專利名稱：肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途，以及涉及一種藥物組合物。
至今，在預(yù)防和治療中用于抑制或阻止炎性反應(yīng)的物質(zhì)，即所謂的免疫抑制劑，主要包括兩類不同的物質(zhì)。第一類是天然存在于體內(nèi)的激素衍生物，即可的松，和第二類是外源性免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素和其衍生物、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺等。所有這些物質(zhì)都具有抗炎作用，但是，在長(zhǎng)時(shí)間治療中，這些物質(zhì)表現(xiàn)出很大的副作用。這些副作用限制了長(zhǎng)期治療的作用，這就是為了將副作用降低到可容忍的水平或者為了能夠?qū)嶋H進(jìn)行治療交替或聯(lián)合應(yīng)用這些物質(zhì)的原因。作為副作用的例子可提及，與可的松有關(guān)的病理性骨折，這種骨折是由于可的松的骨質(zhì)疏松作用引起的，或者可能由于環(huán)孢菌素引起的腎衰竭。這些副作用對(duì)這兩類化合物來(lái)說(shuō)是必然的，因此，問(wèn)題只是治療的持續(xù)時(shí)間和必須停止治療時(shí)的總劑量。
本發(fā)明的目的是提供新的藥物產(chǎn)品，所述產(chǎn)品適用于阻止或抑制炎性作用并只具有較小的副作用。另一個(gè)目的在于提供長(zhǎng)期治療。
下面，本發(fā)明的肽的氨基酸用常用的縮寫表示，這些氨基酸是α-氨基酸。
“類似物”是指一種肽，是由血纖蛋白的序列，特別是由優(yōu)選的序列，通過(guò)衍生化、取代，優(yōu)選同源取代、缺失和/或插入而衍生的。
本發(fā)明提供具有通式I(SEQ ID NO 1、2)肽或蛋白質(zhì) 其中R1和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個(gè)，特別是至多10個(gè)碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z1表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，
Z2表示精氨酸殘基、包含起始精氨酸殘基的，特別是包含2-30個(gè)氨基酸的肽殘基或者蛋白質(zhì)殘基，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的物質(zhì)的混合物，其中特別是只存在L-氨基酸，用于在人和/或獸醫(yī)學(xué)中治療性和/或預(yù)防性地應(yīng)用。
完全出人意料的是，所定義的氨基酸序列阻止血流中的細(xì)胞在血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附和/或其隨后從血液向組織中的移居。
本發(fā)明提供具有通式II(SEQ ID NO 3-10)肽或者蛋白質(zhì) 其中R1和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個(gè)，特別是至多10個(gè)碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z1表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基Z3表示脯氨酸殘基或纈氨酸殘基，Z4表示亮氨酸殘基或者纈氨酸殘基，Z5表示蛋白質(zhì)殘基或者肽殘基，特別是包含2-30個(gè)氨基酸的肽殘基或者蛋白質(zhì)殘基，或者含有1-3，特別是至多10個(gè)碳原子的醇基團(tuán)，或者有機(jī)或無(wú)機(jī)堿基團(tuán)，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的物質(zhì)的混合物，其中特別是只存在L-氨基酸，用于在人和/或獸醫(yī)學(xué)中治療性和/或預(yù)防性地應(yīng)用。
完全令人驚奇的是，血纖蛋白原的部分序列、肽或者片段具有抗炎作用。不受限于與此相關(guān)的理論思考，這種作用可能基于血纖蛋白通過(guò)其Bβ鏈的neo-N-末端結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞上和通過(guò)Aα-鏈的序列與血流中的細(xì)胞結(jié)合，由此導(dǎo)致細(xì)胞的粘附和向組織中移居。這些化合物具有副作用并且抑制血纖蛋白形成。但是這種抑制不構(gòu)成對(duì)病人的潛在危害，因?yàn)樵诓淮嬖谘w蛋白情況下，如果發(fā)生輕微的受傷，血液凝結(jié)也是足夠的。只是在外科手術(shù)時(shí)，可能適合的是停止這種治療。其它的副作用基本上可以排除，因?yàn)檫@些物質(zhì)只與天然配體相互作用。此外，血液中的白細(xì)胞不會(huì)對(duì)天然防御產(chǎn)生相反的影響。這樣，其組成，例如粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞保持不受影響，因此，天然的防御過(guò)程保持不變并且血液中對(duì)感染的抵御保持不變。
血纖蛋白原在肝臟中形成并且這種形式是生物無(wú)活性的，其在血液中的濃度一般為約3g/l。通過(guò)酶原凝血酶原的蛋白水解裂解作用生成凝血酶，它從血纖蛋白原上裂解掉血纖肽A和B。由此血纖蛋白原被轉(zhuǎn)化成其生物活性的形式，生成血纖蛋白和血纖蛋白裂解產(chǎn)物。
