專利名稱：作為除草劑作用位點(diǎn)的色氨酸合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定用作除草劑的色氨酸合酶(TS)的抑制劑的方法，TS抑制除草劑，對(duì)本發(fā)明的除草劑和其它已知除草劑有抗性的TS酶的變體的設(shè)計(jì)方法，TS酶變體本身，編碼這些TS酶變體的多核苷酸，表達(dá)TS酶變體的植物，和雜草控制方法。
現(xiàn)在申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)在色氨酸生物合成中涉及的酶TS對(duì)于除草劑是有用的靶點(diǎn)。在動(dòng)物中缺失TS的同源基因和色氨酸合成途徑是有利的，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的除草劑對(duì)于人和動(dòng)物沒(méi)有毒性。
色氨酸合酶(TS)催化色氨酸生物合成中最后兩個(gè)反應(yīng)，并且由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基四個(gè)亞基組成。TSα亞基催化逆醇醛縮合反應(yīng)，其中吲哚甘油-3-磷酸(IGP)被裂解得到吲哚和D-甘油醛-3-磷酸(GAP)。來(lái)自TSα亞基反應(yīng)的吲哚通過(guò)一個(gè)25埃通道到達(dá)β亞基活性位點(diǎn)。該β亞基催化L絲氨酸和吲哚的縮合作用生成色氨酸。

圖1給出了這些反應(yīng)。在該反應(yīng)中合成的色氨酸是基本氨基酸之一。有證據(jù)證明色氨酸是植物激素吲哚乙酸的前體。
曾進(jìn)行過(guò)鑒定TS的抑制劑的嘗試。例如，底物類似物磷酸吲哚-3-丙醇(IPP)被描述為是TSα亞基的一種抑制劑(Kirschner等，歐洲生物學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)1975，60513)。但是，如實(shí)施例所述，IPP對(duì)酶活性的抑制水平是有節(jié)制的。該化合物沒(méi)有任何除草活性。
Shuto等(除草劑科學(xué)(Pesticide Sci.)1989，1469)在認(rèn)為測(cè)試TSβ反應(yīng)的抑制的較早期測(cè)定中對(duì)一些吡啶衍生物測(cè)試了它們抑制TS的活性。Shuto對(duì)稻作物測(cè)試了幾種這樣的化合物，并且發(fā)現(xiàn)只有一種減緩植物生長(zhǎng)，這就是2-巰基苯并咪唑(MBI)。但是，Shuto沒(méi)有觀察到TS是否是對(duì)MBI的直接靶物。該文章沒(méi)有證據(jù)證明生長(zhǎng)的減緩是否由于色氨酸生物合成的抑制(與很多酶的非選擇性抑制相反)產(chǎn)生這樣的作用機(jī)理。沒(méi)有證明化合物與TS酶復(fù)合物特異性相互作用，也沒(méi)有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)研究供給外源色氨酸是否可以反轉(zhuǎn)抑制劑的有害作用。該化合物盡管是Shuto描述過(guò)最具活性的酶抑制劑，但是與IPP相比也具有小得多的抗TS活性。因此，即使是在Shuto的文章公開之后10年，本領(lǐng)域仍然存在對(duì)于具有除草活性的TS直接抑制劑的需要。
現(xiàn)在，本發(fā)明人利用除草逆轉(zhuǎn)方法和晶體學(xué)研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明TS是本發(fā)明的抑制劑的直接靶物。因此，他們出人意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法(即高通量篩選TS抑制劑，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)TS抑制劑，和開發(fā)除草劑抗性基因的方法)和它們?cè)阼b定有效除草劑中的用途。
因此，本發(fā)明的一方面提供了具有與TS結(jié)合并且抑制色氨酸生物合成性質(zhì)的TS的抑制劑，以及分離的TS和本發(fā)明的抑制劑的復(fù)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了利用(i)以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的方法和/或(ii)靶向的高物料通過(guò)量化合物篩選來(lái)鑒定新的TS抑制劑的方法。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了從植物組織或者從含有重組產(chǎn)生的植物TS的細(xì)菌培養(yǎng)物純化植物TS的方法和如此純化的植物酶。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了對(duì)本發(fā)明的抑制劑的抑制作用有抗性的TS酶的變體，和表達(dá)變體TS的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物。
在另一方面，本發(fā)明提供了使用根據(jù)本發(fā)明鑒定的除草劑進(jìn)行雜草控制的方法。
圖2是色氨酸合酶的膦酸抑制劑1-5的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
圖3A-3E是五種膦酸抑制劑和α亞基活性位點(diǎn)處催化殘基之間的氫鍵合相互作用和相對(duì)距離的示意圖(A)抑制劑1；(B)抑制劑2；(C)抑制劑3；(D)抑制劑4；和(E)抑制劑5。
圖4代表TS與吲哚-丙醇-3-磷酸的復(fù)合物(在αTS的活性位點(diǎn)空穴(pocket)中紫紅色空間填充模型，如線網(wǎng)圖所示，標(biāo)出了Connolly表面(1.4埃探測(cè)半徑，通過(guò)Delphi-產(chǎn)生的靜電電位著色))，注意吲哚平面下面的空穴不良的填充和抑制劑構(gòu)型。
圖5代表空穴中TS與{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的復(fù)合物。注意改進(jìn)了結(jié)合位點(diǎn)的填充，改進(jìn)的范德華接觸提高了親和力。
圖6代表αTS中吲哚環(huán)系的結(jié)合位點(diǎn)示意圖。黃色表面表明αTS結(jié)合空穴的Connolly-表面。藍(lán)色的球和棍模型代表X-射線結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的吲哚環(huán)的位置(2trs)。紅色棍模型代表{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的位置。綠色線代表LUDI檢索到的選擇的片段命中物(hits)。這證明加上了大基團(tuán)例如{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的甲氧基占據(jù)了空間的部分。事實(shí)上，與TS復(fù)合物中的該化合物的X-射線結(jié)構(gòu)表明甲氧基經(jīng)歷大范圍的自轉(zhuǎn)，與該模型吻合。
圖7給出疊加到有與活性位點(diǎn)結(jié)合的{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸的TS的結(jié)構(gòu)上面的Ludi Fragment hit #019。顯然，該程序發(fā)現(xiàn)有OH置換NH基團(tuán)的片段是與αAsp60相互作用位點(diǎn)。雖然OH置換NH2稍微減弱了抑制劑結(jié)合，苯酚基導(dǎo)致好得多的除草曲線(profile)，可能由于導(dǎo)致增加的吸收和易位的提高的酸性。
圖8是與TS結(jié)合的吲哚-丙醇-磷酸和{4-[(2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸(中心綠色的球)的疊加延伸進(jìn)一個(gè)空穴，這個(gè)空穴在其它中尤其由αA129(空間填充的代表，左側(cè))和αIle153(空間填充的模型，右側(cè))之間產(chǎn)生的；這些位點(diǎn)是誘變的高度引人注意的靶物。
發(fā)明的詳細(xì)描述這里引述的所有專利，專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)全部引作參考。在任何不一致的情況下以本發(fā)明公開為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及鑒定是TS抑制劑的除草劑，新的除草劑，經(jīng)遺傳工程處理對(duì)這些除草劑產(chǎn)生抗性的農(nóng)作物和使用除草劑防治雜草的方法。除草抑制劑這里具體列出的TS除草抑制劑以及使用下面描述的方法鑒定的抑制劑具有與TS結(jié)合并且取消色氨酸合成的性質(zhì)?？梢宰C明通過(guò)對(duì)活生物或組織并列施用色氨酸可以抑制或者基本上緩解這些抑制劑的除草作用。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“除草抑制劑”指一種化合物，其(i)與TS結(jié)合并且具有(體外和/或體內(nèi))抑制色氨酸合成的性質(zhì)和(ii)作為除草劑是有效的。
如果將酶活性減小50％需要的濃度(I50)是低nM至大約20μM的范圍，則認(rèn)為一種化合物“作為抑制劑是有效的”。在一個(gè)實(shí)施方案中，I50值最大是大約10μM，優(yōu)選最大是大約1μM，最優(yōu)選更小。在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶活性水平小于500nM。
如果用化合物處理之后植物或植物組織死亡或者嚴(yán)重?fù)p傷或發(fā)育不良，使得其預(yù)期不再存活產(chǎn)生種子或者不再具有農(nóng)業(yè)生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)性，則認(rèn)為一種化合物“作為除草劑是有效的”。對(duì)于一種有效除草劑化合物，其必定提供一種傷害植物的方法。需要的化合物的量將取決于多種因素，但是其中一個(gè)因素要是當(dāng)以合理濃度的抑制劑使用時(shí)該化合物干擾植物中的關(guān)鍵過(guò)程?？梢泽w外測(cè)定該濃度，其對(duì)于所有其它因素同樣合道理，體外最具有抑制性的化合物具有作為除草劑的最有抑制性的潛力。商業(yè)上可行的除草劑在低于20μM下且優(yōu)選低于1μM的濃度下將抑制靶酶的活性的50％。
如這里使用的，“體外”指植物機(jī)體之外。該術(shù)語(yǔ)包括不含細(xì)胞和包含細(xì)胞的系統(tǒng)兩者(例如測(cè)定)。
本發(fā)明的除草抑制劑可以與該酶的任何活性位點(diǎn)結(jié)合，例如α或β亞基的活性位點(diǎn)或連接所述亞基的疏水性通道。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的除草抑制劑是與α亞基的活性位點(diǎn)結(jié)合的化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，除草TS抑制劑是具有下面結(jié)構(gòu)式I的芳基硫基烷基-和芳基硫基鏈烯基膦酸和衍生物 其中Y是氫或鹵素；Z是NH2或OR2；R2是氫，C1-C4烷基羰基或苯甲?；籲是0，1或2的整數(shù)；W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自獨(dú)立地是氫，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亞甲基或堿金屬，銨或有機(jī)銨陽(yáng)離子。
本發(fā)明的優(yōu)選的式I除草劑是那些化合物，其中Y是氫，F(xiàn)或Br；Z是NH2或OR2；R2是氫，C1-C4-烷基羰基或苯甲?；籲是0或1的整數(shù)；W是-(CH2)4-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自獨(dú)立地是氫，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亞甲基或堿金屬或有機(jī)銨陽(yáng)離子。
是特別有效的除草劑的本發(fā)明的芳基硫基烷基-和芳基硫基鏈烯基膦酸和衍生物其中包括{4-[(鄰-羥基苯基)硫基]-1-丁烯基}膦酸；{4-[(鄰-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸二乙酯；{4-[(鄰-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸二鋰；{4-[(鄰-氨基苯基)硫基]丁基}膦酸，與環(huán)己基胺(1∶2)的化合物；雙(羥基甲基){4-[(鄰-羥基苯基)硫基]丁基}膦酸酯二新戊酸酯；{4-[(鄰-羥基苯基)亞磺酰基]丁基}膦酸，與環(huán)己基胺(1∶2)的化合物；{4-[(鄰-羥基苯基)硫基]丁基}膦酸，與N，N，N’，N’-四甲基乙二胺的化合物；{4-[(鄰-羥基苯基)亞磺?；鵠丁基}膦酸；{4-[(鄰-羥基苯基)硫基]丁烯基}膦酸，芳基丁酸酯；和{4-[(鄰-羥基苯基)硫基]-1-丁烯基}膦酸，與異丙基胺(1∶2)的化合物。
上面鹵素的例子是氟，氯，溴和碘。在上面的式I中，堿金屬可以包括鈉，鉀和鋰。此外，術(shù)語(yǔ)有機(jī)銨被定義為由一個(gè)或兩個(gè)帶正電荷的氮原子組成的基團(tuán)，每一個(gè)氮原子連接形成一至四個(gè)C1-C16烷基，前提是當(dāng)該基團(tuán)包含兩個(gè)帶正電荷的氮原子時(shí)，有機(jī)銨陽(yáng)離子R和R1各自存在于相同的基團(tuán)中。本發(fā)明的這些優(yōu)選的除草抑制劑可以根據(jù)美國(guó)專利No.5635449所述制備。
除了上述除草抑制劑之外，這里所述的任何除草抑制劑，或者使用這里所述方法鑒定的所有的除草抑制劑都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，除草抑制劑如這里所述但是不是式I的抑制劑。
與α亞基的活性位點(diǎn)結(jié)合的本發(fā)明的除草抑制劑可以模擬天然TSα底物的結(jié)構(gòu)，磷酸吲哚-3-甘油酯(IGP)和其中間產(chǎn)物(兩者皆在圖1中給出)。參照?qǐng)D1，IGP及其反應(yīng)中間體包含一個(gè)吲哚環(huán)，一個(gè)烷基鏈連接體和一個(gè)磷酸根。
在一個(gè)實(shí)施方案中，除草抑制劑與原底物IGP的不同之處在于至少下面一個(gè)方面(i)吲哚環(huán)的C2原子被去除產(chǎn)生6-元環(huán)；(ii)用具有與TSα亞基的氨基酸αD60相互作用的性質(zhì)的氫鍵供體(可以使用NH，羥基或類似基團(tuán))置換吲哚-NH基團(tuán)；(iii)構(gòu)建的連接體區(qū)優(yōu)選是疏水性的，(iv)連接體可以包含一個(gè)或多個(gè)C＝C雙鍵，(v)連接體具有與四個(gè)單鍵鍵連的碳原子的線性鏈的長(zhǎng)度類似的長(zhǎng)度(連接體是C4H8類似物)和(vi)用膦酸根基團(tuán)置換磷酸根基團(tuán)。可以對(duì)6-元環(huán)加上取代基，例如鹵素，其可以影響π-電子云中的電子密度并且影響芳香堆積和抑制劑的芳香環(huán)的結(jié)合。除了亞甲基基團(tuán)鏈外，連接體可以包含酰胺，C＝C雙鍵，或者甚至環(huán)系，象環(huán)己基或苯基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以用硫(S)置換C3原子(例如圖1)。
所提到的所有的氨基酸均用其單字母代碼和它們?cè)诿钢械奈恢帽硎?。氨基酸位置編?hào)參照來(lái)自沙門氏菌屬的TS酶。前綴“α”指氨基酸位于TSα亞基中。前綴β指氨基酸位于TSβ亞基中。
