專利名稱：一種多肽－人細(xì)胞調(diào)控蛋白54和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了一種多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Rho是一種Ras GTPase的同源蛋白，它廣泛存在于從酵母到哺乳動物的體內(nèi)。Rho在有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間轉(zhuǎn)換，這一轉(zhuǎn)換是調(diào)節(jié)細(xì)胞支持和運(yùn)動性，增強(qiáng)細(xì)胞收縮反應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)移動的開關(guān)。在細(xì)胞過程的特殊階段和特定時候，Rho可以指導(dǎo)肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架的重組。Rho還可以激活一些免疫方面的應(yīng)答反應(yīng)，可以通過一些激酶途徑將信號傳遞至核中。根據(jù)已有的研究，已經(jīng)證明，有兩個信號過程與Rho的調(diào)控有關(guān)一是某些G蛋白結(jié)合受體的激活，如溶血磷脂酸受體；二是一些小的GTPase的激活，包括Ras，CDC42，and Rac等。最近的研究證明，有一些酶可以與Rho相互作用，包括一些脂酶和一些絲氨酸/蘇氨酸激酶，如PKN和p160ROCK。當(dāng)然，對Rho功能的研究還有很多方面有待進(jìn)一步完善，包括Rho對細(xì)胞的刺激作用等。(J Biochem(Tokyo)1996Aug；120(2)215-28)Rho結(jié)合蛋白是一個家族，它們都具有Rho結(jié)合功能域，這個功能域的具體結(jié)構(gòu)是從一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶——p160(ROCK)中被發(fā)現(xiàn)的，但只知道它的一級結(jié)構(gòu)，Rho結(jié)合功能域位于p160(ROCK)的NH2末端，包括934-1015位的氨基酸序列，其中，K934M，L941A，E1008A突變極大地減弱了Rho結(jié)合功能，I1009A突變則會導(dǎo)致Rho結(jié)合功能的喪失，對Rho結(jié)合功能域的研究還有待進(jìn)一步開展。(J Biol Chem 1996 Sep 20；271(38)23022-8)在老鼠的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種蛋白，被稱為rhophilin，這是一種Rho結(jié)合蛋白。Rhophilin的mRNA在成熟個體的睪丸組織內(nèi)高度表達(dá)。此外，rhophilin在微生物、細(xì)菌和鼠的精子尾部的纖維鞘中被證明存在。(FEBS Lett 1999 Feb19；445(1)9-13)Rhophilin可以結(jié)合于活化的GTP-Rho，rhophilin的Rho結(jié)合功能域和一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PKN有40％的相同性，PKN也可以結(jié)合到GTP-Rho并因這種結(jié)合而活化。(Science 1996 Feb 2；271(5249)645-8)Rhotekin也是一種新發(fā)現(xiàn)的Rho結(jié)合蛋白，這是從鼠的腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的，它具有與rhophilin和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKN)同源的Rho結(jié)合功能域。(J Biol Chem 1996 Jun 7；271(23)13556-60)Rho及其結(jié)合蛋白被證明可以在肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化作用過程中有作用，因此，Rho及其結(jié)合蛋白可以對平滑肌的收縮、非肌肉細(xì)胞中肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用等有調(diào)節(jié)作用。(Science 1996 Jul 12；273(5272)245-8)由于上述的Rho的功能，因此，Rho結(jié)合蛋白也被認(rèn)為在很多生命過程中有著重要作用，包括(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞支持和運(yùn)動性，調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮反應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)移動；(2)影響肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架的重組；(3)調(diào)控某些信號傳導(dǎo)過程，如調(diào)控一些GTPase，包括Ras，CDC42，and Rac等?？偟膩碇v，Rho結(jié)合蛋白在細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動等方面都有著重要的作用。
根據(jù)氨基酸同源比較的結(jié)果，本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為一種新的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54(HRhoBP54)，其同源蛋白是小家鼠的Rho結(jié)合蛋白(rhophilin)，蛋白號是U43194。
由于如上所述人細(xì)胞調(diào)控蛋白54蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育等機(jī)體重要功能中起重要作用，而且相信這些調(diào)節(jié)過程中涉及大量的蛋白，因而本領(lǐng)域中一直需要鑒定更多參與這些過程的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新人細(xì)胞調(diào)控蛋白54蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎(chǔ)。這種蛋白可能構(gòu)成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥的基礎(chǔ)，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的抗體。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％相同性的多核苷酸。
更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有<210>1中2-1468位的序列；和(b)具有<210>1中1-2869位的序列。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收表達(dá)產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明提供了一種多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，其基本上是由<210>2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括<210>1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長為2869個堿基，其開放讀框(2-1468)編碼了488個氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與小家鼠的Rho結(jié)合蛋白有47％的同源性，可推斷出該人細(xì)胞調(diào)控蛋白54具有小家鼠的Rho結(jié)合蛋白相似的結(jié)構(gòu)和功能。