在每一次的血液凝結(jié)活化過(guò)程中，即每次組織受傷、發(fā)生炎癥、外傷或者變性發(fā)生(degenerativer Genese)時(shí)生成凝血酶，通過(guò)血纖蛋白的調(diào)節(jié)生成凝血酶是一個(gè)主要的保護(hù)過(guò)程，目的是盡快愈合任何血管系統(tǒng)的缺損。但是，血纖蛋白的生成也是一個(gè)致病過(guò)程。血纖蛋白血栓的形成作為要解決的引起心肌梗塞的起因是人類醫(yī)學(xué)的最重要的問(wèn)題之一。
至今還沒(méi)有或者還沒(méi)有充分研究血纖蛋白在炎性細(xì)胞從血流到組織的外滲過(guò)程中起的作用，這一方面是抵御致病性微生物或存在于組織中的腫瘤細(xì)胞的希望的過(guò)程，但是，另一方面，其本身是一個(gè)引起自身組織損傷或者繼續(xù)損傷的過(guò)程。血纖蛋白借助于序列Bβ，通過(guò)其Bβ的neo-N-末端結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞并且借助于序列Aα結(jié)合血流中的細(xì)胞，因此導(dǎo)致細(xì)胞的粘附和向組織中移居。
本發(fā)明的肽或者蛋白質(zhì)可以抑制血流中的細(xì)胞與血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和/或抑制隨后細(xì)胞從血液向組織中的移居。
通式II的本發(fā)明的肽或者或者蛋白質(zhì)，其中Z5表示具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO 11)的肽殘基Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro AlaPro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg和Z1表示組氨酸殘基，
Arg表示精氨酸殘基，Z3表示脯氨酸殘基，Z4表示亮氨酸殘基，抑制血纖蛋白片段在血管壁上的沉積和粘附。因此，它使炎性細(xì)胞不能牢固地停留在動(dòng)脈和靜脈血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞上，并且阻止了這類細(xì)胞停留在血管壁上，因此阻止了向組織中的進(jìn)一步滲透。
通式II的肽或者蛋白質(zhì)，其中Z5表示具有下述氨基酸序列(SEQ IDNO 12)的肽殘基Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp ProPhe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys并且Z1表示脯氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基，Z3表示纈氨酸殘基，Z4表示纈氨酸殘基，具有抑制周圍血液的細(xì)胞與血纖蛋白或者血纖蛋白片段的粘附的作用，因此抑制其向組織中的遷移。
所述裂解產(chǎn)物在文獻(xiàn)中已知為肽Bβ和肽Aα。上述提及的預(yù)粘附和預(yù)遷移途徑對(duì)于控制細(xì)胞從血液向組織中遷移的體系完全是新的。血纖蛋白的這一功能既可以被肽Bβ，也可以被肽Aα阻斷。
因此，本發(fā)明的肽適合用作治療劑用于人類或動(dòng)物，以阻斷細(xì)胞從血液向組織中的遷移。由于血纖蛋白或者通過(guò)蛋白水解裂解產(chǎn)生的血纖蛋白原的其它產(chǎn)物，例如被尿激酶-血纖蛋白溶酶原-激活劑裂解的血纖蛋白原，僅特異性和區(qū)域性地有限產(chǎn)生，即在炎性、凝結(jié)失調(diào)、動(dòng)脈硬化、血栓形成和/或腫瘤生長(zhǎng)位點(diǎn)，對(duì)此的所述治療劑的作用是區(qū)域性受限的，即希望不在其它區(qū)域發(fā)生病理性副作用或者僅在有限的程度上發(fā)生。
本發(fā)明的肽和/或蛋白質(zhì)的優(yōu)選的和完全未預(yù)料的應(yīng)用領(lǐng)域是用于制備在身體發(fā)生感染的情況下治療或預(yù)防局部和/或全身性炎癥的藥物組合物，所述感染基于自主免疫反應(yīng)、基于風(fēng)濕性疾病、基于免疫系統(tǒng)紊亂、基于遺傳疾病，用于預(yù)防和/或治療器官移植之后發(fā)生的排異反應(yīng)、動(dòng)脈硬化、輸注損傷、基于動(dòng)脈硬化和/或血栓疾病和血纖蛋白沉積增加。這類肽，特別是Bβ，也特別適合用于制備將其它藥物遞送到人或動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞的藥物組合物。對(duì)此，將要遞送的藥物偶聯(lián)到所述肽的一端，然后通過(guò)VE-鈣粘著蛋白沉積到血管壁的游離位點(diǎn)上，即內(nèi)皮細(xì)胞上。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1血纖蛋白原裂解產(chǎn)物的制備血纖蛋白原的非聚合的降解產(chǎn)物是按照Blombck等人(Nature1968，218；130-134)通過(guò)用溴化氰分解得到的。如此裂解得到的血纖蛋白原主要由63kD的片段，即N-末端二硫橋連接，NDSK組成，并且包含Aα鏈1-51、Bβ鏈1-118和γ鏈1-78。為了得到NDSK-II(NDSK減去血纖肽A和B)，在室溫下3小時(shí)用凝血酶(20單位/1μg NDSK)將Aα和Bβ鏈的N-末端的氨基酸裂解掉，然后用氟磷酸二異丙酯處理以阻斷凝血酶的活性。如此得到的NDSK-II由Aα鏈17-51、Bβ鏈15-118和γ鏈1-78組成。