利用本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步修飾和測(cè)試本發(fā)明的除草抑制劑。例如可以加上另外的基團(tuán)以更好地填滿酶結(jié)合位點(diǎn)或者與排齊(line)酶結(jié)合位點(diǎn)的其它基團(tuán)相互作用。例如可以向連接體或者吲哚C3或硫的鄰近位置中的別處加上另外的極性基團(tuán)。該極性基團(tuán)，例如NH或羥基這樣的連接體上另外的氫鍵供體可以與TsααY175-OH或αE49的氨基酸相互作用以進(jìn)一步改善結(jié)合。另一種修飾可能涉及使芳香環(huán)系再成型以優(yōu)化與αD60相互作用的氫鍵供體的位置。
此外，可以設(shè)計(jì)修飾來(lái)改進(jìn)抑制劑的除草活性。通過(guò)加上在施用后通過(guò)化學(xué)或酶裂解可以去除的片段可以設(shè)計(jì)帶電荷或極性基團(tuán)(例如磷酸根/膦酸根，或羥基或氨基)的化學(xué)修飾?？梢栽O(shè)計(jì)這些修飾來(lái)改進(jìn)代謝穩(wěn)定性，吸收(uptake)和/或易位。例如，體外活性抑制劑的酯化或成鹽都大大提高其除草活性。類似地，通過(guò)用苯酚-OH基團(tuán)置換減小苯胺基的堿性并且接著掩蔽羥基，導(dǎo)致當(dāng)前最有效力的對(duì)于TS的除草劑。類似地，可以使用其它基團(tuán)，象磺酰胺來(lái)掩蔽氨基或膦酸根基團(tuán)。
以攜帶上述式I的結(jié)合的抑制劑的TS酶的晶體學(xué)研究為基礎(chǔ)(其中的一些在實(shí)施例18中描述)，認(rèn)識(shí)了TS酶及其抑制劑之間的相互作用。以這些相互作用為基礎(chǔ)，其中的一些如下所述，可以設(shè)計(jì)并評(píng)價(jià)另外的抑制劑。
膦酸根基團(tuán)與TS蛋白質(zhì)之間的極性相互作用包括氫鍵和靜電相互作用網(wǎng)絡(luò)。膦酸根氧原子中的一個(gè)與αG213和αG184的酰胺氫直接相互作用。第二個(gè)膦酸根氧原子與αG234的骨架HN和與緊密鍵合的水分子相互作用，這又與α232的羰基形成一個(gè)氫鍵。水的氧與αI214和αF212的酰胺氫原子相互作用。該水分子位于α-螺旋αK243對(duì)αS235的軸的延伸。該螺旋是根據(jù)Hyde 1988命名的螺旋H8’(Hyde等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)263，33(1988)17857)，并且被認(rèn)為對(duì)通過(guò)其兩極場(chǎng)的磷酸根基團(tuán)的結(jié)合有貢獻(xiàn)。另外，螺旋H8’-封端的αS235的側(cè)鏈官能度和它的羰基兩者都與第三個(gè)膦酸根氧原子強(qiáng)烈地相互作用。如實(shí)施例18所述，αS235/膦酸根相互作用是通過(guò)一個(gè)非常強(qiáng)的氫鍵進(jìn)行的。本項(xiàng)研究證明(如在2σ顯示輪廓的電子密度圖)這兩個(gè)基團(tuán)之間的連續(xù)的電子密度。與αS235羥基緊鄰的是另一個(gè)電子密度點(diǎn)，其對(duì)鍵合的水分子有貢獻(xiàn)。另一個(gè)帶正電荷的基團(tuán)αR179的胍鎓基團(tuán)緊鄰膦酸根而沒(méi)有直接的氫鍵相互作用。對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的靜電相互作用表面的分析(應(yīng)用Finite Element Poisson-Bolzman計(jì)算法計(jì)算)指明其中膦酸根基團(tuán)被鍵合的強(qiáng)正電勢(shì)。該正電勢(shì)由HN基團(tuán)指向膦酸根的作用和R1909的存在產(chǎn)生的。
其它帶電基團(tuán)對(duì)磷酸根基團(tuán)的置換不被TS酶很好地耐受。這可能因?yàn)榱姿岣喈?dāng)特異性地通過(guò)定向氫鍵鍵合，該氫鍵由骨架氨基酸基團(tuán)而不是由較小定向的鹽相互作用帶來(lái)。但是對(duì)于除草設(shè)計(jì)目的，可以被代謝產(chǎn)生磷酸根或膦酸根的基團(tuán)，例如酯或磺酰胺，對(duì)于植物攝入(uptake)目的是優(yōu)選的。
此外，有兩個(gè)與膦酸根鍵合位點(diǎn)相鄰的另外的不同的鍵合空穴。這些位點(diǎn)可以填充以合適的配體來(lái)改進(jìn)結(jié)合親合力和選擇性。通過(guò)使用以片段為基礎(chǔ)的檢索可以設(shè)計(jì)那些配體(例如，如下所述使用LUDI程序)。
將膦酸根與芳基連接在一起的脂肪鏈?zhǔn)沁B接體區(qū)。其與寬得足以允許相當(dāng)?shù)娜犴g性的酶通道鍵合。與TS酶鍵合的{4-[(2-氨基-5-氯苯基)硫基]丁基}膦酸的電子密度提示連接體鏈的雙面旋轉(zhuǎn)自由度。與連接體接觸的TS通道線(lining)的表面是部分疏水性的，由于αF22和αI64的側(cè)鏈。但是，極性基團(tuán)，例如αY175-OH和骨架酰胺導(dǎo)致部分極化的酶表面而不必須和對(duì)于底物的甘油基部分一樣提供直接的氫鍵接觸。例如以酰胺基團(tuán)的形式在連接體區(qū)中引入氫鍵供體/受體不導(dǎo)致提高的結(jié)合親合力，表明氫鍵的形成不補(bǔ)償由于相當(dāng)疏水性酶位點(diǎn)中疏水性基團(tuán)的引入的熵的損失。另一方面，利用C＝C雙鍵提高連接體區(qū)的剛性確實(shí)提高鍵合的自由能。
為設(shè)計(jì)連接體區(qū)的修飾進(jìn)行的LUDI檢索提示有足夠的空間引入苯基或環(huán)己基，即芳基-S-環(huán)己基-膦酸酯型分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。沒(méi)有預(yù)期那些修飾大大提高化合物的結(jié)合親合力，但是其適合引入用于提高除草選擇性或用于提高吸收和易位的代謝操作。
本發(fā)明的抑制劑的硫代芳基(thioaryl)結(jié)合到吲哚-結(jié)合空穴之中，鄰-氨基指向αD60。當(dāng)αE49折疊離開酶裂解的可能的位點(diǎn)并且與αY4和αS125形成水介導(dǎo)的氫鍵時(shí)，硫-酯硫原子位于αF22，αI232，αL100，αL127和αY175產(chǎn)生的疏水性空穴的相對(duì)深處。硫代芳基的結(jié)合相當(dāng)程度上不同于先前描述過(guò)的吲哚衍生物的結(jié)合該硫代芳基環(huán)相對(duì)與TS的復(fù)合物中吲哚衍生物的位置移動(dòng)并且傾斜。抑制劑的芳香部分夾在αL100 on和αF212之間。αF212的苯基平面與抑制劑的芳基平面垂直。αF212的T-形堆積和抑制劑/底物的芳基是T-形π-π相互作用的指征(Burley，S.K.和Petsko，G.A.科學(xué)，229(1985)23)。
αF212的骨架采取了/ψ＝-75/155構(gòu)型，這被認(rèn)為對(duì)于自由的氨基酸在能量方面上是“禁用的”并且通過(guò)電子密度清楚地判斷。這與較早期Rhee等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2738553-5，1998報(bào)道過(guò)的IGP/TS復(fù)合物的X-射線分析得到的結(jié)果相反。膦酸，{4-[(2-氨基-5-氯代苯基)硫基]丁基}-/TS復(fù)合物的電子密度也表明αF212的CZ處的提高的電子密度。骨架位置中該明顯變化揭示膦酸根結(jié)合和芳基結(jié)合之間的密切關(guān)系，現(xiàn)在在這里報(bào)道的X-射線研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)。
αF212和硫代芳基彼此之間的相對(duì)位置(這在這項(xiàng)工作之前是未知的并且從IPP/TS復(fù)合物研究的相似性不能得出)證明芳基中各原子位置處的電子密度對(duì)于結(jié)合親合力是非常關(guān)鍵的。吡啶類似物的親合力的丟失，和用R＝Br＞Cl＞OMe＞H＞CH3取代的系列對(duì)位取代的硫代-芳基類似物的結(jié)合親合力(取代基位于硫的對(duì)位，氨基的間位)通過(guò)T-形芳基-芳基堆積相互作用得以清楚的解釋，其中αF212的氫原子結(jié)合到硫代芳基的π電子云之中。在硫的對(duì)位提高的電子離域作用因此預(yù)期對(duì)結(jié)合是關(guān)鍵的。此外，對(duì)位取代基不必是小的，事實(shí)上，較大的取代基將很好地被耐受，并且可以用來(lái)獲得除草劑選擇性，因?yàn)槟切┤〈鶎⒀由斓降鞍踪|(zhì)的區(qū)域中，該區(qū)域在物種間保守性不強(qiáng)。因此，O-R，S-R等類型的基團(tuán)是改進(jìn)除草劑的候選物。
在極性相互作用網(wǎng)絡(luò)中涉及的抑制劑的氨基，該相互作用首先包括與αD60的羧酸酯官能度的鹽橋，其進(jìn)一步與αT183，αY102-OH，αN68-NH2和水分子相互作用。伯氨基位于形成與αD60的二配位基氫鍵的方向。但是，相應(yīng)的H-O距離2.2埃和3.0埃相當(dāng)長(zhǎng)。氨基也接近αF22，并且可能對(duì)該芳香體系具有極化效應(yīng)。
就除草性能來(lái)說(shuō)用羥基置換氨基是有利的。這歸因于相對(duì)氨基官能度的降低的堿性。因此，掩蔽(mask)氨基的基團(tuán)，例如，磺酰胺衍生物具有改進(jìn)的除草曲線。
靜電電勢(shì)計(jì)算證明在自由酶和在與抑制劑的復(fù)合物中αG49被質(zhì)子化了。這將酶去穩(wěn)定大約10kJ/mol。引入與αG49相互作用的另一個(gè)堿性基團(tuán)預(yù)期以提高的結(jié)合親合力的形式釋放該能量。因此，在合適的位置，即連接體區(qū)的起端，加上例如一個(gè)氨基，預(yù)期是有益的。但是，需要優(yōu)化空間條件，但是在相互作用能量中獲得的大電勢(shì)足以使得膦酸酯-連接體部分置換。
TS酶(作為完整的或各個(gè)亞基)和本發(fā)明的抑制劑之間形成的復(fù)合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在其自然環(huán)境下，即在攜帶TS的生物體或細(xì)胞中，不形成該復(fù)合物。因此，使用分離的和純化的TS或者其亞基可以體外形成該復(fù)合物。該復(fù)合物在這里稱之為“分離的”。
TS或者其亞基的“純化”指通過(guò)將其從它的原來(lái)環(huán)境(例如其天然環(huán)境)取出的蛋白質(zhì)或多肽的衍生。多肽純化的方法是本領(lǐng)域公知的，包括并非限制的有制備片-凝膠電泳，等電點(diǎn)聚焦，HPLC，反相HPLC，凝膠過(guò)濾，離子交換和分配色譜法，和反流分布法。為了某些目的，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中產(chǎn)生多肽，其中蛋白質(zhì)包含有利于純化的另外的序列標(biāo)記，例如但不限于多組氨酸序列。然后通過(guò)在合適的固相基質(zhì)上進(jìn)行色譜可以從宿主細(xì)胞的粗溶解物中純化多肽。或者，抗TS蛋白質(zhì)它的亞基或者抗從中衍生的肽的抗體可以被用作純化試劑。其它純化方法是可能的，實(shí)施例中詳細(xì)描述了其中的一些方法。純化的多核苷酸或多肽可以含有少于大約50％，優(yōu)選少于大約75％，最優(yōu)選少于大約90％的其原始結(jié)合的細(xì)胞成分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，TS或者其亞基基本上是純的，這指最高的純度，應(yīng)用本領(lǐng)域公知的常規(guī)純化技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，TS/抑制劑復(fù)合物在植物(planta)中形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該復(fù)合物(體內(nèi)或體外形成的)不包含式I的抑制劑。對(duì)于除草劑設(shè)計(jì)目的，可以產(chǎn)生該復(fù)合物作為一個(gè)模型，例如作為坐標(biāo)系，用于在計(jì)算機(jī)圖解工作站上展示，用于藥物設(shè)計(jì)算法的應(yīng)用，這一點(diǎn)如下所述。鑒定除草抑制劑的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定新的TS抑制劑的方法，使用(i)高物料通過(guò)量化合物篩選，(ii)以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的方法和/或(iii)同源性方法。A.高物料通過(guò)量篩選可以在本領(lǐng)域公知的方法中使用用于鑒定TS的新的抑制劑的高物料通過(guò)量篩選?？梢院铣稍诟呶锪贤ㄟ^(guò)量測(cè)試中測(cè)定的化合物并且隨機(jī)測(cè)定，或者可以以上面的考慮為基礎(chǔ)篩選化合物。本說(shuō)明書中描述的TS測(cè)試可以用來(lái)測(cè)定這些化合物的活性。實(shí)施例6中描述了這樣一種測(cè)試的例子(使用大腸桿菌突變株的補(bǔ)充測(cè)試(complementationassay))。但是，可以使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的能測(cè)定TS酶的抑制作用的的任何測(cè)試。B.以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的方法以示構(gòu)(rational)/結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的TS的新的抑制劑的設(shè)計(jì)，使用公知的抑制劑或者其片段對(duì)化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，優(yōu)化所需的抑制劑的性質(zhì)的方法(例如使用單獨(dú)的TS或者與抑制劑復(fù)合的TS的三維結(jié)構(gòu))都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
為了支持以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)和TS抑制劑的優(yōu)化，可以建立下面的體系，下面的體系描述于本文沙門氏菌屬和擬南芥屬TS亞基的產(chǎn)生，包括新的微量滴定板TSβ-亞基測(cè)定的TS測(cè)定，和用于TS結(jié)晶以改進(jìn)用于提高TSα-亞基(TSα)的三維結(jié)構(gòu)的分辨度的X-射線衍射圖案。另外，產(chǎn)生抑制劑與之鍵合的三維結(jié)晶的TS結(jié)構(gòu)，并且應(yīng)用證實(shí)設(shè)計(jì)的抑制劑在植物中(in planta)的作用機(jī)理的方法。TS蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和結(jié)晶使用這里描述的方法或者本領(lǐng)域公知的其它方法，從含有TS或者含有編碼TS的異源基因的任何生物體，可以產(chǎn)生，分離和純化TS。作為一個(gè)實(shí)施例，下面描述沙門氏菌屬TS的大量產(chǎn)生和純化。
