專利名稱：胺修飾的假單孢菌素化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及假單孢菌素(pseudomycin)化合物，特別是胺修飾的假單孢菌素化合物。
背景技術：
假單孢菌素是從丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae，與植物有關的細菌)的液體培養(yǎng)物中分離出的天然產物，并且已表明有抗真菌活性(參見Harrison，L.等人，“假單孢菌素，一族得自丁香假單胞菌的具有廣譜抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)以及美國專利5,576,298和5,837,685)。與以前描述過的得自丁香假單胞菌的抗霉菌劑(例如丁香霉素、丁香毒素和丁香抑制素)不同，假單孢菌素A-C含有羥基天冬氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、脫氫氨基丁酸、賴氨酸和二氨基丁酸。
假單胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相應于具有末端羧基的L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，該羧基在N-末端Ser的OH上將大環(huán)閉合。類似物的區(qū)別在于N-?；鶄孺?，即假單孢菌素A被3，4-二羥基十四烷?；鵑-?；賳捂呔谹’被3，4-二羥基十五烷?；鵑-酰化，假單孢菌素B被3-羥基十四烷?；鵑-?；?，假單孢菌素B’被3-羥基十二烷?；鵑-?；賳捂呔谻被3，4-二羥基十六烷?；鵑-?；?，假單孢菌素C’被3-羥基十六烷酰基N-?；?參見Ballio，A.，等人，“得自丁香假單胞菌的生物活性脂縮肽假單孢菌素，”FEBS Letters，355(1)，96-100，(1994)和Coiro，V.M.，等人，“使用得自NMR數據的幾何位距和分子動力學通過計算機模擬確定的丁香假單胞菌MSU16H植物毒性脂縮肽假單孢菌素A的溶液構象，”Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456(1998))。
已知假單孢菌素具有一些不利的生物作用。例如，當靜脈內施用假單孢菌素時，已觀察到了其破壞靜脈的內皮、破壞組織、炎癥、和對宿主組織的局部毒性。因為假單孢菌素具有得以證實的抗真菌活性和相當多未研究的化學特性，所以需要研究這類化合物以找到可用作具有較少不利副作用的抗真菌劑的其它潛在化合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了可用作抗真菌劑或者可用于設計抗真菌劑的下述結構所代表的胺修飾的假單孢菌素化合物、及其可藥用鹽和溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨立地為氫或甲基，或者Ra或Ra′為烷基氨基、與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳環(huán)；Rb和Rb′獨立地為氫、鹵素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羥基；Rc是氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基(C1-C4)烷氧基，或者與Re一起形成6-元芳環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是氫，或者與Rf一起形成6-元芳環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳環(huán)、或C5-C14烷基取代的6-元芳環(huán)，且Rf是C8-C18烷基、C5-C11烷氧基、或聯(lián)苯基；R是 其中Rg是氫、或C1-C13烷基，且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是氫、鹵素、或C5-C8烷氧基，且m是1、2或3；R是 其中
Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1獨立地為氫、甲?；Ⅴ；榛?例如-C(O)CH3、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、和-C(O)C(CH3)3)、酰基烷基氨基(例如-C(O)CH(NH2)CH3)、?；s烷基(例如-C(O)NHCH3和-C(O)NHCH(CH3)2)、酰氧基烯烴(例如-C(O)OCH2CH＝CH2)、酰氧基芳基(例如-C(O)OC6H5)、或?；鶃喖谆被姿狨?例如下示化合物1(a)) R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，且R1b是氫或甲基，條件是至少有一個R1不是氫；R2和R3獨立地為-OR2a、或-N(R2b)(R2c)，其中R2a和R2b獨立地為氫、C1-C10烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等)、C3-C6環(huán)烷基(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊基亞甲基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基等)、羥基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基(例如甲氧基乙基)、或C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基(例如芐基)、雜芳基(C1-C10)烷基(例如3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基)、或環(huán)雜烷基(C1-C10)烷基(例如N-四氫-1，4-噁嗪基乙基和N-哌嗪基乙基)，或者R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基(例如-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(對羥基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-或5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2等)，且R2c是氫或C1-C6烷基。
在另一個本發(fā)明實施方案中，提供了藥物制劑，其中包含上述假單孢菌素化合物和可藥用載體。
在另一個本發(fā)明實施方案中，提供了在動物中治療抗真菌感染的方法，包括給所述動物施用上述假單孢菌素化合物。
定義除非另有說明，本文所用術語“烷基”是指含有1-30個碳原子的通式CnH2n+1烴基。烷基可以是直鏈烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)、支鏈烷基(例如異丙基、異丁基、叔丁基、新戊基等)、環(huán)狀烷基(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基等)、或多環(huán)烷基(例如二環(huán)[2.2.1]庚烷、螺[2.2]戊烷等)。這些烷基可以被取代或未取代。類似地，烷氧基、烷酰基或烷酸酯的烷基部分具有與上述相同的定義。
術語“烯基”是指含有至少一個碳碳雙鍵的無環(huán)烴。烯基可以呈直鏈、支鏈、環(huán)狀、或多環(huán)。烯基可以被取代或未取代。烯氧基、烯?；蛳┧狨サ南┗糠志哂信c上述相同的定義。
術語“芳基”是指具有單環(huán)(例如苯基)或稠合環(huán)系(例如萘、蒽、菲等)的芳族基團。芳基可以被取代或未取代。
在有機化學領域內，特別是在有機生物化學領域內，眾所周知有效取代的化合物是可耐受或甚至有用的。在本發(fā)明中，例如，術語烷基包括作為標準烷基的取代基例如甲基、乙基、丙基、己基、異辛基、十二烷基、十八烷基等。術語“基團”特定涉及并包括烷基上的本領域常用取代基，例如羥基、鹵素、烷氧基、羰基、酮基、酯、氨基甲酸酯等，并包括未取代的烷基。然而，本領域技術人員通常知道，應當選擇取代基以不給化合物的藥理特征帶來不利影響或者不有害地干擾藥物的應用。對于任意上文定義的基團，合適的取代基包括烷基、烯基、炔基、芳基、鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、一-和二烷基氨基、季銨鹽、氨基烷氧基、羥基烷基氨基、氨基烷硫基、氨基甲酰基、羰基、羧基、羥乙?；⒏拾滨；?、肼基、脒基、和它們的組合。
術語“動物”是指人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物供應動物(例如牛、豬、綿羊和家禽)、動物園動物、海洋動物、鳥類以及其它類似種屬動物。
發(fā)明詳述本申請人已經發(fā)現，通過修飾連接在假單孢菌素天然產物或半合成衍生物中的賴氨酸或2，4-二氨基丁酸肽單元上的側鏈氨基，可提供體外實驗表明可有效地抗白色念珠菌(C.albican)、新型隱球酵母(C.neoformans)和/或煙曲霉(A.fumigatus)新化合物。使用含有合適的離去基團的?；瘎被揎棧@樣可與假單孢菌素側鏈的氨基形成酰胺、氨基甲酸酯、脲或酰亞胺鍵接。合適的離去基團是本領域技術人員眾所周知的，并包括基團例如對硝基苯氧基和N-氧基琥珀酰亞胺。