為了得到NDSK-uPA，在37℃下用Technoclone公司，奧地利維也納，的200單位尿激酶-血纖蛋白溶酶原-激活劑(uPA)處理500μgNDSK 1小時(shí)。該反應(yīng)用5mM苯基甲基磺酰氟終止。如此得到的NDSK-uPA是一種NDSK并且不具有血纖肽B。
作為陰性對(duì)照，從用溴化氰處理生成的血纖蛋白原裂解產(chǎn)物得到的第二級(jí)分，按照Nieuwenhuizen等(Biochem Biophys Acta 1983，755；531-533)稱為FCB-2。FCB-2是43kD大小的蛋白質(zhì)并且由Aα鏈148-208、Bβ鏈191-305和γ鏈95-265組成。為了對(duì)照，向這種蛋白質(zhì)中加入凝血酶和氟磷酸二異丙酯。但是，不導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)的任何變化(在此后稱為FCB-2-thr)。
對(duì)于其它的陰性對(duì)照，將培養(yǎng)基(LIfe techn.Inc.公司，Paisky，UK的RPMI)用凝血酶如上述處理并且隨后滅活(RPMI-thr)或者用uPA按上述處理并且滅活(RPMI-uPA)。
實(shí)施例2肽Aα(SEQ ID NO 12)相應(yīng)于血纖蛋白α鏈的氨基酸1-28并且與血纖蛋白原Aα鏈序列的氨基酸17-45相同Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys LysAsp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp AsnTyr Lys肽Bβ(SEQ ID NO 11)相應(yīng)于血纖蛋白β鏈序列的氨基酸1-28，其與血纖蛋白原Bβ鏈序列的氨基酸15-43相同，其具有下述序列Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala ProSer Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly GlyTyr Arg按照Merrifield R.B.，J.Amer.Chem.Soc.1963；85，2149-2154，用多功能肽合成器，按照Carpino L.A.和Han.GY，J.Amer.Chem.Soc.1981；37；3404-3409應(yīng)用芴基甲氧基羰基(FMOC)-保護(hù)基策略通過(guò)固相肽合成合成兩種肽。粗品肽的純化通過(guò)制備反相HPLC，用Nucleosil 100-10，C18柱，按照Engelhart H.和MüllerH.的Chromatography 1984 1977以及Henschen A.，Hupe K.P.和Lottspeich F.High Performance Liquid Chromatography VCH1985進(jìn)行。用相同長(zhǎng)度，但具有無(wú)規(guī)氨基酸序列的肽作為對(duì)照肽。
實(shí)施例3HU-SCID小鼠模型將人的皮膚移植到SCID小鼠的背部，在兩周后將人淋巴細(xì)胞注射到腹膜內(nèi)。這一過(guò)程按照Petzelbauer等(J.Invest.Dermatol.1996，107；576-581)的方法進(jìn)行。然后，將15只這樣準(zhǔn)備的小鼠通過(guò)其尾靜脈注射a)100μg人類NDSK-IIb)100μg人類FCB-2c)100μg肽Aαd)100μg肽Bβe)100μg無(wú)規(guī)的Aαf)100μg無(wú)規(guī)的Bβ
24小時(shí)后，取下人類皮膚并評(píng)價(jià)炎性位點(diǎn)的數(shù)量，用細(xì)胞數(shù)/0.3mm2表示，并且測(cè)定帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。
對(duì)于a22+/-2.8對(duì)于b9+/-2.1對(duì)于c4+/-1.1對(duì)于d6+/-1.1對(duì)于e5+/-1.2對(duì)于f7+/-1.3由此可推出，NDSK-II引起炎癥，因此，所述蛋白質(zhì)被用作致病物質(zhì)。其它化合物本身沒(méi)有表現(xiàn)出炎性細(xì)胞量的任何明顯的增加。
比較例4按照實(shí)施例3通過(guò)其尾靜脈給15只小鼠注射100μg人NDSK-II和100μg無(wú)規(guī)的肽Aα。
按照實(shí)施例3繼續(xù)實(shí)施，可測(cè)得23+/-3.5個(gè)炎性位點(diǎn)/0.3mm2。
比較例5按照實(shí)施例3通過(guò)其尾靜脈給15只小鼠注射100μg按照實(shí)施例1的人NDSK-II和100μg無(wú)規(guī)的肽Bβ。
按照實(shí)施例3繼續(xù)實(shí)施，可測(cè)得24+/-2個(gè)炎性位點(diǎn)/0.3mm2。
實(shí)施例6按照實(shí)施例3給15只小鼠注射100μg人NDSK-II和100μg合成的肽Aα。
按照實(shí)施例3繼續(xù)實(shí)施，可測(cè)得21+/-2.2個(gè)炎性位點(diǎn)/0.3mm2。
