室溫下攪拌4小時并通過CeliteTM短柱濾除催化劑。減壓除去溶劑并將殘余物溶于水(100ml)。通過加入1N的NaOH使該水溶液成堿性并用乙酸乙酯萃取(2×100ml)。合并有機層，用水(50ml)、鹽水(50ml)沖洗并在無水硫酸鈉上干燥。然后將該溶液減壓濃縮得到化合物6的白色粉末，在薄層色譜層析上顯示單一點(2.7g，60％收率)。
圖13顯示了化合物6的NMR數(shù)據(jù)。
實施例7反應圖解1N-[1-(對乙酰硫代丙酰胺)苯乙基-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(半抗原A)的制備在氮氣下向攪拌著的實施例6的化合物6(1g，0.0028mol)和3-(乙酰硫)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SATP)(0.824g，0.00336mol)的251ml無水二惡烷溶液中加入二異丙基乙胺(EDPA)(0.72ml，0.0042mol)，攪拌該混合物并在60℃加熱6小時。然后真空濃縮該混合物，殘余物用10％v/v甲醇的氯仿溶液通過快速硅膠柱色譜純化并在冷的己烷/氯仿中重結晶得到半抗原A白色固體(835mg，收率62％)。
圖14顯示了半抗原A的NMR數(shù)據(jù)。
實施例8反應圖解1N-[1(對琥珀酰胺基)苯乙基-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺(半抗原B)的制備向實施例6的化合物6(1g，0.0028mol)的無水苯(75ml)溶液中加入琥珀酸酐(0.7007g，0.007mol)并將該混合物回流過夜。得到一種白色沉淀物并且TLC確認所有的起始物都已經消耗。濾除沉淀物、用苯沖洗并干燥。將該固體溶于水(20ml)并在50℃加熱1小時，過濾并完全干燥。將固體溶于乙腈(20ml)并在60℃加熱1小時，過濾，用少量冷乙腈沖洗并在真空下干燥過夜得到題目化合物白色固體(0.82g，60％收率)。
實施例9反應圖解2N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-苯胺(脫丙酰基芬太尼)(化合物7)題目化合物是使用1-苯乙基-4-哌啶酮(5.3g，0.026mol)、苯胺(5.01ml，0.55mol)、乙酸(3ml)、1，2-二氯乙烷(100ml)和三乙酰氧基氫硼化鈉(5.82g，0.027mol)按照實施例1所述的方法制備。得到題目化合物白色固體(收率74％)。
實施例10反應圖解2N-(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-苯基-(S-乙酰硫基丙酰胺)(半抗原C)用實施例7所述的相同方法制備半抗原C，收率55％，即在無水二噁烷中使用3-(乙酰硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SATP)，向其中加入二異丙基乙胺(EDPA)。
實施例11反應圖解2半抗原D和E的制備用實施例8所述的相同方法制備半抗原D和E。用琥珀酸酐(2當量)制備半抗原D并用戊二酸酐(2當量)制備半抗原E。
實施例12反應圖解3[乙基-對-(O-羧基丙基)]苯胺(化合物9)的制備在氮氣下，向氫化鈉(3.696g，0.11mol)的100ml無水二甲酰胺懸浮液中滴加對硝基苯酚(13.911g，0.1mol)的100ml的DMF溶液。將該混合物在60℃加熱1小時(沒有逸出氫氣)，然后冷卻到室溫。向該混合物中滴加4-溴代丁酸乙基酯(23.4g，0.12mol)的50ml的DMF溶液15分鐘。再將混合物加熱到60℃并攪拌4小時。冷卻到室溫后，減壓蒸發(fā)溶劑。向粗產物中加入150ml的水，然后用乙酸乙酯萃取(2×150ml)。用鹽水沖洗合并的有機層、干燥并過濾。真空除去溶劑，殘余物用快速色譜法(90％己烷/10％乙酸乙酯)純化得到21.7g(收率86％)的[乙基-對-(O-羧丙基)-1-硝基苯基](化合物8)白色固體。
