專利名稱：新的天然抗菌肽、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、生殖生物學(xué)、分子免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及新的在大鼠附睪頭部特異表達(dá)的天然抗菌肽-Binlb蛋白，以及編碼該抗菌肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及此抗菌肽及其編碼序列的制備方法和用途。Binlb蛋白還與男性生育，尤其是精子成熟有關(guān)。
人類基因組全順序的闡明會繪出一篇密碼圖譜，隨后的是了解哪一段順序編碼哪一個基因？這一基因在體內(nèi)的功能是什么？一個生物學(xué)功能需要哪幾個基因的協(xié)同作用？它們又是如何協(xié)調(diào)控制著生命的正?；顒拥模恳约澳男╁e誤會導(dǎo)致各種病理現(xiàn)象的產(chǎn)生？這一系列艱巨的，極富挑戰(zhàn)性的，能直接為人類造福的，也能產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益的解碼工作促使人們進(jìn)入了功能基因組研究時代。
在回顧20世紀(jì)和展望21世紀(jì)之際，國際同行專家的一致認(rèn)為生殖生物學(xué)發(fā)展至今雖然成果頗豐，但如果沿襲過去的思路和方法，局限于組織水平、細(xì)胞水平的觀察和測定，不借鑒相關(guān)學(xué)科的新技術(shù)，不深入研究生殖的分子機(jī)制，不進(jìn)行多學(xué)科的交叉研究，那么其發(fā)展將不容樂觀。而且，多年來生殖生物學(xué)主要側(cè)重于雌性生殖的研究，對雄性生殖領(lǐng)域的涉足不多。人們對揭示生殖規(guī)律的基礎(chǔ)研究尚不夠重視，致使迄今尚無理想的節(jié)育藥物和技術(shù)，且對自身生殖奧秘的認(rèn)識滯后于現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展。因而生殖生物學(xué)在21世紀(jì)將面臨兩項革命(1)重視發(fā)展其基礎(chǔ)研究，將現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等新思想、新方法、深入研究控制人類生殖和出生缺陷的機(jī)制；(2)加強(qiáng)雄性生殖生物學(xué)的研究，大力發(fā)展男性避孕措施，為當(dāng)前生殖健康研究的國際趨勢。
中國人口目前占世界人口的22％，但耕地只有世界的7％，淡水量只有世界的6％。即便將人口增長率控制在0.01％，每年也將有0.13億以上的人口逐年增長。此外，目前所使用的避孕措施主要以女性為主。何況這些避孕藥還未完善，有著這樣或那樣的副作用(其遺傳后果還猶待評估)。安全的絕育措施也以女性為主，據(jù)WHO的統(tǒng)計，我國四川省男性輸精管結(jié)扎者只有1/12。實際上，避孕是男女雙方都有責(zé)任的，而且男性生殖調(diào)控在人口數(shù)量和質(zhì)量控制兩個方面都更具重要性。因為(1)健康男性在50年生育期內(nèi)，每天產(chǎn)生1億精子，而女性生育期只有40年，每個月才排出1個成熟卵。(2)精子容易受環(huán)境影響而產(chǎn)生突變。(3)50年來，精子數(shù)量和質(zhì)量下降了40％。(4)45歲以下的男性原發(fā)性不育者占5-10％。因此，除了要糾正“避孕是婦女的事”這一誤區(qū)外，還要特別加強(qiáng)雄性生殖生物學(xué)的研究，大力發(fā)展男性避孕措施。眾所周知，人類生殖健康是全球性戰(zhàn)略的頭等大事。避孕畢竟是緩解人口危機(jī)的權(quán)宜之計，而后代在本星球上追求身心健康的生活方式才是恒久主題，生育調(diào)節(jié)藥物的設(shè)計應(yīng)適應(yīng)新的現(xiàn)實需求，更上一層樓。1999年9月9-10日美國兒童健康與人類發(fā)育研究所(NICHD)負(fù)責(zé)在NIH總部召開了“男性避孕在21世紀(jì)”研討會。交流了現(xiàn)狀，提出了目標(biāo)，布署了措施(組織合作及基金支持等)，打響了戰(zhàn)鼓[Trends in Endocrinology and Metabolism2000，11(2)66-69].