可使用本領域技術人員眾所周知的常規(guī)化學方法合成酰胺鏈接。合適的酰化劑包括用于制備其中R1＝?；榛募賳捂呔鼗衔锼璧聂人嵫苌锘蛘咂渲蠷1＝酰基烷基胺的假單孢菌素化合物的氨基酸。酰化劑一般是通過用離去基團(例如N-氧基琥珀酰亞胺)替代羧酸的-OH而形成的。當使用氨基酸酰化劑時，在縮合之前使用本領域技術人員已知的任何常規(guī)氨基保護基(例如芐氧基羰基、對硝基芐氧基羰基、對溴芐氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基、對甲氧基苯基偶氮基芐氧基羰基、對苯基偶氮基芐氧基羰基、叔丁氧基羰基或環(huán)戊氧基羰基)將氨基保護。形成酰胺鍵后，使用標準氫化方法(例如在氫氣氛下使用Pd/C)除去氨基保護基。參見下文中更詳細地描述由氨基酸形成假單孢菌素酰胺衍生物的實施例。
如上所述，假單孢菌素是從丁香假單胞菌分離出的天然產物，并且其特征在于，它是含有被內酯鍵閉合的環(huán)肽部分，并包含特殊氨基酸例如4-氯蘇氨酸(ClThr)、3-羥基天冬氨酸(HOAsp)、2，3-去氫-2-氨基丁酸(Dhb)、和2，4-二氨基丁酸(Dab)的脂縮肽。生長不同丁香假單胞菌的菌株以制備不同假單孢菌素類似物(A、A’、B、B’、C、和C’)的方法描述在Hilton等人于2000年4月14日提交的名稱為“由丁香假單胞菌制備假單孢菌素”的第PCT/US00/08728號PCT專利申請、Kulanthaivel等人于2000年4月14日提交的名稱為“假單孢菌素天然產物”的第PCT/US00/08727號PCT專利申請、以及美國專利5,576,298和5,837,685中，這4篇專利文獻都引入本發(fā)明以作參考。
產生一種或多種假單孢菌素的分離出的丁香假單胞菌菌株是本領域內已知的。下述文獻中描述了野生型菌株MSU 174和通過轉座子誘變生成的該菌株的突變型MSU 16H美國專利5,576,298和5,837,685；Harrison，等人，“假單孢菌素，一族得自丁香假單胞菌的具有廣譜抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；和Lamb等人，“轉座子誘變和熒光假單胞菌標記抗真菌生成是控制Dutchelm疾病所必需的，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6447-6451(1987)。
適于制備一種或多種假單孢菌素的丁香假單胞菌菌株可從環(huán)境來源包括植物(例如大麥作物、柑橘作物、和丁香植物)以及來源例如土壤、水、空氣和灰塵中分離得到。優(yōu)選的菌株是從植物分離的。從環(huán)境來源中分離的丁香假單胞菌菌株可稱為野生型。本文所用的“野生型”是指天然存在于標準丁香假單胞菌群體中的顯性遺傳型(例如天然發(fā)現并且不是由實驗室操作制得的丁香假單胞菌菌株或分離物)。象大多數生物體一樣，所用的假單孢菌素制備培養(yǎng)物(丁香假單胞菌菌株例如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的特征可發(fā)生變異。因此，可通過本領域已知方法獲得這些菌株的后代(例如重組物、突變體和變種)。
丁香假單胞菌MSU 16H可以以保藏號ATCC 67028從AmericanType Culture Collection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA公眾獲得。丁香假單胞菌菌株25-B1、7H9-1、和67 H1是在2000年3月23日由American Type Culture Collection保藏的，并且指定了下述保藏號25-B1保藏號PTA-1622
7H9-1保藏號PTA-162367 H1保藏號PTA-1621丁香假單胞菌的突變體菌株也適于制備一種或多種假單孢菌素。本文所用的“突變體”是指在菌株表型中的突然可遺傳的變化，這種變化可以是自發(fā)的，或者是通過已知的誘變劑例如放射(例如紫外放射或X-射線)、化學誘變劑(例如甲磺酸乙酯(EMS)、二環(huán)氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-亞硝基鳥嘌呤(NTG)、和亞硝酸)、位點特異性誘變和轉座子介導的誘變引起的。制備假單孢菌素的丁香假單胞菌突變體可通過用一定量能有效地產生下述突變體的誘變劑處理細菌而制得即能過度地產生一種或多種假單孢菌素、相對于其它假單孢菌素過量產生一種假單孢菌素(例如假單孢菌素B)、或在有利的生長條件下產生一種或多種假單孢菌素。雖然所用的誘變劑的類型和量可以改變，但是優(yōu)選的方法是將NTG系列稀釋至1-100μg/ml的水平。優(yōu)選的突變體是能過度產生假單孢菌素B、并在基本培養(yǎng)基中生長的突變體。