在氮氣下，向攪拌著的化合物8(9.87g，0.039mol)的400ml無水甲醇溶液中加入10％Pd-C(10％)(1.95g)，接著加入甲酸銨(15g，0.189mol)。在TLC確認所有起始物都已經消耗后，將該混合物在室溫下攪拌2小時。通過CeliteTM濾除催化劑。然后真空除去溶劑并將殘余物溶于水(150ml)。通過加入2N的NaOH使該水溶液成堿性并用乙醚萃取(2×150ml)。合并有機層，用水(100ml)、鹽水(100ml)沖洗并在無水硫酸鈉上干燥。然后將該溶液減壓濃縮得到化合物9的白色粉末(6.52g，收率75％)。
實施例13反應圖解4N-[(1-苯乙基-4-哌啶基)-N-(乙基-對-(O-羧丙基))]苯胺(化合物10)的制備在無水1，2-二氯乙烷、醋酸和三乙氧基氫硼化鈉存在下，用化合物9替代苯胺和1-苯乙基-4-哌啶酮按照實施例1所列的相同方法制備化合物10。得到結晶形式的化合物10(收率65％)。
實施例14反應圖解4[乙基對-(O-羧丙基)]芬太尼(化合物11)的制備在回流下使用無水甲苯和丙酸酐中的化合物10按照實施例2所述的相同方法制備題目化合物。得到題目化合物11白色固體，收率80％。
實施例15反應圖解4對-[(O-羧丙基)]芬太尼(半抗原F)的制備向化合物11(3.5g，7.5mol)的甲醇(80ml)溶液中加入2N的氫氧化鈉(20ml)并在室溫下將該混合物攪拌4小時(TLC顯示沒有剩余起始物)。將該混合物真空干燥，加水(50ml)并將所得到的溶液pH調節(jié)到6。用氯仿萃取該溶液(2×100ml)，用鹽水(1×50ml)沖洗合并的有機萃取液，在硫酸鈉上干燥，過濾并真空濃縮。用乙醚研磨所得到的固體，過濾并干燥過夜得到2.1g(收率64％)的半抗原F。
圖15顯示了半抗原F的NMR數(shù)據(jù)。
實施例16反應圖解5乙基(1-羧甲基)-4-哌啶酮(化合物12)的制備在氮氣下向4-哌啶酮單水合物單鹽酸鹽(12g，78.12mmol)的無水二甲基甲酰胺(120ml)溶液分小份加入氫化鈉[60％w/w礦物油分散液](5.25g，156mmol)。加完后，將該混合物在60℃加熱1小時(再看不到氫氣逸出)，冷卻到室溫并在15分鐘內滴加溴代乙酸乙酯(19.6g，177mmol)的DMF(50ml)溶液。將所得到的混合物在60℃加熱過夜。加入幾滴水終止反應并真空除去溶劑。加水(100ml)并用乙酸乙酯(2×100ml)萃取該混合物。用水(1×100ml)、鹽水(1×100ml)沖洗合并的有機層，在硫酸鈉上干燥并真空除去溶劑。殘余物用柱色譜法(50％乙酸乙酯/50％己烷，v/v)純化得到題目化合物12透明油狀物(3.4g，65％收率)。
實施例17反應圖解5N-[乙基-1-羧甲基]-4-(苯基氨基)]哌啶(化合物13)的制備在三乙氧基氫硼化鈉(8.5g，0.04mol)和乙酸(4ml)存在下使用乙基(1-羧甲基)-4-哌啶酮(化合物12)(7.4g，0.04mol)和苯胺(8.2g，0.14mo1)的1，2-二氯乙烷(120ml)溶液按照實施例1所述的相同方法制備化合物13。在柱色譜層析法(硅膠，10％v/v甲醇氯仿溶液)純化后得到題目化合物(8.4g，收率80％)。