目前已知精祖細(xì)胞在睪丸中通過有絲分裂、減數(shù)分裂和形態(tài)學(xué)分化成為完全的精子細(xì)胞后，進(jìn)入附睪，在其頭部和體部逐漸達(dá)到成熟，然后在尾部儲存，等待射精。而精子運動能力的形成、頂體功能的完善、代謝類型的轉(zhuǎn)變等一系列程序化的成熟功能的獲得并非靠其自身完成，而是在其通過附睪的過程中，與附睪微環(huán)境相互作用中按其特定的程序逐漸成熟的。附睪是一根連接睪丸和輸精管的盤曲的細(xì)長管道。但其每一段落的附睪細(xì)胞表達(dá)不同的基因及基因產(chǎn)物，分泌種類不同的蛋白及免疫抑制分子、有不同的腔液組成、一定的離子強(qiáng)度、pH等，形成不斷變化著的管腔微環(huán)境，與精子相互作用，使精子表面蛋白的成分得以部分改變或得以部分修飾(如加減一序列的磷酸化，酯化，?；?，羧基化，醣基化等)而被激活或抑制從而逐步獲得成熟時所具備的功能及免疫防御能力，保護(hù)其自身能在附睪中儲存及通過女性生殖道直至與卵結(jié)合。
附睪的這種對精子成熟、儲存和保護(hù)的作用因具有下述諸特點而早已被認(rèn)同并視作進(jìn)行抗生育的一個理想的靶器官(1)功能較為單一。干擾其功能的藥物不致引起嚴(yán)重的副反應(yīng)。
(2)激素作用的終極器官。自身不具有內(nèi)分泌機(jī)能。故作用于附睪的藥物一般不會影響激素分泌。
(3)精子在進(jìn)入附睪前已分化完全，基因轉(zhuǎn)錄已停止，其成熟功能的獲得一般與蛋白的修飾有關(guān)，不涉及DNA復(fù)制機(jī)能。因此藥物的作用不可能引起DNA改變的遺傳病。
(4)附睪的研究尚未引起人們的足夠重視，因此是一個未被開墾的處女地，大有用武之地。
然而，附睪不同部位形成這些程序化微環(huán)境差異的機(jī)制絕不是一、兩個基因和蛋白所能左右的，而是一組組基因程序性表達(dá)產(chǎn)物的協(xié)同作用的結(jié)果。而對于這種與精子成熟相關(guān)的附睪特異基因表達(dá)的啟動與程序還知之甚少。因此對這方面的研究，不僅有助于揭示精子在附睪中成熟的分子機(jī)理，解讀一部分基因組密碼，而且還為解決精子成熟異常所引起的不孕癥提供分子基礎(chǔ)，也為開發(fā)一些阻斷精子成熟的男性避孕藥物提供新的設(shè)計思路。
縱觀文獻(xiàn)，對附睪的研究早已受到關(guān)注?；仡欁?0年代至今，主要從三個方面在進(jìn)行探索(1)從蛋白質(zhì)水平而言，利用雙向蛋白質(zhì)電泳等技術(shù)將附睪不同部位的管腔中的蛋白質(zhì)或不同部位成熟程度不同的精子上的膜蛋白進(jìn)行比較，或用這些不同蛋白質(zhì)制成多抗，用免疫法來進(jìn)行比較取得了些結(jié)果，然而由于受分離分析技術(shù)的靈敏度的限制，進(jìn)展不盡如人意。近年來，由于蛋白組學(xué)研究的突飛猛進(jìn)，法國Dacheux實驗室自96年到今年初報道在豬和羊附睪的管腔中鑒定到200多個蛋白。提示與其它器官相比，附睪研究的難度相對較小。然而迄今為止，只有15個附睪特異的蛋白的cDNA被克隆。
(2)通過已知附睪在精子成熟過程中的作用，來研究一些已知功能的蛋白質(zhì)，是否與附睪某一特定功能相關(guān)。如已知附睪能保護(hù)精子免受氧自由基的損傷。曾對附睪不同部位6種抗氧化酶mRNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在其頭部E-GPX的mRNA含量最高，而在體部則E-SOD的mRNA含量最高。這些結(jié)果提示在附睪不同部位所需的抗氧化酶的種類不一。然而這方面的研究局限在已有的知識基礎(chǔ)上，對新基因產(chǎn)物或新功能基因的發(fā)現(xiàn)上則很少有幫助。另外，已知附睪內(nèi)存在大量免疫細(xì)胞與免疫抑制分子，保護(hù)精子不受自身攻擊的免疫微環(huán)境，但其形成與篩選調(diào)控的分子和細(xì)胞機(jī)制不清，資料不系統(tǒng)。
(3)90年代以來由于分子生物學(xué)的技術(shù)日新月異，開始有可能利用差減雜交等方法從mRNA水平上來搜尋附睪特異表達(dá)的新基因。如西德實驗室用差示篩選cDNA庫的方法在人附睪中先后找到6個新mRNA，然而由于人類附睪或其它的材料局限，無法對其功能進(jìn)行深入研究，因而都在用不同手段在其它實驗動物中進(jìn)行搜索。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的與男性生育有關(guān)和/或與附睪有關(guān)的天然蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的天然抗菌肽-Binlb蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽和多核苷酸的方法及其用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離或純化的Binlb多肽，該多肽源自大鼠，它包含具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼分離或純化的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼SEQ ID NO2或3所示Binlb多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中57-263位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中105-263位的序列；(c)具有SEQ IDNO1中1-336位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有Binlb蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)Binlb蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有Binlb蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的Binlb多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1757個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗Binlb多肽活性的化合物，以及抑制Binlb多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是Binlb多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在Binlb蛋白的方法，它包括將樣品與Binlb蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Binlb蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與Binlb多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)Binlb多肽活性的激動劑，或者篩選抑制Binlb多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的Binlb蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的Binlb多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療泌尿生殖系統(tǒng)感染等病癥。
