專利名稱：Reg－結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與Reg蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)，其基因，以及該蛋白質(zhì)和基因的生產(chǎn)和用途。
背景技術(shù)：
胰島β細(xì)胞能產(chǎn)生活體中唯一的血液降血糖因子—胰島素。迄今為止，人們一直認(rèn)為一旦胰β細(xì)胞的數(shù)目因一些損害而減少，這些細(xì)胞不能容易地再生和增殖。據(jù)認(rèn)為這是引起糖尿病發(fā)作的重要因素，也是無(wú)法基于病因根治糖尿病的原因所在。
通常，通過(guò)施用胰島素或口服磺酰脲型抗-糖尿病藥物來(lái)治療糖尿病。然而，施用胰島素僅為癥狀療法，仍難以維持血液胰島素的生理濃度。此外，當(dāng)考慮到治療糖尿病并發(fā)癥，如動(dòng)脈硬化，神經(jīng)病和進(jìn)行性視網(wǎng)膜病時(shí)，該療法具有其局限性。另外，長(zhǎng)期使用口服抗-糖尿病藥物可導(dǎo)致副作用，如冠狀動(dòng)脈硬化，或者，據(jù)認(rèn)為胰腺負(fù)擔(dān)過(guò)重會(huì)導(dǎo)致其分泌胰島素的能力降低。
本發(fā)明人以前曾闡明胰β-細(xì)胞損害的機(jī)理及其預(yù)防(H.Yamamoto等，自然294，284(1981)；Y. Uchigata等，生物化學(xué)雜志，257，6084(1982)；Y.Uchigata等，糖尿病32，316(1983)；H. Okamoto，生物測(cè)定法2，15(1985)；H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999))。此外，本發(fā)明人已成功再生和培養(yǎng)出胰β-細(xì)胞(T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994)；Yonemura，Y等，(1984)糖尿病33，401-404)，并分離出再生期間特異性表達(dá)的基因，即Reg(再生基因)(H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313；KTerazono等，糖尿病學(xué)33，250(1990)；T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994))。另外，本發(fā)明人闡明Reg基因的基因產(chǎn)物Reg蛋白是胰β-細(xì)胞的再生增殖因子，并使用糖尿病模型動(dòng)物證實(shí)了通過(guò)施用Reg蛋白，激活Reg基因或?qū)隦eg基因來(lái)治療糖尿病的可能性(Watanabe，T等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589-3592；Gross，D.J等(1998)內(nèi)分泌學(xué)139，2369-2374；Okamoto，H.(1999)分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74-79)。從這些分析中發(fā)現(xiàn)施用Reg蛋白可誘導(dǎo)β-細(xì)胞的再生和增殖，從而增加β-細(xì)胞的量，并改善90％切除胰腺的大鼠和非-肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病。然而，仍不知道何種蛋白質(zhì)與Reg蛋白相互作用以發(fā)揮其功能。
希望能將Reg蛋白作為胰β-細(xì)胞的增殖因子用于治療糖尿病，以補(bǔ)償施用胰島素的弱點(diǎn)。然而，當(dāng)將其用于臨床時(shí)，仍存在很多技術(shù)問(wèn)題，例如由于Reg蛋白的分子量大，因此難以口服該蛋白，另外，也難以在體內(nèi)靶向高-分子量的蛋白質(zhì)。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與Reg蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)，其基因，以及所述蛋白質(zhì)和基因的生產(chǎn)方法和用途。特別地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于開發(fā)新的糖尿病治療藥物。
為了分析Reg蛋白對(duì)胰β細(xì)胞-譜系細(xì)胞所起的作用，本發(fā)明人進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其中在大鼠胰島瘤細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系RINm5F中加入在酵母中產(chǎn)生的重組Reg蛋白。結(jié)果揭示出加入Reg蛋白能使RINm5F細(xì)胞中5’-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)的摻入顯著增加，Reg蛋白促進(jìn)了這些細(xì)胞的增殖。接著，本發(fā)明人用125I標(biāo)記Reg蛋白，并將其加入RINm5F細(xì)胞中以分析結(jié)合活性。結(jié)果，觀察到Reg蛋白與RINm5F細(xì)胞依賴于濃度的結(jié)合，據(jù)認(rèn)為此結(jié)合是特異性的，因?yàn)檫^(guò)量的未經(jīng)標(biāo)記的Reg蛋白可抑制這種結(jié)合。這些結(jié)果表明胰β細(xì)胞表達(dá)Reg蛋白受體，此受體與Reg蛋白的結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖。
為了分離具有Reg蛋白受體功能的Reg-結(jié)合蛋白，本發(fā)明人用噬菌體載體構(gòu)建了大鼠胰島polyA(+)RNA的表達(dá)cDNA文庫(kù)，并使用經(jīng)標(biāo)記的Reg蛋白，通過(guò)West-Western印跡法篩選出編碼Reg-結(jié)合蛋白的基因。結(jié)果，成功地分離出一種新的cDNA，其編碼含有364個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。將該cDNA插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞-表達(dá)載體，并在COS-7細(xì)胞中表達(dá)。在這些細(xì)胞中加入重組Reg蛋白，證實(shí)Reg蛋白與COS-7細(xì)胞特異性結(jié)合。
本發(fā)明人使用該cDNA為探針篩選大鼠胰島cDNA文庫(kù)，成功分離出另一種編碼Reg-結(jié)合蛋白的cDNA。該cDNA編碼含有919個(gè)氨基酸的細(xì)胞表面蛋白。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)該cDNA時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)于細(xì)胞表面，細(xì)胞與Reg蛋白以高親和力結(jié)合。加入Reg蛋白能誘導(dǎo)BrdU摻入至被該cDNA轉(zhuǎn)染的RINm5Fβ細(xì)胞，使細(xì)胞數(shù)目增加。由這些結(jié)果可以證實(shí)分離的cDNA編碼的Reg-結(jié)合蛋白是Reg蛋白的受體，它能介導(dǎo)胰β細(xì)胞中的細(xì)胞增殖信號(hào)。另外，還揭示出通過(guò)加入高濃度的Reg蛋白，可在大量表達(dá)Reg-結(jié)合蛋白的RINm5F細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
由這些事實(shí)可以設(shè)想Reg-結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)Reg蛋白的信號(hào)，并通過(guò)調(diào)節(jié)例如胰β細(xì)胞的細(xì)胞增殖，來(lái)調(diào)節(jié)胰β細(xì)胞的量。本發(fā)明的Reg-結(jié)合蛋白及其基因可成為闡明糖尿病發(fā)病機(jī)理的有用工具，并且也可用于開發(fā)抗-糖尿病藥物。
本發(fā)明涉及Reg蛋白-結(jié)合蛋白，其基因，生產(chǎn)該蛋白質(zhì)和基因的方法，以及它們的用途，本發(fā)明更具體地涉及(1)根據(jù)(a)至(i)中任一項(xiàng)的DNA，(a)編碼含有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)含有SEQ ID NO1之核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA，(c)編碼含有將SEQ ID NO2的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(d)與含有SEQ ID NO1之核苷酸序列的DNA雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(e)編碼含有SEQ ID NO4之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(f)含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA，(g)編碼含有將SEQ ID NO4的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(h)與含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的DNA雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(i)編碼含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的部分肽的DNA；(2)由根據(jù)(1)的DNA編碼的蛋白質(zhì)或肽；(3)插入根據(jù)(1)的DNA的載體；(4)攜有根據(jù)(3)的載體的宿主細(xì)胞；(5)生產(chǎn)根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)(4)的細(xì)胞，和(b)從經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液中回收細(xì)胞所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)；(6)抗根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽的抗體；(7)含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸與選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3的DNA或與其互補(bǔ)的DNA雜交；(8)篩選能與根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)使蛋白質(zhì)或肽與受試樣品接觸，(b)檢測(cè)受試樣品與蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合，和(c)選擇與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物；(9)篩選能抑制Reg蛋白與根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽接觸，(b)檢測(cè)Reg蛋白與根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合，和(c)選擇能減弱結(jié)合的化合物；(10)通過(guò)根據(jù)(9)的方法分離的化合物，其中所述化合物抑制Reg蛋白與根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合；(11)篩選能對(duì)(2)的蛋白質(zhì)的激活所致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行促進(jìn)或抑制的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與在細(xì)胞表面表達(dá)根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，(b)檢測(cè)細(xì)胞在應(yīng)答Reg蛋白的刺激時(shí)的改變，(c)選擇與缺乏受試樣品時(shí)所作的檢測(cè)相比，能增強(qiáng)或抑制所述細(xì)胞改變的化合物；(12)根據(jù)(11)的方法，其中所述細(xì)胞改變包括細(xì)胞-增殖活性或細(xì)胞DNA-合成活性的改變；
(13)通過(guò)根據(jù)(11)或(12)的方法分離的化合物，其中所述化合物能促進(jìn)或抑制由激活根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)所致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；(14)一種藥劑，其含有根據(jù)(1)的DNA，根據(jù)(2)的蛋白質(zhì)或肽，根據(jù)(3)的載體，根據(jù)(6)的抗體，或根據(jù)(10)或(13)的化合物；(15)根據(jù)(14)的藥劑，其中所述藥劑選自Reg-結(jié)合劑，Reg蛋白應(yīng)答細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑，DNA合成調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑；和(16)根據(jù)(14)或(15)的藥劑，其中所述藥劑是抗-糖尿病藥物。
本發(fā)明涉及一種在胰腺中表達(dá)的，與Reg蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)(Reg-結(jié)合蛋白)。分離的大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”的cDNA的核苷酸序列和由這些cDNA編碼的氨基酸序列分別描述于SEQ ID NO1和SEQ ID NO3，以及SEQ IDNO2和SEQ ID NO4。
一種編碼本發(fā)明的大鼠Reg-結(jié)合蛋白(SEQ ID NO2)的cDNA含有開放閱讀框，其編碼含有364個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)。通過(guò)使用該cDNA為探針進(jìn)行篩選，可分離出編碼大鼠Reg-結(jié)合蛋白的cDNA，所述cDNA含有開放閱讀框(SEQ ID NO3)，其編碼含有919個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。本發(fā)明的大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”在細(xì)胞表面表達(dá)，并具有Reg蛋白-結(jié)合活性。如上所述，Reg蛋白是胰腺β細(xì)胞再生時(shí)特異性表達(dá)的再生增殖因子，已有人提出應(yīng)用該蛋白質(zhì)及其基因治療糖尿病的可能性。據(jù)認(rèn)為本發(fā)明的Reg-結(jié)合蛋白涉及通過(guò)作為Reg蛋白的受體起作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，包括對(duì)胰腺β細(xì)胞進(jìn)行增殖調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明的Reg-結(jié)合蛋白可用作研究的靶，來(lái)闡明導(dǎo)致糖尿病的機(jī)理，或者可用作工具，用于開發(fā)針對(duì)涉及胰腺β細(xì)胞功能之疾病(如糖尿病)的治療劑。
最近，已分離出幾種Reg和Reg-相關(guān)基因，已揭示出這些基因構(gòu)成一個(gè)多基因家族，Reg家族(H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝膽胰腺外科學(xué)雜志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化學(xué)雜志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；M.Abe等，基因246，111(2000))。Reg家族的所有成員都顯示出6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子的保守基因排列，和家族成員之間40-85％的氨基酸序列同源性，保守的6個(gè)半胱氨酸殘基形成3對(duì)分子內(nèi)S-S鍵(H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝膽胰腺外科學(xué)雜志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化學(xué)雜志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；T.Itoh等，F(xiàn)EBS Lett，272，85(1990)；M.Abe等，基因246，111(2000))。根據(jù)Reg蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，將該家族的成員分成3個(gè)亞類，I，II和III型(H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝膽胰腺外科學(xué)雜志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化學(xué)雜志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；T.Watanabe等，生物化學(xué)雜志，265，7432(1990)；M.Abe等，基因246，111(2000))。I型Reg蛋白包括本發(fā)明實(shí)施例中所用的大鼠和人Reg蛋白，它們?cè)谠偕囊葝u中表達(dá)(H. Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病學(xué)33，250(1990)；H.Okamoto，肝膽胰腺外科學(xué)雜志，6，254(1999))。最近，已在人結(jié)腸癌(T.Watanabe等，生物化學(xué)雜志，265，7432(1990)；M.E.Zenilman等，胃腸道外科學(xué)雜志，1，194(1997)；F.R.Bernard-Perrone等，組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，47，863(1999))，大鼠胃粘膜(H.Fukui等，胃腸病學(xué)115，1483(1998))和腸嗜鉻樣細(xì)胞(M.Asahara等，胃腸病學(xué)111，45(1996))中發(fā)現(xiàn)I型Reg在病理性條件下的表達(dá)，也有人提出III型Reg蛋白參與腸帕內(nèi)特(Paneth)細(xì)胞(L.Christa等，美國(guó)生理學(xué)雜志，271，G993(1996))，肝細(xì)胞癌(L.Christa等，美國(guó)生理學(xué)雜志，271，G993(1996))，胰腺腺泡細(xì)胞(L.Christa等，美國(guó)生理學(xué)雜志，271，G993(1996)；E.M.Ortiz等，胃腸病學(xué)114，808(1998))和施旺(Schwann)細(xì)胞(J.F.Livesey等，自然390，614(1997))中的細(xì)胞增殖。因此，所鑒定的Reg受體可在生理和病理?xiàng)l件下，在多種組織和細(xì)胞中作為Reg家族基因產(chǎn)物的受體起作用。