實施例18反應圖解5N-(乙基-羧甲基)-去甲芬太尼(化合物14)的制備使用實施例2所述的相同方法從化合物13(7.86g，0.03mol)在無水甲苯和丙酸酐(8.59g，0.066mol)中制備化合物14。在從乙酸乙酯/己烷重結晶后得到化合物14(7.15g，收率75％)。
實施例19反應圖解5N-(羧甲基)-去甲芬太尼(半抗原G)的制備向化合物14(3.78g，10mmol)的甲醇(80ml)溶液中加入2N氫氧化鈉(20ml)并將該混合物在室溫攪拌4小時(TLC顯示沒有起始物存在)。將該混合物減壓干燥，加水(50ml)并加1N HCl調節(jié)pH到5。所形成的沉淀過濾收集，用少量冷水沖洗并在五氧化二磷存在下干燥過夜。所得到的白色固體就是相應的半抗原G(1.38g，收率50％)。
圖16顯示了半抗原G的NMR數(shù)據(jù)。
實施例20牛血清白蛋白(BSA)-溴代乙酰基甘氨酸的制備向冷卻到0℃的BSA(1g)的0.1M硼酸鹽緩沖液(pH8.5，45ml)溶液中滴加溴代乙?；拾彼酦-琥珀酰亞胺酯(0.375g，0.13mmol)的DMF(5ml)溶液。在加入過程中，保持pH在8。加完后，pH穩(wěn)定在8并將該溶液在0℃攪拌1小時。然后調節(jié)pH大約為7并對著4℃蒸餾水將該溶液透析過夜(交替2次)。然后將該溶液冷凍干燥得到大約1g的溴代乙?；拾彼崴揎椀腂SA。
MALDI-TOF分析(見圖7)顯示了存在主要的信號，這表明m/z為73,818的該樣品的平均質子化質量。在m/z 24,564，36,897和147,713處的信號分別與三電荷、雙電荷和二聚物形式的主要成分一致。而且在m/z 14,927，49,425和111,425處還觀察到了其他信號。
這些數(shù)據(jù)表明溴代乙酰基甘氨酸已經修飾成每分子BSA的40.3個賴氨酸基團。
實施例21用溴代乙?；拾彼嵝揎椀腂SA制備免疫原A將半抗原A(58.15mg，0.12mmol)溶于無水DMF(100μL)中并向該溶液中加入羥胺溶液(900μL，pH12)。將該混合物放置10-15分鐘(TLC顯示沒有半抗原A和形成較低Rf的的新化合物)。加入磷酸鹽緩沖液終止反應并加入0.5M HCl調節(jié)pH到7。將該溶液滴加到實施例20的修飾過的BSA溶液(10ml水中200mg)并在4℃將溶液攪拌過夜(避光保護)。然后將該溶液對著蒸餾水透析24小時(交替3次)并冷凍干燥。
MALDI結果(見附圖8)顯示了12.5個分子的半抗原A已經結合到1分子的修飾過的BSA上。具體來說，該樣品在m/z 79,795處存在顯示平均質子化質量的信號。在m/s 39,759處的信號與雙電荷形式的主要成分一致。在m/z 15,654還觀察到其他信號。
實施例22用溴化乙酰基甘氨酸修飾的BSA制備免疫原C使用半抗原C按照實施例21給出的方法進行結合。
MALDI結果(見附圖9)顯示了7.2個分子的半抗原C已經結合到1分子的修飾過的BSA上。具體來說，該樣品在m/z 76,770處存在顯示平均質子化質量的主要信號。在m/s 38,367處的信號與雙電荷形式的主要成分一致。在m/z 15,514還觀察到其他信號。
實施例23反應圖解4用BSA制備免疫原F將50mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于600μl水中并迅速加入到100mg BSA(1.5μmol)的4ml水溶液中。邊攪拌邊滴加已溶于2ml無水DMF的半抗原F(19.7mg，45lμmol)。加入5mg的磺基-NHS并在37℃溫育所得到的溶液過夜。然后對著4℃5L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.2邊攪拌邊透析該溶液。