實(shí)施例7按照實(shí)施例3通過(guò)其尾靜脈給15只小鼠注射100μg人NDSK-II和
100μg合成的肽Bβ。
按照實(shí)施例3繼續(xù)實(shí)施，可測(cè)得14+/-2炎性位點(diǎn)/0.3mm2。
實(shí)施例4-7表明，肽Bβ阻斷淋巴細(xì)胞的炎癥。
比較例8用紅色熒光染料(Cell Tracker Orange，1μg/ml，MolecularProbes，Eugene，OR)標(biāo)記人類的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)并且接種到膠原基質(zhì)(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)上。在內(nèi)皮細(xì)胞融合后，重疊用綠熒光染料(Cell Tracker Green，1μl/ml，Molecular Probes公司，Eugene，Origon)標(biāo)記的外周血單核細(xì)胞(PBMC)(105個(gè)細(xì)胞/25mm2)。此后，在37℃溫育細(xì)胞12小時(shí)。
用激光掃描顯微鏡給粘附的進(jìn)入凝膠的細(xì)胞照相，并轉(zhuǎn)換成圖像(Pixel)并且用“NIH image”按照Grger等(J.Immunol.Method1999；222101-109)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
每0.1mm2的粘附的細(xì)胞的數(shù)量可例如按在“粘附”下提及的方法進(jìn)行測(cè)定。每0.04mm3遷入的細(xì)胞的數(shù)量可例如按照在“遷移”下提及的方法測(cè)定。測(cè)定具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的三次的平均值。
粘附 遷移a)RPMI-uPA0,1μg/ml 40+/-4 4+/-31,0μg/ml 38+/-2 5+/-210,0μg/ml 32+/-4 5+/-1b)NDSK0,1μg/ml 31+/-186+/-31,0μg/ml 35+/-185+/-210,0μg/ml 36+/-246+/-3c)NDSK-II 0,1μg/ml 55+/-2112+/-51,0μg/ml 67+/-3119+/-1210,0μg/ml 65+/-3119+/-10
d)NDSK-uPA 0,1μg/ml 58+/-3 10+/-21,0μg/ml 60+/-3，5 14+/-310,0μg/ml 65+/-3 18+/-1，5e)FCB2 0,1μg/ml 30+/-26 6+/-41,0μg/ml 10+/-10 3+/-210,0μg/ml 21+/-7 5+/-4f)FCB-2-thr0,1μg/ml 20+/-12 6+/-51,0μg/ml 23+/-13 7+/-510,0μg/ml 26+/-11 4+/-2g)RPMI-thr 0,1μg/ml 29+/-15 4+/-51,0μg/ml 26+/-14 5+/-510,0μg/ml 41+/-20 5+/-4由此可以得出，NDSK-II導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞(PBMC)的明顯遷移比NDSK-uPA程度大，并且因此具有致病活性。對(duì)照a)、b)、e)、f)和g)均不導(dǎo)致明顯的遷移。
實(shí)施例9將100μgNDSK-11和Bβ或者無(wú)規(guī)的Bβ加到按照實(shí)施例8的含有PBMC懸浮液的膠原基質(zhì)中，并按照實(shí)施例8繼續(xù)進(jìn)行。
粘附 遷移a)不加NDSK-II 38+/-156+/-4b)僅100μg NDSK-II73+/-2916+/-7c)10μg Bβ+NDSK-II 63+/-337+/-4d)100μg Bβ+NDSK-II 47+/-345+/-4e)1000μg Bβ+NDSK-II 52+/-2710+/-6f)10μg無(wú)規(guī)的Bβ+NDSK-II 77+/-3316+/-6g)100μg無(wú)規(guī)的Bβ+NDSK-II 86+/-3515+/-6h)1000μg無(wú)規(guī)的Bβ+NDSK-II78+/-3113+/-8
從這些試驗(yàn)結(jié)果中可以得出，肽Bβ阻斷炎癥。
實(shí)施例10將100μgNDSK-11和Aα或者無(wú)規(guī)的Aα加到按照實(shí)施例8的含有PBMC懸浮液的膠原基質(zhì)中，并按照實(shí)施例8繼續(xù)進(jìn)行。
粘附 遷移a)不加NDSK-II 42+/-6 10+/-1b)僅NDSK-II 96+/-11 24+/-3c)10μg Aα+NDSK-II 69+/-12 21+/-4d)100μg Aα+NDSK-II 73+/-13 15+/-6e)1000μg Aα+NDSK-II 70+/-6 13+/-5f)10μg無(wú)規(guī)的Aα+NDSK-II 70+/-6 25+/-2g)100μg無(wú)規(guī)的Aα+NDSK-II 65+/-16 24+/-3h)1000μg無(wú)規(guī)的Aα+NDSK-II70+/-12 26+/-3從這些試驗(yàn)結(jié)果中可以得出，肽Aα只是部分地阻斷PBMC的遷移。
實(shí)施例11由于PBMC主要由淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的混合物構(gòu)成，所以在實(shí)施例11中用純的淋巴細(xì)胞代替PBMC(如在實(shí)施例8-10中)。