在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種殺菌劑，它含有殺菌有效量的本發(fā)明Binlb多肽。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明人利用mRNA的差異顯示分析及差減雜交庫分析分別對大鼠和猴附睪不同部位特異表達(dá)的基因作了篩選(猴方面的工作與美國北卡大學(xué)合作)。不僅鑒定到了那些已被發(fā)現(xiàn)的特異基因，而且還獲得一系列的特異表達(dá)的新基因的全長cDNA克隆(2個在大鼠附睪頭部、4個在猴附睪頭部、4個在猴附睪體部、3個在猴附睪尾部)。
Binlb是其中之一，它是在大鼠附睪頭部特異表達(dá)的基因，已取得其全長cDNA和基因組DNA的克隆(其核苷酸和氨基酸序列和結(jié)構(gòu)已在美國NIH基因銀行中登陸，登陸號為AF217088，AF217089。在本申請之前，這些序列還未公開)。Binlb基因的表達(dá)非常特異，只在大鼠附睪頭部的上皮細(xì)胞中產(chǎn)生，在大鼠生育旺盛期表達(dá)最高，年老后下降。提示可能與生育有關(guān)。而且，Binlb基因的表達(dá)受雄激素正調(diào)控。這為今后利用激素小分子來影響此基因表達(dá)以調(diào)控精子成熟設(shè)計男性避孕藥物成為可能。此外，Binlb基因具有抗菌作用，是在大鼠附睪中發(fā)現(xiàn)的第一個beta-防衛(wèi)素類天然抗菌肽，有望發(fā)展成為治療泌尿生殖系統(tǒng)感染的一個天然藥物。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1顯示了大鼠附睪頭(1)、體(2)和尾(3)的DD-RT-PCR電泳圖。樣品一式兩份重復(fù)以確保準(zhǔn)確性。如箭頭所示，Binl在頭部區(qū)域是差異表達(dá)的。
圖2A顯示了Binlb的基因組序列和結(jié)構(gòu)特性。Binlb的基因組DNA序列(Genebank登錄號AF217089)，是通過使用位于Binlb全長cDNA序列(AF217088)兩端的引物(上游引物5′-GGACACCCAGTCATCAGTCACAT-3′(SEQ ID NO9)和下游引物5′-TTTGGGGTGCTT CCAGGTCTCT-3′(SEQ ID NO10))，并以大鼠基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增而得的。兩個外顯子用大寫字母表示；編碼區(qū)用陰影表示；polyA結(jié)尾信號；粗體大寫字母；內(nèi)含子小寫字母；剪接位點粗體小寫字母；推定的信號肽帶下劃線的氨基酸。在N端有一豆蔻?；腉殘基(用方框表示)，其共有模式(GIRNTV)用粗斜體大寫字母標(biāo)出。圓圈中的S殘基可以被PKC磷酸化，其共有模式(SIK)用粗斜體大寫字母標(biāo)出。終止密碼子用“*”表示。
圖2B顯示了Binlb與β-防衛(wèi)素的序列相似性。保守的6個淺灰陰影標(biāo)出。BNBD9(AAB25872)，BNBD3(AAB25866)，BNBD7(AAB25870)，TAP(P25068)，LAP(Q28880)，EBD(002775)來自牛；HBD1(Q09753)，HBD2(015263)，HBD3(NP061131)來自人；EP2E(AF263555_1)CBD1(AF188607_1)，CBD2(AF209855_1)來自黑猩猩；MBD1(AAB72003)，MBD2(CAB42815)，MBD3(AF092929_1)，MBD4(AF155882_1)來自小鼠；RBD1(AAC28071)，RBD2(AAC28072)來自大鼠；GBD1(CAA76811)，GBD2(CAA08905)來自山羊；SBD1(019038)，SBD2(019039)來自綿羊；PBD1(062697)來自豬；Gall(P46156)，Gal1a(P46157)和Gal2(P46158)分別是雞的gallinacin 1，1α和2；THP1(P80391)和THP2(P80392)分別是火雞的異嗜性肽1和2.EP2E是黑猩猩中與Binlb同源的一種同源蛋白，然而其作者認(rèn)為它不是β-防衛(wèi)素家族的成員。
圖2C是Binlb與靈長目同源蛋白的序列比較。與Binlb相比，靈長目同源蛋白EP2D(AF263554_1)和HE2β1(AF168617_1)具有更長的N端和C端。EP2E(AF262555_1)僅具有更長的C端。在圖中，HE2β1用HE1b1表示。
圖3顯示了Binlb全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯試驗的結(jié)果。
圖3A是對Binlb全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的分析電泳圖。泳道1和2為一式兩份的重復(fù)樣品。
圖3B是用與圖3A中相同的系統(tǒng)，對陰性對照(無質(zhì)粒DNA)和熒光素酶SP6和T7對照進(jìn)行分析的電泳圖。其中，因分子量差異而在12％SDS-PAGE中電泳。泳道1為陰性對照(無質(zhì)粒DNA)，泳道2為熒光素酶SP6對照，泳道3為熒光素酶T7對照。
圖3C.質(zhì)粒pSPT18-Binlb的結(jié)構(gòu)圖。
圖4顯示了重組的Binlb融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白DHFR-Binlb的分子量為31KD，如箭頭所指。各泳道如下NI未誘導(dǎo)，I誘導(dǎo)，CL澄清裂解液，F(xiàn)T流穿液，W洗滌緩沖液，E1洗脫1，E2洗脫2，M分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5顯示了Binlb的定位以及發(fā)育調(diào)控。(A).用Northern分析確定的Binlb組織分布情況。(B).用原位雜交確定的Binlb在附睪中的區(qū)域分布情況，Binlb位于大鼠附睪頭部區(qū)域的中間(Mid)。Ins初始段。(C)用反義探針確定的Binlb細(xì)胞定位。Binlb位于附睪上皮細(xì)胞(Prc)中。(D).有義探針。(E)作為陽性對照的18s探針。(F).在整個生命期間(15-720天)，大鼠附睪中Binlb mRNA的表達(dá)圖。(泳道1，2和3分別表示來自附睪頭、體、尾區(qū)域的mRNA)。
圖6.在用EDS(Ethylene Dimethamesulfonate)處理后，對大鼠頭部總RNA進(jìn)行的Northern印跡分析結(jié)果。
圖6A為Northern印跡電泳雜交圖。
圖6B顯示了Binlb的表達(dá)受雄激素的上調(diào)。其中，帶“▲”的曲線表示在注射EDS后間隔不同時間，大鼠血清中的睪丸激素的水平；帶“◆”的曲線表示了用18s水平校正后大鼠Binlb表達(dá)水平的變化。
圖7顯示了Binlb的抗菌活性以及對炎癥作出的表達(dá)上調(diào)。(A).頭部和尾部培養(yǎng)物抗菌活性的比較。在試驗前16小時，將100 CFU大腸桿菌加至培養(yǎng)物中。(B).反義Binlb對頭部培養(yǎng)物抗菌活性的影響。用反義或有義寡核苷酸(5微克/微升)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物20小時。(C).通過結(jié)扎大鼠輸精管而引起炎癥(2周)，在附睪頭部Binlb mRNA增加，而尾部沒有變化。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Binlb蛋白”、“Binlb多肽”或“抗菌肽-Binlb”可互換使用，都指具有天然抗菌肽Binlb氨基酸序列(SEQ ID NO2或3)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的天然抗菌肽Binlb，以及含有或不含有信號肽的Binlb蛋白。成熟的Binlb蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸和多肽如果與天然狀態(tài)一起存在的其他物質(zhì)分開，則為分離純化的?！胺蛛x”、“純化”包括將重組表達(dá)的Binlb蛋白與其他蛋白、糖類等物質(zhì)分開。