MALDI結果(見附圖10)顯示了17.1個分子的半抗原F已經結合到1分子的BSA上。具體來說，該樣品在m/z 73,590處存在顯示平均質子化質量的主要信號。在m/s 69,870處的信號與雙電荷形式的主要成分一致。在m/z 14,177還觀察到其他信號。
實施例24反應圖解5用BSA制備免疫原G使用半抗原G(12.57mg，43μmol)按照實施例23所述的方法進行結合。
MALDI結果(見附圖11)顯示了10.4個分子的半抗原G已經結合到1分子的修飾過的BSA上。具體來說，該樣品在m/z 69,355處存在顯示平均質子化質量的主要信號。在m/s 34,971處的信號與雙電荷形式的主要成分一致。在m/z 13,924還觀察到其他信號。
實施例25半抗原B和E與標示劑(辣根過氧化物酶(HRP))的結合將10mg的EDC溶于800μl水中并迅速加入半抗原(1mg)的200μl DMF溶液中。輕輕混合所得到的溶液，然后加入HRP(20mg)的1ml水溶液中?；旌虾?，加5mg的磺基-NHS并在37℃黑暗處將整個反應溫育過夜。所得到偶合物通過兩個PD10柱(Pharmacia Biotech)用20mM PBS，pH7.2洗脫來純化，然后對著4℃ 20mM PBS，pH7.2，透析一夜。
實施例26半抗原G與標示劑(HRP)結合將10μl三乙胺(TEA)加入半抗原G(1mg)的400μl的DMF溶液中并在室溫將所得到的溶液混合10分鐘。然后加4μl氯甲酸異丁基酯(BCF)并使反應在室溫下再進行10分鐘。將激活的半抗原迅速加入HRP(20mg)的2ml水溶液中并將該反應物在室溫黑暗處攪拌下溫育過夜。所得到偶合物通過兩個PD10柱(Pharmacia Biotech)用20mM PBS，pH7.2，洗脫來純化，然后對著4℃ 20mM PBS，pH7.2，透析一夜。
實施例27免疫接種和取血將實施例21、22、23和24中制備的每個免疫原水溶液與弗氏完全佐劑(FCA)配制成由2mg/ml免疫原的50％(v/v)FCA組成的乳液。用該乳液給三只羊免疫接種，在每只動物的脅腹四個部位中的每個皮下注射0.25ml。接著免疫接種(強化)包括在50％(v/v)弗氏不完全佐劑(FIA)中乳化的1mg/ml免疫原并每隔1月以相同方法給藥共1年。在每次強化后7到14天，取血樣。將每個樣品處理生成抗血清，再通過辛酸純化和硫酸銨沉淀純化得到免疫球蛋白G(IgG)部分。用如下所述的競爭性ELISA微量滴定板測定法評估IgG部分。
實施例28去甲芬太尼和芬太尼的競爭性ELISA微量滴定板測定(a)用對免疫原A所制備的抗血清(半抗原A-BSA)(實施例21)的IgG部分涂覆提高結合96孔聚乙烯微量滴定板的孔，并用10mM Tris，pH8.5(125μl/孔)稀釋。用標準的ELISA方格盤技術測定適當抗體包覆的稀釋液。將平板在37℃溫育2小時，用含吐溫20(TBST)的Tris緩沖鹽水沖洗4次并干燥。在TBST中以0、1、5、10、50和500ng/ml制備芬太尼和去甲芬太尼的標準溶液并向適當孔中各加25μl(見圖12)。向圖12所示的各孔中加入100μl的稀釋于含EDTA、D-甘露糖醇、蔗糖、硫汞撒和BSA的tris緩沖液的偶合物B(半抗原B-HRP)(實施例25)。也用標準ELISA方格盤技術測定偶合物的適當稀釋液。將該平板在37℃溫育2小時。用TBST在10分鐘內沖洗6次來除去剩余的沒有結合的偶合物。向平板的每孔中加入125μl的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，然后在室溫黑暗處將其溫育15到20分鐘。向每孔中加入125μl 0.2M的H2SO4來終止反應。然后使用微量滴定板計數(shù)器在450nm測定吸收值。下表1顯示了測定中得到的數(shù)據(jù)。