使用用攜帶鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimiurium)trpA和trpB基因的質(zhì)粒pSTB7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌CB149 pSTB7菌株的37℃ 60升發(fā)酵罐來(lái)大量生產(chǎn)320克細(xì)胞，這些細(xì)胞過(guò)量生產(chǎn)色氨酸合酶。將洗滌過(guò)的細(xì)胞懸浮于50mM Tris-氯，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都調(diào)節(jié)到pH7.8)，和1mM苯基甲基磺酰氟，每克細(xì)胞5毫升并且通過(guò)三次用于細(xì)胞溶胞的Manton-Gaulin實(shí)驗(yàn)室勻漿器(10000PSIG)均化。溶胞產(chǎn)物在17500xG下離心30分鐘。攪拌下，以對(duì)于每8份溶胞產(chǎn)物加入2份的比例向上清液加入50mM Tris-Cl，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)，25mM精胺和30％PEG8000。該溶液立即以17500xG離心10分鐘，并且棄除沉積物。上清液在4℃下孵育16-48小時(shí)，直到出現(xiàn)結(jié)晶。通過(guò)以17500xG離心20分鐘收集結(jié)晶，然后再次懸浮并且用50mMTris-Cl，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都調(diào)節(jié)到pH7.8)，5mM精胺和6％PEG8000洗滌，并且以17500xG第二次離心20分鐘。將結(jié)晶重新懸浮于50mM N-二[羥乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巰基乙醇(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)，并且將溶液溫?zé)岬?7℃溶解結(jié)晶。然后在4℃下用50mM N-二[羥乙基]甘氨酸，lmM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巰基乙醇(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)將蛋白質(zhì)透析過(guò)夜，然后以17500xG離心25分鐘，然后以27500xG離心15分鐘。用含有85克/升固體硫酸銨的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.8)，5mM EDTA，0.2mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇將上清液透析23小時(shí)?；厥粘恋聿⑶以俅螒腋∮?0體積的相同的硫酸銨緩沖液中，在-20℃下貯存該懸浮液。
可以根據(jù)所述制備用于晶體學(xué)分析的大的結(jié)晶。將硫酸銨懸浮液樣品離心并且將沉淀溶解于50mM N-二[羥乙基]甘氨酸緩沖液pH7.8，1mM EDTA，1mM DTT，和0.1M磷酸吡哆醛，然后用相同的緩沖液透析，加載到MonoQ柱上，并且用0-1M氯化鈉的梯度洗脫。合并兩個(gè)洗脫的蛋白質(zhì)峰，少量與等體積的孔溶液(50mM N-二[羥乙基]甘氨酸緩沖液pH7.8，1mM EDTA，1mM DTT，12％PEG8000，0.08％疊氮化鈉和21％精胺和0.1M磷酸吡哆醛)混合，并且放置在孔中的位置上使大結(jié)晶產(chǎn)生。然后可以將大結(jié)晶切成較小大小用于酶結(jié)構(gòu)測(cè)定。
可以從植物組織(如實(shí)施例4所述)或者從大腸桿菌或者其它適合過(guò)量表達(dá)植物蛋白質(zhì)的生物體中重組表達(dá)的植物TS亞基(如實(shí)施例5所述)部分純化植物TS酶和/或其亞基。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的和/或與其等價(jià)的這些方法的任何修飾認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物TS部分純化至少大約10倍，最優(yōu)選至少大約180倍。該部分純化方法包括(i)將植物組織勻化；(ii)將植物勻漿離心；(iii)將(ii)步驟中獲得的上清液與大約25％至大約35％飽和度的硫酸銨混合并且將其離心；(iv)收集(iii)步驟離心之后獲得的上清液并且將其與大約45％至大約60％飽和度的硫酸銨混合并且將其離心；和(v)收集合有純化的TS的沉淀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用大約80％至大約90％飽和度的硫酸銨單一沉淀步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步包括將來(lái)自步驟(v)的溶解的沉淀施用到WatersSW300柱或者其等價(jià)物上。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的先導(dǎo)發(fā)現(xiàn)(Lead Finding)和最優(yōu)化在本發(fā)明的一方面，提供了使用已知結(jié)構(gòu)的TS酶鑒定新的除草劑抑制劑的方法。該方法依賴完整TS分子的X-射線結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)模型，或者單獨(dú)依賴活性位點(diǎn)的模型。下面更詳細(xì)地描述這些方法。分子繪圖，靜電計(jì)算和表面公開了展示產(chǎn)生蛋白質(zhì)的抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的有意義描述的原子或表面上的坐標(biāo)(coordinate)，分子表面和物理化學(xué)性質(zhì)繪圖的方法。在該結(jié)合位點(diǎn)中可以放置小分子，通過(guò)例如置換在該位點(diǎn)存在的分子，使用要放置到該位點(diǎn)的新分子對(duì)比到與TS蛋白質(zhì)共同結(jié)晶或者預(yù)先模建或?qū)?modeled or docked)TS蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的分子上。
為了本發(fā)明的目的，與TS共同結(jié)晶的分子或者預(yù)先在TS蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)中模建或?qū)拥姆肿邮恰澳０逡种苿薄！鞍幸种苿笔欠胖玫絋S結(jié)合位點(diǎn)中置換模板抑制劑的新的分子。這些引述的所有的程序在它們各自的文獻(xiàn)中描述。如果沒(méi)有具體指明選擇的參數(shù)是銷售商提供的或者合理范圍內(nèi)的程序啟動(dòng)提供的值。參數(shù)設(shè)置可接受的范圍對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
計(jì)算機(jī)程序可以產(chǎn)生模板抑制劑和靶抑制劑的對(duì)比(alignment)，所述程序例如Alignment，CatShape，APEX(Molecular SimulationsInc.(MSI)，9685 Scranton Rd.，San Diego，CA)或者類似，或者通過(guò)抑制劑的重疊類似性質(zhì)，例如(部分)帶電荷基團(tuán)，氫鍵供體/受體，疏水性部分，例如烷基鏈或芳香基團(tuán)。
或者，或者另外，也可以將分子放置于酶活性位點(diǎn)，使用相互作用模型圖表程序或本領(lǐng)域公知的方法，例如對(duì)接(docking)，使用計(jì)算機(jī)程序Affinity，LUDI或Receptor(MSI)。象CatShape這樣的程序不只是能用來(lái)對(duì)比分子，但是，如手冊(cè)(Catalyst4.0，MSI)中所述，能檢索適合結(jié)合位點(diǎn)的新的分子。除了上述方法之外，通過(guò)使用象LUDI這樣的程序?qū)⒏鞣N各樣的片段定位于TS結(jié)合位點(diǎn)之中，可以產(chǎn)生用于有形檢索的模板。然后使用Receptor程序(MSI)可以使用與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的所有片段的重疊來(lái)產(chǎn)生受體表面。該受體模型對(duì)于將電子數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的分子對(duì)比到結(jié)合位點(diǎn)之中是有用的。這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)的例子是專利藥化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，例如Cyanamid’s CL-File，the Available ChemicaldDirectory(ACD)(MSI分布)，和使用合適的程序例如Catalyst的實(shí)際上起作用的化學(xué)品數(shù)據(jù)庫(kù)。
一旦發(fā)現(xiàn)感興趣的分子在結(jié)合位點(diǎn)中開始的定位，可以使用本領(lǐng)域公知的基于勢(shì)能函數(shù)的方法(potential enery function basedmethod)，例如能量最小化，分子力學(xué)，分子動(dòng)力學(xué)或Metropolis MonteCarlo(MMC)方法，來(lái)精化該小分子在結(jié)合位點(diǎn)中的位置，優(yōu)選地通過(guò)使蛋白質(zhì)或者其部分靈活的重排。
可以將得出的能量方面最好的構(gòu)象和取向與其它先前鑒定的抑制劑的結(jié)合相比較。力場(chǎng)計(jì)算得到的相互作用能量值，完全符合結(jié)合位點(diǎn)和另外的標(biāo)準(zhǔn)，例如滿足LUDI和DOCK程序涉及的氫鍵和偶極和電荷相互作用，可以用來(lái)測(cè)定抑制劑的性質(zhì)。具有較好的分?jǐn)?shù)或較低的相互作用能量的抑制劑是預(yù)期具有改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)的候選物。
其它修飾的引入，例如使構(gòu)象剛性的元素，從而減小自由和結(jié)合狀態(tài)的熵的差異，或者，為了同樣的原因，使用上述對(duì)接/精化(docking/refinement)方法也可以研究親水性基團(tuán)的去除。
為了改進(jìn)新的抑制劑，可以對(duì)抑制劑加上另外的基團(tuán)。使用相互作用分子圖解程序和接下來(lái)的上述勢(shì)能函數(shù)-基礎(chǔ)的精化方法或者使用一種規(guī)則或者以分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)的體系，例如LUDI(MSI)程序中涉及的，可以人工做到這一點(diǎn)。
在一項(xiàng)方法中，選擇核心分子，并且將對(duì)來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)的各種各樣的試驗(yàn)片段模建成該核心分子，目的在于改進(jìn)分子間相互作用的數(shù)量和強(qiáng)度。
該方法包括下面的步驟(i)使用TS的結(jié)晶結(jié)構(gòu)(或者TS蛋白質(zhì)或TS活性位點(diǎn)的可比較的模型)來(lái)確定在一個(gè)位置上的檢索中心，在那里小分子應(yīng)該結(jié)合以抑制TS活性(例如，亞基，“通道”，或者與已知底物結(jié)合時(shí)重排的蛋白質(zhì)部分接近的位置上的活性位點(diǎn))；(ii)關(guān)于相互作用位點(diǎn)進(jìn)行該結(jié)合位點(diǎn)的分析(例如電子和氫結(jié)合受體和供體，疏水性表面，靜電勢(shì)能)；(iii)在化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索完全或部分補(bǔ)充先前定義的相互作用位點(diǎn)的小分子；(iv)使那些“命中者”適合入結(jié)合位點(diǎn)并且對(duì)于結(jié)合強(qiáng)度評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)和能量值；和(v)選擇用于合成和試驗(yàn)的候選物根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)，例如該化合物的可獲得性，容易合成，或者計(jì)算的物理化學(xué)參數(shù)(例如clogP)。以抑制劑為基礎(chǔ)的先導(dǎo)最優(yōu)化(Lead Optimization)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了以已知的抑制劑的結(jié)構(gòu)信息為基礎(chǔ)的鑒定抑制劑的方法。該方法已知為以TS-結(jié)合分子為基礎(chǔ)的合理設(shè)計(jì)。
該方法包括(i)分析TS-抑制劑復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)中抑制劑的構(gòu)象和(ii)設(shè)計(jì)模擬抑制劑的化合物和設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的化合物(“模擬物”)的改進(jìn)的性質(zhì)。具體地說(shuō)，該方法包括用已知的抑制劑或者其部分檢索電子數(shù)據(jù)，或者其計(jì)算機(jī)代表為檢索模板(即分子抽象為藥效基因模型)?；蛘撸蛘叱藬?shù)據(jù)庫(kù)檢索之外，可以設(shè)計(jì)抑制劑的修飾，使得保留對(duì)于結(jié)合TS必須的基團(tuán)的所有的位置，但是基團(tuán)的其它原子被修飾，缺失或加入。上面和實(shí)施例18描述對(duì)于結(jié)合TSα重要的基團(tuán)。C.同源性模建(modeling)在該方法中，沙門氏菌屬TS酶的結(jié)晶結(jié)構(gòu)可以被用作產(chǎn)生來(lái)自另一個(gè)來(lái)源例如高等植物的TS的同源性模建的模板(前提是該植物蛋白的氨基酸序列是已知的)。任何其它已知的TS酶可以用作模板。同源性模建的優(yōu)點(diǎn)在于可以直接在靶向抑制或修飾的蛋白質(zhì)/基因上設(shè)計(jì)抑制劑/蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。例如，該方法可以用來(lái)證明擬南芥屬TS中的結(jié)合位點(diǎn)與沙門氏菌屬TS中的那些相同。
使用一種或多種已知的(來(lái)自結(jié)晶圖分析或同源性模建)的TS或者其結(jié)構(gòu)同系物的三維結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性模建技術(shù)對(duì)具有TS活性的蛋白質(zhì)的同源性模建處理。使用相同的方法，可以對(duì)形成抑制劑結(jié)合位點(diǎn)中涉及的TS片段做模型(代替完整TS模型)。做模型的方法一般包括(i)選擇一種或多種模板分子，(ii)對(duì)比模板蛋白質(zhì)的氨基酸序列與靶蛋白質(zhì)的氨基酸序列，(iii)利用蛋白質(zhì)同源性產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)的計(jì)算機(jī)模型。任選地，使用最小化，分子動(dòng)力學(xué)或Monte-Carlo方法勢(shì)能或評(píng)分函數(shù)，可以另外精化步驟(iii)中產(chǎn)生的計(jì)算機(jī)模型。
計(jì)算機(jī)模型對(duì)于理解TS的作用和抑制的模式是有用的?？梢砸赃@些同源性模建為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)抑制劑。然后，可以利用該知識(shí)，并且結(jié)合相互作用分子圖解方法，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法，從頭(de-novo)設(shè)計(jì)方法，或者本領(lǐng)域公知的類似方法，來(lái)改進(jìn)抑制劑期望的性質(zhì)(例如對(duì)于化學(xué)修飾的結(jié)合活性或優(yōu)選的位點(diǎn)，其可以引入提高除草劑藥效的期望的物理化學(xué)或其它性質(zhì))。