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與<210>1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有<210>2的蛋白質(zhì)或多肽，但與<210>1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與<210>2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應(yīng)的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定人細(xì)胞調(diào)控蛋白5 4的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測定生物學(xué)活性，來檢測基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人細(xì)胞調(diào)控蛋白54基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復(fù)進(jìn)行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人細(xì)胞調(diào)控蛋白54編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動子的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中，編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的藥劑的方法。激動劑提高人細(xì)胞調(diào)控蛋白54刺激細(xì)胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細(xì)胞過度增殖有關(guān)的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細(xì)胞或表達(dá)人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的膜制劑與標(biāo)記的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的拮抗劑可以與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54結(jié)合并消除其功能，或是抑制該多肽的產(chǎn)生，或是與該多肽的活性位點(diǎn)結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人細(xì)胞調(diào)控蛋白54加入生物分析測定中，通過測定化合物對人細(xì)胞調(diào)控蛋白54和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，一般應(yīng)對人細(xì)胞調(diào)控蛋白54分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細(xì)胞作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對人細(xì)胞調(diào)控蛋白54抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人細(xì)胞調(diào)控蛋白54直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人細(xì)胞調(diào)控蛋白5 4的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohlerand Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的單鏈抗體。
抗人細(xì)胞調(diào)控蛋白5 4的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54。
與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
抗體還可用于設(shè)計針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人細(xì)胞調(diào)控蛋白54高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人細(xì)胞調(diào)控蛋白54陽性的細(xì)胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的產(chǎn)生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人細(xì)胞調(diào)控蛋白54水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗(yàn)中所檢測的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54水平，可以用作解釋人細(xì)胞調(diào)控蛋白54在各種疾病中的重要性和用于診斷人細(xì)胞調(diào)控蛋白54起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進(jìn)行質(zhì)譜分析。
編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的無表達(dá)或異常/無活性表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計用于表達(dá)變異的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，以抑制內(nèi)源性的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54活性。例如，一種變異的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54可以是縮短的、缺失了信號傳導(dǎo)功能域的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏信號傳導(dǎo)活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人細(xì)胞調(diào)控蛋白54表達(dá)或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸可包裝到脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
抑制人細(xì)胞調(diào)控蛋白54mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸可用于與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的相關(guān)疾病的診斷。編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸可用于檢測人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的異常表達(dá)。如編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的DNA序列可用于對活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用人細(xì)胞調(diào)控蛋白54特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測人細(xì)胞調(diào)控蛋白54基因的突變也可用于診斷人細(xì)胞調(diào)控蛋白54相關(guān)的疾病。人細(xì)胞調(diào)控蛋白54突變的形式包括與正常野生型人細(xì)胞調(diào)控蛋白54DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點(diǎn)?，F(xiàn)在，只有很少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記物可用于標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合細(xì)胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實(shí)現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進(jìn)行染色體定位。此技術(shù)的綜述，參見Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結(jié)構(gòu)的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術(shù)的分辨能力，被精確定位至與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應(yīng)于一個基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人細(xì)胞調(diào)控蛋白54以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來給藥。施用于患者的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明人細(xì)胞調(diào)控蛋白54和小家鼠的Rho結(jié)合蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，下方序列是小家鼠的Rho結(jié)合蛋白。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。54kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆0784F04的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測定。結(jié)果表明，0784F04克隆所含的全長cDNA為2869bp(如<210>1所示)，從第2bp至1468bp有一個1467bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如<210>2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0784F04，編碼的蛋白質(zhì)命名為人細(xì)胞調(diào)控蛋白54。