表1使用對免疫原A制備的抗血清(半抗原A-BSA)(實施例21)和作為檢測劑的偶合物B(半抗原B-HRP)(實施例25)的去甲芬太尼和芬太尼的競爭性微量滴定板測定法中得到的數(shù)據(jù)
A450＝在450nm處的吸收值B＝在450nm處xng/ml標準濃度的吸收值B0＝在450nm處0ng/ml標準濃度的吸收值IC50＝產生50％B/B0的標準濃度(b)用與實施例28(a)所述的相似方式并使用對A450、B、B0和IC50的相同定義，用對免疫原A制備的抗血清(半抗原A-BSA)(實施例21)的IgG部分包覆96孔的微量滴定板的孔并用偶合物G(半抗原G-HRP)(實施例26)作為測定試劑。下表2中顯示了所得到的數(shù)據(jù)。
表2使用對免疫原A制備的抗血清(半抗原A-BSA)(實施例21)和偶合物G(半抗原G-HRP)作檢測劑(實施例26)對去甲芬太尼和芬太尼的競爭性微量滴定板測定法中得到的數(shù)據(jù)
(c)以與實施例28(a)所述的相似方法，用對免疫原C制備的抗血清(半抗原C-BSA)(實施例22)的IgG部分和用偶合物E(半抗原E-HRP)(實施例25)作為檢測劑包覆96孔的微量滴定板的孔。下表3中顯示了所得到的數(shù)據(jù)。
表3使用對免疫原C制備的抗血清(半抗原C-BSA)(實施例22)和偶合物E(半抗原E-HRP)作檢測劑(實施例25)對去甲芬太尼和芬太尼的競爭性微量滴定板測定法中得到的數(shù)據(jù)
參考文獻Camu等；麻醉與止痛(Anesth.Analg.)；61；pp657-61(1982).
Frincke，J.M.& Henderson，G.L.；藥物代謝與處置(Drug Metab.Dispos)；8(6)；pp425-7(1980).
Hammargren，W.R.& Henderson，G.L.；分析毒理學雜志(J.Anal.Toxicol.)；12；pp183-191(1988).
Henderson等；藥理學與實驗治療學雜志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)；192(2)；pp489-96(1975).
Makowski等；臨床與實驗科學年刊(Annals of Clinical and LaboraloryScience)；25(2)；pp169-177(1995).
McDonald等；化學病理學與藥理學研究通訊(Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.)；57(3)；pp389-407(1987).
Meuldermans等；Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.；257；pp4-19(1982).
Michiels等；歐洲臨床藥理學雜志(Eur.J.Clin.Pharmacol.)；12(2)；pp1 53-8(1977).
Ruangyuttikam等；分析毒理學雜志(J.Anal.Toxicol.)；14；pp160-164(1990).
Silverstein等；麻醉與止痛(Anesthesia and Analgesia)；76；pp618-621(1993).
Watts，V.W.& Caplan，Y.H.；分析毒理學雜志(J.Anal.Toxicol)；14；pp266-272(1990).