結(jié)構(gòu)同系物是一種蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)模型，其基本上具有相同的折疊，其中折疊是在三維空間中相對(duì)于其它的第二結(jié)構(gòu)因素例如β-折疊和/或α螺旋的相對(duì)取向。對(duì)于TSα亞基，折疊的特征是β-桶結(jié)構(gòu)。TS測(cè)定方法為了測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)或鑒定的抑制劑的特異性和效力，可以使用體外酶測(cè)試。對(duì)于表征TS酶的變體形式，例如除草劑抗性突變體TS酶，以及表征從各種各樣的來(lái)源例如表達(dá)TS的大腸桿菌培養(yǎng)物，從農(nóng)作物和雜草物種分離的TS酶，這些測(cè)試也是有用的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何測(cè)試方法。例如下面文獻(xiàn)中描述的測(cè)試Smith OH和Yanofsky C 1962酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)vol.V pp794-806，更優(yōu)選地pp 801-806(色氨酸合酶)；Creighton TE和Yanofsky C酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)vol.XVIIA pp 365；Kirschner等。1975歐洲生物化學(xué)雜志(Eur，J.Biochemistry)60513；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)240725(1965)Hardman和Yanofsky；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)241980(1966)；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2456016-6025(1970)；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2641449(1971)；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2536266(1978)；生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262l0678。
也可以使用實(shí)施例中描述的測(cè)試。
色氨酸合酶的α或β反應(yīng)的抑制作用抑制全酶的活性。為了測(cè)定TS的抑制作用，人們可以測(cè)定TSα反應(yīng)或TSβ反應(yīng)的活性的降低。但是，定量測(cè)定TSα的活性需要純的酶。這是因?yàn)楸仨毜牡孜颕GP具有磷酸酯基團(tuán)，其在非特異性磷酸酯酶的存在下特別不穩(wěn)定。作為結(jié)果，含有競(jìng)爭(zhēng)酶活性的不純的酶制劑一般通過(guò)因?yàn)闇p小底物的表觀濃度而難以清楚TSα的真實(shí)活性。
當(dāng)亞基在全酶α2β2中組合時(shí)，由于協(xié)同性現(xiàn)象，每一種亞基反應(yīng)，TSα或TSβ已知是最大活性。通過(guò)在過(guò)量絲氨酸存在下加入有限的IGP，對(duì)于完整的全酶來(lái)說(shuō)，TSα的活性是適格的，對(duì)于TSβ反應(yīng)需要絲氨酸。作為代替色氨酸的產(chǎn)物測(cè)定甘油醛3-P(G3P)，但對(duì)于要產(chǎn)生的G3P，也必須產(chǎn)生等量的色氨酸。通過(guò)商售甘油醛3-磷酸酯脫氫酶，另一種高度純化酶，在與NADH生產(chǎn)偶聯(lián)的反應(yīng)中測(cè)定G3P。
因?yàn)橹参锞哂邢鄬?duì)低水平的同源TS，證明難以將植物TS純化至同質(zhì)性。這意味著來(lái)自植物的TSα活性不能被重復(fù)穩(wěn)定地測(cè)定，因?yàn)闇y(cè)試需要高純化酶，而粗植物酶制劑可能含有大量的干擾酶。相反，通過(guò)TSβ反應(yīng)測(cè)定植物中內(nèi)源TS活性。這使得在TS活性最集中的地方和TS最具活性的植物的發(fā)育生長(zhǎng)階段測(cè)定植物的部分。TSβ反應(yīng)不需要純的酶，但是對(duì)于精確度確實(shí)需要仔細(xì)分離的底物吲哚和產(chǎn)物色氨酸，其吸收光譜高度重疊。在用于TSβ活性的優(yōu)選的測(cè)試中，在過(guò)量絲氨酸的存在下測(cè)定吲哚的消失，這發(fā)生在色氨酸生產(chǎn)中。通過(guò)吲哚的時(shí)間依賴性減少來(lái)定量測(cè)定測(cè)試。在實(shí)施例4中更詳細(xì)地描述該項(xiàng)測(cè)試。
提供了測(cè)定TSβ反應(yīng)的新的方法。該方法包括通過(guò)微量滴定板測(cè)試，使用三相液體體系，分離和定量測(cè)定吲哚。在該方法中，將來(lái)自植物組織的粗勻漿或者來(lái)自粗植物勻漿的部分純化的硫酸銨級(jí)分用作植物酶的來(lái)源。該方法包括(i)在植物TS，吲哚和絲氨酸的存在下進(jìn)行TSβ反應(yīng)；(ii)分離含有吲哚相并且將其轉(zhuǎn)移到微量滴定板中形成三相液體體系，如實(shí)施例4所述；和(iii)測(cè)定吲哚的量。
用于TSα反應(yīng)的改進(jìn)的測(cè)試也在本發(fā)明范圍內(nèi)。對(duì)微量滴定板方式采用該測(cè)試，其節(jié)省了試劑并且同時(shí)觀察動(dòng)力學(xué)酶測(cè)試。另外，反應(yīng)中IGP底物的水平小于5X對(duì)于IGP的酶的Km，并且優(yōu)選地是大約1X至大約2X。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在此TSα測(cè)試中試驗(yàn)弱抑制劑時(shí)，基本上在加入競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)之前將抑制劑與酶一起預(yù)先孵育。逆轉(zhuǎn)測(cè)試通過(guò)對(duì)處理過(guò)的植物補(bǔ)充色氨酸，通過(guò)證明除草癥狀的逆轉(zhuǎn)，可以證實(shí)植物TS體內(nèi)抑制。術(shù)語(yǔ)逆轉(zhuǎn)在概念上和實(shí)際術(shù)語(yǔ)上相當(dāng)于脫離，補(bǔ)償和防止損傷。只有用色氨酸能克服其作用的那些抑制劑在本發(fā)明范圍內(nèi)。逆轉(zhuǎn)測(cè)試代表用于除草抑制劑鑒定的以機(jī)理為基礎(chǔ)的測(cè)試。實(shí)施例中提供了這樣的測(cè)試的一個(gè)例子。但是，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或者顯而易見的任何修飾。鑒定和構(gòu)建除草抗性TS的方法也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是在商業(yè)上重要的植物，例如谷物，大豆，canola，甘蔗，甜菜，大麥，小麥，稻和其它農(nóng)作物中設(shè)計(jì)除草劑抗性TS的方法。根據(jù)這些方法構(gòu)建的TS變體蛋白質(zhì)和表達(dá)變體TS蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的除草抑制劑和靶蛋白質(zhì)TS之間的分子相互作用可以被用來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)中的變化來(lái)抑制結(jié)合。已經(jīng)證明以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)是設(shè)計(jì)除草劑耐受基因的有效途徑(Ott等，1996，JMB 263359和Kakefuda等的美國(guó)專利No.5853973)。可以使用相同的方法或者對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何其它方法來(lái)設(shè)計(jì)和制備對(duì)本發(fā)明的除草抑制劑有抗性的TS變體蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，可以使用TS基因或蛋白質(zhì)的大部分序列的同源性模建衍生潛在的除草劑抗性位點(diǎn)。這需要結(jié)合抑制劑中涉及的位點(diǎn)的圖譜，或者將抑制劑運(yùn)輸?shù)浇Y(jié)合位點(diǎn)中涉及的位點(diǎn)的圖譜，或者接通到該序列上的亞基中涉及的位點(diǎn)的圖譜，或者通過(guò)三維結(jié)構(gòu)的目測(cè)或計(jì)算機(jī)分析(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的Cartesian或內(nèi)部配位)。然后，使用本領(lǐng)域公知的分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)性誘變已鑒定在結(jié)合抑制劑機(jī)理中涉及的位點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，下面氨基酸的至少一個(gè)發(fā)生突變沙門氏菌屬α-亞基中的αL100，αY102，αA129，αI153，αL177，αF212，和β-亞基中的βI326和βP318。產(chǎn)生這些位置上突變成其它氨基酸的各種突變，并且可以使用在異源表達(dá)系統(tǒng)中這些突變蛋白的表達(dá)和有或沒(méi)有抑制劑的其活性的測(cè)定來(lái)進(jìn)一步選擇具有期望的特性(profile)的TS蛋白變體，例如通過(guò)選擇的除草劑的抗抑制作用的抗性?；蛘?，通過(guò)在植物中轉(zhuǎn)化可以體內(nèi)測(cè)定抗性基因。進(jìn)一步突變的精化，包括組合各種突變，可以用來(lái)替代地改進(jìn)期望的酶特征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用缺失其內(nèi)源TSβ(或TSα)亞基表達(dá)的大腸桿菌突變株可以進(jìn)行除草劑抗性變體的篩選。已知用實(shí)施例6所述的表達(dá)擬南芥屬TSβ(或TSα)-亞基的質(zhì)?？梢匝a(bǔ)償該突變?？梢栽诒景l(fā)明方法中使用該大腸桿菌株來(lái)對(duì)植物篩選例如對(duì)抑制TS活性的化合物有抗性的擬南芥屬TSβ突變體。可以類似地進(jìn)行該方法來(lái)篩選對(duì)TS抑制劑有抗性的TSα變體(E.R.Radwanski，J.Zhao，R.L.Last，Mol GenGenet248657-667)。
使用上述方法鑒定的抗性TS變體蛋白質(zhì)及其編碼基因也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。賦與TS抑制除草劑抗性的基因也可以用來(lái)使用本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。雜草控制方法本發(fā)明進(jìn)一步提供通過(guò)施用本發(fā)明的除草抑制劑的雜草控制的方法。施用方式和使用的抑制劑的量是本領(lǐng)域公知的。例如，抑制劑可以用于各種不期望植物品種的出芽后控制，并且可以以大約0.5kg/ha至大約10kg/ha的比例對(duì)葉和莖施用，如美國(guó)專利No.5635449所述。
在下面的非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。
IPP是Ki為15μM的TSα亞基反應(yīng)的抑制劑。在下面的實(shí)驗(yàn)中，將IPP的活性與根據(jù)圖示1制備的兩種有潛力的抑制劑(膦酸酯7a和7b)相比較。
圖示1 試劑和條件(a)LAH；(b)NaH，TsCl；(c)NaI；(d)P(OEt)3；(e)20％ KOH；(f)TMSBr
參照?qǐng)D示1，用LAH將3-吲哚-丙酸，2a，和3-吲哚-丁酸，2b還原，得到伯醇3a和3b。通過(guò)用氫化鈉和甲苯磺酰氯各2當(dāng)量處理而將它們轉(zhuǎn)化為二甲苯磺?；苌铩＾D(zhuǎn)化為一級(jí)碘化物，接著用亞磷酸三乙酯處理得到期望的膦酸酯6a和6b。去除保護(hù)基得到期望的膦酸酯7a和7b。
對(duì)目標(biāo)化合物體外測(cè)定TSα亞基反應(yīng)的抑制作用并且體內(nèi)測(cè)定對(duì)全部植物的除草活性。根據(jù)實(shí)施例3(體外測(cè)定)和實(shí)施例2(除草活性)所述進(jìn)行測(cè)定。表1中給出了這些結(jié)果。
表1
*通過(guò)高度純化的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)全酶的TSα反應(yīng)測(cè)定。I50是抑制沒(méi)有抑制劑存在下將酶活性50％需要的濃度。
**沒(méi)有活性＝在出苗后溫室試驗(yàn)中在4kg/ha下沒(méi)有活性；弱活性＝對(duì)任何物種的最大20-30％傷害。
表1中給出的I50值是酶活性的一種量度，并且指在下述測(cè)試條件下能將酶活性體外減小50％的抑制劑濃度。這是比較抑制劑對(duì)酶作用的常用手段。
如表1所示，發(fā)現(xiàn)膦酸酯7b是一種TS的抑制劑，具有比相應(yīng)的磷酸酯IPP的I50弱的I50。更短鏈膦酸酯類似物7a是一種比7b弱的抑制劑。在溫室測(cè)試中，只有化合物7b表現(xiàn)出活性。當(dāng)出苗后施用時(shí)，該化合物稍微抑制一種植物物種的生長(zhǎng)。該效果是最小的，并且植物能在沒(méi)有早期癥狀下生長(zhǎng)。
在該實(shí)驗(yàn)中，制備了化合物，它們具有類似于TSα亞基反應(yīng)的反應(yīng)中間體(下面給出的化合物8)的形狀。在TSα酶促反應(yīng)中，IGP底物的吲哚環(huán)的C-3位被質(zhì)子化，產(chǎn)生在C-3位含有一個(gè)sp3原子的反應(yīng)中間體8。在該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的該假設(shè)是該位置的C-3可能對(duì)與該酶的相互作用是重要的。因此制備含有一個(gè)sp3原子的試驗(yàn)化合物，其模擬反應(yīng)中間體8的C-3位。另外，去除IGP底物以及公知的抑制劑IPP中的吲哚環(huán)的C-2原子。這樣做簡(jiǎn)化了合成，并且獲得了具有比原底物更高的構(gòu)象橈性的化合物。用通式9代表試驗(yàn)化合物。
命名sp3是本領(lǐng)域公知的，并且指p-和s-軌道組合形成的原子和分子軌道，其是電子云包圍的原子，其在其它原子的取向上在空間延伸，并且指向規(guī)則四面體的各個(gè)角?！案叩扔袡C(jī)化學(xué)”(Advanced OrganicChemistry)，Jerry March編著，John Wiley and Sons，IntersciencePublication。 制備和測(cè)定的第一組式9的化合物是在硫原子的鄰位具有羧酰胺或胺的芳基烷基膦酸酯硫化物(sp3＝S)。圖示2中描述了這些化合物的合成。關(guān)鍵反應(yīng)是將芳基硫醇鹽加給4-溴丁基膦酸二乙酯之后將酯TMSBr裂解。
圖示2
15X＝CO2CH318X＝CO2CH316X＝CO2H19X＝CO2H17X＝CONH220X＝CONH2試劑和條件(a)TEA；(b)TMSBr；(c)NaOH；(d)SOCl2，NH3在體外TS酶測(cè)試中測(cè)定圖示2中給出的四種膦酸(13，18，19，20)。盡管化合物18-20是沒(méi)有活性的，但是鄰-氨基化合物13在體外測(cè)試中具有非常好的酶活性(I50＝400nM)，如表2所示。另外，該化合物及其相關(guān)的鹽和酯表現(xiàn)出溫室除草活性，如表2所示。