實(shí)施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索。與本發(fā)明的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54同源性最高的基因是一種已知的小家鼠的Rho結(jié)合蛋白，其編碼的蛋白在Genbank的準(zhǔn)入號為U43194。蛋白質(zhì)同源結(jié)果示于圖1，兩者高度同源，其相同性為47％；相似性為60％。
實(shí)施例3用RT-PCR方法克隆編碼人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的基因用胎腦細(xì)胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer15’-GATGTTCTCTCTCACCGGGGTTC-3’(<210>3)Primer25’-GGTAAATGAATATGTTTATTTAA-3’(<210>4)Primer1為位于<210>1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為<210>1的中的3’端反向序列。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設(shè)3-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與<210>1所示的1-2869bp完全相同。
實(shí)施例4Northern印跡法分析人細(xì)胞調(diào)控蛋白54基因的表達(dá)用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進(jìn)行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機(jī)引物法制備32P-標(biāo)記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴(kuò)增的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54編碼區(qū)序列(2bp至1468bp)。將32P-標(biāo)記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進(jìn)行分析和定量。
實(shí)施例5重組人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的體外表達(dá)、分離和純化根據(jù)<210>1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計出一對特異性擴(kuò)增引物，序列如下
Primer35’-CCCCATATGATGTTCTCTCTCACCGGGGTICCGG-3’(<210>5)Primer45’-CCCGAGCTCTTAGTACCAAGAACTGTCTGAGTTG-3’(<210>6)此兩段引物的5’端分別含有NdeI和SacI酶切位點(diǎn)，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeI和SacI酶切位點(diǎn)相應(yīng)于表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28b(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以含有全長目的基因的pBS-0784F04質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-0784F04質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s，60℃30s，68℃ 2min，共25個循環(huán)。用NdeI和SacI分別對擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0784F04)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0784F04)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進(jìn)行層析，得到了純化的目的蛋白人細(xì)胞調(diào)控蛋白54。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在54kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與<210>2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實(shí)施例6抗人細(xì)胞調(diào)控蛋白54抗體的產(chǎn)生用多肽合成儀(PE公司產(chǎn)品)合成下述人細(xì)胞調(diào)控蛋白54特異性的多肽NH2-Met-Phe-Ser-Leu-Thr-Gly-Val-Pro-Val-Ser-Gln-Gln-Asn-Leu-Leu-COOH。
將該多肽分別與血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復(fù)合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍(lán)蛋白多肽復(fù)合物加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復(fù)合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54結(jié)合。
序列表<110>上海博德基因開發(fā)有限公司<120>一種多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54和編碼這種多肽的多核苷酸<130>0784f04<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1500<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(2)..(1468)<223>
<400>1g atg ttc tct ctc acc ggg gtt ccg gtc agc cag cag aac ctg ctg ctg 49Met Phe Ser Leu Thr Gly Val Pro Val Ser Gln Gln Asn Leu Leu Leu1510 15gag aag gcc agt gtc ctg ttc aac act ggg gcc ctc tac acc cag att97Glu Lys Ala Ser Val Leu Phe Asn Thr Gly Ala Leu Tyr Thr Gln Ile20 25 30ggg acc cgg tgt gat cgg cag acg cag gct ggg ctg gag agt gcc ata 145Gly Thr Arg Cys Asp Arg Gln Thr Gln Ala Gly Leu Glu Ser Ala Ile35 40 45
