專利名稱：從植物中分離提取和純化奇壬醇的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物中分離提取和純化化合物奇壬醇(kirenol)的方法，特別是從藥用植物豨薟革中分離提取和純化奇壬醇的方法，本發(fā)明還涉及奇壬醇的應(yīng)用，特別是在抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鎮(zhèn)痛等藥物中應(yīng)用。
根據(jù)“中華人民共和國(guó)藥典”(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社，1995年版一部P325)記載，豨薟草為菊科植物東方豨薟、腺梗豨薟或毛梗豨薟的干燥地上部分。性味辛、苦、寒、歸肝、腎經(jīng)。主要功能與主治為祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、解毒。用于風(fēng)濕痹痛、筋骨無(wú)力、腰膝酸軟、四只麻痹、半身不遂、風(fēng)疹濕瘡。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(UA)是一種不明原因的慢性全身性免疫反應(yīng)性炎癥性疾病，免疫反應(yīng)多發(fā)生于關(guān)節(jié)滑膜，為最常見的結(jié)締組織疾病。
目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物治療方法主要是1.消炎鎮(zhèn)痛類①乙酰水楊酸 有消炎鎮(zhèn)痛作用，對(duì)關(guān)節(jié)蒸裝有明顯效果。
②消炎痛 作用較阿司匹林強(qiáng)，但消化道潰瘍及肝腎功能不全者忌用。
③保泰松 1周內(nèi)可顯效，但可引起粒細(xì)胞和血小板減少。
④氯滅酸 該藥抗炎作用強(qiáng)，副作用小，偶爾有頭痛、頭暈。
2.糖皮質(zhì)激素 因激素副作用大，停用后易復(fù)發(fā)，故一般在其它要無(wú)效時(shí)才使用。
3.金制劑 硫代蘋果酸金鈉合金硫葡萄糖，深部肌肉注射，該藥可誘發(fā)皮炎，如有腎功能損害應(yīng)慎用。
4.免疫抑制劑 如果用上述藥物不理想，可加用免疫抑制劑。如環(huán)磷酰胺。
5.氯喹 用藥1-3個(gè)月可顯效，應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意視網(wǎng)膜病。
目前主要使用的西藥皆有不同程度的毒副作用或其它副作用，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中直接使用中藥治療疾病的不方便之處，提供從傳統(tǒng)中藥中獲得藥效成分奇壬醇的方法，并以奇壬醇作為先導(dǎo)化合物，為抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗瘧、降壓、舒張血管等疾病的治療，提供毒性低、藥效明顯之良藥。
2.用溶媒回流提取或浸泡滲漉提取步驟1中得到的濾渣。溶媒可以是30-95％乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％的水液；溶媒的加入量按照步驟1中加入的原料加入量計(jì)算，每次加入溶媒的體積升數(shù)∶最初加入干品重量公斤數(shù)＝6-12∶1，或溶媒的體積升數(shù)∶新鮮藥材重量公斤數(shù)＝4-8∶1；回流提取的方法是向?yàn)V渣中按比例加入溶媒，反復(fù)回流提取2-5次，每次回流時(shí)間為1-4小時(shí)；浸泡滲漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常溫下對(duì)濾渣進(jìn)行1-4次滲漉提取，每次滲漉4-6天，將得到的提取液過濾，收集濾液；在低于80℃溫度下，對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮，除去溶媒，得比重為1.1-1.4的浸膏狀提取物A。
3.對(duì)步驟2中得到的提取物A，先加入水混懸溶解，提取物A的重量公斤數(shù)∶水的體積升數(shù)＝1∶3-6，然后以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、環(huán)己烷、正己烷在內(nèi)的C6-C7烷烴，每次水相與溶媒相的體積比＝1∶0.2-2，分離出溶媒層，水層再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在內(nèi)的鹵化烴或包括乙醚在內(nèi)的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在內(nèi)的有機(jī)酸酯類或C3-C5的脂肪醇，每次水相與溶媒相的體積比例為1∶0.2-3；合并各次萃取后的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇。