根據(jù)美國(guó)專利No.5635449所述測(cè)定化合物的除草活性。具體地說(shuō)，通過(guò)下面的試驗(yàn)證明本發(fā)明的化合物的除草活性，其中用分散在含水丙酮混合物中的試驗(yàn)化合物處理各種雙子葉和單子葉植物。在該項(xiàng)試驗(yàn)中，籽苗植物在暫時(shí)平臺(tái)中生長(zhǎng)大約2星期。試驗(yàn)化合物分散于含有0.5％TWEEN#20的50/50丙酮/水混合物中，TWEEN#20是AtlasChemistry Industries的一種聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯表面活性劑，其量足以提供當(dāng)在40psi下操作預(yù)計(jì)時(shí)間通過(guò)噴嘴施與植物時(shí)相當(dāng)于每公頃大約1.0千克至8.0千克試驗(yàn)化合物。噴施之后，將植物放置在溫室長(zhǎng)臺(tái)上，并且以常規(guī)方式護(hù)理，和常規(guī)溫室實(shí)踐相同。處理之后4-5星期，檢查籽苗植物并且根據(jù)下面提出的評(píng)級(jí)體系進(jìn)行評(píng)級(jí)。
芳基硫化物13的好的酶和除草活性的發(fā)現(xiàn)促使合成另外的類似物。圖示3說(shuō)明幾種鄰-羥基苯硫化物的合成。通過(guò)用亞甲基二膦酸四乙酯的陰離子處理醛25制備化合物28(Kosolapoff，G.J.Amer.Chem.Soc.1953，75，1500)。該Witting反應(yīng)選擇性提供反式烯烴。通過(guò)氧化膦酸來(lái)制備亞砜和砜衍生物。純化這些極性高的化合物需要利用C-18反相色譜。圖示3 試劑和條件(a)TEA；(b)TMSBr；(c)TEA，2-(2-氯乙基)-1，3-二噁烷；(d)HCL；(e)nBuLi，CH2(P(＝O)(OEt)2)2；(f)Br2；(g)1當(dāng)量.mCPA；(h)2當(dāng)量.mCPBA
表2給出了試驗(yàn)的芳基硫化物膦酸酯的生物活性數(shù)據(jù)。證明幾種鄰-羥基苯基硫化物的除草活性比化合物13更好。對(duì)于所有的化合物，只觀察到出苗后除草活性。在雙鍵形式的連接鏈中引入的剛性也提高了生物活性(化合物28)。
表2TSα的芳基硫化物膦酸酯抑制劑
參見表1對(duì)舉例的腳注；IA＝?jīng)]有活性。
**出苗后施用。除草劑評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)+＝對(duì)一個(gè)物種的30-80％損傷；++ ＝對(duì)一個(gè)物種的80-100％損傷；+++ ＝對(duì)兩個(gè)物種的80-100％損傷；+ ++++＝對(duì)三種以上物種的80-100％損傷。
用色氨酸合酶除草劑處理的植物表現(xiàn)出其作用方式是氨基酸生物合成的抑制的除草劑的典型癥狀。除草活性使發(fā)育緩慢，開始時(shí)生長(zhǎng)停止，退綠或斑駁，接著是一些枯斑。表2給出了選擇的化合物的除草曲線。
37℃下，在補(bǔ)充有30mg/L氨芐青霉素的L-肉湯(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取液，1％氯化鈉，0.1％調(diào)節(jié)到pH7的葡萄糖)中搖動(dòng)培養(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在28℃或37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。該誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有基本培養(yǎng)基(0.8mM硫酸鎂x六水合物，10mM)檸檬酸x一水合物，60mM磷酸氫二鉀，10mM一代磷酸鈉，10mM磷酸二氫銨(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH6.6)，0.5％葡萄糖，0.5％酪蛋白水解物，5mg/L色氨酸，加3-mg/L氨芐青霉素。在生長(zhǎng)期末，離心(10000xg)收集細(xì)胞，再次懸浮于15毫升(2.5％原培養(yǎng)基體積)的0.85％氯化鈉，再次離心。
為了提取TS，細(xì)胞再次懸浮于4毫升的50mM Tris-氯，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都用鹽酸調(diào)節(jié)到pH7.8)，和1mM苯基甲基磺酰氟，向其中加入0.6mg/ml的溶菌酶，細(xì)胞經(jīng)超聲處理(15秒3次猝發(fā)脈沖)，以27000xg離心20分鐘去除碎屑，并且將上清液轉(zhuǎn)移到新試管。小心攪拌下向其中加入1毫升的50mM Tris-氯，5mMEDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)，25mM精胺和30％PEG8000。立即以27000xg離心5分鐘后收集上清液，并且在4℃下孵育48小時(shí)直到形成結(jié)晶。
在4-5℃下以27000xg離心15分鐘收集結(jié)晶，然后用50mM Tris-氯，5mM EDTA，0.1mM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(都調(diào)節(jié)到pH7.8)，5mM精胺和6％PEG8000洗滌，再次離心。將結(jié)晶再次懸浮于1毫升的50mMN-二[羥乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巰基乙醇(都用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)，并且在37℃下攪拌10分鐘，然后用100毫升相同的pH7.8，50mM N-二[羥乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.02mM磷酸吡哆醛和10mM巰基乙醇溶液在4℃下透析過(guò)夜。蛋白質(zhì)透析液在微量試管中以12000xg離心并且棄除沉積物。接著上清液用補(bǔ)充有85g/L的固體硫酸銨的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.8)，5mM EDTA，0.2mM磷酸吡哆醛和10mM巰基乙醇透析以沉淀TS。離心收集沉淀，用硫酸銨-磷酸緩沖液洗滌一次，再次離心，重新懸浮于硫酸銨-磷酸緩沖液并且在-20℃下貯存。使用遞增蛋白質(zhì)載量通過(guò)SDS凝膠電泳確定TS的純度。凝膠上的結(jié)果證明只有兩個(gè)蛋白質(zhì)成分，代表亞基TSα和TSβ。吲哚甘油磷酸酯的合成IGP，正向TSα反應(yīng)的底物，在商業(yè)上得不到，但是可以通過(guò)TSα的反向反應(yīng)(吲哚+D-甘油醛-P--→吲哚-3-甘油-磷酸酯)生物合成。通過(guò)吲哚從反應(yīng)混合物的消失監(jiān)測(cè)反應(yīng)。
可以使用適合合成IGP并且從在測(cè)試中干擾的物質(zhì)中分離IGP的任何方法(例如Smith OH和Yanofsky C酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)vol.VIpp.590-597；或者Brzovic PS，Ngo KN，DunnMF1992生物化學(xué)(Biochemistry)313831-3839)。
根據(jù)提供者(Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO)的方法從二乙基乙縮醛的鋇鹽制備DL-甘油醛-3-磷酸酯，用氫氧化銨將終溶液調(diào)節(jié)到pH4。在含有TS(大約0.2-0.3mg/ml)，5mM EDTA，50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.3，6mM吲哚，和大約10-13mM甘油醛-3-磷酸酯的溶液中制備IGP，在25℃-37℃下孵育最多16小時(shí)。25℃或37℃下孵育1小時(shí)后吲哚的利用率不受5.3-7.3范圍內(nèi)pH的影響，而在16小時(shí)之后利用率在pH5.3時(shí)是大約97％，在pH6.3時(shí)是大約94％，在pH7.3時(shí)是大約85-88％。使用12.8g/l二甲基氨基苯甲醛，64ml/l濃鹽酸在乙醇中(最多14％(體積比)含水樣品)反應(yīng)30-60分鐘之后用540nm(A540)或567(A567)波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)吲哚的消失。通過(guò)常規(guī)離子交換色譜，通過(guò)HPLC(Waters C18-Zorbax柱，Waters Corporation，F(xiàn)ranklinMA，0-80％乙腈，1毫升/分鐘)，或者優(yōu)選使用C18 Sep-Pak柱(WatersCorporation，F(xiàn)ranklin MA)(IGP是在水溶液中通過(guò))并且通過(guò)HPLC評(píng)價(jià)從吲哚分離IGP。通過(guò)上述Brznovic等1992的方法從G3P分離IGP。使用G3P脫氫酶監(jiān)測(cè)G3P，通過(guò)高碘酸鹽方法監(jiān)測(cè)IGP，其中100微升試驗(yàn)溶液，或IGP，與含有33mM偏高碘酸鈉的60微升0.66M乙酸鹽緩沖液pH5混合20分鐘，然后用堿(80微升1N氫氧化鈉)處理，并且分配到1毫升乙酸乙酯中，并且在290nm下監(jiān)測(cè)吸光度。通過(guò)TSα反應(yīng)測(cè)試色氨酸合酶的抑制作用的測(cè)試通過(guò)在有限量的吲哚-3-甘油磷酸酯和過(guò)量絲氨酸的存在下鼠傷寒沙門氏菌全酶(α2β2)的TSα反應(yīng)，通過(guò)它們抑制甘油醛-3-P的產(chǎn)生的能力，鑒定TS的抑制劑。
該測(cè)試開發(fā)為以Creighton(EurJBch131-10，1970)和Creighton和Yanofsky(JBC241980，1966)的組合方法為基礎(chǔ)的有改進(jìn)的新的微量滴定板動(dòng)力學(xué)酶測(cè)試。在偶聯(lián)酶測(cè)試中在甘油醛-3-磷酸脫氫酶的存在下以NAD+的線性消耗(340nm下的分光光度吸光度)測(cè)定甘油醛產(chǎn)生的速度。
測(cè)試溶液含有一種試驗(yàn)抑制劑化合物，50mM Tris-Cl(pH7.8)，6mM砷酸鈉，5微克/毫升磷酸吡哆醛，0.5mM DTT，0.18M NaCl，60mM絲氨酸，1.6mM NAD+，8e.u./ml酵母甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(Sigma，Catalog#G2647；Kirschner等，Eur J Bch，1975，60513)和大約1.5e.u沙門氏菌TS。加入100μM IGP起始反應(yīng)，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行并且每次測(cè)試在微量滴定板中使用300微升。
以其Km濃度1.5-2倍使用底物IGP來(lái)加強(qiáng)鑒定在底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的弱抑制劑的可能性。該鑒定酶抑制劑的方法是新的，因?yàn)樵诿富钚詼y(cè)定中常規(guī)使用過(guò)量的全部底物(至少是各自Km值的5倍)通過(guò)加入100μM抑制劑(與底物IGP等摩爾)或者更少(在100μM1∶1稀釋系列)評(píng)價(jià)潛在的抑制劑，直到測(cè)定的抑制作用小于15％。在抑制劑存在和不存在下比較V最大的反應(yīng)速度。
另外，在加入IGP之前抑制劑與TS測(cè)定混合物預(yù)先孵育24小時(shí)之后鑒定一些較弱的抑制劑。鑒定較弱的抑制劑有助于結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的定量評(píng)價(jià)(QSAR)，或者鑒定新的除草抑制劑先導(dǎo)。先前已知的抑制劑IPP在所有的試驗(yàn)中用作標(biāo)準(zhǔn)物，其中IPP的I50是1-2μM。
表3給出了體外測(cè)試的結(jié)果。頭兩種抑制劑化合物表現(xiàn)出典型的數(shù)據(jù)，從中計(jì)算出I50值。表3
*使用沙門氏菌全酶用TSα反應(yīng)測(cè)定的TS活性。在37℃下在30分鐘測(cè)試中以穩(wěn)定V最大速率A340定量進(jìn)行測(cè)試。反應(yīng)混合物(每300微升)含有15微升的1M Tris-Cl，1.8微升的1M砷酸鈉，0.6微升的1mMPLP，1.5微升的0.1M DTT，54微升的1M NaCl，60微升的0.3M絲氨酸，4.8微升的0.1M NAD+，純沙門氏菌TS，甘油醛磷酸脫氫酶(來(lái)自酵母)和100μM IGP。在100μM最大濃度下測(cè)定抑制劑。
**發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)活性化合物在微量試管中通過(guò)TSβ反應(yīng)(吲哚+L-絲氨酸-→L-色氨酸+H20)進(jìn)行測(cè)試。100微升的提取液與含有7.5微升的飽和氯化鈉的150微升的0.4mM吲哚，80mM絲氨酸，0.03mM PLP，0.1M Tris-Cl緩沖液pH7.8混合。在21℃下以從10分鐘至幾小時(shí)的遞增的時(shí)間間隔孵育混合物。加入25微升1N氫氧化鈉中止反應(yīng)，然后與1毫升甲苯混合，然后在微量試管中以10000xG離心2分鐘將殘留的吲哚分配到甲苯相中，并且遠(yuǎn)離酶。接著將殘留的吲哚分配到吲哚試劑相中并且與二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)來(lái)自微量試管的500微升甲苯層與另一個(gè)試管中的1毫升的吲哚試劑混合，并且使分離20分鐘，然后小心將下層移液到小池中并且在450nm下測(cè)定吸光度。進(jìn)行該部分的測(cè)試是本領(lǐng)域公知的。
也開發(fā)出獨(dú)特的微量滴定板方法來(lái)革新分配步驟和數(shù)據(jù)采集。首先，如上所述在微量試管中進(jìn)行TSβ反應(yīng)。然后，孵育和從測(cè)試溶液分離吲哚之后，將含有吲哚的150微升甲苯相轉(zhuǎn)移到聚丙烯微量滴定板(可以使用任何溶劑抗性微量滴定板)，并且加入100微升二甲基氨基苯甲醛試劑。輕搖動(dòng)平板。加入一滴礦物油以覆蓋存在的兩層液體(這樣導(dǎo)致每孔三層)。以低速離心平板，如果需要，將中間相水平面平整。通過(guò)甲苯層分開下層試劑和礦物油。用聚酯薄膜片覆蓋平板(以保護(hù)平板讀數(shù)器和避免蒸發(fā))，并且在535nm處在平板讀數(shù)器上監(jiān)測(cè)吸光度。用來(lái)表達(dá)結(jié)果的單位是每小時(shí)每克新鮮組織重量反應(yīng)的吲哚的nmol，或者nmol/小時(shí)/毫克蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過(guò)Bradford的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72，248(1976))使用從Bio-RadLaboratories，Hercules，CA購(gòu)得的試劑測(cè)定。從高等植物部分純化TS從菠菜部分純化TS在TSβ測(cè)試中使用。通過(guò)將組織勻漿，制備30-50％硫酸銨級(jí)分并且將其冷凍，將溶解的沉淀施用到FPLC柱(Waters SW300，Waters Corporation，F(xiàn)ranklin MA)，從大量蛋白質(zhì)分離TS活性(測(cè)定為TSβ)，實(shí)現(xiàn)最大程度的純化。產(chǎn)率是34％，180倍純化。對(duì)于玉米TS使用類似的方法。接著在MonoQ上進(jìn)行色譜，用氯化鈉洗脫通過(guò)從合酶中部分去除TSα亞基提高純度，但是導(dǎo)致產(chǎn)率的降低。因?yàn)椴糠旨兓闹参颰S的測(cè)試的低產(chǎn)率，在粗提取液或者在酶制劑中測(cè)定內(nèi)源酶，涉及一個(gè)或兩個(gè)純化步驟。如下面的實(shí)施例5所述，相對(duì)純的植物TS的生產(chǎn)需要使用轉(zhuǎn)化的生物體。