gat gcc ttt cag aca gcc gca ggg gtt tta aat tac ctg aaa gac aca 193Asp Ala Phe Gln Thr Ala Ala Gly Val Leu Asn Tyr Leu Lys Asp Thr50 55 60ttt acc cat act cca agt tac gac atg agc cct gcc atg ctc agc gtg 241Phe Thr His Thr Pro Ser Tyr Asp Met Ser Pro Ala Met Leu Ser Val65 70 75 80ctc gtc aaa atg atg ctt gca caa gcc caa gaa agc gtg ttt gag aaa 289Leu Val Lys Met Met Leu Ala Gln Ala Gln Glu Ser Val Phe Glu Lys85 90 95atc agc ctt cct ggg atc cgg aat gaa ttc ttc atg ctg gtg aag gtg 337Ile Ser Leu Pro Gly Ile Arg Asn Glu Phe Phe Met Leu Val Lys Val100 105 110gct cag gag gct gct aag gtg gga gag gtc tac caa cag cta cac gca 385Ala Gln Glu Ala Ala Lys Val Gly Glu Val Tyr Gln Gln Leu His Ala115 120 125gcc atg agc cag gcg ccg gtg aaa gag aac atc ccc tac tcc tgg gcc 433Ala Met Ser Gln Ala Pro Val Lys Glu Asn Ile Pro Tyr Ser Trp Ala130 135 140agc tta gcc tgc gtg aag gcc cac cac tac gcg gcc ctg gcc cac tac 481Ser Leu Ala Cys Val Lys Ala His His Tyr Ala Ala Leu Ala His Tyr145 150 155 160ttc act gcc atc ctc ctc atc gac cac cag gtg aag cca ggc acg gat 529Phe Thr Ala Ile Leu Leu Ile Asp His Gln Val Lys Pro Gly Thr Asp165 170 175ctg gac cac cag gag aag tgc ctg tcc cag ctc tac gac cac atg cca 577Leu Asp His Gln Glu Lys Cys Leu Ser Gln Leu Tyr Asp His Met Pro180 185 190gag ggg ctg aca ccc ttg gcc aca ctg aag aat gat cag cag cgc cga 625Glu Gly Leu Thr Pro Leu Ala Thr Leu Lys Asn Asp Gln Gln Arg Arg195 200 205cag ctg ggg aag tcc cac ttg cgc aga gcc atg gct cat cac gag gag 673Gln Leu Gly Lys Ser His Leu Arg Arg Ala Met Ala His His Glu Glu
210 215 220tcg gtg cgg gag gcc agc ctc tgc aag aag ctg cgg agc att gag gtg721Ser Val Arg Glu Ala Ser Leu Cys Lys Lys Leu Arg Ser Ile Glu Val225 230 235 240cta cag aag gtg ctg tgt gcc gca cag gaa cgc tcc cgg ctc acg tac769Leu Gln Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Glu Arg Ser Arg Leu Thr Tyr245 250 255gcc cag cac cag gag gag gat gac ctg ctg aac ctg atc gac gcc ccc817Ala Gln His Gln Glu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Leu Ile Asp Ala Pro260 265 270agt gtt gtt gct aaa act gag caa gag gtt gac att ata ttg ccc cag865Ser Val Val Ala Lys Thr Glu Gln Glu Val Asp Ile Ile Leu Pro Gln275 280 285ttc tcc aag ctg aca gtc acg gac ttc ttc cag aag ctg ggc ccc tta913Phe Ser Lys Leu Thr Val Thr Asp Phe Phe Gln Lys Leu Gly Pro Leu290 295 300tct gtg ttt tcg gct aac aag cgg tgg acg cct cct cga agc atc cgc961Ser Val Phe Ser Ala Asn Lys Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ser Ile Arg305 310 315 320ttc act gca gaa gaa ggg gac ttg ggg ttc acc ttg aga ggg aac gcc 1009Phe Thr Ala Glu Glu Gly Asp Leu Gly Phe Thr Leu Arg Gly Asn Ala325 330 335ccc gtt cag gtt cac ttc ctg gat cct tac tgc tct gcc tcg gtg gca 1057Pro Val Gln Val His Phe Leu Asp Pro Tyr Cys Ser Ala Ser Val Ala340 345 350gga gcc cgg gaa gga gat tat att gtc tcc att cag ctt gtg gat tgt 1105Gly Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Ile Val Ser Ile Gln Leu Val Asp Cys355 360 365aag tgg ctg acg ctg agt gag gtt atg aag ctg ctg aag agc ttt ggc 1153Lys Trp Leu Thr Leu Ser Glu Val Met Lys Leu Leu Lys Ser Phe Gly370 375 380gag gac cag atc gag atg aaa gtc gtg agc ctc ctg gac tcc aca tca 1201
Glu Asp Gln Ile Glu Met Lys Val Val Ser Leu Leu Asp Ser Thr Ser385 390 395 400tcc atg cat aat aag agt gcc aca tac tcc gtg gga atg cag aaa acg 1249Ser Met His Asn Lys Ser Ala Thr Tyr Ser Val Gly Met Gln Lys Thr405 410 415tac tcc atg atc tgc tta gcc att gat gat gac gac aaa act gat aaa 1297Tyr Ser Met Ile Cys Leu Ala Ile Asp Asp Asp Asp Lys Thr Asp Lys420 425 430acc aag aaa atc tcc aag aag ctt tcc ttc ctg agt tgg ggc acc aac 1345Thr Lys Lys Ile Ser Lys Lys Leu Ser Phe Leu Ser Trp Gly Thr Asn435 440 445aag aac aga cag aag tca gcc agc acc ttg tgc ctc cca tcg gtc ggg 1393Lys Asn Arg Gln Lys Ser Ala Ser Thr Leu Cys Leu Pro Ser Val Gly450 455 460gct gca cgg cct cag gtc aag aag aag ctg ccc tcc cct ttc agc ctt 1441Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Lys Lys Leu Pro Ser Pro Phe Ser Leu465 470 475 480ctc aac tca gac agt tct tgg tac taa tgtgaggaaa caaacatgtt 1488Leu Asn Ser Asp Ser Ser Trp Tyr485caggccctgaac1500<210>2<211>488<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Phe Ser Leu Thr Gly Val Pro Val Ser Gln Gln Asn Leu Leu Leu15 10 15