分別將100μgNDSK-uPA或100μgNDSK-II和Aα或Bβ加到按照實(shí)施例8的含有內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的膠原基質(zhì)中。
粘附 遷移a)不加 68+/-8 16+/-3b)NDSK-uPA 143+/-11 53+/-5c)NDSK-II 119+/-11 43+/-4d)僅100μg Bβ58+/-18 14+/-1e)NDSK-uPA+100μg Bβ 74+/-8 19+/-2f)NDSK-II+100μg Bβ74+/-8 17+/-3
g)僅100μg Aα77+/-4 18+/-1h)NDSK-uPA+100μg Aα 131+/-4 40+/-3i)NDSK-II+100μg Aα131+/-4 44+/-4j)僅100g無(wú)規(guī)的Bβ 75+/-5 19+/-1k)NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Bβ134+/-1346+/-41)NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Bβ 120+/-1242+/-4這些試驗(yàn)結(jié)果表明1)NDSK-II和NDSK-uPA都促進(jìn)淋巴細(xì)胞的炎癥，2)肽Bβ完全阻斷由NDSK-11和NDSK-uPA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞粘附和遷移，而肽Aα不具有阻斷活性，這表明自由的α鏈對(duì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的粘附和遷移不是需要的。
實(shí)施例12按照實(shí)施例11進(jìn)行操作，但是替代淋巴細(xì)胞應(yīng)用純的單核細(xì)胞。分別將100μgNDSK-uPA或100μgNDSK-II加到肽Aα、無(wú)規(guī)的Aα、Bβ或者無(wú)規(guī)的Bβ中。
粘附遷移a)不加 43+/-8 7+/-1b)NDSK-uPA 48+/-1010+/-2c)NDSK-II 90+/-1119+/-6d)100μg Bβ 59+/-7 5+/-1e)NDSK-uPA+100μg Bβ61+/-118+/-3f)NDSK-II+100μg Bβ 70+/-7 7+/-5g)100μg無(wú)規(guī)的Bβ40+/-7 6+/-1h)NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Bβ 45+/-5 8+/-3i)NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Bβ92+/-1020+/-7j)100μg Aα 59+/-6 5+/-1k)NDSK-uPA+100μg Aα62+/-4 8+/-5l)NDSK-II+100μg Aα 68+/-109+/-6m)100g無(wú)規(guī)的Aα58+/-7 6+/-1
n)NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Aα 50+/-10 10+/-4o)NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Aα 108+/-8 21+/-5這些試驗(yàn)結(jié)果表明，僅NDSK-II并且不是NDSK-uPA促進(jìn)單核細(xì)胞的遷移，即α鏈和β鏈必須具有一個(gè)游離的N-末端并阻斷單核細(xì)胞的遷移。
實(shí)施例13按照實(shí)施例11的步驟進(jìn)行，應(yīng)用純的淋巴細(xì)胞。分別將100μgNDSK-uPA或100μg NDSK-II加到衍生于AαGly Pro Arg(Pfo)-NH2乙酸鹽(Aα-衍生物)或者衍生于Bβ Gly His Arg Pro-OH乙酸鹽(Bβ-衍生物)的短肽的鹽中。
粘附 遷移a) 不加 60+/-8 14+/-1b) NDSK-uPA 149+/-1257+/-5c) NDSK-II121+/-1148+/-7d) 僅100μg Bβ-衍生物58+/-10 12+/-9e) NDSK-uPA+100μg Bβ-衍生物 70+/-8 16+/-3f) NDSK-II+100μg Bβ-衍生物 69+/-7 14+/-5g) 僅100μg Aα-衍生物77+/-4 18+/-1h) NDSK-uPA+100μg Aα-衍生物 134+/-4 48+/-5i) NDSK-II+100μg Aα-衍生物 131+/-7 49+/-6j) 僅100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物 70+/-5 14+/-7k) NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物130+/-1249+/-6l) NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物 120+/-1055+/-8由這些試驗(yàn)得出，如果淋巴細(xì)胞遷移被抑制，這些以適當(dāng)方式連續(xù)加入的短鏈肽與長(zhǎng)鏈肽具有相同的活性。