如下制備在上述TSβ測(cè)試中使用的植物組織。在液氮中用研體和研午均化2克植物組織，并且轉(zhuǎn)移到第二個(gè)研體中，在0.1mM PLP，5mMEDTA，10mMβ-巰基甲醇，1mM PMSF和50mM氯化鉀(總體積10毫升)中進(jìn)一步勻化，并且以25000xG離心20分鐘。這是粗勻漿。向上清液加入硫酸銨至大約30％飽和度并且離心去除沉淀。然后向得到的上清液加入硫酸銨至大約50％飽和度。離心收集第二次沉淀，并且溶解于上述測(cè)試溶液中開始TSβ測(cè)試。或者，將沉淀冷凍以在較晚些時(shí)候進(jìn)一步純化。
或者，使用80％飽和度下一次硫酸銨沉淀物沉淀TS。用最后的溶液將冷凍的沉積物洗滌。然后每克鮮重再次懸浮于0.5毫升勻化緩沖液用于測(cè)定。二氫色氨酸用作對(duì)照。已知二氫色氨酸抑制TSβ活性。
該實(shí)施例說(shuō)明在大腸桿菌中超表達(dá)產(chǎn)生活性重組TSα亞基。下面描述在這些實(shí)驗(yàn)中使用的方法和材料。植物TSα表達(dá)載體的構(gòu)建為了獲得大量的(微克-毫克)純化的活性植物TS用于抑制劑和修飾的TS基因的分析，開發(fā)了大腸桿菌基生產(chǎn)系統(tǒng)。構(gòu)建了三種質(zhì)粒用于在大腸桿菌中表達(dá)擬南芥屬TSα基因?；蚬こ虒?duì)質(zhì)粒進(jìn)行處理表達(dá)TSα編碼序列，包括(i)一個(gè)完全的轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC757)，(ii)一個(gè)部分轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC758)，和(iii)只有一個(gè)成熟蛋白質(zhì)序列(即沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC759))。
用來(lái)擴(kuò)增具有一個(gè)完全的轉(zhuǎn)運(yùn)序列(用于pAC757構(gòu)建)的編碼TSα的基因片段的5-prime PCR引物包含序列5’-GGGTTGGATCCATGGCGATTGCTT-3’。對(duì)于具有一個(gè)部分轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC757)的TSα構(gòu)建體，5-prime引物包含序列5’-GATTCGGATCCATGGCTTCTCTCT-3’。對(duì)于只編碼推導(dǎo)的成熟TSα蛋白的基因片段的擴(kuò)增，5-prime引物包含序列5’-AACAAGGATCCGTAGCATTCATACC-3’。每一次擴(kuò)增的3-prime PCR引物包含序列5’-TATCGATTTCGAACCCGGGTACCGA-3’。設(shè)計(jì)每一個(gè)5一原型引物包含Bam HI限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3-prime引物包含Eco RI位點(diǎn)。擬南芥屬TSα基因用作模板。每一個(gè)PCR產(chǎn)生的片段首先克隆到TA克隆載體(可從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得)中，然后符合讀框地亞克隆到pGEX-2T載體(可從Pharmacia(Piscataway，NJ)獲得)中。將完全表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中。從大腸桿菌培養(yǎng)物中純化植物TSα使用用pAC753，pAC754或pAC755轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(DH5α)的50ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種1升含有50微克/毫升氨芐青霉素和1∶1000稀釋度的滅菌消泡劑A的Luria肉湯。該培養(yǎng)物在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。加入IPTG至1mM(0.238克/升)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，并且將細(xì)胞再培養(yǎng)2.5小時(shí)。離心(在Beckman JA-10旋轉(zhuǎn)器中以5000rpm離心10分鐘)收集細(xì)胞，并且立即冷凍并且在-20℃下貯存。將冷凍的沉積物再次懸浮于10毫升MTPBS(150mM氯化鈉，16mM磷酸氫二鈉，4mM磷酸二氫鈉，pH7.3)。加入Triton X-100至終濃度為1％，并且加入溶菌酶至終濃度為100微克/毫升。將該漿液在30℃下孵育15分鐘。通過(guò)中度超聲處理降低粘度。樣品在4℃下在Beckman JA-20旋轉(zhuǎn)器中以10000rpm離心10分鐘。
細(xì)胞溶胞和離心之后，上清液與2毫升溶漲谷胱甘肽瓊脂糖小球(硫鍵，Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO)，1毫升溶漲的固體小球，l毫升緩沖液。混合，并且在攪拌下孵育45分鐘。離心(1000rpm臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘)沉積小球并且用室溫的MTPBS洗滌小球。重復(fù)洗滌兩次。將洗滌過(guò)的小球加到建議的柱子上。該柱子進(jìn)一步用MTPBS洗滌直到洗脫液的A280與MTPBS所匹配。用游離的谷胱甘肽競(jìng)爭(zhēng)洗脫融合蛋白(含有5mM還原的谷胱甘肽[從Sigma購(gòu)得][最終pH7.5，新制備的]的50mM Tris.HCl pH8.0)。集中A280吸光度的所有的級(jí)分。SDS-PAGE分析指明從每一個(gè)構(gòu)建體表達(dá)預(yù)期分子量的融合蛋白。向集合液加入一毫克凝血酶制劑(凝血酶-牛血漿凝血酶，從Sigma購(gòu)得，Ctalog#T7513)，該樣品在室溫下在50mM檸檬酸鈉和150mM氯化鈉中透析過(guò)夜。SDS-PAGE表明每一種融合蛋白被裂解為各GST和TSα蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒pAC758表現(xiàn)出產(chǎn)生最大量的TSα蛋白質(zhì)，但是，以沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)序列的TSα的預(yù)期分子量為基礎(chǔ)，GST蛋白質(zhì)泳帶可能被該蛋白質(zhì)泳帶遮蔽了。對(duì)于具有完全轉(zhuǎn)運(yùn)序列的裂解的TSα蛋白質(zhì)，在凝膠上沒(méi)有檢測(cè)到蛋白質(zhì)，但是該樣品具有TSα活性。大部分蛋白質(zhì)和大部分活性都從pAC758產(chǎn)生。植物TSβ表達(dá)構(gòu)建體為了獲得大量的純化的活性植物TS用于抑制劑和修飾的TS基因的分析，開發(fā)了大腸桿菌基生產(chǎn)系統(tǒng)。構(gòu)建了三種質(zhì)粒用于在大腸桿菌中表達(dá)擬南芥屬TSβ基因。基因工程對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行處理表達(dá)TSβ，所述TSβ具有(i)一個(gè)完全的轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC753)，(ii)一個(gè)部分轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC754)，或(iii)沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)序列，即只表達(dá)預(yù)計(jì)的成熟TSβ蛋白質(zhì)(pAC755)。通過(guò)TSβ基因片段的PCR擴(kuò)增開始構(gòu)建pAC753，使用引物3(5’-AACAGGGATCCGCAGCCTCAGGC-3’)和引物4(5’-GTTTCTCGAATTCAAACATCAAGAT-3’)，并且從Dr.G.R.Fink，MIT(M.B.Berlyn等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)864604-4608，6月，1989)處獲得的擬南芥屬TSβ基因用作模板。為了產(chǎn)生含有包含部分轉(zhuǎn)運(yùn)序列(pAC754)的TSβ編碼序列的片段，使用引物2(5’-TCGTCTGGATCCAAGTCATCATCCT-3’)和引物4。為了產(chǎn)生沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)序列的編碼成熟TSβ蛋白質(zhì)的片段，使用引物1(5’-ACCCGGATCCTTCGGTCGGTTT-3’)和引物4。設(shè)計(jì)每一個(gè)5-prime引物包含一個(gè)Bam HI限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3-prime引物包含一個(gè)Eco RI位點(diǎn)。為了表達(dá)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶/TSβ基因融合蛋白，這些限制性酶切位點(diǎn)用來(lái)將PCR片段克隆到pGEX-2T載體(Pharmacia)。每一個(gè)PCR擴(kuò)增的片段首先克隆到Invitrogen TA克隆載體中，然后亞克隆到pGEX-2T載體中。將完全構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DHα中。
為了能從TSβ蛋白質(zhì)裂解谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)，構(gòu)建質(zhì)粒包含5個(gè)氨基酸凝血酶識(shí)別位點(diǎn)。蛋白質(zhì)酶解在TSβ蛋白質(zhì)的N-末端產(chǎn)生兩個(gè)額外的殘基，Gly-Ser。正如SDS-PAGE凝膠上證實(shí)的，用凝血酶處理之后，上述每一個(gè)載體表達(dá)預(yù)期的融合蛋白和預(yù)期的GST和TSβ蛋白質(zhì)。從大腸桿菌培養(yǎng)物中純化植物TSβ使用用pAC753，pAC754或pAC755轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(DH5α)的50ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種1升含有50微克/毫升氨芐青霉素和1∶1000稀釋度的滅菌消泡劑A的Luria肉湯。該培養(yǎng)物在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。加入IPTG至1mM(0.238克/升)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，并且將細(xì)胞再培養(yǎng)2.5小時(shí)。離心(在Beckman JA-10旋轉(zhuǎn)器中以5000rpm離心10分鐘)收集細(xì)胞，并且立即冷凍并且在-20℃下貯存。將冷凍的沉積物再次懸浮于10毫升MTPBS(150mM氯化鈉，16mM磷酸氫二鈉，4mM磷酸二氫鈉，pH7.3)。加入Triton X-100至終濃度為1％，并且加入溶菌酶至終濃度為100微克/毫升。將該漿液在30℃下孵育15分鐘。通過(guò)中度超聲處理降低粘度。樣品在4℃下在Beckman JA-20旋轉(zhuǎn)器中以10000rpm離心10分鐘。
為了純化GST/TSβ融合蛋白，將上清液溫?zé)嶂潦覝?，并且與用MTPBS平衡的1毫升谷胱甘肽瓊脂糖漿液(0.5毫升溶漲的固體小球，0.5毫升緩沖液)(硫鍵，從Sigma Chemistry Co.，St.Louis，MO獲得)混合。緩慢攪拌樣品并且孵育10分鐘。將rpm提高到1500在臺(tái)式離心機(jī)上離心沉積小球并且立即關(guān)閉離心機(jī)。棄除上清液，小球用5毫升MTPBS洗滌，再次離心。重復(fù)洗滌步驟4次。加入含有5mM還原的谷胱甘肽[從Sigma購(gòu)得][最終pH7.5，新制備的]的0.5毫升的50mMTris.HCl pH8.0)洗脫融合蛋白。低速離心再次沉積小球并且收集上清液。再重復(fù)洗滌步驟2次。過(guò)濾上清液去除殘留的谷胱甘肽瓊脂糖小球。加入0.5毫克凝血酶制劑(含有凝血酶和緩沖液鹽，SigmaCat#T7513)裂解GST/TSβ融合蛋白。然后該樣品在2升50mM檸檬酸鹽和150mM氯化鈉pH6.5中透析過(guò)夜。使用在大腸桿菌中表達(dá)的TSα和TSβ的植物TS測(cè)試將植物TS蛋白質(zhì)表達(dá)為融合蛋白，其具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)有利于純化。純化之后，如上所述在進(jìn)行植物TS測(cè)試之前用凝血酶切割掉GST蛋白質(zhì)。凝血酶酶切之后，TSα和TSβ-亞基蛋白質(zhì)除了TS序列之外都在蛋白質(zhì)的N-末端保留了Gly-Ser殘基。對(duì)于每一次TSα測(cè)試使用大約5微克蛋白質(zhì)，對(duì)于每一次TSβ測(cè)試使用大約10微克蛋白質(zhì)。
如實(shí)施例3中對(duì)沙門氏菌TSα所述進(jìn)行TSα酶測(cè)試。表4給出了TSα酶活性的結(jié)果。表4
*在加入TSβ樣品之前向反應(yīng)混合物加入TSα樣品(裂解的融合蛋白)。
**這接近測(cè)試限。
表4中的結(jié)果表明在大腸桿菌中表達(dá)的TSα蛋白質(zhì)是活性的。但是只有在TSβ蛋白質(zhì)的存在下TSα蛋白質(zhì)才是完全有活性的。
根據(jù)實(shí)施例4所述進(jìn)行TSβ測(cè)試。表5給出了測(cè)試的結(jié)果。
表5
參照表5，兩個(gè)構(gòu)建體pAC753和pAC754具有非常高的TSβ活性，比使用內(nèi)源植物提取液例如來(lái)自菠菜或玉米的提取液獲得的高得多。沒(méi)有前導(dǎo)序列的TSβ是失活的。但是，沒(méi)有轉(zhuǎn)運(yùn)序列的TSβ蛋白質(zhì)能激活TSα-亞基活性(參見表4)。
這些數(shù)據(jù)與使用缺失色氨酸合酶活性的大腸桿菌突變體的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例6描述的實(shí)驗(yàn))獲得的結(jié)果相吻合。參照實(shí)施例6，沒(méi)有前導(dǎo)序列的成熟擬南芥屬TSβ基因不能補(bǔ)償大腸桿菌。但是，表達(dá)完整轉(zhuǎn)運(yùn)序列的TSβ基因能補(bǔ)償該突變。
使用的大腸桿菌突變株在內(nèi)源酶基因中包含一個(gè)突變。菌株EC972(met-arg-trpB202)和NK7402(trpB83∷tn10)從ATCC保藏中心獲得。菌株W3110 trpA33和W3110 tnA2 trpB9578是StanfordUniversity的Charles Yanofsky饋贈(zèng)的(Radwanski，E.R.等，Mol.Gen.Genet.248657-667，1995)。所有的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)(complementation test)都在M9培養(yǎng)基上進(jìn)行。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有蛋酸和精氨酸用于測(cè)定EC972轉(zhuǎn)化體。