Glu Lys Ala Ser Val Leu Phe Asn Thr Gly Ala Leu Tyr Thr Gln Ile20 25 30Gly Thr Arg Cys Asp Arg Gln Thr Gln Ala Gly Leu Glu Ser Ala Ile35 40 45Asp Ala Phe Gln Thr Ala Ala Gly Val Leu Asn Tyr Leu Lys Asp Thr50 55 60Phe Thr His Thr Pro Ser Tyr Asp Met Ser Pro Ala Met Leu Ser Val65 70 75 80Leu Val Lys Met Met Leu Ala Gln Ala Gln Glu Ser Val Phe Glu Lys85 90 95Ile Ser Leu Pro Gly Ile Arg Asn Glu Phe Phe Met Leu Val Lys Val100 105 110Ala Gln Glu Ala Ala Lys Val Gly Glu Val Tyr Gln Gln Leu His Ala115 120 125Ala Met Ser Gln Ala Pro Val Lys Glu Asn Ile Pro Tyr Ser Trp Ala130 135 140Ser Leu Ala Cys Val Lys Ala His His Tyr Ala Ala Leu Ala His Tyr145 150 155 160Phe Thr Ala Ile Leu Leu Ile Asp His Gln Val Lys Pro Gly Thr Asp165 170 175Leu Asp His Gln Glu Lys Cys Leu Ser Gln Leu Tyr Asp His Met Pro
180 185 190Glu Gly Leu Thr Pro Leu Ala Thr Leu Lys Asn Asp Gln Gln Arg Arg195 200 205Gln Leu Gly Lys Ser His Leu Arg Arg Ala Met Ala His His Glu Glu210 215 220Ser Val Arg Glu Ala Ser Leu Cys Lys Lys Leu Arg Ser Ile Glu Val225 230 235 240Leu Gln Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Glu Arg Ser Arg Leu Thr Tyr245 250 255Ala Gln His Gln Glu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Leu Ile Asp Ala Pro260 265 270Ser Val Val Ala Lys Thr Glu Gln Glu Val Asp Ile Ile Leu Pro Gln275 280 285Phe Ser Lys Leu Thr Val Thr Asp Phe Phe Gln Lys Leu Gly Pro Leu290 295 300Ser Val Phe Ser Ala Asn Lys Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ser Ile Arg305 310 315 320Phe Thr Ala Glu Glu Gly Asp Leu Gly Phe Thr Leu Arg Gly Asn Ala325 330 335Pro Val Gln Val His Phe Leu Asp Pro Tyr Cys Ser Ala Ser Val Ala340 345 350
Gly Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Ile Val Ser Ile Gln Leu Val Asp Cys355 360 365Lys Trp Leu Thr Leu Ser Glu Val Met Lys Leu Leu Lys Ser Phe Gly370 375 380Glu Asp Gln Ile Glu Met Lys Val Val Ser Leu Leu Asp Ser Thr Ser385 390 395 400Ser Met His Asn Lys Ser Ala Thr Tyr Ser Val Gly Met Gln Lys Thr405 410 415Tyr Ser Met Ile Cys Leu Ala Ile Asp Asp Asp Asp Lys Thr Asp Lys420 425 430Thr Lys Lys Ile Ser Lys Lys Leu Ser Phe Leu Ser Trp Gly Thr Asn435 440 445Lys Asn Arg Gln Lys Ser Ala Ser Thr Leu Cys Leu Pro Ser Val Gly450 455 460Ala Ala Arg Pro Gln Val Lys Lys Lys Leu Pro Ser Pro Phe Ser Leu465 470 475 480Leu Asn Ser Asp Ser Ser Trp Tyr485<210>3<211>23<212>DNA<213>Homo sapiens
<400>3gatgttctct ctcaccgggg ttc23<210>4<211>23<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4ggtaaatgaa tatgtttatt taa23<210>5<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ccccatatgatgttctctct caccggggttccgg34<210>6<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6cccgagctcttagtaccaag aactgtctgagttg3權(quán)利要求
1.一種分離的多肽-人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，其特征在于它包含有<210>2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與<210>2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有<210>2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有<210>1中2-1468位的序列或<210>1中1-2689位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體構(gòu)建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求7所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；或(b)用權(quán)利要求4-6中的任一權(quán)利要求所述多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.一種具有人細(xì)胞調(diào)控蛋白54活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達(dá)人細(xì)胞調(diào)控蛋白54條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的工程化宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人細(xì)胞調(diào)控蛋白54活性的多肽。
10.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人細(xì)胞調(diào)控蛋白54特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多肽——人細(xì)胞調(diào)控蛋白54，編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法，如惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類炎癥等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的人細(xì)胞調(diào)控蛋白54的多核苷酸的用途。
文檔編號C07H21/00GK1493589SQ0213772
公開日2004年5月5日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月30日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發(fā)有限公司