上述發(fā)現(xiàn)表明本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于開發(fā)治療劑，所述治療劑不僅可以治療和預(yù)防糖尿病，還可以治療和預(yù)防諸如胃腸道腫瘤(Asahara，M等，胃腸病學(xué)111，45-55(1996)；Fukui，H等，胃腸病學(xué)115，1483-1493(1998))，神經(jīng)變性病(Livesy，F(xiàn).J等，自然390，614-618(1997))和胰腺炎(Christa，L等，美國(guó)生理學(xué)雜志，271，G993-G1002(1996)；Ortiz，E等，胃腸病學(xué)114，808-816(1998))等疾病。另外，據(jù)認(rèn)為當(dāng)腫瘤中出現(xiàn)Reg蛋白-Reg-結(jié)合蛋白紊亂，例如過(guò)度刺激時(shí)，Reg蛋白自身可用于治療，因?yàn)槭┯每扇苄问降腞eg-結(jié)合蛋白可抑制過(guò)度刺激，從而抑制腫瘤增殖等。
本發(fā)明包括結(jié)構(gòu)與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”類似的蛋白質(zhì)，只要它們具有與Reg蛋白結(jié)合的活性即可。結(jié)構(gòu)類似的蛋白質(zhì)包括“Reg-結(jié)合蛋白”的突變體和得自其它生物體的“Reg-結(jié)合蛋白”。
本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如眾所周知的誘變方法可以容易地制備這些蛋白質(zhì)。改變蛋白質(zhì)中的氨基酸的已知方法包括Kunkel的方法(Kunkel，T.A(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,488)，寡核苷酸-定向雙琥珀(ODA)法(Hashimoto-Gotoh，T等(1995)基因152，271-275)，PCR-限制性酶法(Ito，W等(1991)基因102，67-70)，ODA-PCR法(Hashimoto-Gotoh，T等(1995)基因152，271-275；Ito，W等(1991)基因102，67-70)等。對(duì)蛋白質(zhì)中所改變的氨基酸殘基數(shù)目沒(méi)有限制，但是，當(dāng)進(jìn)行人工改變時(shí)，所改變的氨基酸殘基數(shù)目通常為50個(gè)或更少，優(yōu)選為10個(gè)或更少，更優(yōu)選為5個(gè)或更少。
蛋白質(zhì)中的氨基酸突變可以自發(fā)發(fā)生。本發(fā)明也包括下述蛋白質(zhì)，只要它們具有與Reg蛋白結(jié)合的活性即可，所述蛋白質(zhì)具有因人工或自發(fā)地取代，缺失，添加和/或插入氨基酸而與天然大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”有所不同的氨基酸序列。
優(yōu)選使用與被取代的氨基酸特性類似的氨基酸進(jìn)行取代。例如，由于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe和Trp被歸類為非-極性氨基酸，可以認(rèn)為它們具有類似的特性。另外，不帶電的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。另外，酸性氨基酸包括Asp和Glu，而堿性氨基酸包括Lys，Arg和His。
在本發(fā)明中，大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”的氨基酸有缺陷的蛋白質(zhì)包括僅含有胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。另外，除含有大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”之外，還含有其它氨基酸的蛋白質(zhì)包括大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”和另一種肽的融合蛋白。
使用已知的雜交技術(shù)(Sambrook，J等，(1989)分子克隆第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(Sambrook，J等，(1989)分子克隆第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社；Innis，M.A等，PCR方法，Academic出版社(1990))，即可制備與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”結(jié)構(gòu)類似，且具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)。即，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地將大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”cDNA(SEQ ID NO1或3)或其部分用作探針，將與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”cDNA特異性雜交的寡核苷酸用作引物，從多種其它生物體中分離出與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”cDNA高度同源的DNA，再由分離的DNA獲得與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”結(jié)構(gòu)類似的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中包括與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”cDNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)，只要它具有與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”結(jié)合的活性即可。其它可用于分離所述蛋白質(zhì)的生物體包括例如人，猴，小鼠，兔，山羊，牛，豬，狗等，但并不局限于此。據(jù)認(rèn)為這些生物體的胰島β細(xì)胞是分離編碼所述蛋白質(zhì)的DNA的適當(dāng)來(lái)源。
得自除大鼠外的生物體的，編碼“Reg-結(jié)合蛋白”的DNA通常與大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”的cDNA序列(SEQ ID NO1或3)高度同源。“高度同源”指的是在核苷酸序列水平上具有至少60％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選90％或更高，甚至更優(yōu)選95％或更高，最優(yōu)選99％或更高的序列同一性。通過(guò)FASTA(用寬范圍的序列相似性搜索某個(gè)序列)，BLAST(用局部的高相似性搜索某個(gè)序列)和SSEARCH(利用Smith-Waterman算法進(jìn)行搜索)，即可測(cè)定序列同源性。進(jìn)入眾所周知的數(shù)據(jù)庫(kù)和站點(diǎn)，例如日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)，即可使用這些程序。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇雜交條件，用以使用大鼠“Reg-結(jié)合蛋白”cDNA，從除大鼠外的生物體中分離出編碼與“Reg-結(jié)合蛋白”功能等同的蛋白質(zhì)的cDNA。例如，可在42℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鮭(鯡)精DNA和10％甲酰胺溶液進(jìn)行雜交(低度-嚴(yán)緊條件)。優(yōu)選在42℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鮭(鯡)精DNA和30％甲酰胺溶液進(jìn)行雜交(中度-嚴(yán)緊條件)。更優(yōu)選在50℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鮭(鯡)精DNA和50％甲酰胺溶液進(jìn)行雜交(高度-嚴(yán)緊條件)。在此情況下，盡管據(jù)認(rèn)為包括溫度，甲酰胺濃度，鹽濃度等的幾個(gè)因素影響雜交的嚴(yán)緊度，但本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)選擇這些因素可以達(dá)到類似的嚴(yán)緊度。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可被制備成天然蛋白質(zhì)，或者可以利用基因重組技術(shù)將其制備成重組蛋白質(zhì)。通過(guò)例如按下文所述，將據(jù)認(rèn)為可表達(dá)“Reg-結(jié)合蛋白”的組織(例如胰島β細(xì)胞)提取物上樣至使用抗“Reg-結(jié)合蛋白”之抗體的親和層析，即可制備出天然蛋白質(zhì)。另一方面，通過(guò)按下文所述，培養(yǎng)用編碼“Reg-結(jié)合蛋白”的DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使轉(zhuǎn)化子表達(dá)該蛋白，并回收該蛋白即可制備出重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明包括本發(fā)明蛋白質(zhì)的部分肽。本發(fā)明蛋白質(zhì)的部分肽的例子為相當(dāng)于Reg蛋白-結(jié)合位點(diǎn)的肽。通過(guò)給活體施用本發(fā)明的部分肽，可將其用作本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或拮抗劑，或Reg蛋白的拮抗劑等。這種部分肽可用作由本發(fā)明蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活劑或抑制劑。另外，本發(fā)明的部分肽包括本發(fā)明蛋白質(zhì)N-末端區(qū)域或C-末端區(qū)域的部分肽，這些肽可用于制備抗體。含有特異于本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分多肽具有至少7個(gè)，優(yōu)選為至少8個(gè)，更優(yōu)選為至少9個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)例如基因工程技術(shù)，已知的肽合成方法，或者通過(guò)用適當(dāng)?shù)碾拿噶呀獗景l(fā)明的蛋白質(zhì)，即可制備本發(fā)明的部分肽。例如，可使用含有與Reg蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的部分肽來(lái)結(jié)合Reg蛋白。所述部分肽可用作Reg蛋白-結(jié)合劑。
本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA。對(duì)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA沒(méi)有特別的限制，只要它能編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)即可，所述DNA包括cDNA，基因組DNA和合成的DNA。本發(fā)明還包括具有基于遺傳密碼簡(jiǎn)并性的任何核苷酸序列的DNA，只要它能編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)即可。
通過(guò)例如用32P等標(biāo)記SEQ ID NO1或3的cDNA或其片斷，與它們互補(bǔ)的RNA，或含有部分cDNA序列的合成寡核苷酸，并使它們與得自表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的組織(如胰腺等)的cDNA文庫(kù)雜交，可以篩選出編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的cDNA。另外，通過(guò)合成對(duì)應(yīng)于cDNA核苷酸序列的寡核苷酸，并以得自適當(dāng)組織(如胰腺等)的cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)上述寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，也可克隆出所述cDNA。通過(guò)例如用32P等標(biāo)記SEQ ID NO1或3的cDNA或其區(qū)斷，與它們互補(bǔ)的RNA，或含有部分cDNA序列的合成寡核苷酸，并使它們與基因組DNA文庫(kù)雜交，可以篩選出基因組DNA?；蛘?，通過(guò)合成對(duì)應(yīng)于這些cDNA的核苷酸序列的寡核苷酸，并以基因組DNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)上述寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，也可克隆出基因組DNA。另一方面，通過(guò)例如化學(xué)合成含有SEQ ID NO1或3的cDNA部分序列的寡核苷酸，使它們退火以形成雙鏈，并用DNA連接酶使它們相互連接，即可制備合成DNA。
這些DNA可用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。即通過(guò)將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA(例如SEQ ID NO1或3)插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，用該載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并回收表達(dá)的蛋白質(zhì)，即可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)制備成重組蛋白質(zhì)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)之后，可將其制備成純化的或粗的蛋白質(zhì)，或者制備成與膜-結(jié)合的形式。
特定宿主-載體系統(tǒng)的例子是大腸桿菌-pGEX系統(tǒng)(Amer-sham PharmaciaBiotech；表達(dá)成GST-融合蛋白)，大腸桿菌-pHB6系統(tǒng)和pVB6系統(tǒng)(Rochediagnostics；表達(dá)成6×His-融合蛋白)，大腸桿菌-pMAL系統(tǒng)(New EnglandBiolabs；表達(dá)成與麥芽糖-結(jié)合蛋白的融合蛋白)，大腸桿菌-pTYB系統(tǒng)(NewEngland Biolabs；表達(dá)成與內(nèi)蛋白子(Intein)的融合蛋白(在DTT的存在下可消化Intein部分，便于僅純化目的蛋白質(zhì)))，畢赤氏酵母-pPIC系統(tǒng)和pGAP系統(tǒng)(Invitrogen)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS7)-pCI-neo系統(tǒng)(Promega)和pHook系統(tǒng)(Invitrogen)等。
可通過(guò)以下方法將載體導(dǎo)入宿主，如眾所周知的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或電穿孔大腸桿菌，轉(zhuǎn)化用畢赤氏酵母Easy Comp試劑盒制備的感受態(tài)細(xì)胞(參見實(shí)施例1)或電穿孔畢赤氏酵母，電穿孔或眾所周知的使用陽(yáng)離子脂質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的方法等。
可通過(guò)已知方法純化宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。通過(guò)鎳柱或谷胱甘肽Sepharose凝膠柱等可以純化以融合蛋白的形式表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如具有組氨酸殘基標(biāo)記物或N-末端結(jié)合有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的蛋白質(zhì)。
也可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA用于基因治療，以治療由所述DNA的突變引起的疾病。例如，可使用病毒載體，例如痘苗病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療。實(shí)際的治療方法是在培養(yǎng)條件下，使用這些重組病毒將“Reg-結(jié)合蛋白”導(dǎo)入例如用于移植的胰腺或胰島，并進(jìn)行移植。這將會(huì)通過(guò)增殖胰腺β細(xì)胞來(lái)改善移植的治療效果，并能有效使用移植器官。