如本文所用，“分離或純化的Binlb蛋白或多肽”是指Binlb多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Binlb蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括Binlb蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然Binlb蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
一類特殊的Binlb類似物是在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中Binlb的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列，通過雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Binlb多肽”指具有Binlb蛋白活性的SEQ ID NO.2或3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與Binlb蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-20個，較佳地1-10個，更佳地1-5個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Binlb蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Binlb DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Binlb多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Binlb多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了Binlb多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Binlb多肽序列的至少約15個連續(xù)氨基酸，通常至少約25個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約35個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約40個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供Binlb蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然Binlb多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“Binlb蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2或3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2或3的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1中相應(yīng)編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼Binlb成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列+各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列+任選的附加編碼序列+非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知，等位變異體是一種多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但這種變化不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Binlb核苷酸序列。
本發(fā)明的Binlb核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，因為Binlb編碼序列的長度較短。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Binlb蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Binlb多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼Binlb多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，Binlb多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Binlb編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的Binlb蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療泌尿生殖系統(tǒng)感染疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笲inlb蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組Binlb蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激Binlb蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對Binlb DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于Binlb基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與Binlb基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Binlb蛋白的分子，也包括那些并不影響B(tài)inlb蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的Binlb基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體等。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Binlb基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Binlb蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292.1976Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hvbridomas.Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷Binlb蛋白功能的抗體以及不影響B(tài)inlb蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用Binlb基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Binlb基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗Binlb蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的Binlb蛋白。此外，與Binlb蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Binlb蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于泌尿生殖系統(tǒng)感染方面的治療。在使用本發(fā)明Binlb蛋白時，還可同時使用其他藥劑，如青霉素等抗菌素。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Binlb多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的Binlb蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。此外，Binlb核苷酸序列也可用于多種治療目的。