4.對(duì)步驟3中收集到的溶媒液B，在低于80℃條件下進(jìn)行減壓濃縮，得到提取固體濃縮物B1。
5.對(duì)步驟4中得到的提取固體濃縮物B1，用色譜法進(jìn)行一次或多次同種或不同種的層析法純化，或?qū)游龇ǖ漠a(chǎn)品再進(jìn)行重結(jié)晶純化，就得到奇壬醇純品。色譜法層析純化的具體步驟為取層析柱，用填料裝柱，用洗脫液洗脫，收集含奇壬醇的部位，得到本發(fā)明所說的純化有效化合物奇壬醇；對(duì)于色譜法中使用的不同填料，采取不同的條件，具體為1)硅膠層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-400目硅膠為填料，提取固體濃縮物B1與硅膠重量份數(shù)比在1∶10-1∶300之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為洗脫液，或用體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為洗脫液，將收集到的含奇壬醇的洗脫液，再在低于50℃溫度下減壓濃縮成固體；2)D101大孔樹脂層析柱取常壓玻璃層析柱，以D101大孔樹脂為填料，提取固體濃縮物B1與填料的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，用水洗脫至洗脫流出液無(wú)色，然后再依次用體積百分比為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫至洗脫流出液無(wú)色再增加梯度，收集60％-80％的洗脫流出液，其中主含奇壬醇，再在低于60℃溫度下將洗脫流出液減壓濃縮成固體；3)中性氧化鋁層析柱取常壓或真空玻璃層析柱，以60-300目中性氧化鋁為填料，提取固體濃縮物B1與中性氧化鋁的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-5之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的極性梯度增加，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低于60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；4)聚酰胺層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-300目聚酰胺為填料，提取濃縮物B1與聚酰胺的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶1-1∶10之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-10之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液為梯度洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低于60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；5)反相硅膠層析柱取常壓柱或包括Lobar柱在內(nèi)的制備型加壓柱，以100-300目反相硅膠C-18或C-8為填料，提取固體濃縮物B1與反相硅膠C-18或C-8的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶9-4∶1之間的甲醇和水的混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇的洗脫液，或以體積比在0∶1-1∶0之間的甲醇-水混合液為梯度洗脫液，即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0為梯度洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液；然后控制溫度低于60℃、將收集到的洗脫流出液減壓濃縮成固體；
所述的重結(jié)晶，就是將色譜法層析純化后得到的固體，在分析純級(jí)的有機(jī)溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在內(nèi)的C1-C4醇或水中進(jìn)行重結(jié)晶1-4次，得到奇壬醇結(jié)晶純品。
依照上述方法分離提取到的奇壬醇，其純度不低于95％。