可選擇環(huán)境分離物、突變體菌株、和其它所需的丁香假單胞菌菌株以獲得所需的生長習性、生長培養(yǎng)基營養(yǎng)來源、碳來源、生長條件、氨基酸需求等的特征。優(yōu)選地，選擇制備假單孢菌素的丁香假單胞菌菌株以使其能在基本培養(yǎng)基例如N21培養(yǎng)基中生長和/或能產生水平大于約10μg/ml的一種或多種假單孢菌素。優(yōu)選的菌株表現出這樣的特征當在包含3種或3種以下的氨基酸和任選的脂質、馬鈴薯產品或其組合的培養(yǎng)基中生長時，能產生一種或多種假單孢菌素。
重組菌株可通過使用本領域已知的方法轉化丁香假單胞菌菌株而制得。通過使用重組DNA技術，可將丁香假單胞菌菌株轉化以表達出除了這些菌株產生的抗生素以外的多種不同基因產物。例如，可修飾菌株以引入多個內源性假單孢菌素生物合成基因的拷貝，來獲得更高的假單孢菌素產率。
為了從野生型丁香假單胞菌或丁香假單胞菌的突變體菌株中產生一種或多種假單孢菌素，在攪拌下將生物體在包含有效量的3種或3種以下氨基酸，優(yōu)選谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、或其組合的含水營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；蛘撸瑢⒏拾彼崤c一種或多種馬鈴薯產品和脂質混合。在能有效地使丁香假單胞菌生長并且生成所需假單孢菌素的條件下進行培養(yǎng)。有效條件包括約22℃-約27℃的溫度、和約36小時-約96小時的培養(yǎng)時間。在丁香假單胞菌的培養(yǎng)期間控制培養(yǎng)基中氧的濃度對于生成假單孢菌素是有利的。優(yōu)選地，將氧水平保持在約5-50％飽和、更優(yōu)選約30％飽和。用空氣、純氧、或包含氧的氣體混合物吹掃可控制培養(yǎng)基中氧的濃度。
在丁香假單胞菌的培養(yǎng)期間控制培養(yǎng)基的pH也是有利的。假單孢菌素在堿性pH下不穩(wěn)定，并且如果培養(yǎng)基的pH在大于約6的水平保持約12小時，則可發(fā)生顯著的降解。優(yōu)選將培養(yǎng)基的pH維持在6-4。當在分批培養(yǎng)物中生長時，丁香假單胞菌可產生一種或多種假單孢菌素。然而，分批補入或半連續(xù)補入葡萄糖和任選補入酸或堿(例如氫氧化銨)以控制pH能提高產量。通過使用其中自動補入葡萄糖和氫氧化銨的連續(xù)培養(yǎng)方法可進一步提高假單孢菌素產量。
選擇丁香假單胞菌可影響所生成的假單孢菌素的量和分布。例如，菌株MSU 16H和67 H1分別主要生成假單孢菌素A，但是也生成假單孢菌素B和C，三者的比例通常為4∶2∶1。通常情況下，菌株67 H1生成的假單孢菌素的水平比菌株MSU 16H生成的水平高約3-5倍。與菌株MSU 16H和67 H1相比，菌株25-B1生成更多的假單孢菌素B和更少的假單孢菌素C。菌株7H9-1的與眾不同之處在于，其主要生成假單孢菌素B，并且假單孢菌素B的產量大于其它菌株。例如，該菌株生成的假單孢菌素B的量可比假單孢菌素A或C大至少10倍。
或者，可由N-?；牒铣苫衔镄纬杀景l(fā)明胺修飾的假單孢菌素化合物。半合成假單孢菌素化合物可通過交換L-絲氨酸單元上的N-?；鶃砗铣伞８鞣NN-?；苌锏膶嵗枋鲈贐elvo，等人于同一日期提交的名稱為“假單孢菌素N-?；鶄孺滎愃莆铩钡牡赺__號PCT專利申請中，該專利申請引入本發(fā)明以作參考。通常使用4個合成步驟來從天然假單孢菌素化合物制備半合成化合物(1)選擇性地保護氨基；(2)用化學或酶法將N-?；鶄孺溍擋?；(3)用不同側鏈再?；?；和(4)將氨基脫保護。
可使用本領域技術人員已知的保護氨基的標準方法將在2、4和5位上的側鏈氨基保護。所用的氨基保護基的特定種類不是至關重要的，只要是在隨后于中間體分子的其它位點上進行反應的條件下其保持穩(wěn)定，并且可在適當位點選擇性地除去、同時又不斷裂包括其它氨基保護基在內的分子的其余部分即可。合適的氨基保護基包括芐氧基羰基、對硝基芐氧基羰基、對溴芐氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基、對甲氧基苯基偶氮基芐氧基羰基、對苯基偶氮基芐氧基羰基、叔丁氧基羰基、環(huán)戊氧基羰基、和鄰苯二甲酰亞氨基。優(yōu)選的氨基保護基是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙氧基羰基、鄰苯二甲酰亞氨基、和芐氧基羰基(Cbz或CBZ)。合適的保護基的其它實例描述在T.W.Greene，“有機合成中的保護基(Protective Groups in OrganicSynthesis)，”John Wiley and Sons，New York，N.Y.，(2nd ed.，1991)，第7章中。