權利要求
1.一種如下通式的免疫原 其中Z1是結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑或氫；Z4選自于N-苯乙基、結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，條件是當Z1是氫時，Z4是結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，并且當Z4是N-苯乙基時，Z1是結合具有抗原性的載體物質的交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑不是-COOH。
2.一種如下通式的偶聯(lián)物 其中其中Z1是共價結合有可檢測的標示劑的交聯(lián)劑或氫；Z4選自于N-苯乙基、共價結合可檢測標示劑的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，條件是當Z1是氫時，Z4是共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑或 其中Z2是在鄰位、間位或對位共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，并且當Z4是N-苯乙基時，Z1是共價結合可檢測的標示劑的交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑不是-COOH。
3.按照權利要求1或2中的任何一項所要求的免疫原或偶合物，其中Z2的交聯(lián)劑在對位。
4.按照前述權利要求中任何一項所要求的免疫原或偶合物，其中所述的交聯(lián)劑在其游離端是用-CO-R終止，其中R是羥基或短鏈的烷基(C1-5)，優(yōu)選C1-2烷基。
5.按照權利要求1-3的任何一項所要求的免疫原或偶聯(lián)物，其中所述的交聯(lián)劑含有-(NH)a-(CO)b-Xc-(CH2)d-Se-CO-R其中a是0或1；b是0或1；X是氧或硫；c是0或1；d是選自1-5的整數(shù)；e是0或1并且R是短鏈(C1-5)烷基，優(yōu)選C1-2烷基或羥基。
6.按照權利要求6所要求的免疫原或偶合物，其中a是1；b是1；c是0和d是2。
7.按照權利要求6所要求的免疫原和偶合物，其中e是1而R是甲基。
8.按照權利要求6所要求的免疫原或偶合物，其中e是0和R是羥基。
9.按照權利要求6-8的任何一項所要求的免疫原或偶合物，其中Z1是氫而Z2交聯(lián)劑是在對位。
10.按照權利要求5所要求的免疫原或偶合物，其中a是0；b是0而c是0。
11.按照權利要求10所要求的免疫原和偶合物，其中d是0；e是1而R是甲基。
12.按照權利要求10所要求的免疫原和偶合物，其中d是1；e是0而R是羥基。
13.按照權利要求10-12的任何一項所要求的免疫原或偶合物，其中Z1或Z2是交聯(lián)劑。
14.按照權利要求1和3-13中的任何一項所要求的免疫原，其中具有抗原性的載體物質是選自于蛋白、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。
15.抗權利要求1和3-14中任何一項所要求的免疫原所制備的抗體，其中所述抗體是能夠與至少一個芬太尼代謝物或芬太尼類似物的代謝物的結構表位結合。
16.一種制備權利要求15所述抗體的方法，該方法包括通過反復給藥權利要求1和3-14中任何一項所述免疫原來給動物免疫接種和收集所得到的免疫接種過的動物的血清的步驟。
17.按照權利要求2-13中任何一項所要求的偶合物，其中可檢測的標示劑選自酶，優(yōu)選是過氧化酶，更優(yōu)選辣根過氧化物酶；發(fā)光的物質，優(yōu)選選自生物發(fā)光、化學發(fā)光或熒光性物質；放射活性物質；或其混合物。
18.一種檢測或定量測定樣品中芬太尼的代謝物或芬太尼類似物的代謝物的方法，該方法包括將權利要求2-13和17所要求的偶合物或其混合物以及權利要求15所要求的抗體或其混合物與樣品接觸；并且從樣品中芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的存在或含量的校準曲線推出。
19.一種檢測或定量測定芬太尼代謝物和芬太尼類似物的代謝物的試劑盒，該試劑盒包括權利要求2-13和17中任何一項所要求的偶合物或其混合物和權利要求15所要求的抗體或其混合物。
20.按照權利要求18或19的方法或試劑盒，其中抗體是抗其中Z1或Z2是交聯(lián)劑優(yōu)選Z2是交聯(lián)劑的免疫原所制備的。
21.按照權利要求18-20中任何一項的方法或試劑盒，其中偶合物的Z2或Z4是交聯(lián)劑，優(yōu)選Z4是交聯(lián)劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了可用交聯(lián)劑衍生的半抗原，是在附圖1a中R
文檔編號C07D211/58GK1428607SQ0215066
公開日2003年7月9日 申請日期2002年11月15日 優(yōu)先權日2001年11月16日
發(fā)明者羅伯特·I·麥康奈爾, 埃爾·O·本奇克, 斯蒂芬·P·菲茨杰拉德, 約翰·V·拉蒙特 申請人:蘭多克斯實驗室有限公司