奇壬醇的分子結(jié)構(gòu)式為 根據(jù)上述方法和步驟得到的化合物奇壬醇，其在甲醇中的理化特征和性質(zhì)為無(wú)色透明方晶，可溶解于己酸己酯、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正丁醇，部分溶解于水。分子組成為C20H34O4，mp.201℃～202℃，元素分析結(jié)果為C 71.012％；H 10.061％；紅外波譜IR(KBr)max cm-13314，2914，1650，1450，1397，1059，1033，857；核磁共振碳譜13CNMR(C5D5N)ppm49.2(C-1)，63.8(C-2)，45.6(C-3)，40.9(C-4)，55.4(C-5)，22.6(C-6)，36.7(C-7)，138.0(C-8)，51.3(C-9)，39.7(C-10)，19.1(C-11)，32.7(C-12)，37.9(C-13)，129.7(C-14)，76.6(C-15)，63.8(C-16)，23.3(C-17)，28.2(C-18)，64.8(C-19)，16.9(C-20)；核磁共振氫譜 1HNMR(C5D5N)ppm5.50(1H，br，s，14-H)，4.14(1H，d，J＝11.8Hz，19-Ha)，3.64(1H，d，J＝11.8Hz，19-Hb)，δ4.01(1H，t，J＝11.7Hz，16-CH)，3.42(d，J＝11.7Hz，2H，H-17)，4.19(1H，m，1H)，2.85(1H，br，d)，1.26(3H，s，18-CH3)，1.15(3H，s，15-CH4)，0.81(3H，s，C20-CH3)；質(zhì)譜EIMSm/z277[M-CH(OH)-CH2OH]+，259，241，151，121，109，81，43.FABMSm/z339(M+1)+。
對(duì)上述方法和步驟得到的奇任醇進(jìn)行純度檢查，tR＝4.08min，215nm檢測(cè)，純度98.28％。
峰面積百分比峰號(hào) 保留時(shí)間 峰寬 峰高 峰面積百分比1 1.350 0.0530 187.32345 1.68372 4.057 0.1545 1364.72534 98.21383. 1.210 0.0324 152.34754 0.10243注2為溶劑殘留峰，2為奇任醇峰硅膠TLC檢測(cè)測(cè)定結(jié)果為點(diǎn)樣量100μl，未見明顯雜質(zhì)斑。
展距9cm
顯色劑10％硫酸液，加熱110℃，5min.Rf值0.46本發(fā)明還提供奇壬醇在抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。藥物的劑型根據(jù)臨床應(yīng)用方式而定，可以是片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸劑、外用擦劑、透皮吸收制劑或注射劑。
本發(fā)明從植物、特別是從藥用植物豨薟草中分離提取和純化出奇壬醇，奇壬醇具有抗菌、抗炎作用，降壓及舒張血的作用，免疫抑制作用，抗瘧作用，抗生育作用等。以奇壬醇為有效成分制成的藥品，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有明顯作用。
實(shí)施例1通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然干燥地上部分1公斤，經(jīng)粉碎，加入加熱回流瓶中，再加石油醚8升，升溫至回流，第一次回流時(shí)間為2小時(shí)；冷卻，倒于布氏漏斗減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入石油醚6升，重復(fù)上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加95％乙醇6升，升溫至回流2小時(shí)，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重復(fù)上述回流過程2次，合并濾液。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度45℃，經(jīng)減壓濃縮除去醇，得比重為1.3的浸膏狀提取物A 120克。
3.將步驟2中得到的提取物A120克混懸溶解于360毫升水中，用石油醚100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水層，再重復(fù)上述萃取過程1次，接收水層，水層再用乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合并各次萃取后的乙酸乙酯提取液B，其中主含奇壬醇。
4.對(duì)步驟3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約40克。
5.對(duì)步驟4中得到的提取濃縮物B140克，用10克100目硅膠拌樣，涼干待用；在5×60cm玻璃柱中干法裝200-300目硅膠400克，再將拌樣硅膠裝于柱內(nèi)，上面再加2克硅膠，以體積比為1∶1的石油醚和乙酸乙酯混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結(jié)晶約3.5克。將得到的奇壬醇粗結(jié)晶溶解在乙酸乙酯中，重結(jié)晶2次，得到奇壬醇結(jié)晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測(cè)為98％。