具有γ或δ羥基化側鏈的N-?；?例如3，4-二羥基十四烷酸酯)的脫?？赏ㄟ^在含水溶劑中用酸處理氨基保護的假單孢菌素化合物來實現。合適的酸包括乙酸和三氟乙酸。優(yōu)選的酸是三氟乙酸。如果使用三氟乙酸，該反應可在室溫或接近室溫的溫度下完成。然而，當使用乙酸時，該反應通常在約40℃進行。合適的含水溶劑系統(tǒng)包括乙腈、水、及其混合物。有機溶劑能促進該反應；然而，加入有機溶劑可導致生成其它副產物。
在側鏈上沒有δ或γ羥基的假單孢菌素化合物(例如假單孢菌素B和C’)可用酶方法脫酰。合適的脫酰酶包括多粘菌素?；D移酶(164-16081 Fatty Acylase(粗產物)或161-16091 Fatty Acylase(純)，得自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、或ECB脫酰酶。酶法脫?？墒褂帽绢I域技術人員眾所周知的標準脫酰方法來完成。例如，使用多粘菌素酰基轉移酶的一般方法可參見Yasuda，N.，等人，Agric.Biol.Chem.，53，3245(1989)和Kimura，Y.，等人，Agric.Biol.Chem.，53，497(1989)。
在羰基活化劑存在下，使用所需?；南鄳釋⒚擋．a物(也稱為假單孢菌素核)再酰化。“羰基活化基團”是指能促進在該羰基上進行的親核加成反應的取代基。合適的活化取代基是對羰基有凈吸電子作用的基團。這樣的基團包括但不限于烷氧基、芳氧基、含氮芳香雜環(huán)、或氨基(例如羥苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯苯氧基、N-羥琥珀酰亞胺、N，N’-二環(huán)己基異脲-O-基、和N-氧基-N-甲氧基氨基)；乙酸酯；甲酸酯；磺酸酯(例如甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、和對甲苯磺酸酯)；鹵化物(例如氯化物、溴化物、和碘化物)。
在?；椒ㄖ锌墒褂枚喾N不同的酸。合適的酸包括含有一個或多個側鏈的芳基、烷基、氨基(包括伯胺、仲胺和叔胺)、羥基、烷氧基、和酰氨基的脂族酸；在脂族鏈內含有氮或氧的脂族酸；被烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的芳族酸；和被烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的雜芳族酸。
或者，可使用固相合成，其中是使用羥基苯并三唑-樹脂(HOBt-樹脂)作為?；磻呐悸?lián)劑。
一旦氨基被去?；驮脔；?上述)，即可以通過在氫化催化劑(例如10％Pd/C)存在下氫化來除去氨基保護基(在2、4和5位)。當氨基保護基是烯丙氧基羰基時，該保護基可通過使用氫化三丁基錫和二氯化三苯基膦鈀來除去。該特定保護/脫保護方案的優(yōu)點在于降低了假單孢菌素結構的Z-Dhb單元的乙烯基被氫化的可能性。
然后如下所述進行N-?；牒铣苫衔锏陌沸揎棇⒅辽僖粋€連接在N-?；揎椀陌牒铣杉賳捂呔鼗衔锏馁嚢彼峄?，4-二氨基丁酸肽單元上的側鏈氨基酰化以形成所需的酰胺、脲、氨基甲酸酯或酰亞胺鍵。
可通過將假單孢菌素環(huán)的天冬氨酸和/或羥基天冬氨酸單元的側鏈羧酸基團酰胺化或酯化來進一步修飾該胺修飾的假單孢菌素化合物。各種酸修飾的衍生物的實例描述在Chen等人于同一日期提交的名稱為“假單孢菌素酰胺&酯類似物”的第___號PCT專利申請中，該專利申請引入本發(fā)明以作參考。酸修飾的衍生物可這樣形成將任意上述胺修飾的假單孢菌素化合物與適當醇或胺縮合以分別生成酯和酰胺。
可使用本領域技術人員眾所周知的標準酯化方法形成酯基。在酸性條件下酯化一般包括在質子酸(例如HCl、TFA、對甲苯磺酸等)存在下將假單孢菌素化合物溶于或懸浮在適當醇中。在堿性條件下，一般是在弱堿(例如碳酸氫鈉和碳酸鉀)存在下將假單孢菌素化合物與適當的烷基鹵反應。
酰氨基的形成可使用本領域技術人員眾所周知的標準酰胺化方法來實現。然而，要選擇偶聯(lián)劑來選擇性地修飾酸基團。例如，使用苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)作為偶聯(lián)劑使得能夠同時分離出純的在殘基8的單酰胺和(在有些情況下)純的二酰胺。然而，使用鄰苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)作為偶聯(lián)劑有利于形成在殘基3的單酰胺。
可分離出假單孢菌素酰胺衍生物，并以其自身的形式或其可藥用鹽或溶劑化物的形式使用。術語“可藥用鹽”是指用無機酸和有機酸形成的無毒酸加成鹽。合適的鹽衍生物包括鹵化物、硫氰酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、芳基磺酸鹽、烷基磺酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鏈烷酸鹽、環(huán)烷基鏈烷酸鹽、芳基鏈烷酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡萄糖酸鹽、三氟乙酸鹽等。