本發(fā)明還涉及含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，所述核苷酸能與含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA或其互補(bǔ)DNA雜交。所述多核苷酸優(yōu)選與含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA特異性雜交，并含有至少15個(gè)核苷酸?！疤禺愋噪s交”指的是在正常雜交條件下，優(yōu)選在上述中度-嚴(yán)緊雜交條件下，更優(yōu)選在上述高度-嚴(yán)緊雜交條件下，未觀察到與編碼其它蛋白質(zhì)的DNA的顯著交叉雜交。可在上述條件下進(jìn)行雜交。這些多核苷酸包括探針和引物，核苷酸或核苷酸衍生物(例如反義寡核苷酸和核酶)，它們可與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或與該DNA互補(bǔ)的DNA特異性雜交。
可使用含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的cDNA或其部分序列的寡核苷酸克隆編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因或cDNA，或使用所述寡核苷酸通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。另外，所述寡核苷酸還可用于檢測(cè)和定量編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA。另外，可使用所述寡核苷酸通過(guò)諸如限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)的方法檢測(cè)突變，多態(tài)性或疾病(如基因診斷)。
本發(fā)明的多核苷酸可用于胰腺檢測(cè)，例如胰腺β細(xì)胞檢測(cè)，因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)在形成，再生和/或維持胰腺，尤其是調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞的量的方面具有重要功能。另外，本發(fā)明的多核苷酸可用于糖尿病檢測(cè)。例如，從受試者體內(nèi)分離胰腺組織樣品，通過(guò)諸如Northern雜交，RT-PCR或DNA芯片(DNA微列陣)的方法檢查這些組織中本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)水平的異常。另外，通過(guò)序列分析，SSCP，RFLP等可檢測(cè)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或RNA中是否存在突變或多態(tài)性。當(dāng)使用多核苷酸作為檢測(cè)試劑時(shí)，可將其與無(wú)菌水，緩沖液，鹽等適當(dāng)混合。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA，和其中已插入該DNA的載體可用于按下述方法來(lái)篩選能抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與Reg蛋白結(jié)合的化合物。它們也可用于篩選能促進(jìn)或抑制通過(guò)激活本發(fā)明蛋白質(zhì)而刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如細(xì)胞增殖活性或細(xì)胞的DNA-合成活性)的化合物。這些篩選可用于分析由胰腺β細(xì)胞的量或功能紊亂所導(dǎo)致疾病，包括糖尿病的治療劑或預(yù)防藥物。除糖尿病外，這些篩選也可用于分析或篩選胃腸腫瘤，神經(jīng)變性疾病，胰腺炎和其它腫瘤的治療劑或預(yù)防藥物。
另外，本發(fā)明涉及與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體包括多克隆和單克隆抗體。通過(guò)使用眾所周知的方法(Harlow，E和Lane，D，抗體，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)等)，將上述制備自生物材料(例如胰島)的“Reg-結(jié)合蛋白”，通過(guò)宿主-載體系統(tǒng)產(chǎn)生的重組“Reg-結(jié)合蛋白”等，或通過(guò)常規(guī)肽合成方法合成的部分肽用作抗原，免疫兔，山羊，綿羊等，即可制備多克隆抗體。通過(guò)使用眾所周知的方法(Harlow，E和Lane，D，抗體，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)等)，將上述制備自生物材料(例如胰島)的“Reg-結(jié)合蛋白”，通過(guò)宿主-載體系統(tǒng)產(chǎn)生的重組“Reg-結(jié)合蛋白”等，或通過(guò)常規(guī)肽合成方法合成的部分肽用作抗原，免疫小鼠，大鼠等，并使用小鼠，大鼠等的脾細(xì)胞獲得能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，即可制備單克隆抗體。
通過(guò)常規(guī)的生物化學(xué)方法，例如硫酸銨分級(jí)分離，G蛋白Sepharose柱，或固相化抗原親和柱，從血清中純化多克隆抗體，從雜交瘤的培養(yǎng)物上清液或接種了雜交瘤的動(dòng)物的腹水中純化單克隆抗體。
將如此制備的抗體用于親和純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或者用于檢測(cè)和診斷由本發(fā)明蛋白質(zhì)的異常表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的疾病，以及用于檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。具體地說(shuō)，例如，從組織或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，通過(guò)Western印跡，免疫沉淀，ELISA等檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，籍此檢測(cè)和/或診斷表達(dá)或結(jié)構(gòu)的異常。本發(fā)明的抗體也可用于胰腺檢測(cè)，例如胰腺β細(xì)胞檢測(cè)。另外，本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)糖尿病。例如，從受試者體內(nèi)分離胰腺組織樣品，通過(guò)Western印跡，免疫組化，ELISA，EIA等方法檢測(cè)所述組織中本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)水平或結(jié)構(gòu)的異常。當(dāng)使用抗體作為檢測(cè)試劑時(shí)，可將其與無(wú)菌水，緩沖液，鹽，穩(wěn)定劑，防腐劑等適當(dāng)混合。另外，本發(fā)明的抗體也可用于抗體治療。當(dāng)使用本發(fā)明的抗體進(jìn)行抗體治療時(shí)，優(yōu)選使用人源化抗體或人抗體。此時(shí)，使人淋巴細(xì)胞與HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)-缺陷型小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，使用HAT培養(yǎng)基選擇人-小鼠異源雜交瘤。通過(guò)眾所周知的RIA或ELISA法(其中將“Reg-結(jié)合蛋白”用作抗原)選擇骨髓瘤細(xì)胞，獲得能產(chǎn)生Reg結(jié)合蛋白的人源化單克隆抗體的克隆。按上述進(jìn)行抗體的純化。
本發(fā)明還涉及篩選能與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法?？赏ㄟ^(guò)包括下列步驟的方法進(jìn)行篩選(a)使本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽與受試樣品接觸，(b)檢測(cè)受試樣品與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽的結(jié)合，和(c)選擇能與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合的化合物。
可根據(jù)篩選方法，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)以純化的蛋白質(zhì)，細(xì)胞表面-表達(dá)的形式，或細(xì)胞膜組分的形式用于篩選。
可使用的受試樣品包括例如細(xì)胞提取物，基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。必要時(shí)，在使用前可標(biāo)記篩選所用的受試樣品。標(biāo)記物包括例如放射性標(biāo)記和熒光標(biāo)記等，但并不局限于此。
通過(guò)例如將有望表達(dá)與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，或細(xì)胞提取物上樣于固定有本發(fā)明蛋白質(zhì)的親和柱，并通過(guò)純化與該柱特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，即可篩選出與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)。
另外，可根據(jù)“West-Western印跡法”等進(jìn)行篩選，其中由有望表達(dá)與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞(例如胰腺β細(xì)胞)通過(guò)噬菌載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)，然后，在瓊脂糖上表達(dá)所述文庫(kù)，將表達(dá)的蛋白質(zhì)固定于濾膜上，并與經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明蛋白質(zhì)反應(yīng)，以檢測(cè)表達(dá)結(jié)合蛋白的噬斑。另一種方法是“雙-雜種系統(tǒng)”，其中GAL4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域被表達(dá)成本發(fā)明蛋白與受試蛋白的融合蛋白，通過(guò)表達(dá)報(bào)道基因即可檢測(cè)本發(fā)明蛋白質(zhì)與受試蛋白質(zhì)的結(jié)合，所述報(bào)道基因與具有GAL4-DNA結(jié)合蛋白之結(jié)合序列的啟動(dòng)子的下游相連接。
另外，使固定化的本發(fā)明蛋白質(zhì)與合成的化合物，天然產(chǎn)物庫(kù)，或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)反應(yīng)從而篩選結(jié)合蛋白的方法，和通過(guò)使用高-物料流通量系統(tǒng)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選，分離出與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)。
另外，還例舉了使用BIACORE(Biacore)的篩選方法，或通過(guò)使用微型生理計(jì)(Molecular Device)等監(jiān)測(cè)被強(qiáng)制表達(dá)本發(fā)明Reg-結(jié)合蛋白的培養(yǎng)細(xì)胞的酸分泌速度變化的方法。
另外，本發(fā)明還涉及篩選能抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與Reg蛋白結(jié)合的化合物的方法，可通過(guò)包括下列步驟的方法進(jìn)行篩選(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸，(b)檢測(cè)Reg蛋白與本發(fā)明蛋白的結(jié)合，和(c)選擇能減弱該結(jié)合的化合物。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以純化的蛋白質(zhì)，細(xì)胞表面-表達(dá)的形式，或細(xì)胞膜組分的形式用于篩選。Reg蛋白通常以純化蛋白質(zhì)的形式用于篩選。例如，人REG Iα或大鼠Reg I等可用作Reg蛋白?？蓪⑦@些蛋白質(zhì)制備成重組蛋白質(zhì)(參照實(shí)施例1)。必要時(shí)，可用放射性同位素，如[125I]標(biāo)記Reg蛋白。
關(guān)于受試樣品，可使用細(xì)胞提取液，基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。
例如，可按下述進(jìn)行篩選。在受試樣品的存在下，使表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞或使用所述細(xì)胞制備的膜組分與經(jīng)標(biāo)記的配體(Reg蛋白)接觸，測(cè)定與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記配體的量。選擇與缺乏受試樣品時(shí)相比，能減少配體量的化合物。使用上述BIACORE或微型生理計(jì)可測(cè)定本發(fā)明蛋白質(zhì)與Reg蛋白的結(jié)合。如此分離得到的化合物可以是本發(fā)明蛋白質(zhì)的候選拮抗劑或激動(dòng)劑。
另外，本發(fā)明還涉及篩選能對(duì)激活本發(fā)明的蛋白質(zhì)所致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行促進(jìn)或抑制的化合物的方法，可通過(guò)下列步驟進(jìn)行篩選(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與在表面表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，(b)檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)答Reg蛋白的刺激時(shí)的改變，(c)選擇與缺乏受試樣品時(shí)所作的檢測(cè)(對(duì)照)相比，能增強(qiáng)或抑制所述細(xì)胞改變的化合物。
通過(guò)將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA插入適當(dāng)表達(dá)載體，并將所述載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞，可以制備在其表面表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞。例如，諸如RINm5F細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS-7細(xì)胞等細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。關(guān)于載體，可使用pCI-neo(Promega)，pHook(Invitrogen)等。
關(guān)于受試樣品，可使用例如細(xì)胞提取液，基因文庫(kù)的表達(dá)產(chǎn)物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。另外，關(guān)于受試樣品，也可以使用按照與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合為所指示，通過(guò)上述篩選分離得到的化合物。
Reg蛋白通常以純化蛋白質(zhì)的形式用于篩選。例如，人REG Iα或大鼠Reg I等可用作Reg蛋白?？蓪⑦@些蛋白質(zhì)制備成重組蛋白質(zhì)(參照實(shí)施例1)。
在篩選中，檢測(cè)上述細(xì)胞在受試樣品的存在下，應(yīng)答Reg蛋白的刺激作出的改變。關(guān)于細(xì)胞應(yīng)答Reg蛋白刺激作出的改變包括例如細(xì)胞增殖活性的改變，DNA-合成活性的改變，細(xì)胞凋亡水平的改變，本發(fā)明蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的磷酸化，細(xì)胞中特定基因表達(dá)的改變等，但改變并不局限于此。
例如，如實(shí)施例中所述，可通過(guò)測(cè)定5’-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)的摻入來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的DNA合成。另外，通過(guò)在細(xì)胞中添加3H-胸苷，然后測(cè)定摻入的放射性也可進(jìn)行檢測(cè)。通常使用細(xì)胞的3H-胸苷摻入試驗(yàn)分析對(duì)DNA合成的促進(jìn)或抑制效果。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能處理相對(duì)大量的樣品，且敏感性高等。篩選能促進(jìn)或抑制DNA合成的化合物時(shí)，具體操作如下將細(xì)胞接種于多孔板上，保溫1-2天后，將培養(yǎng)基換成含有受試樣品的培養(yǎng)基，保溫一段時(shí)間，如24小時(shí)。隨后，例如，加入1μCi/ml3H胸苷。保溫后，除去培養(yǎng)基，洗滌，加入10％TCA，再將細(xì)胞放在冰塊上約20分鐘，用冰冷的5％TCA洗滌，然后用0.5N NaOH裂解細(xì)胞，在冰上放置10分鐘，加入1/2體積的1N HCl，小心混合，再加入40％TCA至終濃度為10％，并小心混合。在冰上放置20分鐘后，該溶液通過(guò)Whatman GF/C濾膜等過(guò)濾以收集不溶的物質(zhì)。用100％乙醇洗滌3次并干燥之后，使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。