能與Binlb蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測Binlb蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的Binlb蛋白水平，可以用作解釋Binlb蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Binlb蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在Binlb蛋白的方法是利用Binlb蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與Binlb蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Binlb蛋白。
Binlb核苷酸序列可用于Binlb蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Binlb核苷酸序列可用于檢測Binlb蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Binlb蛋白的異常表達(dá)。如Binlb DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷Binlb蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Binlb蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測Binlb蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測Binlb基因的突變也可用于診斷Binlb蛋白相關(guān)的疾病。Binlb蛋白突變的形式包括與正常野生型Binlb DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明Binlb蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
本發(fā)明的Binlb為治療泌尿生殖系統(tǒng)感染等疾病以及開辟男性避孕方法提供新的途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1Binlb mRNA的差異片段的發(fā)現(xiàn)基本上按Liang，P.等在“Science”上發(fā)表的方法[P.Liang，and A.B.Pardee，Science 257，967(1992)]，從Sprague-Dawley大鼠附睪的頭部、體部、尾部分別抽提總RNA，并用不含RNase的DNase消化去除留存的染色體DNA。經(jīng)沉淀后，用2ug分別來自頭、體、尾部的純化的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用2.5uM的下游引物T11CA(5′-TTTTTTTTTTTCA-3′)和400單位的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶。以1/20的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在20ul反轉(zhuǎn)錄體系中，包含2.5uM的上游引物502(5′-TGGATTGGTC-3′)，0.5uM的下游引物T11CA，10mM Tris-HCl pH 9.0，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1％Triton X-100，4μM each dNTP，1μCi32P-dATP和3單位Taq聚合酶。反應(yīng)條件為94℃ 5min；然后是40個循環(huán)94℃ 30秒，40℃ 60秒，72℃ 50秒；最后是72℃ 10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)沉淀后，在0.2mm厚的6％的測序膠上分離。
在大鼠附睪頭部有一條特異表達(dá)340bp的條帶(命名為Binl，如圖1中箭頭所示)。將該條帶割出后，于沸水中洗脫15分鐘。被洗脫出的DNA經(jīng)乙醇沉淀后，用上面相同的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但需改變dNTP的濃度為40uM并且不加同位素。擴(kuò)增出來的DNA片段克隆于pBluescript SK-質(zhì)粒中。用反向Northern方法從52個克隆中篩選出在附睪頭部有特異雜交信號的克隆，并命名為Binlb。在這個基因片段基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用5′-RACE的方法克隆該基因的全長cDNA。
實施例2Binlb全長cDNA的克隆和結(jié)構(gòu)分析根據(jù)已有的cDNA片段設(shè)計引物，通過類似的RT-PCR反應(yīng)向5′-末端延伸。使用了兩種5′-RACE的方法獲得cDNA全長。
第一種方法參照Apte，A.N.的報道[A.N.Apte，P.D.Siebert，in ReverseTranscriptase PCR J.W.Larrick，P.D.Siebert，Eds.(Ellis Horwood，London，1995)pp.232-244.]，利用DNA oligo和cDNA第一鏈連接的方式。
另外一種方法修訂于Maruyama，K.[K.Maruyama and S.Sugano，Gene 138，171(1994)]的報道，我們做了一定的修改，這種方法克服了前一種方法的缺陷，可以確保獲得cDNA的5′-帽子位點。它使用DNA oligo代替RNA oligo和總RNA進(jìn)行連接。具體過程如下將50ug大鼠附睪頭部的總RNA用400單位的細(xì)菌堿性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatase，BAP)于37℃消化30分鐘，隨后65℃消化30分鐘。接著，用50ng/ul的蛋白酶K于37℃酶解30分鐘，以便消化BAP。經(jīng)純化后，將其中10ug RNA用2單位的煙草酸焦磷酸酶(Tobacco AcidPyrophosphatase，TAP)于37℃酶解2小時，經(jīng)苯酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀。分別取0.75ug(3pmol)未經(jīng)任何處理的RNA、BAP處理的RNA、和TAP處理的RNA與1.25pmol DNA oligo#7209(5′-AATGGTACCGTGACGTGGTCC-3′)(SEQ ID NO5)在10ul反應(yīng)體系中于17℃連接18小時，連接反應(yīng)體系中包括1.2單位/ulT4 RNA連接酶，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2，1mM氯化六氨合高鈷(hexammine)colbalt chloride)，25％PEG8000，1mM ATP。