術語“溶劑化物”是指包含一個或多個溶質分子(即胺修飾的假單孢菌素化合物)和一個或多個可藥用溶劑分子例如水、乙醇等分子的聚集體。當溶劑是水時，該聚集體稱為水合物。溶劑化物一般是通過在加熱條件下將化合物溶于適當溶劑中，并緩慢地冷卻以生成無定形或結晶溶劑化物形式。
可通過本領域技術人員已知的任何不同方法檢測、測定、分離和/或純化各種假單孢菌素化合物、半合成假單孢菌素衍生物和混合物。例如，肉湯或分離物或純化的組合物中假單孢菌素或胺修飾的假單孢菌素活性水平可通過抗真菌例如假絲酵母屬的抗真菌作用來確定，并且可通過高效液相色譜法分離和純化。
一般是將活性組分(即本發(fā)明假單孢菌素化合物)配制成藥物劑型以提供易于控制的藥物劑量和給患者、醫(yī)師或獸醫(yī)提供雅致且易于使用的產品。制劑可含有0.1％-99.9％重量的活性組分、更通常約10％-約30％重量的活性組分。
本文所用的術語“單位劑量”或“劑量單位”是指含有經計算能產生所需療效的預定量活性組分的物理不連續(xù)單位。當劑量單位經口服或非胃腸道途徑施用時，其一般以片劑、膠囊、丸劑、粉末小包、局部施用的組合物、栓劑、糯米紙囊劑、在安瓿或多劑量容器中的測定量單位等形式提供?；蛘?，劑量單位可以以干燥或液體氣霧劑的形式施用，這樣的氣霧劑可吸入或噴霧給藥。
給藥劑量可根據動物的身體狀況、動物癥狀的嚴重程度、施用藥物的方法以及動物種類而變。對于給定動物，具體劑量通常由負責醫(yī)生或獸醫(yī)決定。
合適的載體、稀釋劑和賦形劑是本領域技術人員眾所周知的，并且包括材料例如碳水化合物、蠟、水溶性和/或可膨脹的聚合物、親水或疏水性物質、明膠、油、溶劑、水等。所用的特定載體、稀釋劑或賦形劑將取決于施用活性組分的手段和目的。制劑還可以包含潤濕劑、潤滑劑、表面活性劑、緩沖劑、增強劑、增量劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜料、香料、矯味劑和它們的組合。
可使用不同方法施用藥物組合物。合適的方法包括局部施用(例如膏劑或噴霧劑)、口服、注射和吸入。特定治療方法將取決于所治療的感染類型。
在非胃腸道靜脈內施用中，通常是將制劑稀釋或重新配制(如果是冷凍干燥的話)并且如果需要的話在給藥前進一步稀釋。對于冷凍干燥產品的重新配制規(guī)程的實例是將10ml注射用水(WFI)加到小瓶中，并輕微攪拌以溶解。重新配制時間一般少于1分鐘。然后在給藥前將所得溶液在輸注溶液例如5％葡萄糖水溶液(D5W)中進一步稀釋。
假單胞菌素化合物已顯示具有抗真菌活性，例如包括抑制以下的傳染性真菌的生長假絲酵母屬各種(即白色念珠菌(C.albicans)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、克魯絲氏假絲酵母(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)或葡萄牙假絲酵母(C.lusitania))；球擬酵母屬各種(即光滑球擬酵母(T.glabrata))；曲霉屬各種(即煙曲霉(A.fumigatus))；組織胞漿菌屬各種(即莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum))；隱球酵母屬各種(即新型隱球酵母(C.neoformans))；芽生菌屬各種(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis))；鐮孢屬各種；發(fā)癬菌屬各種、Pseudallescheria boydii、粗球孢子菌、申克氏孢子絲菌等。
因此，本發(fā)明化合物和制劑可用于制備用于抗全身真菌感染或真菌皮膚感染的藥物。所以本發(fā)明提供了用于抑制真菌活性的方法，包括將本發(fā)明胺修飾的假單孢菌素化合物與真菌接觸。優(yōu)選的方法包括抑制白色念珠菌或煙曲霉的活性。術語“接觸”包括本發(fā)明化合物與真菌的結合或接合或表面的接觸或相互接觸。該術語不意味著對本發(fā)明方法進一步限制，例如通過抑制機理限制。所述方法定義為包括通過本發(fā)明化合物的作用或其固有的抗真菌特性抑制真菌活性。