另外，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目或集落數(shù)目，或通過(guò)加入諸如MTT或Alamar藍(lán)等染料測(cè)定依賴于細(xì)胞數(shù)目的顏色生成，可以測(cè)定細(xì)胞增殖。MTT法使用MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)所致的顏色生成來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖活性，由于與活細(xì)胞線粒體的呼吸鏈反應(yīng)，形成了MTT甲瓚。所生成的量反映了細(xì)胞數(shù)目。具體地說(shuō)，例如，細(xì)胞在96孔板中保溫，與受試樣品反應(yīng)，然后加入10μl 5mg/ml MTT溶液，保溫4小時(shí)。再加入100μl 0.04NHCl/異丙醇，充分混合，靜置幾分鐘。然后，在參照波長(zhǎng)為630nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm時(shí)，使用微滴板讀數(shù)儀測(cè)定顏色生成。另外，如實(shí)施例11所述，四唑鹽4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并]-1，3-苯二磺酸鹽(WST-1)可用于該分析。
例如，以核的形態(tài)學(xué)改變(核的凝聚或區(qū)段化)，染色體的片段化(序列梯的形成)等為指標(biāo)，可測(cè)定細(xì)胞凋亡。具體地說(shuō)，通過(guò)例如TUNEL法(Y.Gavrieli等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，119，493(1992))等可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡(參照實(shí)施例11)。
據(jù)認(rèn)為蛋白質(zhì)磷酸化出現(xiàn)在絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基中。通過(guò)用Western印跡法或使用抗-磷酸絲氨酸，抗-磷酸蘇氨酸或抗-磷酸酪氨酸抗體的免疫沉淀法測(cè)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，可以測(cè)定這些磷酸化變化。與細(xì)胞增殖-相關(guān)的蛋白質(zhì)，如MAP激酶家族，STAT家族或Fos-Jun家族蛋白質(zhì)有望被磷酸化，但并不局限于此。
已知上述蛋白質(zhì)磷酸化等可誘導(dǎo)或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄。使用報(bào)道基因可檢測(cè)依賴于本發(fā)明蛋白質(zhì)與其配體的結(jié)合的特定基因表達(dá)的變化。也即，通過(guò)檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)可測(cè)定表達(dá)的變化，其中報(bào)道基因與所述基因啟動(dòng)子的下游相連接。另外，通過(guò)檢測(cè)mRNA的Northern印跡或RT-PCR法，使用抗體檢測(cè)身為基因翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的方法，或檢測(cè)身為基因翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)活性的方法，也可以測(cè)定特定基因表達(dá)的變化。
通過(guò)這些篩選方法分離的化合物包括例如(1)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)或抑制其活性的化合物，(2)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體，如Reg蛋白等結(jié)合，并促進(jìn)或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的化合物，(3)與本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體結(jié)合，并促進(jìn)或抑制其激活的化合物，和(4)促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)所致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而表達(dá)出細(xì)胞變化的化合物。
所述化合物可用作本發(fā)明蛋白質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)紊亂所致疾病(例如由胰腺β細(xì)胞功能紊亂引起的疾病)的預(yù)防或治療劑。例如，這些化合物可用作糖尿病的治療劑。
當(dāng)用作治療劑時(shí)，本發(fā)明的DNA，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，含有本發(fā)明DNA的載體，抗本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的抗體，和通過(guò)上述篩選分離的化合物可以單獨(dú)使用，或者與其它化合物聯(lián)合使用。本發(fā)明的治療劑中包括試劑和藥物。
例如，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有與Reg蛋白結(jié)合的活性，因此可使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合Reg蛋白。所述蛋白質(zhì)或肽可用于檢測(cè)Reg蛋白，或用于親和純化。通過(guò)使本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽與Reg蛋白接觸，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽可與Reg蛋白結(jié)合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽可被純化或表達(dá)于細(xì)胞膜表面。它們也可與載體結(jié)合。對(duì)所結(jié)合的Reg蛋白的來(lái)源沒(méi)有限制，可以使用小鼠，大鼠或人Reg蛋白。另外，通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，可使編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的載體用于相同的目的。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼它們的DNA，或含有攜所述DNA之載體的治療劑可以是Reg蛋白-結(jié)合劑。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可作為Reg蛋白的受體起作用。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于調(diào)節(jié)(促進(jìn)或抑制)應(yīng)答Reg蛋白的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)激活本發(fā)明的蛋白質(zhì)，可促進(jìn)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，反過(guò)來(lái)，通過(guò)抑制激活，可阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，通過(guò)使表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO4)的細(xì)胞與本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體，如Reg蛋白或激動(dòng)劑接觸，可使本發(fā)明的蛋白質(zhì)被激活并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部。優(yōu)選細(xì)胞是胰腺β細(xì)胞譜系，上皮細(xì)胞等。另外，可使用與Reg蛋白結(jié)合，但不能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)來(lái)阻斷Reg蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可使用含有與Reg蛋白結(jié)合的區(qū)域，但不含將信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域的蛋白質(zhì)。通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)這種蛋白質(zhì)，或?qū)⑺鼈兲砑又涟?，可以阻斷Reg蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，也可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的載體用于相同的目的。另外，與本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合的抗體，或通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物也可用于相同的目的。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA，插入了所述DNA的載體，本發(fā)明的抗體，通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物是應(yīng)答Reg蛋白的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑(促進(jìn)劑，抑制劑等)。
應(yīng)答Reg蛋白的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的例子包括促進(jìn)細(xì)胞的DNA合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖(促進(jìn)或抑制)。即這表明可使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)抑制細(xì)胞的DNA合成，促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖。優(yōu)選靶細(xì)胞為胰腺β細(xì)胞譜系的細(xì)胞，上皮細(xì)胞等。通過(guò)使表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞與本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體(例如Reg蛋白)或激動(dòng)劑接觸以促進(jìn)DNA合成，即可促進(jìn)細(xì)胞增殖(或細(xì)胞分裂)。當(dāng)在細(xì)胞中外源表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，可將表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO4)的載體導(dǎo)入細(xì)胞。另外，可使用與Reg蛋白結(jié)合，但不能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)來(lái)抑制DNA合成或細(xì)胞增殖。例如，可使用含有與Reg蛋白結(jié)合的區(qū)域，但不含將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游的區(qū)域的蛋白質(zhì)。通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)這種蛋白質(zhì)，或?qū)⑺鼈兲砑又涟?，可以抑制DNA合成或細(xì)胞增殖。通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，也可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA，或插入了所述DNA的載體用于相同的目的。另外，與本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合的抗體，和通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物也可用于調(diào)節(jié)DNA合成或細(xì)胞增殖。例如，通過(guò)給活體施用作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體或激動(dòng)劑起作用的抗體或化合物，可促進(jìn)細(xì)胞(如胰腺β細(xì)胞)的增殖。給藥可以在體外和體內(nèi)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA，插入了所述DNA的載體，本發(fā)明的抗體，通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物可以是細(xì)胞的DNA合成或細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)劑(促進(jìn)劑或抑制劑)。
另外，通過(guò)激活本發(fā)明的蛋白質(zhì)而引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的例子還包括細(xì)胞凋亡。即本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制該誘導(dǎo)作用)。通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，也可將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA，或插入了所述DNA的載體用于相同的目的。另外，與本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分肽結(jié)合的抗體，和通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物也可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。優(yōu)選靶細(xì)胞為胰腺β細(xì)胞譜系的細(xì)胞，上皮細(xì)胞等。通過(guò)使表達(dá)高濃度的本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞與本發(fā)明蛋白質(zhì)的配體(例如Reg蛋白)接觸，可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞接觸的Reg蛋白的濃度高于100nM，優(yōu)選500nM或更高，更優(yōu)選1000nM或更高。當(dāng)在細(xì)胞中外源表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，可將表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NO4)的載體導(dǎo)入細(xì)胞。另外，可使用與Reg蛋白結(jié)合，但不能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)來(lái)抑制由Reg蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)這種蛋白質(zhì)，或?qū)⑺鼈兗又涟猓梢砸种萍?xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的載體，本發(fā)明的抗體，通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物可以是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑(誘導(dǎo)劑或抑制劑等)。
可通過(guò)眾所周知的藥學(xué)方法，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA，插入了所述DNA的載體，本發(fā)明的抗體，通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物與蒸餾水，緩沖劑，鹽，BSA，甘油，穩(wěn)定劑，防腐劑或去污劑混合，可以制備成組合物。另外，本發(fā)明的藥劑可用作上述胰腺檢查所用的試劑。另外，它也可用作藥物組合物，用于治療或預(yù)防糖尿病，消化道腫瘤，神經(jīng)變性疾病，胰腺炎和其它腫瘤。
當(dāng)將本發(fā)明的藥劑用作藥物時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽，編碼所述蛋白質(zhì)或肽的DNA，插入了所述DNA的載體，本發(fā)明的抗體，通過(guò)本發(fā)明的篩選分離出的化合物可以直接施用于患者，或者可通過(guò)眾所周知的藥學(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行配制。例如，為了進(jìn)行配制，可以適當(dāng)混合藥物可接受的載體或介質(zhì)，具體地為無(wú)菌水，生理鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇，植物油，乳化劑，懸浮劑，去污劑，穩(wěn)定劑等，然后再施用。本發(fā)明的藥物組合物可以是溶液，片劑，膠囊，錠劑，含片，酏劑，懸浮液或糖漿形式?？梢赃m當(dāng)決定活性化合物的含量。除了動(dòng)脈內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮下注射外，還可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行給藥，例如鼻內(nèi)，經(jīng)支氣管，肌內(nèi)或口服給藥?？梢匀硇曰蚓植拷o藥。劑量可根據(jù)患者的體重，年齡，給藥方法，癥狀等而改變，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)膭┝??？煞忠淮位驇状谓o藥。另外，只要化合物是由DNA編碼的物質(zhì)，可通過(guò)將DNA整合至基因治療載體來(lái)進(jìn)行基因治療。給藥可在體外或體內(nèi)進(jìn)行?？筛鶕?jù)患者的體重，年齡，癥狀等改變給藥劑量，給藥方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇給藥方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了在大鼠胰島瘤衍生的細(xì)胞系RINm5F細(xì)胞中加入人REG蛋白(REG Iα)之后，測(cè)定BrdU摻入的結(jié)果(實(shí)施例3)。