實(shí)施例14按照實(shí)施例12進(jìn)行操作，應(yīng)用純的單核細(xì)胞。分別將100μgNDSK-uPA或100μg NDSK-II加到衍生于AαGly Pro Arg(Pro)-NH2乙酸鹽(Aα-衍生物)或者衍生于Bβ Gly His Arg Pro-OH乙酸鹽(Bβ-衍生物)的短肽的鹽中。
粘附遷移a)不加 40+/-8 5+/-1b)NDSK-uPA 54+/-9 7+/-2c)NDSK-II85+/-11 22+/-6d)100μg Bβ-衍生物 52+/-7 6+/-1e)NDSK-uPA+100μg Bβ-衍生物 61+/-11 8+/-3f)NDSK-II+100μg Bβ-衍生物 68+/-7 8+/-4g)100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物 40+/-7 6+/-1h)NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物44+/-6 8+/-2i)NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Bβ-衍生物 92+/-10 23+/-7j)100μg Aα-衍生物 50+/-5 4+/-4k)NDSK-uPA+100μg Aα-衍生物 60+/-5 7+/-6l)NDSK-II+100μg Aα-衍生物 64+/-11 8+/-2m)100μg無(wú)規(guī)的Aα-衍生物 54+/-10 6+/-3n)NDSK-uPA+100μg無(wú)規(guī)的Aα-衍生物50+/-10 10+/-4o)NDSK-II+100μg無(wú)規(guī)的Aα-衍生物 99+/-8 21+/-7由這些試驗(yàn)得出，如果單核細(xì)胞遷移被抑制，這些以適當(dāng)方式連續(xù)加入的短鏈肽與長(zhǎng)鏈肽具有相同的活性。
實(shí)施例15該試驗(yàn)用220g-280g重的雄性Wistar大鼠進(jìn)行。給這些大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。為了進(jìn)行該試驗(yàn)，將大鼠麻醉并進(jìn)行頻率為70次/分鐘的人工呼吸，其中通過(guò)1mm-2mm水銀的超壓按照每千克8ml-10ml給予含有30體積％氧氣的氣體。給右心動(dòng)脈安裝測(cè)量插管并測(cè)定該動(dòng)脈的血壓和心率。測(cè)定壓力比率，作為該動(dòng)脈中的血壓和心率的乘積，其量綱為mm水銀/分鐘/103。在右側(cè)的靜脈安裝測(cè)量插管用于施加測(cè)試物質(zhì)。在進(jìn)行外科處理后，向大鼠心臟提供2ml大鼠血液。30分鐘后，將左側(cè)的心動(dòng)脈閉合。再過(guò)25分鐘將閉合松開，以給缺血區(qū)域供血。在此刻，給半數(shù)動(dòng)物靜脈施用800μg/kg的肽Bβ或無(wú)規(guī)的肽Bβ，然后等待2小時(shí)。
然后，為了區(qū)分受損的和未受損的心肌組織，給左側(cè)心臟動(dòng)脈提供濃度為2重量％的evans藍(lán)染料。然后將取下的心臟水平切片成5部分，去除右靜脈壁并用氯化三苯基tetratol(1重量％)在37℃處理這些切片20分鐘，以區(qū)分正常組織和梗塞的組織。用電腦控制的面積法評(píng)價(jià)這些切片。
由于血管閉合，對(duì)照大鼠心臟中心肌的62.5％受到威脅，而在試驗(yàn)大鼠心臟中為60％。在對(duì)照大鼠心臟中受到威脅的組織的46％壞死，相反在試驗(yàn)大鼠心臟中只有29％。這相當(dāng)于壞死組織降低了37％(p＜0.05)。
按照本發(fā)明的物質(zhì)以及按照本發(fā)明的物質(zhì)的用于制備藥物組合物的用途具有特別的意義用于治療由自主反應(yīng)的淋巴細(xì)胞的組織破壞作用引起的疾病中使用的藥物組合物。
屬于這類的疾病的是自身免疫領(lǐng)域的疾病，例如膠原性疾病、風(fēng)濕病、牛皮癬和感染后/副感染疾病和由移植物與宿主反應(yīng)引起的疾病。產(chǎn)生治愈效果，因?yàn)檫@些藥物組合物阻斷淋巴細(xì)胞遷移到組織中。因此，這些淋巴細(xì)胞停留在血液中并且不能產(chǎn)生自主反應(yīng)性組織破壞作用。
在治療和/或預(yù)防器官移植后發(fā)生排斥時(shí)這些藥物產(chǎn)生治愈效果，因?yàn)檫@些藥物阻止淋巴細(xì)胞從血液向外來(lái)器官中遷移，因此，外來(lái)器官不能被自主反應(yīng)性淋巴細(xì)胞破壞。
在治療和/或預(yù)防器官移植后的動(dòng)脈硬化時(shí)這些藥物產(chǎn)生治愈效果，因?yàn)檫@些藥物抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞向血管壁中的遷移，因此，阻止了血管壁中細(xì)胞的活化。對(duì)此，將器官移植后動(dòng)脈硬化發(fā)生率最小化或者被阻止。
在治療和/或預(yù)防術(shù)后再灌注損傷或者藥物引起的血流恢復(fù)，例如心肌梗塞后、中風(fēng)后、血管手術(shù)后、分流術(shù)和器官移植后的血流恢復(fù)時(shí)這些藥物產(chǎn)生治愈效果，因?yàn)檫@些藥物抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞向血管壁中遷移。再灌注損傷是由于血流恢復(fù)過(guò)程中存在的血管細(xì)胞由于缺氧/酸中毒引起的并導(dǎo)致其活化。因此，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附到血管壁上并向其中遷移。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在血管壁上的粘附和向血管壁中的遷移被抑制的事實(shí)降低了缺氧/酸中毒引起的損傷，不會(huì)由于隨后的炎性反應(yīng)引起任何永久性血管損傷。