本發(fā)明還提供了治療真菌感染的方法，包括給需要這種治療的宿主動物施用有效量的本發(fā)明藥物制劑。優(yōu)選的方法包括治療白色念珠菌或煙曲霉感染。術語“有效量”是指能抑制真菌活性的活性化合物的量。給藥劑量將隨諸如感染的性質和嚴重程度、宿主的年齡和一般健康狀況、宿主對抗真菌劑的耐受性和宿主種類這樣的因素而變。特定給藥方案同樣可根據這些因素而變。藥物可以以單次日劑量或者在一天期間多次劑量的方式施用。給藥治療可持續(xù)約2-3天到約2-3周或更長。日劑量(以單劑量或均分劑量施用)一般含有約0.01mg/kg-100mg/kg體重活性化合物的劑量水平。優(yōu)選的日劑量一般為約0.1mg/kg-60mg/kg、更優(yōu)選為約2.5mg/kg-40mg/kg。宿主可以是任何動物，包括人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物供應動物(例如牛、豬、羊和家禽)、動物園動物、海洋動物、鳥類以及其它類似種屬動物。
實施例在整個實施例中使用下述縮寫以代表各物質ACN-乙腈TFA-三氟乙酸DMF-二甲基甲酰胺EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽BOC＝叔丁氧基羰基，(CH3)3C-O-C(O)-CBZ＝芐氧基羰基，C6H5CH2-O-C(O)-PyBOP＝苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽TBTU＝鄰苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽DIEA＝N，N-二異丙基乙基胺使用下述結構II來描述在實施例1-7中觀測的產物。 抗真菌活性的檢測和定量測定通過使用標準瓊脂稀釋測試或圓盤擴散測試獲得化合物的最小抑制濃度(MIC)來在體外測定抗真菌活性。在抗真菌活性測試中使用的典型真菌是白色念珠菌。當測試樣本(50μl)對接種到瓊脂板上的白色念珠菌的抑制引起10-12mm直徑區(qū)域帶時認為有顯著抗真菌活性。尾靜脈毒性在第0、24、48和72小時，用0.1ml測試化合物(20mg/kg)經由側尾靜脈靜脈內(IV)給藥來治療小鼠。每組包括2只小鼠。將化合物配制在0.5％葡萄糖和無菌注射用水中。首次治療后監(jiān)測小鼠7天，并密切觀察包括紅斑、腫脹、變色、壞死、尾損失在內的刺激征狀以及表明毒性的其它副作用征狀。
在該實驗中使用的小鼠是遠系繁殖的，雄性ICR小鼠的平均體重為18-20g(得自Harlan Sprangue Dawley，Indianapolis，IN)。
制備 化合物1a-1購自Novabiochem(San Diego，CA)。
制備化合物2a-1 化合物2a-1是使用在Admiak，R.W.，等人，Tetrahedron Lett.，No.22，1935-1936(1997)中描述的方法制備的。
在每一下述實施例中，使用特定假單孢菌素化合物作為原料；然而，本領域技術人員應當認識到，使用相同方法，用具有不同N-?；募賳捂呔鼗衔镒鳛樵峡珊铣善渌麼-?；苌?。
實施例1實施例1舉例說明了假單孢菌素B的?；榛费苌?n＝10，R2和R3＝-OH)的形成。合成化合物1-1:
R1′、R1″和R1＝-C(O)CH2NH21-1向50ml圓底燒瓶中加入10ml無水DMF、假單孢菌素B(250.6mg，0.181mmol)和?；瘎?a-1(343.0mg，1.12mmol)。將該反應在室溫下攪拌24小時。然后在真空下除去溶劑，用ACN處理殘余物，并通過制備HPLC純化，冷凍干燥后獲得了172.5mg三取代的保護的胺。將134.4mg三取代的保護的胺溶于10ml MeOH/1.5ml冰醋酸溶液中。使用129.6mg 10％Pd/C標準氫化20分鐘，通過過濾除去催化劑，并通過制備HPLC純化，冷凍干燥后，獲得了74.8mg化合物1-1。MS(離子噴霧)C57H97ClN15O22(M+H)+的計算值為1378.65，實測值為1378.9。
使用與上述相同的方法，并用適當氨基酸形成?；瘎珊铣?1-2和1-3)。 實施例2實施例2舉例說明了假單孢菌素B的酰氧基芳基衍生物(n＝10，R2和R3＝-OH)的合成。合成化合物2-1 除了用化合物2a-1作為?；瘎┩猓褂门c實施例1所述相同的方法合成化合物2-1。
或者，可如下所述合成化合物2-1在0-4℃，將氯甲酸苯酯(389mg，2.48mmol)加到HOBT(37.5mg，2.48mmol)和DIEA(322.8mg，399ml，2.48mmol)的溶液中。將該混合物用100ml DMF稀釋，并加入假單孢菌素B(1.0g，0.83mmol)。將該混合物攪拌過夜。然后在真空下除去溶劑，并通過HPLC純化殘余物，獲得了430mg(產率為33％)化合物2-1。
實施例3實施例3舉例說明了假單孢菌素B的?；榛苌?n＝10，R2和R3＝-OH)的合成。合成化合物3-1 除了用乙酸酐作為?；瘎┩猓褂门c實施例1所述相同的方法合成化合物3-1。合成化合物3-2 除了用三甲基乙酸酐作為?；瘎┩猓褂门c實施例1所述相同的方法合成化合物3-2。