圖2顯示了在RINm5F細(xì)胞中加入經(jīng)[125I]標(biāo)記的大鼠Reg蛋白(Reg I)時(shí)，測(cè)定所述Reg蛋白與細(xì)胞的結(jié)合的結(jié)果(實(shí)施例4)?！癏ot”表示僅加入經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白時(shí)的結(jié)果，“Hot+100×Cold”表示加入經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白和100倍量的未經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白的結(jié)果。
圖3顯示了在表達(dá)了分離型Reg-結(jié)合蛋白的COS-7細(xì)胞中加入經(jīng)[125I]標(biāo)記的大鼠Reg蛋白(Reg I)時(shí)，測(cè)定經(jīng)[125I]標(biāo)記的大鼠Reg蛋白(Reg I)與所述細(xì)胞的結(jié)合的結(jié)果(實(shí)施例6)?！皃CI-neo”和“pCI-167.1”分別表示導(dǎo)入空白載體和Reg-結(jié)合蛋白表達(dá)載體的細(xì)胞的結(jié)果。另外，(-)和(+)分別表示僅加入經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白，和加入經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白并加入100倍量的未經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白的結(jié)果。
圖4顯示了大鼠Reg結(jié)合蛋白，即Reg受體(rEXTL3)(SEQ ID NO4)，人EXTL3/EXTR1(hEXTL3)(GenBank登錄號(hào)為AF001690和AB 007042)(SEQID NO5)，人EXT2(hEXT2)(GenBank登錄號(hào)為U64511)(SEQ ID NO6)，人EXT1(hEXT1)(GenBank登錄號(hào)為S79639)(SEQ ID NO7)，人EXTL1(hEXTL1)(GenBank登錄號(hào)為U67191)(SEQ ID NO8)和人EXTL2(hEXTL2)(GenBank登錄號(hào)為AF000416)(SEQ ID NO9)的推測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸序列的比對(duì)(實(shí)施例7)。下劃線部分為跨膜結(jié)構(gòu)域。右邊的數(shù)字對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基。點(diǎn)表示與大鼠Reg-結(jié)合蛋白(rEXTL3)相同的殘基。連字號(hào)表示在大鼠Reg-結(jié)合蛋白(rEXTL3)中缺乏相應(yīng)的殘基。
圖5顯示出Reg-結(jié)合蛋白的細(xì)胞分布。泳道1，導(dǎo)入對(duì)照載體的COS-7細(xì)胞的勻漿液；泳道2-6，導(dǎo)入Reg受體表達(dá)載體的COS-7細(xì)胞的勻漿液，膜組分，線粒體組分，微粒體組分和胞質(zhì)組分(實(shí)施例8)。在每個(gè)泳道中電泳10微克蛋白質(zhì)，通過(guò)使用針對(duì)與Reg-結(jié)合蛋白結(jié)合的HA標(biāo)記物的抗體進(jìn)行Western印跡分析其顯示Reg蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面表達(dá)。
圖6顯示了人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物是細(xì)胞表面型Reg-結(jié)合蛋白(實(shí)施例9)。該圖顯示了存在(+；過(guò)量100倍)或缺乏(-)未經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白時(shí)，[125I]Reg蛋白與表達(dá)Reg受體的細(xì)胞的結(jié)合?！皃CIneo”是導(dǎo)入空白載體的對(duì)照，而“pCI.rEXTL3”是在細(xì)胞中導(dǎo)入Reg-結(jié)合蛋白表達(dá)載體的結(jié)果。結(jié)果被表示為4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±S.E.M.。
圖7顯示了Reg受體的功能鑒定。(A)通過(guò)大鼠Reg蛋白使BrdU摻入至穩(wěn)定表達(dá)Reg受體的CHO細(xì)胞中(實(shí)施例10)。檢測(cè)了兩個(gè)表達(dá)Reg受體的獨(dú)立細(xì)胞系(RegR-#3和RegR-#22)。結(jié)果被表示為8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±S.E.M.。(B)大鼠Reg(圓形)和人REG(方形)與大鼠Reg受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線。結(jié)果被表示為4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±S.E.M.。
圖8顯示了表達(dá)Reg受體的β-細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡(實(shí)施例11)。檢測(cè)了三個(gè)表達(dá)Reg受體的獨(dú)立細(xì)胞系(#1，#6和#24)。RIN是RINm5F對(duì)照。結(jié)果被表示為4-8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±S.E.M.。(A)通過(guò)大鼠Reg蛋白使BrdU摻入穩(wěn)定表達(dá)Reg受體的RINm5F細(xì)胞。(B)Reg蛋白增加了活細(xì)胞對(duì)WST-1的裂解。(C)通過(guò)TUNEL法定量測(cè)定Reg蛋白-誘導(dǎo)的RINm5F細(xì)胞凋亡。
圖9顯示了Reg受體mRNA的表達(dá)(實(shí)施例12)。進(jìn)行RNA酶保護(hù)試驗(yàn)以測(cè)定Reg受體mRNA的表達(dá)。309個(gè)核苷酸的帶對(duì)應(yīng)于Reg受體mRNA受保護(hù)的大小。(A)在β-細(xì)胞中表達(dá)Reg受體mRNA。再生胰島分離自接受腹膜內(nèi)注射0.5mg/kg/天煙酰胺達(dá)1至3個(gè)月，90％的胰腺被切除的大鼠(K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yoneyama，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病學(xué)33，250(1990)；Y. Yonemura等，糖尿病33，401(1984))泳道1，正常胰島；泳道2，部分胰腺切除術(shù)后1個(gè)月的再生胰島；泳道3，部分胰腺切除術(shù)后2個(gè)月的再生胰島；泳道4，部分胰腺切除術(shù)后3個(gè)月的再生胰島；泳道5，RINm5F細(xì)胞；泳道6，ARIP細(xì)胞。泳道P中僅使用探針。(B)在大鼠組織中表達(dá)Reg受體mRNA泳道1，正常胰島；泳道2，整個(gè)胰腺；泳道3，肝臟；泳道4，腎臟；泳道5，心臟；泳道6，脾臟；泳道7，胸腺；泳道8，睪丸；泳道9，腎上腺；泳道10，胃；泳道11，空腸；泳道12，回腸；泳道13，結(jié)腸；泳道14，腦垂體；泳道15，腦。
圖10顯示了在穩(wěn)定表達(dá)Reg受體的CHO細(xì)胞中，Reg蛋白增加了活細(xì)胞對(duì)WST-1的裂解(實(shí)施例12)。使用了兩個(gè)如圖7A所述的獨(dú)立細(xì)胞系。結(jié)果被表示為8次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±S.E.M.。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式下文將使用實(shí)施例具體解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此。實(shí)施例1構(gòu)建人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I)的表達(dá)載體使用接頭將人REG IαcDNA的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(Terazono，K等，生物化學(xué)雜志，263，2111-2114(1998))插入畢赤氏酵母表達(dá)載體pPIC3.5(Invitrogen)的酵母醇氧化酶啟動(dòng)子下游的SnaBI/AvrII位點(diǎn)以構(gòu)建表達(dá)載體。類似地，使用接頭將大鼠Reg I cDNA的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(Terazono，K等，文獻(xiàn)同上)插入pPIC3.5的SnaBI/NotI位點(diǎn)。使用CsCl法純化這兩種表達(dá)載體的DNA，并將所述DNA導(dǎo)入使用畢赤氏酵母Easy Comp試劑盒(Invitrogen)制備的感受態(tài)細(xì)胞(畢赤氏酵母GS115菌株)。通過(guò)已導(dǎo)入表達(dá)載體的細(xì)胞獲得了在不含組氨酸的培養(yǎng)基中增殖的能力這一事實(shí)，即可選擇出這些細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，選擇當(dāng)加入甲醇時(shí)，產(chǎn)生并分泌至培養(yǎng)基中的人REG蛋白或大鼠Reg蛋白的量達(dá)到最大值的克隆。實(shí)施例2制備人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I)于28至30℃，在BMGY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％聚胨，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34％Yeast Nitrogen Base，0.00004％生物素，1％甘油)中將能生產(chǎn)上述人REG蛋白或大鼠Reg蛋白的畢赤氏酵母(巴斯德畢赤氏酵母)預(yù)培養(yǎng)16至18小時(shí)。然后，在BMGY培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)直至OD600為2至5。離心收集酵母，將其重新懸浮于BMMY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％聚胨，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，1.34％ Yeast Nitrogen Base，0.00004％生物素，0.5％甲醇)中，于28至30℃培養(yǎng)3至4天使OD600達(dá)到1為止。在培養(yǎng)過(guò)程中，以24小時(shí)為間隔加入甲醇至終濃度為0.5％。收集培養(yǎng)物上清液，加入乙酸而將pH調(diào)節(jié)為3.5。將已調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基上樣于用50mM醋酸鈉(pH3.5)平衡過(guò)的STREAMLINE SP(Pharmacia)，用50mM醋酸鈉(pH3.5)洗滌之后，再用50mM醋酸鈉(pH3.5)/0.5M NaCl洗脫。使用質(zhì)譜法證實(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是人REG蛋白或大鼠Reg蛋白。實(shí)施例3加入REG蛋白對(duì)大鼠胰島瘤衍生的培養(yǎng)細(xì)胞RINm5F細(xì)胞的影響在大鼠胰島瘤衍生的培養(yǎng)細(xì)胞RINm5F細(xì)胞(Zenilman，M.E等，胃腸病學(xué)110，1208-1214(1996))中加入REG蛋白，測(cè)定5’-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)的摻入(細(xì)胞增殖活性)。首先，將5×105個(gè)細(xì)胞/ml的RINm5F細(xì)胞以100μl/孔的量接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃培養(yǎng)2天。然后，將培養(yǎng)基換成100μl/孔下述培養(yǎng)基。關(guān)于人REG Iα，使用的是實(shí)施例2中所述的人REG Iα。
培養(yǎng)基+1％FCS培養(yǎng)基+1％FCS+人REG Iα(1nM；0.016μg/ml)培養(yǎng)基+1％FCS+人REG Iα(10nM；0.16μg/ml)培養(yǎng)基+1％FCS+人REG Iα(100nM；1.6μg/ml)培養(yǎng)基+1％FCS+人REG Iα(1000nM；16μg/ml)于37℃將細(xì)胞保溫24小時(shí)，然后加入10μl/孔BrdU標(biāo)記溶液(用培養(yǎng)基將10mM BrdU原液稀釋至100μM)(終濃度為10μM)。37℃保溫12小時(shí)，然后除去培養(yǎng)基，加入200μl/孔FixDenat(Roche Diagnostics)。室溫下保溫15分鐘，除去FixDenat溶液，然后加入100μl/孔抗-BrdU-POD抗體(原液的1/100稀釋溶液，Roche Diagnostics)。室溫下保溫60分鐘之后，除去抗-BrdU-POD抗體溶液，然后用200μl/孔洗滌溶液(10x洗滌溶液，Roche Diagnostics)沖洗3次。加入100μl/孔底物溶液(Roche Diagnostics)，室溫下保溫直至充分顯色。使用ELISA讀數(shù)儀測(cè)定每個(gè)樣品在370nm的光吸收值(參照波長(zhǎng)約492nm)。
結(jié)果，觀察到依賴于REG蛋白濃度的細(xì)胞增殖(圖1)。實(shí)施例4檢測(cè)Reg蛋白對(duì)RINm5F細(xì)胞的結(jié)合活性首先，按下述制備經(jīng)稀釋的[125I]Reg I溶液。用DMEM將[125I]大鼠Reg I原液(50ng/μl≈3.33μM，8.6×105cpm/μl)稀釋至1nM，333pM，100pM，33pM和10pM。另外，按類似方法制備含100倍濃度未經(jīng)標(biāo)記的Reg I原液(460ng/μl≈30.6μM)的稀釋溶液。將3ml 4×105個(gè)細(xì)胞/ml RINm5F細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)2天。用冰冷的DMEM洗滌，然后加入3ml含有上述[125I]大鼠Reg I(終濃度10pM，33pM，100pM，333pM和1nM)的DMEM。在競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，使用了含100倍量未經(jīng)標(biāo)記的Reg I的DMEM。在冰上放置2小時(shí)，然后用DMEM將細(xì)胞洗滌3次，通過(guò)加入0.5至1ml/孔[100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，1％Triton X-100]進(jìn)行裂解，用γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)[125I]放射性。
結(jié)果看出過(guò)量的未經(jīng)標(biāo)記的Reg蛋白抑制結(jié)合，這表明RINm5F細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在一種特異性結(jié)合所必需的分子(圖2)。實(shí)施例5鑒定和分離Reg-結(jié)合蛋白使用大鼠胰島的poly(A)+RNA為模板，用λZAP II載體構(gòu)建大鼠胰島表達(dá)cDNA文庫(kù)。使用Bolton-Hunter試劑，用[125I]標(biāo)記實(shí)施例2中制備的大鼠Reg蛋白，通過(guò)West-Western法，從表達(dá)的cDNA文庫(kù)中選擇并分離與Reg蛋白結(jié)合的噬菌體克隆。
使用得自陽(yáng)性噬菌體克隆的輔助噬菌體，通過(guò)體內(nèi)切除法將cDNA重組至質(zhì)粒載體(pBluescript SK(-)，Stratagene)。通過(guò)雙脫氧法測(cè)定cDNA的核苷酸序列。核苷酸序列和預(yù)期的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。據(jù)認(rèn)為由核苷酸序列估計(jì)的蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜蛋白質(zhì)，其跨膜結(jié)構(gòu)域含有疏水氨基酸簇。實(shí)施例6在COS-7細(xì)胞中表達(dá)Reg-結(jié)合蛋白將實(shí)施例5中分離的cDNA整合至含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(pCI-neo)(Promega)，以構(gòu)建Reg-結(jié)合蛋白表達(dá)載體(pCl-167.1)。通過(guò)電穿孔法將載體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并瞬時(shí)表達(dá)。導(dǎo)入載體48小時(shí)之后，通過(guò)類似于實(shí)施例4中所述的方法檢測(cè)Reg結(jié)合活性。
具體地說(shuō)，首先，使用DMEM將[125I]大鼠Reg I原液(50ng/μl≈3.33μM，2.7×105cpm/μl)稀釋至10nM。另外，還制備一種稀釋液，使該稀釋液中加入的未經(jīng)標(biāo)記的Reg I原液(2250ng/μl＝150μM)濃度為[125I]Reg I濃度(1μM)的100倍。