質(zhì)粒pB1907，G.R.Fink，MIT博士(M.B.Berlyn，R.L.Last，G.R.Fink，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)864604-4608，6月，1989)饋贈(zèng)的禮物，包含編碼2.1kb EcoRI片段上TSβ亞基的擬南芥屬TSβ基因。將EcoRI片段改變?yōu)榘ˋTG起始密碼子周圍的NcoI位點(diǎn)(CCATGG)。通過(guò)用NcoI(基因的5’末端)和Hind III(基因的3’末端的多位點(diǎn)接頭)消化將該片段克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pKK233-2(得自Pharmacia，Piscataway，NJ)中，產(chǎn)生鑒定的分離的質(zhì)粒pAC502和pAC505。表達(dá)載體pKK233-2含有tac啟動(dòng)子和rrnB核糖體中止子。
將側(cè)翼有pKK233-2啟動(dòng)子和中止子的擬南芥屬TRPB序列亞克隆到載體pACYC184(New England Biolabs，Beverly，MA)中。首先為了將啟動(dòng)子-中止子區(qū)亞克隆到pACYC184中并且產(chǎn)生鑒定的分離的質(zhì)粒pAC510和pAC511，用Sca I和Eco RI消化兩個(gè)質(zhì)粒pKK233-2和pACYC184。通過(guò)用HindIII完全消化和用NcoI部分消化，從質(zhì)粒pAC502獲得含有擬南芥屬TRPB序列的片段。將得到的片段克隆到pAC510中，pAC510用NcoI完全消化和用HindIII部分消化，產(chǎn)生鑒定的分離的質(zhì)粒pAC515和pAC516。
兩個(gè)獨(dú)立分離的克隆pAC502和pAC504轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株EC972中。由于內(nèi)源trpB基因中的一個(gè)突變，該菌株需要補(bǔ)充色氨酸以生長(zhǎng)。對(duì)表達(dá)擬南芥屬TSβ的轉(zhuǎn)化體測(cè)定它們的在下面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力(i)沒(méi)有補(bǔ)充的基本培養(yǎng)基或者(ii)補(bǔ)充有吲哚，TSβ亞基的底物的基本培養(yǎng)基。表6給出了這些試驗(yàn)的結(jié)果。
表6
ND＝?jīng)]有測(cè)定*補(bǔ)充有蛋氨酸和精氨酸的M9基本培養(yǎng)基，因?yàn)镋C972是met-arg-。
表達(dá)擬南芥屬酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體能在基本培養(yǎng)基和補(bǔ)充有吲哚的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明植物酶在大腸桿菌中有功能。
當(dāng)含有tac啟動(dòng)子，擬南芥屬TRPB基因和rrnB終止子的片段從質(zhì)粒pKK233-2亞克隆到質(zhì)粒pACYC184中時(shí)證實(shí)了該結(jié)果。得到的pAC515和pAC516質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到W3110tna2trpB9578(表型trpB-)和NK7402trpB83∷tn10(表型trpA-trpB-)中。在下面的培養(yǎng)基上平鋪攜帶pAC515或pAC516的5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體(i)基本培養(yǎng)基，(ii)補(bǔ)充吲哚的基本培養(yǎng)基或者(iii)補(bǔ)充色氨酸的基本培養(yǎng)基。W3110trpA33(表型trpA-)和W3110tna2trpB9578(表型trpB-)插入為對(duì)照物。表7給出了該補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表7
1W3110 trpB＝W3110tna2trpB9578，表型是trpB-。
2NK7402 trpB83∷tn10。表型是trpA-trpB-。
ND＝?jīng)]有測(cè)定。
當(dāng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充有吲哚時(shí)，擬南芥屬TSβ亞基能補(bǔ)償攜帶大腸桿菌trpB基因一個(gè)突變的菌株的生長(zhǎng)，并且能補(bǔ)償攜帶trpA和trpB兩者都有突變的大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)。高通量抑制劑篩選方法通過(guò)植物酶的表達(dá)補(bǔ)償缺失內(nèi)源TS活性的大腸桿菌菌株使得以高生產(chǎn)率方式篩選植物TS的抑制劑?？梢栽谟谢驔](méi)有補(bǔ)充色氨酸的基本培養(yǎng)基的雙份平板上進(jìn)行篩選?？梢栽谄桨迳霞哟竽c桿菌菌株的菌苔，然后以雙份的方式用試驗(yàn)化合物點(diǎn)平板。在沒(méi)有色氨酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生一條清晰的帶但是在補(bǔ)充有色氨酸的培養(yǎng)基中具有較小的或者沒(méi)有清晰的帶的化合物是色氨酸生物合成途徑的抑制劑的指征。以這種方式鑒定的化合物可以進(jìn)一步進(jìn)行酶測(cè)試或者進(jìn)行這里描述的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法。在細(xì)菌中進(jìn)行該項(xiàng)篩選的優(yōu)點(diǎn)在于可以以高生產(chǎn)率和自動(dòng)方式篩選大量的化合物。
使用補(bǔ)償擬南芥屬TSα或TSβ基因的相同的大腸桿菌菌株以高生產(chǎn)率方式來(lái)鑒定帶來(lái)對(duì)TS抑制劑的抗性的突變。這樣的變體抗性基因用于賦與農(nóng)作物對(duì)TS抑制除草劑的抗性。誘變大腸桿菌菌株，并且平鋪到含有除草劑的M9基本培養(yǎng)基上?；厥諗y帶具有植物TS酶的抗性變體的質(zhì)粒的菌株。對(duì)TS基因測(cè)序來(lái)鑒定突變。將這些抗性基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物中。
表8
*在加入大腸桿菌pAC755(3微克)酶解蛋白質(zhì)之前向反應(yīng)混合物加入大腸桿菌pAC758(1.5微克)酶解蛋白質(zhì)。
**這接近該項(xiàng)測(cè)試限。
這些結(jié)果證明設(shè)計(jì)抑制沙門氏菌屬酶的化合物也抑制來(lái)自高等植物的TS酶。因此，可以將包含微生物TS酶的測(cè)試用作鑒定和測(cè)試植物TS的新的抑制劑的試驗(yàn)體系。
對(duì)沙門氏菌屬酶有活性(在TSα測(cè)試中測(cè)定的)的抑制化合物對(duì)菠菜酶也有活性(在根據(jù)實(shí)施例4的TSβ測(cè)試中測(cè)定的)。在這些實(shí)驗(yàn)中，定量測(cè)定TSα活性，同時(shí)定性測(cè)定TSβ活性。表9給出了結(jié)果。
表9
*“+”數(shù)的增加相應(yīng)于抑制作用的增強(qiáng)。
前面的實(shí)施例證明本發(fā)明的化合物是有力的微生物和植物TS酶的體外抑制劑。但是，這些化合物體內(nèi)可具有不同的作用機(jī)理。因此證明化合物的除草作用是由于阻斷色氨酸生物合成這一點(diǎn)是重要的。下面描述的逆轉(zhuǎn)測(cè)試(也已知為拯救，防止或補(bǔ)償)證明預(yù)期的作用機(jī)理(即阻斷色氨酸生物合成)事實(shí)上在植物中發(fā)生。擬南芥屬中TS抑制劑的除草活性的逆轉(zhuǎn)通過(guò)代謝產(chǎn)物，生物合成途徑的產(chǎn)物或者其它化合物的除草癥狀的逆轉(zhuǎn)可以指明除草化合物的作用機(jī)理。
在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，在含有0.7％瓊脂的Murashige基本培養(yǎng)基(從LifeTechnologies，Grand Island，Y.N.獲得)上生長(zhǎng)的擬南芥上測(cè)試TS抑制劑。對(duì)化合物在不同的濃度下試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)它們的除草活性。表10給出了證明用色氨酸的TS抑制劑的除草活性的逆轉(zhuǎn)的結(jié)果。
表10
分級(jí)0-沒(méi)有效果，9-完全殺死，C-處理后4-6天萎黃病籽苗。
參照表10，TS抑制劑在寬濃度范圍下是除草性的，引起籽苗的嚴(yán)重矮化和萎黃病，最終導(dǎo)致植物死亡。通過(guò)向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入L-色氨酸完全防止了這些癥狀。用除草劑處理的植物變干，而用除草劑和L-色氨酸處理的植物看起來(lái)健康并且與未處理的植物沒(méi)有不同。色氨酸是能完全逆轉(zhuǎn)這些TS抑制劑的除草活性的唯一一種氨基酸。這些結(jié)果證明體外抑制TS的化合物在體內(nèi)是除草性的，體內(nèi)除草活性只是由于色氨酸生物合成的抑制。
因此，使用用色氨酸的逆反測(cè)試可以鑒定抑制TS的除草化合物。該方法開始可以用作高通量篩選測(cè)試，或者用作鑒定和證明一種特定抑制劑的作用機(jī)理是由于色氨酸生物合成的抑制的第二級(jí)測(cè)試。實(shí)施例10該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明自由酸類似物酯在體內(nèi)是更有效的抑制劑。
植物具有酯酶，其從很多生物異源物質(zhì)去除酯基，盡管在一些物種中具體化合物的去酯化作用可能比其它物種發(fā)生得更快。此外，基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)中的變化可能影響各物種中去酯化作用的速度。下面的結(jié)果證明這影響對(duì)擬南芥屬的除草損傷，并且解釋為什么一些酯在體外條件下可能比在體內(nèi)條件下在溫室中效果小。表11給出了結(jié)果。
表11除草劑的濃度
比分0-沒(méi)有效果，9-完全殺死，C-萎黃病籽苗。
因此，事實(shí)上，是TS的除草抑制劑的化合物通?？梢院铣蔀槎ズ湍承愿纳圃谥参飪?nèi)將化合物送遞給靶位點(diǎn)。
集胞藍(lán)細(xì)菌屬是單細(xì)胞綠色生物體，其實(shí)際上是光合成細(xì)菌，其光合成系統(tǒng)非常類似于高等植物葉綠體。本發(fā)明的化合物可以抑制集胞藍(lán)細(xì)菌屬的培養(yǎng)物生長(zhǎng)，并且在色氨酸的存在下可以防止生長(zhǎng)抑制作用。
色氨酸完全逆轉(zhuǎn)4-[(2-羥基苯基)硫基]丁基-膦酸的苯甲酸酯對(duì)藍(lán)細(xì)菌屬集胞藍(lán)細(xì)菌屬PCC6803的生長(zhǎng)抑制作用。
表12
*在微量滴定板中液體培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)試，在0時(shí)間(培養(yǎng)稀釋)加入抑制劑，然后在4天后測(cè)定活性。更大濃度的抑制劑或色氨酸是抑制性的。
表13給出了本發(fā)明的TS-抑制除草劑引起的早期損傷癥狀。通過(guò)以4或8kg/ha施用的{4-[(鄰-羥基苯基)硫基]丁基}-膦酸除草活性代表癥狀和物種效果。
表13
*出苗后施用抑制劑之后6天描述的癥狀。
**出苗后施用之后13天描述的物種效果。
利用TSβ反應(yīng)測(cè)試來(lái)自根據(jù)實(shí)施例4制備的硫酸銨沉淀的TS，并且以每小時(shí)每克鮮重使用的吲哚的nmol或者以nmol/小時(shí)/毫克組織蛋白質(zhì)表示結(jié)果。使用菠菜，玉米和番茄的實(shí)驗(yàn)證明嫩的生長(zhǎng)著或發(fā)育著的組織具有最大量的TS酶。這與用TS-抑制除草劑處理過(guò)的植物物種的品種中見到的損傷癥狀的類型極為相關(guān)。相反，莖和莖干組織不具有可測(cè)得量的酶。這與高等植物TS基因包含將該蛋白質(zhì)定向葉綠體的信號(hào)序列的事實(shí)相關(guān)。
表14給出了證明Spinacea oleracea中分化和生長(zhǎng)著的組織具有最高TS活性的結(jié)果。除了成熟葉子外的所有的組織都是分化和/或生長(zhǎng)組織。
表14
玉米組織培養(yǎng)物是內(nèi)源TS的另一個(gè)來(lái)源?；厥盏幕钚缘牧咳Q于培養(yǎng)物的基因型和/或狀態(tài)。部分純化產(chǎn)生的酶在Waters SW300柱子上洗脫鑒定為菠菜TS。通過(guò)β反應(yīng)測(cè)定來(lái)自玉米培養(yǎng)物的TS活性。
表15給出了證明玉米的分化細(xì)胞培養(yǎng)物(II型胼胝體)比緩慢生長(zhǎng)的細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)物(晚對(duì)數(shù)期)具更多的TS活性的結(jié)果。
表15
使用來(lái)自番茄(Lycopersicum esculentum)的TS來(lái)比較TS水平與組織年齡的關(guān)系。使用下面的植物材料長(zhǎng)有很多成熟番茄的成熟植物；10-葉期的開花植物；和19天齡的小籽苗?？焖偕L(zhǎng)的植物上新生長(zhǎng)著的組織具有最大的酶活性和比活。通過(guò)Bradford蛋白質(zhì)分析測(cè)定比活。表16給出了證明高TS活性與在Lycopersicum esculentum中活性生長(zhǎng)和/或分化的組織相關(guān)的結(jié)果。表16
快速生長(zhǎng)著的“庫(kù)(sink)”組織具有比緩慢或者非生長(zhǎng)“源(source)”組織高得多的TS水平?！皫?kù)”組織表現(xiàn)出隨著時(shí)間凈獲得一些營(yíng)養(yǎng)和有機(jī)代謝產(chǎn)物，而“源”組織減少這些營(yíng)養(yǎng)。5葉的非開花植物上嫩快速擴(kuò)展的葉(庫(kù)組織)具有比開花的7-葉植物的第一次開花花束基部的葉子(源組織)更高的TS活性。
表17給出了證明番茄中“庫(kù)”葉組織具有比“源”葉組織更高的TS活性的結(jié)果。
表17
所有齡的植物上莖尖具有最大TS活性。只有在結(jié)果之后莖尖處的TS活性才下降。這樣，TS抑制劑在施用或達(dá)到植物生長(zhǎng)著的莖尖是最有效。
表18給出了證明所有齡的番茄植物在結(jié)果之前莖尖具有最大TS活性的結(jié)果。
表18
*全葉是至少有擴(kuò)展的5個(gè)小葉的葉子。各莖尖的最大葉子是沿著葉軸大約8厘米。
表19給出了證明莖尖下面的組織具有極小TS活性的結(jié)果。種植之后22天提取溫室番茄籽苗。根組織和莖尖下面的莖干組織沒(méi)有可測(cè)得的TS活性。
表19
*當(dāng)去除土壤時(shí)根尖受到了損傷。
表20給出了證明不同齡的番茄植物的頂尖處的小葉比接近不同齡的番茄植物的頂尖處的較大葉子具有更大的TS活性。將TS活性對(duì)鮮重的葉子進(jìn)行對(duì)數(shù)校正(回歸校正0.74)，每個(gè)葉子0.1-0.6克鮮重是最大活性，并且每個(gè)葉子4克或者更高活性小于10％(表20)。
表20
*從事先種植了13天，27天，40天和81天的植物去除葉子，并且利用TSβ反應(yīng)測(cè)定TS水平。