實施例4實施例4舉例說明了假單孢菌素B的?；s烷基(即脲鍵)衍生物(n＝10，R2和R3＝-OH)的合成。合成化合物4-1 除了用異氰酸甲酯作為?；瘎┩?，使用與實施例1所述相同的方法合成化合物4-1。
實施例5實施例5舉例說明了假單孢菌素B的甲?；苌?n＝10，R2和R3＝-OH)的合成。 除了用甲酸4-硝基苯基酯作為酰化劑外，使用與實施例1所述相同的方法合成化合物5-1。
實施例6實施例6舉例說明了假單孢菌素B的酰氧基烯基衍生物(n＝10，R2和R3＝-OH)的合成。 除了用二碳酸二烯丙基酯(diallylpyrocarbonate)作為?；瘎┩猓褂门c實施例1所述相同的方法合成化合物6-1。產率為77％
權利要求
1.具有下述結構的胺修飾的假單孢菌素化合物、及其可藥用鹽和溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨立地為氫或甲基，或者Ra或Ra′為烷基氨基、與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳環(huán)；Rb和Rb′獨立地為氫、鹵素、或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羥基；Rc是氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基(C1-C4)烷氧基，或者與Re一起形成6-元芳環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是氫，或者與Rf一起形成6-元芳環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳環(huán)、或C5-C14烷基取代的6-元芳環(huán)，且Rf是C8-C18烷基、或C5-C11烷氧基；R是 其中Rg是氫、或C1-C13烷基，且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是氫、鹵素、或C5-C8烷氧基，且m是1、2或3；R是 其中Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基；或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1獨立地為氫、甲?；?、?；榛Ⅴ；榛贰Ⅴ；s烷基、酰氧基烯烴、酰氧基芳基、或酰基亞甲基氨基甲酸酯，條件是至少有一個R1不是氫；R2和R3獨立地為-OR2a、或-N(R2b)(R2c)，其中R2a和R2b獨立地為氫、C1-C10烷基、C3-C6環(huán)烷基、羥基(C1-C10)烷基、烷氧基烷基、或C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、雜芳基(C1-C10)烷基、環(huán)雜烷基(C1-C10)烷基，或者R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基，且R2c是氫或C1-C6烷基。
2.權利要求1的胺修飾的假單孢菌素化合物，其中所述?；鶃喖谆被姿狨ビ山Y構1(a)代表 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，且R1b是氫或甲基。
3.權利要求1的胺修飾的假單孢菌素化合物，其中所述氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基由-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(對羥基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2(5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、或-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2代表。
4.前述權利要求任一項的化合物在制備用于抗全身真菌感染或真菌皮膚感染的藥物中的應用。
5.一種藥物制劑，它包含權利要求1的胺修飾的假單孢菌素化合物和可藥用載體。
6.治療動物中抗真菌感染的方法，該方法包括給所述動物施用權利要求1的胺修飾的假單孢菌素化合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了結構(I)所代表的胺修飾的假單孢菌素化合物,其中R
文檔編號C07K7/00GK1361790SQ00810326
公開日2002年7月31日 申請日期2000年6月8日 優(yōu)先權日1999年7月15日
發(fā)明者S·H·陳, J·A·亞米森, M·J·羅德里格茨, X·D·孫, V·瓦蘇德范, M·J·茨維菲爾 申請人:伊萊利利公司