實(shí)施例2通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然干燥地上部分1公斤，經(jīng)粉碎，加入加熱回流瓶中，再加環(huán)己烷8升，升溫至回流，第一次回流時(shí)間為2小時(shí)；冷卻，倒于布氏漏斗減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入環(huán)己烷6升，重復(fù)上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加溶媒丙酮6升，升溫至回流2小時(shí)，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重復(fù)上述回流過程2次，合并濾液。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度40℃，經(jīng)減壓濃縮除去丙酮，得比重為1.6的浸膏狀提取物A約100克。
3.將步驟2中得到的提取物A100克混懸溶解于300毫升水中，用環(huán)己烷100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水層，再重復(fù)上述萃取過程1次，接收水層，水層再用乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，每次用100毫升乙酸乙酯，合并各次萃取后的乙酸乙酯液提取B，其中主含奇壬醇。
4.對(duì)步驟3中收集到的溶媒乙酸乙酯提取液B，在40℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約35克。
5.對(duì)步驟4中得到的提取濃縮物B1 35克，用10克100目硅膠拌樣，涼干待用；在5×60cm玻璃柱中干法裝200-300目硅膠350克，再將拌樣硅膠裝于柱內(nèi)，上面再加2克硅膠，以體積比為2∶1的石油醚和丙酮混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結(jié)晶約3.5克。將得到的奇壬醇粗結(jié)晶溶解在無(wú)水丙酮中，重結(jié)晶2次，得到奇壬醇結(jié)晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測(cè)為98％。
實(shí)施例3通過下列方法和步驟分離提取和純化奇壬醇1.取原料藥材豨薟草腺梗豨薟的自然干燥地上部分1公斤，經(jīng)粉碎，加入加熱回流瓶中，再加環(huán)己烷8升，升溫至回流，第一次回流時(shí)間為2小時(shí)；冷卻，倒于布氏漏斗減壓過濾去除回流液。在濾渣中再加入環(huán)己烷6升，重復(fù)上述回流1次，減壓過濾去除回流液。
2.將步驟1中得到的濾渣在回流瓶中加甲醇6升，升溫至回流2小時(shí)，冷卻，減壓過濾去回流液，濾渣再重復(fù)上述回流過程2次，合并回流液。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度45℃，經(jīng)減壓濃縮除去甲醇，得比重為1.8的浸膏狀提取物A約110克。
3.將步驟2中得到的提取物A約110克混懸溶解于350毫升水中，用環(huán)己烷100毫升于分液漏斗中萃取1次，接收水層，再重復(fù)上述萃取過程1次，接收水層，水層再用二氯甲烷重復(fù)萃取3次，每次用100毫升二氯甲烷，合并各次萃取后的二氯甲烷提取液B，其中主含奇壬醇。
4.對(duì)步驟3中收集到的二氯甲烷提取液B，在40℃溫度下進(jìn)行減壓濃縮，得提取固體濃縮物B1約40克。
5.對(duì)步驟4中得到的固體提取濃縮物B1 40克，溶解于60毫升的20％(體積比)乙醇-水中，濾去不溶物，用以60-300目聚酰胺為填料，在30×200厘米的玻璃層析柱上，加入經(jīng)預(yù)處理后的D101聚酰胺1000克，以水飽和之界面，加入B1的60毫升的20％乙醇-水，靜置3小時(shí)后，用水洗脫至無(wú)色；再分別用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％(體積比)的乙醇-水梯度極性洗脫，每極性度的洗脫量視洗脫液至無(wú)色后再增加極性梯度，收集含奇壬醇的洗脫液，然后控制溫度在45℃，對(duì)收集到的洗脫液進(jìn)行減壓濃縮成固體B2；對(duì)得到的濃縮固體物B2 5克，用10克100目硅膠拌樣，涼干待用；在5×60cm玻璃柱中干法裝200-300目硅膠250克，再將拌樣硅膠裝于柱內(nèi)，上再加2克硅膠，以體積比為2∶1的溶媒石油醚和丙酮混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇部位，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上控制溫度40℃，得到奇壬醇粗結(jié)晶約3.0克。將奇壬醇粗結(jié)晶溶解于10毫升無(wú)水乙醇中，于冰箱中低溫靜置，進(jìn)行重結(jié)晶1-4次，得到奇壬醇結(jié)晶純品約2克。