將3ml 2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)2天。用冰冷的DMEM洗滌，然后加入3ml含有[125I]大鼠Reg I(終濃度為10nM)的DMEM。在競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)存在100倍量的未經(jīng)標(biāo)記的Reg I。在冰上放置2小時(shí)，然后用DMEM將細(xì)胞洗滌3次，加入1ml/孔[100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，1％Triton X-100]以裂解細(xì)胞，用γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)[125I]放射性。
結(jié)果，與僅導(dǎo)入載體的細(xì)胞相比，在導(dǎo)入cDNA的細(xì)胞中，與經(jīng)[125I]標(biāo)記的Reg蛋白的結(jié)合顯著增加。另外，通過(guò)加入過(guò)量未經(jīng)標(biāo)記的Reg蛋白使所述結(jié)合消失(圖3)。因此，可以認(rèn)為由分離的cDNA編碼的蛋白質(zhì)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上與Reg蛋白結(jié)合的分子，所述分子可以是對(duì)β細(xì)胞再生和Reg蛋白的增殖活性起著重要作用的受體分子。實(shí)施例7篩選大鼠胰島cDNA文庫(kù)為了進(jìn)一步分離編碼Reg-結(jié)合蛋白的cDNA，可使用實(shí)施例5中所得的cDNA片段為探針，通過(guò)噬斑雜交來(lái)篩選大鼠胰島cDNA文庫(kù)(5×106個(gè)克隆)，得到8個(gè)陽(yáng)性克隆。這8個(gè)克隆彼此高度重疊，并且在重疊區(qū)域具有完全的核苷酸同一性。所得的編碼大鼠Reg-結(jié)合蛋白的cDNA序列和由該cDNA編碼的Reg-結(jié)合蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO3和SEQ IDNO4。
如圖4所示，該cDNA具有2760bp的開放閱讀框，其編碼919個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由該cDNA推定的氨基酸序列推測(cè)該蛋白質(zhì)是II型跨膜結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有長(zhǎng)的胞外結(jié)構(gòu)域(868個(gè)氨基酸殘基)，跨膜結(jié)構(gòu)域(殘基29-51)，和位于N-末端的短的胞內(nèi)區(qū)域。實(shí)施例8表達(dá)大鼠Reg-結(jié)合蛋白構(gòu)建實(shí)施例7中分離的大鼠Reg蛋白cDNA的表達(dá)載體，并在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。將大鼠Reg結(jié)合蛋白cDNA與能在N末端編碼血凝素(HA)九肽-標(biāo)記物(YPYDVPDYA)的寡核苷酸連接，然后插入pCl-neo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(Promega)。通過(guò)電穿孔將該載體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并表達(dá)。保溫48小時(shí)之后，收集細(xì)胞，勻漿，并按文獻(xiàn)所述進(jìn)行分級(jí)分離(S.Takasawa等，生物化學(xué)雜志，268，26052(1983)；H.Okamoto等，酶學(xué)方法，280，306(1997))。蛋白質(zhì)樣品在12.5％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至Immobilon-P(Millipore)。按S.Takasawa等，生物化學(xué)雜志，270，30257(1995)；H.Okamoto等，酶學(xué)方法，280，306(1997)所述進(jìn)行Western印跡分析。抗HA的單克隆抗體是抗-HA 3F10(Boehringer)。
免疫印跡分析表明由所述cDNA編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜組分中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其表觀分子量為105kD(圖5A)，這與由推定的氨基酸序列計(jì)算出的分子量(104,682)一致。實(shí)施例9大鼠Reg-結(jié)合蛋白與Reg蛋白的結(jié)合通過(guò)電穿孔將實(shí)施例8中構(gòu)建的大鼠Reg-結(jié)合蛋白(也稱為EXTL3/EXTR1)表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞，并瞬時(shí)表達(dá)。按上文所述分離穩(wěn)定表達(dá)Reg受體的CHO細(xì)胞。用RPMI 1640(Roswell ParkMemorial institute 1640培養(yǎng)基)洗滌細(xì)胞(7.5×105個(gè)細(xì)胞)，在經(jīng)125I標(biāo)記的大鼠Reg蛋白(50ng/ml，1.5×105cpm/ml)的存在下，在冰上將上述細(xì)胞與含有多種濃度未經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg或人REG蛋白和1％胎牛血清的RPMI 1640一起保溫2小時(shí)。用RPMI 1640洗滌3次之后，用1ml 100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA和1％ Triton X-100溶解細(xì)胞。通過(guò)γ-計(jì)數(shù)器(Cobra，Packard)測(cè)定裂解物的放射性。結(jié)果，導(dǎo)入大鼠Reg結(jié)合蛋白表達(dá)載體的COS-7細(xì)胞與經(jīng)125I標(biāo)記的大鼠Reg蛋白結(jié)合，通過(guò)加入未經(jīng)標(biāo)記的Reg蛋白可以減少該結(jié)合(圖6)。
在DNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明大鼠Reg結(jié)合蛋白的cDNA(SEQ ID NO3)及其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO4)與多發(fā)性外生骨疣(EXT)家族基因，尤其是人EXT-樣基因3(EXTL3)/EXT-相關(guān)基因1(EXTR1)(W.Van Hui等，基因組學(xué)47，230(1998)；T.Saito等，生物化學(xué)與生物物理研究通訊，243，61(1998))的相應(yīng)序列顯示出顯著的同源性(氨基酸同一性超過(guò)97％)，這表明所述cDNA編碼人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物。通過(guò)同源性篩選已分離出身為EXT家族基因成員的EXTL3/EXTR1基因，但尚未闡明其生理功能和病理學(xué)意義。據(jù)認(rèn)為EXTL3/EXTR1屬于EXT家族(W.Van Hui等，基因組學(xué)47，230(1998)；T.Saito等，生物化學(xué)與生物物理研究通訊，243，61(1998))，因?yàn)樗cEXT2和EXT1在C-末端區(qū)域顯示出同源性(C末端的262個(gè)氨基酸與EXT2有52％同源，C末端的247個(gè)氨基酸與EXT1有40％同源)(見圖4)。然而，EXTL3/EXTR1的N-末端區(qū)域(殘基1-656)與EXT家族基因的任何其它成員都沒(méi)有同源性。另外，EXTL3/EXTR1的N-末端區(qū)域含有跨膜結(jié)構(gòu)域，但該家族的其它成員缺乏該結(jié)構(gòu)域，因此，不認(rèn)為它們是細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。另外，起初在篩選大鼠胰島cDNA表達(dá)文庫(kù)時(shí)作為Reg-結(jié)合蛋白被分離的1.6kbp cDNA僅含有N-末端區(qū)域(氨基酸殘基1-332)。因此，可以合理地假定N-末端區(qū)域含有Reg結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且除EXTL3/EXTR1外的EXT家族成員不能結(jié)合Reg蛋白。實(shí)施例10 Reg蛋白對(duì)大鼠Reg-結(jié)合蛋白(大鼠Reg受體)表達(dá)細(xì)胞的刺激作用將實(shí)施例8中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞，建立幾個(gè)過(guò)量表達(dá)受體蛋白質(zhì)的細(xì)胞系，測(cè)定細(xì)胞對(duì)大鼠Reg蛋白刺激作出反應(yīng)而摻入的5’-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)。
將具有HA-標(biāo)記的大鼠受體表達(dá)載體導(dǎo)入CHO細(xì)胞和RINm5F細(xì)胞。在含有10％胎牛血清(Bio Whittaker，Walersville，Maryland)和250μg/ml新霉素(Gibco)的Roswell Park Memorial institute 1640培養(yǎng)基(RPMI1640)中將細(xì)胞培養(yǎng)2周[S.Takasawa等，生物化學(xué)雜志，273，2497(1998)]。通過(guò)對(duì)HA進(jìn)行免疫印跡分析，篩選出表達(dá)高水平重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，并分離這些轉(zhuǎn)化子。在濃度漸增的大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中將表達(dá)Reg受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)24小時(shí)。在最后的2小時(shí)，在培養(yǎng)基中加入BrdU(10μM)，使用比色細(xì)胞增殖ELISA試劑盒(Boehringer)測(cè)定BrdU摻入。
當(dāng)與1-300nM大鼠Reg蛋白保溫時(shí)，表達(dá)EXTL3/EXTR1的細(xì)胞系(#3和#22)中的BrdU摻入顯著增加(細(xì)胞系#3的EC50＝4.01nM，細(xì)胞系#22中為1.11nM，圖7A)。對(duì)CHO-細(xì)胞系表現(xiàn)出增殖-刺激作用的Reg蛋白濃度與對(duì)大鼠胰島原代培養(yǎng)物的(T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994))一致，這表明Reg蛋白刺激胰腺β-細(xì)胞增殖的作用是由EXTL3/EXTR1的大鼠同系物介導(dǎo)的。
經(jīng)125I-標(biāo)記的大鼠Reg蛋白與表達(dá)大鼠Reg受體的CHO細(xì)胞結(jié)合(Kd＝4.41nM)，通過(guò)增加未經(jīng)標(biāo)記的大鼠Reg蛋白的濃度可以置換該結(jié)合(Ki＝1.61 nM；圖7B)(參照實(shí)施例9)。經(jīng)估計(jì)，大鼠Reg蛋白的Hill系數(shù)為nH＝1.18，表明與單個(gè)勻質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)群的相互作用。另外，顯示出與大鼠Reg蛋白70％氨基酸同一性的人REG蛋白(K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313)也能與表達(dá)上述大鼠Reg受體的CHO細(xì)胞結(jié)合(Kα＝14.0nM)。經(jīng)放射性標(biāo)記的大鼠Reg蛋白和CHO細(xì)胞的結(jié)合雖然也能通過(guò)人REG蛋白置換，但置換需要較高的濃度(Ki＝7.41 nM；圖7B)。這些結(jié)果強(qiáng)烈地暗示EXTL3/EXTR1是細(xì)胞表面Reg受體，它能與Reg蛋白結(jié)合，并能轉(zhuǎn)導(dǎo)Reg蛋白的增殖刺激信號(hào)。實(shí)施例11大鼠Reg受體的功能分析Reg被認(rèn)為是β-細(xì)胞增殖因子(H.Okamoto，分子醫(yī)學(xué)雜志，77，74(1999)；T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994)；D.J.Gross等，內(nèi)分泌學(xué)139，2369(1998))。當(dāng)在大鼠胰島瘤衍生的β細(xì)胞系RINm5F中加入Reg蛋白時(shí)，細(xì)胞的BrdU摻入增加(1.5至2倍)，這表明它可以以依賴于Reg蛋白濃度的方式刺激細(xì)胞數(shù)目的增加。由于刺激RINm5F細(xì)胞增殖的Reg蛋白濃度與大鼠胰島原代培養(yǎng)物中的一致，可以認(rèn)為在這兩種細(xì)胞中Reg蛋白通過(guò)相同的受體反應(yīng)。接著，將實(shí)施例8中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入RINm5F細(xì)胞以建立幾個(gè)過(guò)量表達(dá)Reg受體的細(xì)胞系，使用這些細(xì)胞系檢測(cè)Reg蛋白的功能。
當(dāng)與0.3至300nM的大鼠Reg蛋白保溫時(shí)，表達(dá)受體的細(xì)胞系(細(xì)胞系#1，#6和#24)的BrdU摻入(參照實(shí)施例10的檢測(cè)方法)顯著增加(圖8A)。
在多種濃度大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中將表達(dá)Reg受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子保溫24小時(shí)之后，在培養(yǎng)基中加入含有WST-1的溶液，再培養(yǎng)30分鐘，使用細(xì)胞增殖試劑WST-1(Boehringer)，測(cè)定活細(xì)胞中由線粒體脫氫酶所致的四唑鹽4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并]-1，3-苯二磺酸鹽(WST-1)的裂解。RINm5F細(xì)胞對(duì)加入Reg蛋白(0.3-100nM)作出反應(yīng)使細(xì)胞數(shù)目增加，但當(dāng)將細(xì)胞與高濃度的Reg蛋白保溫時(shí)，細(xì)胞數(shù)目減少(圖8B)。
為了評(píng)價(jià)高濃度的Reg蛋白誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡的可能性，在濃度漸增的大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中將表達(dá)Reg受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子保溫24小時(shí)。保溫之后，使用細(xì)胞凋亡篩選試劑盒(Wako，Osaka，日本)，通過(guò)TUNEL法(Y.Gavrieli，Y.Sherman，S.A.Ben-Sasson，細(xì)胞生物學(xué)雜志，119，493(1992))檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，揭示出高濃度的Reg蛋白可誘導(dǎo)表達(dá)Reg受體的RINm5F細(xì)胞凋亡(圖8C)。這些結(jié)果表明Reg受體對(duì)Reg蛋白作出反應(yīng)，介導(dǎo)胰腺β-細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡，從而維持穩(wěn)定的β-細(xì)胞量。實(shí)施例12 Reg受體mRNA的表達(dá)分析通過(guò)RNA酶保護(hù)試驗(yàn)在各種大鼠組織和細(xì)胞中檢測(cè)Reg受體mRNA的表達(dá)。
按文獻(xiàn)所述制備大鼠再生胰島(K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y. Yoneyama，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313；Y.Yonemura等，糖尿病33，401(1984))。按文獻(xiàn)所述從各種大鼠組織和細(xì)胞系中分離RNA(T.Koguma等，Biochem.Biophys.Acta 1223，180(1994)；N.Noguchi等，生物化學(xué)雜志，272，3133(1997)；H.Okamoto等，酶學(xué)方法，280，306(1997))。將大鼠Reg受體cDNA的PstI/BglII片斷亞克隆至pBluescript SK(-)的PstI/BglII位點(diǎn)，用HindIII使其線性化，并使用[α-32P]CTP，通過(guò)T3 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將所得的0.45kb cRNA用作探針。根據(jù)廠商說(shuō)明，使用RPA III試劑盒(Ambion)進(jìn)行RNA酶保護(hù)試驗(yàn)。