在治療和/或預(yù)防代謝疾病或老化過(guò)程之后的動(dòng)脈硬化時(shí)，這些藥物產(chǎn)生治愈效果，因?yàn)檫@些藥物抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞向血管壁中的遷移，因此，抑制了由此引起的動(dòng)脈硬化斑的進(jìn)展。
也可以用本發(fā)明的藥物組合物轉(zhuǎn)運(yùn)另一種藥物物質(zhì)。按照本發(fā)明的藥物組合物特異性結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞的表面分子。因此，與其偶聯(lián)的藥物物質(zhì)可以高濃度與內(nèi)皮細(xì)胞接觸，而使它們不會(huì)在其它位置引發(fā)副作用。作為實(shí)例可提及應(yīng)用抑制細(xì)胞分裂的物質(zhì)，這些物質(zhì)被特異性地引導(dǎo)到內(nèi)皮細(xì)胞之后發(fā)揮其抗血管生成作用。在這種情況下對(duì)腫瘤患者有治療作用，因?yàn)橥ㄟ^(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和因此通過(guò)避免新血管生成而阻斷了腫瘤的生長(zhǎng)。
序列表<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<150>AT 2063/2000<151>2000 12 12<160>12<170>Microsoft Windows NT，Workstation 4.0，Office 97<210>1<211>32<212>肽<400>Gly His Arg Xaa2Xaa29
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<150>AT 2063/2000<151>2000 12 12<160>12<170>Microsoft Windows NT，Workstation 4.0，Office 97<210>2<211>32<212>肽<400>Gly Pro Arg Xaa2Xaa29
<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<110>FIBREX醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)公司/Petzelbauer Peter<120>肽和/或蛋白質(zhì)及其用于制備治療性和/或預(yù)防性藥物組合物的用途<130>
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<150>AT 2063/2000<151>2000 12 12<160>12<170>Microsoft Windows NT，Workstation 4.0，Office 97<210>12<211>28<212>肽<400>Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gln Ser AlaCys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser AspGlu Asp Trp Asn Tyr Lys
權(quán)利要求
1.通式I(SEQ ID NO 1、2)的肽或蛋白質(zhì) 其中R1和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個(gè)，特別是至多10個(gè)碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z1表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Z2表示精氨酸殘基、包含起始精氨酸殘基的，特別是包含2-30個(gè)氨基酸的肽殘基或者蛋白質(zhì)殘基，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的用于人和/或獸醫(yī)學(xué)中的用于治療性和/或預(yù)防性應(yīng)用的物質(zhì)的混合物。
2.按照權(quán)利要求1的具有通式II(SEQ ID NO 3-10)的肽或者蛋白質(zhì) 其中R1和R2相同或不同，表示氫、具有1-3個(gè)，特別是至多10個(gè)碳原子的飽和的或者不飽和的烴基，Z1表示組氨酸殘基或者脯氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基Z3表示脯氨酸殘基或纈氨酸殘基，Z4表示亮氨酸殘基或者纈氨酸殘基，Z5表示蛋白質(zhì)殘基或者肽殘基，特別是包含2-30個(gè)氨基酸的肽殘基或者蛋白質(zhì)殘基，或者含有1-3，特別是至多10個(gè)碳原子的醇基團(tuán)，或者有機(jī)或無(wú)機(jī)堿基團(tuán)，及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它的用于人和/或獸醫(yī)學(xué)中的用于治療性和/或預(yù)防性應(yīng)用的物質(zhì)的混合物。