上述方法和步驟得到的奇壬醇純度，用HPLC檢測(cè)為98％。
實(shí)施例4本實(shí)施例為應(yīng)用實(shí)施例。
用實(shí)施例1中得到的奇壬醇純品，進(jìn)行抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和鎮(zhèn)痛的藥效研究，試驗(yàn)方法和結(jié)果如下材料和方法1.藥品與試劑福氏完全佐劑(Freund’s Adjuvant complete)，RPMI-1640粉為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，刀豆蛋白(Con A)，脂多糖(LPS)均為Sigma公司產(chǎn)品。
2.動(dòng)物分組SD大鼠雌雄各半，2-3月齡，體重(250±30)克，C57BL/6小鼠，雌雄兼用，6周齡，體重(20±3)克，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，正常組每日每只灌服4ml水，于給水第1日給大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1ml生理鹽水，模型組每日每只灌服4ml(0.24g/ml)奇壬醇，模型組與給藥組于給水，給藥第1日分別在左后足跖皮內(nèi)注射0.1ml福氏完全佐劑，第18日將動(dòng)物全部處死，取脾和腹腔巨噬細(xì)胞備用。
測(cè)定結(jié)果①奇壬醇對(duì)佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞增值有促進(jìn)作用，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞增值功能低下，與正常組比較下降28％，奇壬醇對(duì)AA大鼠模型淋巴細(xì)胞增值有促進(jìn)作用增加20％。具體數(shù)據(jù)如表1所示。表1、奇王醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響(X±S)OD值(570nmmGroup Animal 5×106 splenGontrol 71.623±0.42AA 71.164±0.09## P＜0.05AA+奇王醇 71.400±0.15**P＜0.05＜##與正常組比較；**與AA組比較。
②奇壬醇可促進(jìn)AA大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2的產(chǎn)生。佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2功能低下，與正常組比較下降28％，給藥后奇壬醇對(duì)AA大鼠模型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2在1∶2；1∶4；1∶8均有促進(jìn)作用，與模型組比較，分別增加50％；52％；65％(P＜0.05)，并能恢復(fù)至正常大鼠水平。具體數(shù)據(jù)如表2所示。表2、奇王醇對(duì)AA大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2的影響-(X±S)IL-2 OD值570(nm)Group Animal1∶21∶41∶8Control 7 0.241±0.023 0.175±0.0230.143±0.012AA 7 0.174±0.017 0.122±0.0110.077±0.016AA+XXC 7 0.261±0.009 0.186±0.0240.127±0.021##與正常組比較＜0.05；**與AA組比較P＜0.05。
③奇壬醇可抑制LPS誘導(dǎo)的AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1的產(chǎn)生。
佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔細(xì)胞產(chǎn)生IL-1功能亢進(jìn)，與正常組比較上升34％，給藥后奇壬醇對(duì)AA大鼠模型腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1在1∶10；1∶20；1∶40稀釋毒均有抑制作用，與模型組比較，分別下降23％；33％；57％(P＜0.05)，并能恢復(fù)至正常大鼠水平。具體數(shù)據(jù)如表3所示。表3、奇王醇對(duì)AA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1的影響(X±S)IL-1 OD 值570(nm)Group Animal 1∶10 1∶20 1∶40Control 7 0.164±0.013 0.097±0.015 0.055±0.014AA 7 0.219±0.016##0.141±0.040##0.106±0.063##AA+奇王醇7 0.168±0.020**0.108±0.023**0.046±0.009**##與正常組比較P＜0.05；**與AA組比較P＜0.05。