如圖9A所示，正常的胰島，再生的胰島和RINm5F β-細(xì)胞中表達(dá)Reg受體mRNA。與正常的胰島相比，再生胰島中的Reg受體表達(dá)未增加，這表明使β-細(xì)胞量增加的胰腺β-細(xì)胞再生和增殖主要由Reg蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)，而不是由受體的表達(dá)調(diào)節(jié)。這一假說(shuō)與以下觀察結(jié)果一致Reg基因最初被鑒定為在再生的胰島中特異性表達(dá)的基因(K.Terazono等，生物化學(xué)雜志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yoneyama，胰島分子生物學(xué)，H.Okamoto編(劍橋大學(xué)出版社，劍橋，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病學(xué)33，250(1990))，而且，在瞬時(shí)β-細(xì)胞增殖期，例如在處于糖尿病緩解期的BB/Wor/Tky大鼠的胰島(C.Ishii等，內(nèi)分泌學(xué)雜志，40，269(1993))，處于糖尿病活躍期的NOD小鼠的胰島(N.J.Baeza等，糖尿病45，67(1996))和自身免疫性糖尿病小鼠模型的處于分化和增殖中的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞(被認(rèn)為是β-細(xì)胞的祖細(xì)胞)(E.Anastasi等，歐洲內(nèi)分泌學(xué)雜志，141，644-52(1999))中，也能觀察到Reg基因表達(dá)。據(jù)報(bào)道，表達(dá)Reg受體的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系A(chǔ)RIP細(xì)胞(見圖9A，泳道6)也能以依賴于Reg蛋白的方式增殖(M.E.Zenilman等，胃腸病學(xué)110，1208(1996)；M.E.Zenilman等，胰腺17，256(1998))。在肝臟，腎臟，胃，小腸，結(jié)腸，腎上腺，腦垂體和腦中也可檢測(cè)到Reg受體mRNA的表達(dá)，而在心臟中卻檢測(cè)不到這種表達(dá)(圖9B)，這表明在除胰腺β-細(xì)胞以外的多種細(xì)胞類型中，Reg-Reg受體信號(hào)系統(tǒng)可能涉及細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的控制機(jī)制。實(shí)際上，表達(dá)Reg受體的CHO細(xì)胞系對(duì)Reg蛋白作出反應(yīng)而增殖(圖7A)。另外，CHO細(xì)胞數(shù)目的增加和減少(參照實(shí)施例11的檢測(cè)方法)依賴于Reg蛋白的濃度(圖10)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了Reg-結(jié)合蛋白(Reg受體)。Reg蛋白是胰腺β細(xì)胞的細(xì)胞增殖因子，已知它也可在上皮細(xì)胞等中發(fā)揮細(xì)胞增殖活性。據(jù)認(rèn)為在胰腺β細(xì)胞中，Reg-結(jié)合蛋白具有通過(guò)與Reg蛋白結(jié)合而轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖所需信號(hào)的功能，胰腺β細(xì)胞通過(guò)Reg蛋白與Reg-結(jié)合蛋白的結(jié)合而再生。因此，通過(guò)分析Reg-結(jié)合蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，并尋找與該結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體的類似物，可以開發(fā)能誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞生理增殖的“抗-糖尿病治療劑”。另外，由于Reg蛋白不會(huì)導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞的過(guò)量增殖，據(jù)認(rèn)為不存在由胰島素過(guò)量而導(dǎo)致低血糖的可能性。
序列表<110>岡本宏(OKAMOTO，Hiroshi)<120>Reg-結(jié)合蛋白<130>OKT-101PCT<140><141><150>JP 1999-164488<151>1999-06-10<160>9<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>1599<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(168)..(1259)<400>1tcagcgagga aaatgaaatt cccattttat ttggtgcctt gtgcagggag cacactgatc60cctctagaac cttgtgtgtg aaaaagaggt cgagttttgt caaacagact catggttatg120gcaagtgatc cgacgtgacc agagtgggca agagccacag tgaactc atg aca ggc176Met Thr Gly1tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt ggt cag acc tgt 224Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly Gln Thr Cys5 10 15atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg ctg agt ttc acg 272Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu Ser Phe Thr20 25 30 35ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc cac tat tac ctc 320Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His Tyr Tyr Leu40 45 50acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc atc ttt ggc ccc 368Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile Phe Gly Pro55 60 65cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc cta gat ctt tgt 416Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu Asp Leu Cys70 75 80cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag cta gaa gcc aag 464Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu Glu Ala Lys85 90 95cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac ctc aag att gaa 512Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu Lys Ile Glu100 105 110 115gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac ctg ctg cag ctc 560Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu Leu Gln Leu120 125 130aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag gag ctg atg gcc 608Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu Leu Met Ala135 140 145cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg ctc cct gag aag 656Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu Pro Glu Lys150 155 160gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg ggt tgc cgg cta 704Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly Cys Arg Leu165 170 175cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg tct ggc ttt cct 752His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser Gly Phe Pro180 185 190 195gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt gcc ttt ggg agc tac ctg gac 800Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser Tyr Leu Asp200 205 210cct ttg gtc aag cag gct ttt cag gct aca gtg aga gcc aac gtt tat 848Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala Asn Val Tyr215 220 225gtt aca gaa aat gca gcc atc gcc tgc ctg tat gtg gtg tta gtg gga 896Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val Leu Val Gly230 235 240gag ata caa gag ccc gct gtg ctg cag cct gcc gac ctt gag aag cag 944Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu Glu Lys Gln245 250 255ctg cat tct ctg cca cac tgg agg aca gac gga cac aac cat gtc atc 992Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn His Val Ile260 265 270 275atc aat ctg tcc cgg aag tca gac aca caa aat tta ctg tac aat gtc 1040Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu Tyr Asn Val280 285 290agt aca ggt cgg gcc atg gtg gcc cag tct acc ttc tat gct gcc cag 1088Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr Ala Ala Gln295 300 305tac aga gct ggc ttt gac ttg gtt gtg tca cca ctt gtc cat gcc atg 1136Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val His Ala Met310 315 320tct gaa ccc aac ttc atg gaa atc cca cgt gta act att ttt tca ctt 1184Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile Phe Ser Leu325 330 335ggg aga ggt gag gaa gaa caa gag aag ctg ggg gtg tgg aga ggc aga 1232Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp Arg Gly Arg340 345 350 355ccc ccc cca ggc tgg ggt gct ggc ccc tagactaggg tgctgacccc1279Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro360tgggctgggg tgctgcgtgc tacctcccac tgtgaaatcg atggtgctca caattgtctc1339ttgtaatgta tgtgattttt ttttaaggag aaaaagaaac tatttaagat tctgaaggtg1399ctactatttt tgttgccaca ggctttaaag aaactttctg agtgggtggg gccttgccca1459cttatctttc tctcctccaa atgaggagtt aaaaatgtta ctaaattgcc cgcacgtgta1519atccgctgaa aagaaaaaaa aaaaagaaaa aaaaaaggaa ggaaagaagg aaagaaggaa1579ggaaggaagg aaggaaagga1599<210>2<211>364<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly1 5 10 15Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu20 25 30Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His35 40 45Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile50 55 60Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu65 70 75 80Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu85 90 95Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu
100 105 110Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu115 120 125Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu130 135 140Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu145 150 155 160Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly165 170 175Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser180 185 190Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser195 200 205Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala210 215 220Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val225 230 235 240Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu245 250 255Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn260 265 270His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu275 280 285Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr290 295 300Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val305 310 315 320His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile325 330 335Phe Ser Leu Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp340 345 350Arg Gly Arg Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro355 360<210>3<211>3198<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(5)..(2761)<400>3actc atg aca ggc tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt 49Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly1 5 10 15ggt cag acc tgt atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg 97Gly Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp20 25 30ctg agt ttc acg ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc 145Leu Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala35 40 45cac tat tac ctc acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc 193His Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg50 55 60atc ttt ggc ccc cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc 241Ile Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val65 70 75cta gat ctt tgt cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag 289Leu Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln80 85 90 95cta gaa gcc aag cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac 337Leu Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn100 105 110ctc aag att gaa gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac 385Leu Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp115 120 125ctg ctg cag ctc aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag 433Leu Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys130 135 140gag ctg atg gcc cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg 481Glu Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu145 150 155ctc cct gag aag gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg 529Leu Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg160 165 170 175ggt tgc cgg cta cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg 577Gly Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr180 185 190tct ggc ttt cct gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt 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Pro Cys Pro Arg Thr Phe Gln Leu Gly165 170 175Gln Ala Met Val Ala Glu Ala Ser Pro Thr Val Asp Ser Phe Arg Pro180 185 190Gly Phe Asp Val Ala Leu Pro Phe Leu Pro Glu Ala His Pro Leu Arg195 200 205Gly Gly Ala Pro Gly Gln Leu Arg Gln His Ser Pro Gln Pro Gly Val210 215 220Ala Leu Leu Ala Leu Glu Glu Glu Arg Gly Gly Trp Arg Thr Ala Asp225 230 235 240Thr Gly Ser Ser Ala Cys Pro Trp Asp Gly Arg Cys Glu Gln Asp Pro245 250 255Gly Pro Gly Gln Thr Gln Arg Gln Glu Thr Leu Pro Asn Ala Thr Phe260 265 270Cys Leu Ile Ser Gly His Arg Pro Glu Ala Ala Ser Arg Phe Leu Gln275 280 285Ala Leu Gln Ala Gly Cys Ile Pro Val Leu Leu Ser Pro Arg Trp Glu290 295 300Leu Pro Phe Ser Glu Val Ile Asp Trp Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala305 310 315 320Asp Glu Arg Leu Pro Leu Gln Val Leu Ala Ala Leu Gln Glu Met Ser325 330 335Pro Ala Arg Val Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Asp340 345 350Ala Tyr Phe Ser Ser Val Glu Lys Val Ile His Thr Thr Leu Glu Val355 360 365Ile Gln Asp Arg Ile Phe Gly Thr Ser Ala Asn Pro Ser Leu Leu Trp370 375 380Asn Ser Pro Pro Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ser Thr Phe Ser Thr Ser385 390 395 400Pro Gln Asp Phe Pro Phe Tyr Tyr Leu Gln Gln Gly Ser Arg Pro Glu405 410 415Gly Arg Phe Ser Ala Leu Ile Trp Val Gly Pro Pro Gly Gln Pro Pro420 425 430Leu Lys Leu Ile Gln Ala Val Ala Gly Ser Gln His Cys Ala Gln Ile
435 440 445Leu Val Leu Trp Ser Asn Glu Arg Pro Leu Pro Ser Arg Trp Pro Glu450 455 460Thr Ala Val Pro Leu Thr Val Ile Asp Gly His Arg Lys Val Ser Asp465 470 475 480Arg Phe Tyr Pro Tyr Ser Thr Ile Arg Thr Asp Ala Ile Leu Ser Leu485 490 495Asp Ala Arg Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Val Asp Phe Ala Phe Leu500 505 510Val Trp Gln Ser Phe Pro Glu Arg Met Val Gly Phe Leu Thr Ser Ser515 520 525His Phe Trp Asp Glu Ala His Gly Gly Trp Gly Tyr Thr Ala Glu Arg530 535 540Thr Asn Glu Phe Ser Met Val Leu Thr Thr Ala Ala Phe Tyr His Arg545 550 555 560Tyr Tyr His Thr Leu Phe Thr His Ser Leu Pro Lys Ala Leu Arg Thr565 570 575Leu Ala Asp Glu Ala Pro Thr Cys Val Asp Val Leu Met Asn Phe Ile580 585 590Val Ala Ala Val Thr Lys Leu Pro Pro Ile Lys Val Pro Tyr Gly Lys595 600 605Gln Arg Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ala Pro Gly Gly Pro Gly Pro Arg610 615 620Pro Lys Pro Pro Ala Pro Ala Pro Asp Cys Ile Asn Gln Ile Ala Ala625 630 635 640Ala Phe Gly His Met Pro Leu Leu Ser Ser Arg Leu Arg Leu Asp Pro645 650 655Val Leu Phe Lys Asp Pro Val Ser Val Gln Arg Lys Lys Tyr Arg Ser660 665 670Leu Glu Lys Pro675<210>9<211>330<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Met Arg Cys Cys His Ile Cys Lys Leu Pro Gly Arg Val Met Gly Ile1 5 10 15Arg Val Leu Arg Leu Ser Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Leu Val20 25 30Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Leu Pro Ser Val Lys Glu Asp Lys Met35 40 45Leu Met Leu Arg Arg Glu Ile Lys Ser Gln Gly Lys Ser Thr Met Asp50 55 60Ser Phe Thr Leu Ile Met Gln Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Leu Leu65 70 75 80Lys Leu Leu Asn His Tyr Gln Ala Val Pro Asn Leu His Lys Val Ile85 90 95Val Val Trp Asn Asn Ile Gly Glu Lys Ala Pro Asp Glu Leu Trp Asn100 105 110Ser Leu Gly Pro His Pro Ile Pro Val Ile Phe Lys Gln Gln Thr Ala115 120 125Asn Arg Met Arg Asn Arg Leu Gln Val Phe Pro Glu Leu Glu Thr Asn130 135 140Ala Val Leu Met Val Asp Asp Asp Thr Leu Ile Ser Thr Pro Asp Leu145 150 155 160Val Phe Ala Phe Ser Val Trp Gln Gln Phe Pro Asp Gln Ile Val GIy165 170 175Phe Val Pro Arg Lys His Val Ser Thr Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Tyr
180 185 190Gly Ser Phe Glu Met Gln Ala Pro Gly Ser Gly Asn Gly Asp Gln Tyr195 200 205Ser Met Val Leu Ile Gly Ala Ser Phe Phe Asn Ser Lys Tyr Leu Glu210 215 220Leu Phe Gln Arg Gln Pro Ala Ala Val His Ala Leu Ile Asp Asp Thr225 230 235 240Gln Asn Cys Asp Asp Ile Ala Met Asn Phe Ile Ile Ala Lys His Ile245 250 255Gly Lys Thr Ser Gly Ile Phe Val Lys Pro Val Asn Met Asp Asn Leu260 265 270Glu Lys Glu Thr Asn Ser Gly Tyr Ser Gly Met Trp His Arg Ala Glu275 280 285His Ala Leu Gln Arg Ser Tyr Cys Ile Asn Lys Leu Val Asn Ile Tyr290 295 300Asp Ser Met Pro Leu Arg Tyr Ser Asn Ile Met Ile Ser Gln Phe Gly305 310 315 320Phe Pro Tyr Ala Asn Tyr Lys Arg Lys Ile325 330
權(quán)利要求
1.根據(jù)(a)至(i)中任一項(xiàng)的DNA，(a)編碼含有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(b)含有SEQ ID NO1之核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA，(c)編碼含有將SEQ ID NO2的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(d)與含有SEQ ID NO1之核苷酸序列的DNA雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(e)編碼含有SEQ ID NO4之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，(f)含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA，(g)編碼含有將SEQ ID NO4的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(h)與含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的DNA雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有與Reg蛋白結(jié)合之活性的蛋白質(zhì)，(i)編碼含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之氨基酸序列的蛋白質(zhì)的部分肽的DNA。
2.由根據(jù)權(quán)利要求1的DNA編碼的蛋白質(zhì)或肽。
3.插入了根據(jù)權(quán)利要求1的DNA的載體。
4.攜有根據(jù)權(quán)利要求3的載體的宿主細(xì)胞。
5.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)胞，和(b)從經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液中回收細(xì)胞所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。
6.抗根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽的抗體。
7.含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸與選自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3的DNA或與其互補(bǔ)DNA的DNA雜交。
8.篩選能與根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)使蛋白質(zhì)或肽與受試樣品接觸，(b)檢測(cè)受試樣品與所述蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合，和(c)選擇與所述蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物。
9.篩選能抑制Reg蛋白與根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽接觸，(b)檢測(cè)Reg蛋白與根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合，和(c)選擇能減弱該結(jié)合的化合物。
10.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求9的方法分離的化合物，其中所述化合物抑制Reg蛋白與根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合。
11.篩選能對(duì)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的激活所致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行促進(jìn)或抑制的化合物的方法，其中所述方法包括下列步驟(a)在受試樣品的存在下，使Reg蛋白與在細(xì)胞表面表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸，(b)檢測(cè)細(xì)胞在應(yīng)答Reg蛋白的刺激中的改變，(c)選擇與缺乏受試樣品時(shí)所作的檢測(cè)相比，能增強(qiáng)或抑制所述細(xì)胞改變的化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞改變包括細(xì)胞-增殖活性或細(xì)胞的DNA-合成活性的改變。
13.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法分離的化合物，其中所述化合物能促進(jìn)或抑制由激活根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)所致的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
14.一種藥劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)或肽，根據(jù)權(quán)利要求3的載體，根據(jù)權(quán)利要求6的抗體，或根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求13的化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥劑，其中所述藥劑選自Reg-結(jié)合劑，Reg蛋白應(yīng)答細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑，DNA合成調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的藥劑，其中所述藥劑是抗-糖尿病藥物。
全文摘要
本發(fā)明從大鼠胰島－衍生的cDNA中成功克隆出與Reg蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)。經(jīng)證實(shí),COS細(xì)胞表面表達(dá)的這種蛋白質(zhì)特異性地與Reg蛋白結(jié)合。當(dāng)在RINm5Fβ細(xì)胞中表達(dá)Reg－結(jié)合蛋白時(shí),DNA合成和細(xì)胞增殖受到刺激,受刺激的程度依賴于培養(yǎng)基中所加入Reg蛋白的劑量,在較高濃度時(shí),會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。據(jù)認(rèn)為該蛋白質(zhì)作為細(xì)胞(如β細(xì)胞)表面表達(dá)的Reg受體起作用,并能調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的增殖。該蛋白質(zhì)及其基因可用于開發(fā)新的糖尿病治療劑。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1361822SQ00810465
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月10日
發(fā)明者岡本宏 申請(qǐng)人:岡本宏