1/50的連接產(chǎn)物被用來進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系采用GIBCO BRL公司的SuperScript IIOne-Step RT-PCR System，反應(yīng)體積為20ul。另外，還包括200nM的Binlb基因特異的引物(GSP)(5′-TGGCCCCGCTGCATGAAGCAC-3′)(SEQ ID NO6)和200nM的DNA oligo#7209(5′-AATGGTACCGTGACGTGGTCC-3′)(SEQ ID NO5)。反應(yīng)條件為50℃ 30min，94℃ 2min，然后按照以下條件進(jìn)行35個循環(huán)，94℃ 5秒，60℃ 15秒，72℃ 45秒，最后于72℃延伸5min。取0.2ul RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積為10ul，反應(yīng)體系中含有50mMTris-HCl pH 8.3，1-3mM MgCl2，250μg/ml BSA，0.5％Ficoll 400，1mM tartrazine，200μM dNTP，500nM Binlb GSP，500nM DNA oligo#7209，和0.4單位的Taq聚合酶。反應(yīng)在毛細(xì)管中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃ 1min，然后按下列條件進(jìn)行60個循環(huán)94℃ 0秒，60℃ 0秒，77℃ 15秒，最后于77℃延伸5min。PCR產(chǎn)物克隆于pBluescript SK+T-載體中，并進(jìn)行測序。這樣，本發(fā)明人就獲得了Binlb的3′和5′兩個cDNA片段。
在2個cDNA片段的兩端分別設(shè)計引物(5’-GGACACCCAG TCATCAGTCA-3’(SEQID NO7)和5’-CAGCAAGTGT TTATTGAGCA-3’(SEQ ID NO8))，使用RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，通過PCR反應(yīng)獲得Binlb的全長cDNA克隆。這個序列在6只不同齡的大鼠中得到了驗證。Binlb的全長cDNA為385bp(SEQ ID NO1)(如圖2A所示)。它編碼一個68個氨基酸的多肽(命名為Binlb蛋白)(SEQ ID NO2)，在其N端有一個16個氨基酸的信號肽，它的C-端45個氨基酸為理論上的成熟多肽(另有7個氨基酸在pro-Binlb轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍讜r被切除)。
通過Genebank的Blastn程序查詢發(fā)現(xiàn)，Binlb在編碼區(qū)180-241位與人精子抗原HE2(673bp)的非編碼區(qū)(457-518位)有83％的相似性。此外，通過Genebank的Blastp程序查詢發(fā)現(xiàn)Binlb編碼的多肽與哺乳動物β-防衛(wèi)素家族有一定程度的相似性(如圖2B所示)。
繼而，本發(fā)明人用類似的PCR方法克隆了Binlb的基因組DNA(SEQ ID NO4)(如圖2A所示)。證明了Binlb基因結(jié)構(gòu)也附合β-defensin家族的規(guī)律，即由一個內(nèi)含子和兩個外顯子組成。
目前，關(guān)于HE2的研究發(fā)展很快，有兩家實驗室相繼報導(dǎo)了人HE2和大猩猩HE2(EP2)的多個異構(gòu)體。有一些異構(gòu)體雖然它們的表達(dá)量很低，然而與Binlb有非常好的同源性(如圖2C所示)。
實施例3Binlb蛋白的表達(dá)在該實施例中，通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯實驗，驗證了Binlb表達(dá)出多肽的大小與理論上推斷的一致，約為31kDa。
將帶有約75bp polyA尾部且包括編碼僅68個氨基酸(7799道爾頓)的ORF的Binlb全長cDNA，克隆在pSPT18(Promega)的EcoRI和HindIII之間，位于T7啟動子下游，形成質(zhì)粒pSPT18-Binlb(圖3C)。用HindIII線性化的質(zhì)粒，在含有放射性標(biāo)記的35S-Met的TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System中分析，并用16.5％Tricine-SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分析(按Schagger和Von Jagow所述的方法)，結(jié)果如圖3A所示。同時，使用陰性對照(無質(zhì)粒DNA)和熒光素酶SP6和T7對照進(jìn)行比較(圖3B)。
實施例4Binlb的融合表達(dá)及抗體制備將Binlb cDNA的126-281位的片段接入融合表達(dá)載體pQE-40(Qiagen公司)中。挑選出的陽性克隆，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni-NTA-瓊脂糖(Qiagen公司)純化。該實驗的具體操作過程詳見QiaExpressionist(Qiagen公司)。
純化后的融合表達(dá)蛋白DHFR-Binlb的大小為31KD(如圖4所示)。將純化的蛋白免疫兔子，取得抗DHFR-lb的抗血清。然而，該抗血清的抗Binlb的滴度不高，有待進(jìn)一步改進(jìn)。
實施例5Binlb表達(dá)的組織分布Binlb表達(dá)的組織分布的Northern印跡分析，按1984年Church和Gilbert首先報道的方法進(jìn)行。從Sprague-Dawley大鼠附睪的頭部、睪丸、前列腺、肝、心、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、凝結(jié)腺(Coagulating gland)、精囊、下丘腦、紋狀體、垂體、海馬、小腦、大腦皮層中分別抽提總RNA。各取20ug總RNA，在1.2％的甲醛瓊脂糖電泳上分離，并轉(zhuǎn)膜HybondTM-N+尼龍濾膜(AmershamPharmacia Biotech)。Binlb的探針用Promega公司的Prime-a-GeneSystem試劑盒標(biāo)記。雜交結(jié)果表明，Binlb只在大鼠附睪頭部有表達(dá)(如圖5A所示)。這也促使我們用原位雜交來更精確地定位Binlb的表達(dá)特異性。
實施例6Binlb表達(dá)在附睪中的定位在該實施例中，用原位雜交法對Binlb進(jìn)行定位，方法如下(1)45天齡大鼠附睪，以4％多聚甲醛室溫固定4小時以上，固定后的組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、56-58℃高溫石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚10微米，貼于硅烷處理的載玻片上，42℃烤片48-72小時，密封于玻璃染色缸內(nèi)，保存于4℃。
(2)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水至DEPC-H2O中，于0.2M HCl中處理20分鐘，DEPC-H2O洗5分鐘，2×SSC 70℃ 30分鐘，DEPC-H2O洗5分鐘，切片經(jīng)TE(pH 7.5)37℃平衡30分鐘后，置于含3ug/ml的蛋白酶K的TE(pH7.5)中，37℃消化10分鐘。以含0.2％甘氨酸的PBS和PBS溶液各洗2次，每次1分鐘，再以4％多聚甲醛室溫后固定20分鐘，之后浸于1.5％乙酸酐/0.25M三乙醇胺中，室溫10分鐘，PBS洗5分鐘。
(3)用餐巾紙吸去載玻片上多余的水分，將預(yù)雜交液[每5ml雜交A液中含有0.65ml DEPC-H2O，2.5ml甲酰胺，1.25ml 20X雜交鹽液(3M NaCl，0.1MPIPES，0.1M EDTA pH 6.8)，0.5ml 100X Denhardt′s，0.1ml 10％SDS。將125ul魚精DNA/酵母tRNA(10mg/ml)煮沸5分鐘，立即冷卻于碎冰中，加入4.875ml雜交A液，混合后，其中4ml作為預(yù)雜交液，1ml留作制備雜交液。]滴在組織切片上，然后水平放置于濕盒內(nèi)，60℃ 4小時。