④奇壬醇對(duì)AA大屬踝關(guān)節(jié)局部組織有恢復(fù)作用。AA大鼠踝關(guān)節(jié)切片局部滑囊細(xì)胞增生，纖維滲出，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。灌服奇壬醇后，充血減輕，炎癥細(xì)胞滲出減少。
結(jié)論使用福氏完全佐劑制備的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎，是免疫性炎癥模型，常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，引起關(guān)節(jié)和全身的病變，與體液與細(xì)胞免致均有關(guān)，而T細(xì)胞直接參與這一病變。為此本試驗(yàn)采用上述免疫性炎癥模型，探討奇王醇抗風(fēng)濕的作用機(jī)理。致炎后大鼠ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖功能低下，脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-2活性下降，LPS誘導(dǎo)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-1活性亢進(jìn)，表明佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠細(xì)胞免疫功能下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的。給予奇王醇后，奇王醇可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖功能，并能使其產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-2恢復(fù)至正常水平，見表2。提示奇王醇可通過增強(qiáng)T細(xì)胞的功能進(jìn)而調(diào)整大鼠的機(jī)體免疫功能，從而改善機(jī)體的免疫狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與巨噬細(xì)胞的異?；罨嘘P(guān)，巨噬細(xì)胞的異常活化可產(chǎn)生過量的白細(xì)胞介素-1，而白細(xì)胞介素-1在佐劑性關(guān)節(jié)炎及人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的進(jìn)行性破壞中起重要的作用。使新生正常軟骨蛋白多糖損失，刺激滑膜細(xì)胞增殖，從而使軟骨和骨質(zhì)破壞。
本試驗(yàn)也證實(shí)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠白細(xì)胞介素-1的產(chǎn)生亢進(jìn)，同時(shí)表明奇王醇可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-1，見表3，從而可阻止白細(xì)胞介素-1對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的破壞進(jìn)程，減輕全身及局部的病變進(jìn)程。
佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，活動(dòng)受限。病理組織學(xué)檢查表明踝關(guān)節(jié)滑囊細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)、纖維素滲出。灌服奇王醇的AA大鼠踝關(guān)節(jié)切片表明纖維素滲出減少，充血減輕。上述試驗(yàn)初步表明烯薟草可調(diào)整佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫功能，抑制局部組織炎癥細(xì)胞滲出，減輕局部病理反映，使佐劑性關(guān)節(jié)炎得以恢復(fù)。
奇王醇鎮(zhèn)痛作用藥效研究奇王醇可明顯減少疼痛模型小鼠的扭體次數(shù)，見表4。小鼠灌服奇王醇后可減輕醋酸的疼痛刺激，與模型組比較有顯著的差異，鎮(zhèn)痛率為65％，表明奇王醇有較好的鎮(zhèn)痛作用。表4奇王醇對(duì)疼痛小鼠模型的鎮(zhèn)痛作用動(dòng)物數(shù) 劑量 扭體反應(yīng)鎮(zhèn)痛率組別 (n) (g/kg) (次數(shù)/只)(％)生理鹽水模型 2010ml 29 0鹽酸嗎啡 200.01 0 100奇王醇 201.5 10 65注與生理鹽水組比較，*P＜0.001