3.按照權(quán)利要求2的肽或者蛋白質(zhì)，其中Z5是衍生于血纖蛋白Aα-鏈的肽殘基。
4.按照權(quán)利要求2的肽或者蛋白質(zhì)，其中Z5是衍生于血纖蛋白Bβ-鏈的肽殘基。
5.按照權(quán)利要求2通式II的肽或者蛋白質(zhì)，其中Z5是具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO 11)的肽殘基Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg ProAla Pro Pro Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg并且Z1表示組氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基，Z3表示脯氨酸殘基，Z4表示亮氨酸殘基。
6.按照權(quán)利要求2的通式II的肽或者蛋白質(zhì)，其中Z5是具有下述氨基酸序列(SEQ ID NO 12)的肽殘基Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp TrpPro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys并且Z1表示脯氨酸殘基，Arg表示精氨酸殘基，Z3表示纈氨酸殘基，Z4表示纈氨酸殘基。
7.按照權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備治療感染引起的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
8.按照權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備治療基于自身免疫反應(yīng)的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
9.按照權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備治療基于風(fēng)濕病的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
10.按照權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備治療基于免疫系統(tǒng)紊亂的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
11.按照權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備治療基于遺傳疾病的身體局部和/或全身炎癥的藥物組合物的用途。
12.按照權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防和/或治療器官移植后發(fā)生的排斥反應(yīng)、動(dòng)脈硬化、再灌注損傷、動(dòng)脈硬化疾病和/或在衰老過(guò)程中血纖蛋白沉積增多的藥物組合物的用途。
13.按照權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防和/或治療器官移植后動(dòng)脈硬化的藥物組合物的用途。
14.按照權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防和/或治療再灌注損傷的藥物組合物的用途。
15.按照權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防和/或治療動(dòng)脈硬化和/或血栓疾病的藥物組合物的用途。
16.按照權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防和/或治療衰老過(guò)程中血纖蛋白沉積增多的藥物組合物的用途。
17.按照權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)用于制備用于向人或動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞遞送一種其它藥物的藥物組合物的用途。
18.一種藥物組合物，含有至少一種權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的肽和/或蛋白質(zhì)。
19.按照權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的藥物組合物，這些藥物組合物為適于注射的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的肽或蛋白質(zhì)及其鹽，以及例如酰胺，或者相互的混合物和/或與至少一種其它物質(zhì)的混合物用于人和/或獸醫(yī)學(xué)中治療性和/或預(yù)防性應(yīng)用，其中R
文檔編號(hào)C07K5/078GK1518558SQ01822599
公開日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者P·佩策爾保爾, P 佩策爾保爾 申請(qǐng)人:菲布雷克斯醫(yī)療研究及開發(fā)有限責(zé)任公, 菲布雷克斯醫(yī)療研究及開發(fā)有限責(zé)任公司