(4)取適量Dig標(biāo)記的反義RNA探針和有義RNA探針(探針的標(biāo)記參照Dig RNALabeling Kit，寶靈曼公司)，分別加入等量的甲酰胺，煮沸30秒，立即冷卻于碎冰中，加入適量預(yù)雜交液，充分混合即為雜交液。用吸水紙吸去切片上的預(yù)雜交液，將雜交液滴加在組織切片上，每張切片40ul，其中含1.2ug探針，探針濃度為30ng/ul(可作不同的濃度，以滴定出最佳濃度)。同時做抗體對照(不加探針，加抗體)和空白對照(探針、抗體都不加)。在雜交液上加蓋玻片，切片水平放置在密封濕盒內(nèi)，60℃雜交過夜。
(5)將載玻片置4×SSC中去掉蓋玻片，再以4×SSC洗四次，每次5分鐘，于含有20ug/ml RNase A的RNase緩沖液(含0.5M NaCl的TE)中37℃消化30分鐘，再于RNase緩沖液中30℃吸30分鐘，于2×SSC中50℃洗2次，每次15分鐘，于0.1×SSC中50℃洗2次，每次15分鐘。
(6)切片置TBS(100mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl)中洗5分鐘，將含有0.5％封閉劑(寶靈曼公司)的封閉液滴在組織切片上，室溫封閉1小時，吸去封閉液，滴加1∶1000(可滴定)封閉液稀釋的Anti-Dig-AP抗體，室溫結(jié)合90分鐘或4℃過夜，TBS洗4次，每次5分鐘。切片置于顯色緩沖液CDS(100mM Tris-HClpH 9.5，100mM NaCl，50mM MgCl2)中5分鐘，將顯色液[每ml含4.5ul氮藍(lán)四唑(nitroblue tetrazolium(NBT)，75mg/ml)，3.5ul 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate(BCIP)，50mg/ml)，2ul 1MLevamisole，CDS 990ul]滴于組織切片上，置于避光濕盒內(nèi)，37℃顯色1-5小時或室溫顯色過夜。顯色后以TE pH 8.0洗3次，每次5分鐘，終止反應(yīng)。再以雙蒸水洗5分鐘，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。經(jīng)顯微鏡觀察，Binlb定位在大鼠附睪頭部中央的上皮細(xì)胞中(如圖5B-E所示)。
實施例7Binlb在大鼠發(fā)育過程中的變化Binlb在大鼠發(fā)育過程中的變化的Northern印跡分析方法同實施例5，RNA樣品提取自15天齡大鼠的附睪頭、30、45、60、120、270、720天齡大鼠的附睪頭、附睪體和附睪尾。
結(jié)果表明，Binlb的表達(dá)水平在性成熟期(包括性活躍期)達(dá)到最高，然后逐漸下降(如圖5F所示)。這提示Binlb與男性精子成熟有關(guān)，并可能可以調(diào)控Binlb進(jìn)而實現(xiàn)男性避孕。
實施例8Binlb的表達(dá)受激素等小分子的調(diào)控在該實施例中，通過EDS模型觀察到Binlb的表達(dá)至少是部分受雄激素正調(diào)控的。
用二甲亞砜-水(1∶3，v/v)中的EDS(7.5mg/100g體重)，對成年Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射一次。在之后間隔1天，3天，7天，14天，21天，28天，42天等不同時間，將大鼠殺死。另一組未注射EDS的大鼠也被殺死，作為空白對照。從大鼠附睪頭部區(qū)域抽提的總RNA(20微克)，用1.2％甲醛-瓊脂糖凝膠電泳分級，印跡于Hybond+尼龍濾膜，然后再依次與Binlb 3′端cDNA探針和18s核糖體RNA探針雜交。
在注射EDS后，雄激素的分泌會受抑制而下降，但約2周后雄激素的分泌又會恢復(fù)。與雄激素水平的變化相比，可以看出Binlb的表達(dá)受雄激素的正調(diào)控(圖6A和6B)。
這提示，可以通過激素小分子來影響B(tài)inlb基因的表達(dá)，從而調(diào)控精子的成熟，進(jìn)而為設(shè)計男性避孕藥開辟了新途徑。
實施例9Binlb是一個天然抗菌肽上述的一系列研究提示，Binlb是β-防衛(wèi)素家族的一個成員且與精子成熟相關(guān)。在該實施例中，證實了Binlb的抗菌活性。
為了驗證Binlb殺菌功能，檢驗了大鼠附睪頭部細(xì)胞培養(yǎng)的分泌物的殺菌功能。100CFU(colony forming units)的大腸桿菌(E.coli)與大鼠附睪頭部和尾部的上皮細(xì)胞分別共培養(yǎng)。16個小時以后，收集細(xì)胞的培養(yǎng)液，用來檢測殺菌活力，發(fā)現(xiàn)頭部上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液有很強(qiáng)的殺菌活力而尾部的則無(如圖7A所示)。這首先肯定了附睪頭部細(xì)胞的分泌物有殺菌活力。
雖然Binlb表達(dá)在附睪的頭部，但為了確定殺菌活力是否屬于Binlb蛋白，本發(fā)明人在與大腸桿菌共培養(yǎng)之前，先加入Binlb的反義RNA，用以阻斷Binlb的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Binlb的反義RNA來抑制Binlb蛋白的產(chǎn)生后，附睪頭部細(xì)胞的分泌物的殺菌活力隨之消失，從而證實了Binlb的抗菌性。(如圖7B所示)。
綜上所述，Binlb蛋白為一未見報道的屬于β-防衛(wèi)素家族的新型天然抗菌肽。
實施例10Binlb的表達(dá)受炎癥上調(diào)將大鼠輸精管結(jié)扎，引起附睪中精子堆積而發(fā)生炎癥感染時，附睪頭部BinlbmRNA比結(jié)扎前增加約3倍，而在尾部則無任何改變(如圖7C)。這表明，Binlb的表達(dá)受炎癥上調(diào)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的天然抗菌肽、其編碼序列及用途(iii)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度385bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGACACCCAG TCATCAGTCA CATCTGCTTT CCTGCACAGA GAGAGCGCCA TAAAACATGA60AGGTTTTGTT ACTCTTTGCT GTTTTCTTCT GCTTGGTCCA AAGAAACTCA GGGGACATAC120CACCTGGAAT CAGAAACACC GTGTGCTTCA TGCAGCGGGG CCACTGTAGG CTCTTCATGT180GCCGTTCTGG GGAGAGAAAG GGGGATATTT GCTCTGACCC CTGGAACAGA TGCTGCGTAT240CCAGTTCCAT TAAAAACAGA TGATAGAAGA CTCATTGGAA GATCTGAGAT GTGGGGTGCA300AGCTCTTGGA AGCTAGAGAC CTGGAAGCAC CCCAAAGGCT TTGAGTATGT GTGGCTAATG360GTGCGTGCTC AATAAACACT TGCTG 385(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度68個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MKVLLLFAVF FCLVQRNSGD IPPGIRNTVC FMQRGHCRLF MCRSGERKGD 50ICSDPWNRCC VSSSIKNR68(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度45個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO3GIRNTVCFMQ RGHCRLFMCR SGERKGDICS DPWNRCCVSS SIKNR 45(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度1696堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GGACACCCAG TCATCAGTCA CATCTGCTTT CCTGCACAGA GAGAGCGCCA TAAAACATGA 60AGGTTTTGTT ACTCTTTGCT GTTTTCTTCT GCTTGGTCCA AAGAAACTCA Ggtaaatgtc 120ttctgagtag ccctggagaa ggcaggatgc ccttttaggt ttgtagacca cattgaggtg 180tgtccaggta tcaacattgg gcacagatgg tgggccactc tggggctcag ggtcggacca 240ctttcctaac gaagaggttt tattttgatt tttttttgtt tgttcatttg tcaagagttg 300caaattttac agcacggaga cacagaggcc tatattctcc attgtgaata agaaggtctg 360attgtaactt gagagtttat tcaggacaga attacagccg tacctgtgtc aaaagtgtaa 420ttttactgcc tcgctgtgag cagagaaggt gttcacattt atgccccttc cctacccatt 480acatccacag aacaccagat gtatgcttta aatgaatttt caaatgagag aaaaataggt 540tcctttaaga aagctagagt ccaggtcctg aagccttgaa ttgctggcag ttctgtcaag 600gtggactaca cccacatctc catgaacctt cccaaccatg gtaaaccgga tgaacacagt 660atcacaaatc agtccccagc tgaagtccgg ctattgcagg agaccagttt cctaaatgtt 720acaggcatag gttgggccgc tgttgctttt taacacaggg tgtgcaacat tgttaaaaag 780gtttttttta accatctctt tcccatggtg ctttcttttg ggggactcta gttgtttttg 840ttttgtttta ttgttttact tagaaggaca cacaagacac attgttatct ttcttcttct 900tattgtagtc ataagagtga aaacccaacc atgagctgag acagacccgc tcctaacttt 960tctatggcct gagacccagc tcctgttatt ctgttctgtt ttctttttct tttttaattt 1020atttatttta tgtatgtgag tacagtgtca ctgtcttcag acacaccaga agagggtgtc 1080agatcccatt acagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggaattga actcgggacc 1140tctggaagag cagtcagtgc tcttaaccgc tgagccatct ttccagcccc tgttctgttt 1200tcttaaatac cactccccca ctccacaatg tacctctatc tctgggcagc tgcagagccc 1260tggcctgcaa tgggctaggt gacttcacac tcagtctgtc atgccatccc cgaaacacca 1320cgagatataa atggttgcta ttgaaagcta aggaggaaaa tctcagtgac gccgaaactc 1380tggaagagtg gagcagattc ttcgagaggg gctgggggct gggggctggg ggctggagcc 1440actgttttat ctcagtctgt tgtttccaca gGGGACATAC CACCTGGAAT CAGAAACACC 1500GTGTGCTTCA TGCAGCGGGG CCACTGTAGG CTCTTCATGT GCCGTTCTGG GGAGAGAAAG 1560GGGGATATTT GCTCTGACCC CTGGAACAGA TGCTGCGTAT CCAGTTCCAT TAAAAACAGA 1620TGATAGAAGA CTCATTGGAA GATCTGAGAT GTGGGGTGCA AGCTCTTGGA AGCTAGAGAC1680CTGGAAGCAC CCCAAA1696(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AATGGTACCG TGACGTGGTC C 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGCCCCGCT GCATGAAGCA C21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GGACACCCAG TCATCAGTCA 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CAGCAAGTGT TTATTGAGCA 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9GGACACCCAG TCATCAGTCA CAT 23(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTGGGGTGC TTCCAGGTCT CT2權(quán)利要求
1.一種分離或純化的多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列。
3.一種分離或純化的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼SEQ ID NO2或3所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種具有Binlb蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)Binlb蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有Binlb蛋白活性的多肽。
8.一種能與權(quán)利要求1所述的Binlb蛋白特異性結(jié)合的抗體。
9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種殺菌劑，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求1所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Binlb蛋白,以及編碼Binlb蛋白的多核苷酸。Binlb蛋白不僅是天然抗菌肽,而且還與精子成熟等有關(guān)。本發(fā)明還公開了該Binlb蛋白及其核酸的制法和用途。此Binlb蛋白用于治療多種疾病如泌尿生殖系統(tǒng)感染等。本發(fā)明還提供了含Binlb蛋白的藥物組合物。
文檔編號C07K14/47GK1367180SQ0110528
公開日2002年9月4日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月22日
發(fā)明者張永蓮, 陳小章, 李鵬, 何彬, 蘇兆祥, 鐘耀華, 商權(quán), 張友端 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所