表5.東方烯薟和腺梗烯薟的鎮(zhèn)痛作用組別 動(dòng)物數(shù) 濃度 出現(xiàn)第一次扭體 扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛率 (只)(g/生藥kg) 時(shí)間(min)(a±SD)(％)對(duì)照組 10 0 4.3 20.4±8.4東方烯薟10 28.39 3.2 12.1±6.9*40.710 9.46 4.4 15.4±12.724.5腺梗烯薟10 41.73 4.6 13.2±6.2*35.310 13.91 4.6 15.0±7.426.5注*P＜0.05從表5結(jié)果可以看出，東方烯薟和腺梗烯薟對(duì)冰醋酸誘發(fā)的腹痛均有鎮(zhèn)痛作用，東方烯薟的作用強(qiáng)于腺梗烯薟。毒性結(jié)果根據(jù)中醫(yī)臨床應(yīng)用，本發(fā)明對(duì)奇壬醇進(jìn)行了最大耐受量的測(cè)定試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠。
最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，昆明小鼠對(duì)奇壬醇的最大耐受量分別為880.7mg/kg，結(jié)果提示奇壬醇的毒性極小，在推薦給藥劑量范圍內(nèi)使用比較安全。
實(shí)施例5本實(shí)施例為應(yīng)用實(shí)施例。
用實(shí)施例1得到的奇壬醇，制成藥劑，建議臨床推薦用量為15mg/日。片劑制備方法為取奇壬醇150克，粉碎成粉末，過400目篩，加1％硬脂酸鎂，混合均勻，在壓片機(jī)上壓制10000粒，使每粒片劑中含15mg奇壬醇，患者每日服用1粒。主要功效為祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，鎮(zhèn)痛，解毒。用于風(fēng)濕痹痛，筋骨無(wú)力，腰膝酸軟，四肢麻痹，半身不遂，風(fēng)疹濕瘡。
權(quán)利要求
1.一種從藥用植物豨薟草中分離提取和純化化合物奇壬醇的方法，其特征在于該方法和步驟為(1)取原料藥材豨薟草東方豨薟、腺梗豨薟或毛梗豨薟中的一種或兩種或三種，將生藥干品或新鮮藥材粉碎后，稱取干品或新鮮生藥，向其中加入石油醚或環(huán)己烷，回流提取2-3次，每次回流時(shí)間為1-4小時(shí)，每次石油醚或環(huán)己烷的加入體積升數(shù)與生藥干品重量公斤數(shù)之比＝6-12∶1，或石油醚或環(huán)己烷的加入體積升數(shù)與新鮮藥材重量公斤數(shù)之比＝4-8∶1，每次回流后都進(jìn)行過濾處理，去除回流液，再對(duì)濾渣進(jìn)行下一次回流，最后一次的濾渣待用；(2)用溶媒回流提取或浸泡滲漉提取步驟(1)中得到的濾渣，溶媒可以是30-95％(體積比)乙醇水溶液、氯仿、二氯甲烷、己酸己酯、丙酮、甲醇或含有丙酮40-80％(體積比)的水液；溶媒的加入量按照步驟(1)中加入的原料加入量計(jì)算，每次加入溶媒的體積升數(shù)∶最初加入干品重量公斤數(shù)＝6-12∶1，或溶媒的體積升數(shù)∶新鮮藥材重量公斤數(shù)＝4-8∶1；回流提取的方法是向?yàn)V渣中按比例加入溶媒，反復(fù)回流提取2-5次，每次回流時(shí)間為1-4小時(shí)；浸泡滲漉的方法是直接用上述溶媒、按上述比例在常溫下對(duì)濾渣進(jìn)行1-4次滲漉提取，每次滲漉4-6天；將上述操作得到的提取液過濾，收集濾液；在低于80℃溫度下，對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮，除去溶媒，得比重為1.1-1.4的浸膏狀提取物A；(3)對(duì)步驟(2)中得到的提取物A，先加入水混懸溶解，提取物A的重量公斤數(shù)∶水的體積升數(shù)＝1∶3-6，然后以溶媒I萃取1-4次，溶媒I是石油醚或包括己烷、環(huán)己烷、正己烷在內(nèi)的C6-C7烷烴，每次水相與溶媒相的體積比＝1∶0.2-2，分離出溶媒層，水層再用溶媒II萃取1-4次，溶媒II是乙酸乙酯或包括二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳在內(nèi)的鹵化烴或包括乙醚在內(nèi)的醚或包括乙酸丁酯、乙酸戊酯在內(nèi)的有機(jī)酸酯類或C3-C5的脂肪醇，每次水相與溶媒相的體積比例為1∶0.2-3；合并各次萃取后的溶媒II液，得溶媒液B，其中主含奇壬醇；(4)對(duì)步驟(3)中收集到的溶媒液B，在低于80℃條件下進(jìn)行減壓濃縮，得到提取固體濃縮物B1；(5)對(duì)步驟(4)中得到的提取固體濃縮物B1，用色譜法進(jìn)行一次或多次的同種或不同種的層析法純化，或?qū)游龇ǖ漠a(chǎn)品再進(jìn)行重結(jié)晶純化，得到奇壬醇純品；色譜法層析純化的具體步驟為取層析柱，用填料裝柱，用洗脫液洗脫，收集含奇壬醇的部位，得到純化了的奇壬醇；對(duì)于色譜法中使用的不同填料，采取不同的條件，具體為1)硅膠層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-400目硅膠為填料，提取固體濃縮物B1與硅膠重量份數(shù)比在1∶10-1∶300之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑或石油醚和丙酮的混合溶劑為洗脫液，將收集到的含奇壬醇的洗脫液，在低于50℃溫度下減壓濃縮成固體；2)D101大孔樹脂層析柱取常壓玻璃層析柱，以D101大孔樹脂為填料，提取固體濃縮物B1與填料的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，用水洗脫至洗脫流出液無(wú)色，然后再依次用體積百分比為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫至洗脫流出液無(wú)色再增加梯度，收集60％-80％的洗脫流出液，其中主含奇壬醇，再在低于60℃溫度下將洗脫流出液減壓濃縮成固體；3)中性氧化鋁層析柱取常壓或真空玻璃層析柱，以60-300目中性氧化鋁為填料，提取固體濃縮物B1與中性氧化鋁的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶0.5-1∶5之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑或石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液，即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的極性梯度增加，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低于60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；4)聚酰胺層析柱取常壓玻璃層析柱，以60-300目聚酰胺為填料，提取濃縮物B1與聚酰胺的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶1-1∶10之間的石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10為梯度洗脫液，或以體積比在1∶0.5-10之間的石油醚和丙酮的混合溶劑為梯度洗脫液即依次以2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合液為梯度洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液，控制溫度低于60℃，將洗脫流出液減壓濃縮成固體；5)反相硅膠層析柱取常壓柱或包括Lobar柱在內(nèi)的制備型加壓柱，以100-300目反相硅膠C-18或C-8為填料，提取固體濃縮物B1與反相硅膠C-18或C-8的重量份數(shù)比在1∶20-1∶200之間，以體積比在1∶9-4∶1之間的甲醇和水的混合溶劑為洗脫液，收集含奇壬醇的洗脫液，或以體積比在0∶1-1∶0之間的甲醇-水混合液為梯度洗脫液即依次以0∶1、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶1、8∶2、9∶1、1∶0為梯度洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度洗脫至無(wú)樣品檢出，再增加至下一梯度，收集含奇壬醇的洗脫流出液；然后控制溫度低于60℃、將收集到的洗脫流出液減壓濃縮成固體；所述的重結(jié)晶，就是將色譜法層析純化后得到的固體，在分析純級(jí)的有機(jī)溶媒乙酸乙酯或丙酮或包括乙醇在內(nèi)的C1-C4醇或水中進(jìn)行重結(jié)晶1-4次，得到奇壬醇結(jié)晶純品。
2.奇壬醇在制備治療抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥中的應(yīng)用。
3.奇壬醇在制備鎮(zhèn)痛藥中的應(yīng)用。
4.奇壬醇在制備抗菌藥中的應(yīng)用。
5.奇壬醇在制備抗瘧藥中的應(yīng)用。
6.奇壬醇在制備降壓藥中的應(yīng)用。
7.奇壬醇在制備舒張血管藥中的應(yīng)用。
8.奇壬醇在制備免疫抑制劑藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從植物、特別是從藥用植物豨薟草中分離提取和純化化合物奇壬醇的方法以及該化合物在醫(yī)藥中的應(yīng)用,以奇壬醇作為先導(dǎo)化合物制成的藥劑,具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗瘧、降壓、舒張血管等功效,并具有毒性低、藥效明顯的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07C35/42GK1380277SQ02116909
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2002年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月26日
發(fā)明者林文翰, 付宏征, 李軍 申請(qǐng)人:林文翰