TS不是一種豐富的酶，在上述番茄和菠菜的實(shí)施例中，即使最高水平的TS活性也一般小于200nmol/h/g植物組織鮮重。大多數(shù)籽苗甚至具有比番茄或菠菜更低的TS活性。根據(jù)實(shí)施例4所述測(cè)試TSβ活性。在溫室的合成盆栽混合物中種植雜草物種2星期(從種子開始年生)或4星期(季生雜草物種)。植物沒(méi)有用農(nóng)藥處理，但是用于實(shí)驗(yàn)的雜草籽苗大小與早期出苗后施用除草劑的那些相等。
表21給出了證明一些主要雜草中TS活性水平非常低的結(jié)果。很多雜草具有低得不能測(cè)定的TS活性。因此在活性酶的量已經(jīng)非常低的意義上TS是好的除草劑靶物。當(dāng)對(duì)硫酸銨沉淀(25-60％)(根據(jù)實(shí)施例4制備)測(cè)試TSβ活性時(shí)，只有野歐白芥(Sinapis arvensis)和偃麥草(Elytrigia repens)具有可測(cè)定的活性。
表21
*在種植2星期之后對(duì)年生雜草物種(上莖)提取，在種植44星期種植對(duì)多年生的提取。
表22給出了證明TS活性分布于幼玉米籽苗中的結(jié)果。
在5天齡水培生長(zhǎng)的籽苗玉米提取測(cè)定TS活性以避免土壤顆粒接觸根。通過(guò)在濕潤(rùn)紙塔中使籽苗萌芽，然后只把各籽苗的根放在盛有合適的稀釋的無(wú)機(jī)溶液的2盎司玻璃杯中。應(yīng)用TSβ測(cè)試評(píng)價(jià)組織樣品。居間分生組織帶是包含下輪葉組織并且包括莖干分生組織的組織帶。
表22
參照表22，嫩葉葉片比莖干輪生組織或根更具TS活性。
抗色氨酸合酶β-亞基(TSβ)的抗體可以用來(lái)評(píng)價(jià)酶在靶組織中表達(dá)的位置和水平。其也可以用作用于蛋白質(zhì)在異源體系中表達(dá)的分析試劑。
從pAC755表達(dá)TSβ亞基，純化，并且用凝血酶消化，如實(shí)施例5所述。
向凝血酶消化過(guò)的制劑(體積11毫升)，加入五分之一體積的5XSDS樣品緩沖液(50％甘油，SDS，溴代苯酚藍(lán))，和十分之一體積的1MDTT。將樣品放置于沸水域中3分鐘并且在4℃下貯存。制備12.5％SDSPAGE制備凝膠(Laemlli，1.5mm寬)，并且加載2毫升SDS處理過(guò)的樣品。凝膠上還加載2道Bio-Rad預(yù)先染色的標(biāo)準(zhǔn)物。在40mAmp下將凝膠電泳通過(guò)積層凝膠并且60mAmp通過(guò)分離凝膠。取下含有一組標(biāo)準(zhǔn)物的凝膠的部分和凝膠的TSβ制劑部分并且用考馬斯藍(lán)染色。剩余凝膠放在1M氯化鉀溶液中。觀察氯化鉀處理過(guò)的凝膠中的沉淀的蛋白質(zhì)。切除含有TSβ蛋白質(zhì)的凝膠部分并且用蒸餾水洗滌去除氯化鉀。凝膠切片在-20℃下保存。
將含有TSβ蛋白質(zhì)的凝膠切片放在錐形試管中，并且在干冰上冷凍該試管。將錐形試管穿透一個(gè)孔，并且凍干凝膠切片。通過(guò)用玻璃棒研磨弄碎凍干的樣品。稱重凍干樣品并且讓其通過(guò)加載有已知量的作為標(biāo)準(zhǔn)物的BSA的SDS-PAGE凝膠。估計(jì)每毫克凍干的丙烯酰胺凝膠中含有大約5.0微克TSβ蛋白質(zhì)。將大約10微克TSβ蛋白質(zhì)懸浮于0.8毫升RIBI MPL+TDM佐劑中。使用0.2毫升樣品腹膜內(nèi)免疫小鼠。接種之后，采集腹水。
抗擬南芥屬TS抗血清能識(shí)別大腸桿菌中表達(dá)的TSβ蛋白質(zhì)。也對(duì)抗擬南芥屬TS抗血清測(cè)試了抗擬南芥屬粗提取液。
沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，表明植物中TS蛋白質(zhì)以非常低的水平表達(dá)。該蛋白質(zhì)的低豐度對(duì)開發(fā)作為除草劑靶物的TS是有利的。
如上所述制備色氨酸合酶并且與{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-膦酸共同結(jié)晶。根據(jù)Langevine和Finn的美國(guó)專利No.5635449中描述的方法制備該化合物。
通過(guò)將{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-膦酸和TS混合制備蛋白質(zhì)-抑制劑復(fù)合物(終濃度大約10毫克/毫升和5毫克/毫升)。在如上所述的條件下生長(zhǎng)復(fù)合物的結(jié)晶。在1.步驟在100K采集衍射數(shù)據(jù)。結(jié)晶表現(xiàn)出間基C2與不對(duì)稱單位中一對(duì)αβ的對(duì)稱性。晶胞參數(shù)是a＝183.3埃，b＝59.5埃，c＝67.3埃，α＝γ＝90°，β＝94.78。對(duì)于精化，在兩倍ε(F＞20F)截留量下，從29埃和2埃之間的拆分范圍使用了47362個(gè)單一反射，相應(yīng)于全96％的完全性和91％最高拆分度。重復(fù)精化方法使用刺激的變性方法來(lái)精化該結(jié)構(gòu)，并且加上160個(gè)水分子至0.21最終R值。該精化方法非常類似于下面的實(shí)施例描述的方法，除了所有的觀察和溶劑，輔助因子和抑制劑分子的替換都使用Quanta程序(MSI)進(jìn)行。
與膦酸，{4-[(2-氨基-5-甲氧基苯基)硫基]丁基}-結(jié)合的TS的最終模型的電子密度詳細(xì)闡明了說(shuō)明書中討論的膦酸酯結(jié)合。也第一次闡明了αPhe212具有非常不一般的骨架雙面夾角，α-碳-氫鍵指向膦酸根基團(tuán)，并且苯環(huán)體系位于抑制劑的環(huán)系之上，這樣對(duì)抑制劑的芳環(huán)提供了一種T-形芳香-芳香相互作用。
靜電勢(shì)計(jì)算使用DELPHI程序(MSI)中實(shí)現(xiàn)的Finite ElementPoisson-Boltzman算法，有兩步程序，參數(shù)如Bashford和Karplus，Biochemistrym1990，29，10219中所描述。在該以格柵為基礎(chǔ)的數(shù)字計(jì)算中，溶劑對(duì)蛋白質(zhì)靜電的影響忽略不計(jì)。以介電常數(shù)(εr)為4處理蛋白質(zhì)區(qū)，同時(shí)外部(由用1.4埃探測(cè)半徑的Connolly表面計(jì)算所定義的)被分派為εr＝78。以為離子半徑大于2埃。
在用來(lái)自CVFF力場(chǎng)(MSI)的每一個(gè)原子上帶有的部分電荷，100埃側(cè)緣長(zhǎng)度和1埃格柵間距的立方格柵，中心αE49，第一次計(jì)算TSα-亞基，將立方體表面上的格柵點(diǎn)設(shè)定為0，進(jìn)行計(jì)算。然后用最外平面格柵點(diǎn)第一次計(jì)算得到的值計(jì)算感興趣的中心周圍實(shí)現(xiàn)高分辨格柵的101格柵點(diǎn)間距0.25埃的格柵的聚焦。計(jì)算出了蛋白質(zhì)(Pu)和αE49質(zhì)子化蛋白質(zhì)(Pp)的靜電勢(shì)能的兩個(gè)值，以及相同位置和構(gòu)象但是沒(méi)有質(zhì)子化(Ap)和非質(zhì)子化(Au)形式蛋白質(zhì)殘留部分的該氨基酸的能量值的相應(yīng)對(duì)。以αE49(Pp-Pu)質(zhì)子化蛋白質(zhì)的靜電自由能和溶液(Ap-Au)中αE49質(zhì)子化作用的靜電自由能之間的差異為基礎(chǔ)，計(jì)算αE49的pKa的變化大約為8。這與實(shí)驗(yàn)得到的值7.5(Yutani等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)25914076-81，1984)和8.5(Sawada等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)189667-673，1990)良好吻合。類似的計(jì)算表明Asp60更具酸性，大約1pKa。從其在疏水性環(huán)境中的位置和αD60的存在導(dǎo)致αE49的此相當(dāng)不通常的pKa值。該氨基酸αD60的負(fù)電荷提高了去質(zhì)子化αE49的能量，因?yàn)檫@在具有兩個(gè)緊鄰的未補(bǔ)償負(fù)電荷的蛋白質(zhì)深處內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)疏水性裂隙。αE49的pKa值的該變化使酶的折疊構(gòu)象不穩(wěn)定。引入能與αE49形成鹽橋的基團(tuán)因此將釋放結(jié)合能形式的勢(shì)能。這與本發(fā)明的抑制劑的氨基和αD60之間的相互作用類似的相互作用。
也可以使用靜電勢(shì)能格柵來(lái)觀察蛋白質(zhì)和抑制劑之間的相互作用表面，因此可讓化學(xué)家觀察該蛋白質(zhì)-抑制劑相互作用的細(xì)節(jié)。圖4給出了這樣的展示的一個(gè)實(shí)例。
特別地，當(dāng)使用有立體展示優(yōu)點(diǎn)時(shí)，這樣的顯示對(duì)于合成化學(xué)家開發(fā)化學(xué)修飾的新的設(shè)想是重要的。合成程序的大多數(shù)概念性工作以早期晶體學(xué)信息的查索為基礎(chǔ)。例如，與αTS鍵合的IPPP的構(gòu)象的分析表明吲哚平面和連接基團(tuán)之間幾乎90°角(圖4)。另外，該分析表明吲哚部分非常不好地填充可得的活性位點(diǎn)空穴。作為連接基團(tuán)的硫的引入和連接基團(tuán)的延長(zhǎng)產(chǎn)生一系列性能非常優(yōu)越的抑制劑(圖5)。
描述了對(duì)設(shè)計(jì)來(lái)抑制TSα-反應(yīng)的芳基硫基烷基膦酸酯過(guò)渡態(tài)類似物1-5的結(jié)構(gòu)研究(圖5)。為了建立這些物質(zhì)的抑制作用的分子基礎(chǔ)，在2.3?；蚋玫姆直媛氏聹y(cè)定相應(yīng)的復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。這些實(shí)驗(yàn)獲得的信息解釋催化機(jī)理和研究類似物系列中抑制劑的結(jié)合的模式之間的差異。
化合物。在該項(xiàng)研究中使用下面的色氨酸合酶抑制劑4-(2-羥基苯基硫基)-1-丁烯基膦酸，與異丙基胺1∶2的鹽(1)；4-(2-羥基苯基硫基)-丁基膦酸，與二異丙基胺1∶2的鹽(2)；4-(2-氨基苯基硫基)-丁基膦酸(3)；4-(2-羥基-5-氟代苯基硫基)-丁基膦酸，與二異丙基胺1∶1的鹽(4)；和4-(2-羥基苯基亞磺?；?-丁基膦酸(5)。根據(jù)Langevine和Finn的美國(guó)專利No.5635449中的描述制備該化合物。圖2給出了這些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
結(jié)晶和X-射線數(shù)據(jù)采集。根據(jù)Miles等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2646280-6287，1989所述從鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimiurium)表達(dá)和純化色氨酸合酶α2β2復(fù)合物。通過(guò)將各成分混合制備蛋白質(zhì)-抑制劑復(fù)合物，這樣最終蛋白質(zhì)濃度是5-10毫克/毫升，最終抑制劑濃度是10mM。在結(jié)晶沒(méi)有配體的酶的原方法修改的條件下(50mM N-二[羥乙基]甘氨酸，1mM EDTA，0.8-1.5mM精胺和12％PEG4000，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.8)復(fù)合物的結(jié)晶生長(zhǎng)。晶體表現(xiàn)出對(duì)稱性間基C2，在不對(duì)稱單位中一對(duì)αβ。
在安裝有Yale雙反射鏡系統(tǒng)的Raxis IIC成象平板體系上在低溫下采集衍射數(shù)據(jù)，從在50kV和100mA下操作的Rigaku RU-200旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極產(chǎn)生CuKαX-射線。晶體與檢測(cè)器的距離是100毫米，并且振動(dòng)范圍1°。用DENZO(Otwinowski等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol)276307-325，1997)和CCP4(Dodson等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol)277620-633，1997)組程序處理數(shù)據(jù)。
精化。所有5種精化的起始模型是沒(méi)有輔因子PLP的天然TRPS(PDBentry la5s)(Schneider等，生物化學(xué)375394-406，1998)的坐標(biāo)系精化模型。對(duì)于所有的計(jì)算使用X-PLOR3.851(Rrunger，A.T.，“E-PLOR3.851”，Yale Univ.Press.，New Haven，CT1997)。使用圖解程序O(Jone等，Acta Crystallogr.A47110-119，1991)用于展示電子密度圖(不同等值水平合成的2F觀察值-F計(jì)算值和F觀察值-F計(jì)算值)，并且再次手工建立原子模型。從開始就涉及R自由因子(Brunger，A.T.Nature355472-475，1994)并且其值被用作精化過(guò)程中模型改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)。最初一輪剛體精化后，使模型進(jìn)行在4000K開始的刺激變性方法。在該點(diǎn)處，建立各復(fù)合物的膦酸酯抑制劑的原子模型和用InsightII(MSI)產(chǎn)生并且?guī)缀巫钚』墓餐o助因子PLP，計(jì)算相應(yīng)的電子密度。
接著進(jìn)行幾輪不同重量和起始溫度，分組和各B因素精化和手工再建的緩慢冷卻方案。通過(guò)在F觀察值-F計(jì)算值差異圖中選擇峰值來(lái)進(jìn)行水分子的置換。應(yīng)用兩個(gè)參數(shù)大量溶劑校正(Jiang等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)243100-115，1994)，并且這使得在精化中使用低分辨率(5-10埃)反射。在精化的最后階段中，通過(guò)使用耦合梯度最小化算法精化原子模型坐標(biāo)和B因子。表23給出了數(shù)據(jù)和精化統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果酶-抑制劑相互作用.2.3?；蚋叻直媛氏碌某Ｒ?guī)的和受激發(fā)的退火-缺省電子密度圖表明強(qiáng)陽(yáng)性特征并且清楚地描繪出不同抑制劑的苯環(huán)，硫代丁基或硫代丁烯基或亞磺?；』糠趾挽⑺岣鶊F(tuán)。正如所預(yù)期的，膦酸酯抑制劑結(jié)合α-反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)。圖3A-E中給出了對(duì)于不同抑制劑的潛在的氫鍵相互作用和自活性位點(diǎn)殘基的相對(duì)距離。在所有的抑制劑中一些相互作用是共同的，而另一些是獨(dú)特的并且對(duì)不同的抑制作用常數(shù)有貢獻(xiàn)。
使所有的抑制劑的苯環(huán)和側(cè)鏈(硫代丁基(thiobutyl)，硫代丁烯基(thiobutenyl)或亞磺?；』?與多種疏水性殘基接觸，包括Phe-22，Leu-100，Leu-127，Phe-212，Leu-232，和Thr-183的甲基。正如所預(yù)測(cè)的，這與吲哚和IPP的丙基部分的堆積非常類似。抑制劑的膦酸酯部分以大約和苯環(huán)垂直的直角延伸，而且膦酸酯氧原子和Gly-184，Gly-213，Gly-234和Ser-235的主鏈氮原子，兩個(gè)水分子和Ser-235的羥基形成氫鍵。后一種相互作用(與Ser-235的羥基)表現(xiàn)出在與抑制劑1，4和5的TRPS的復(fù)合物中特別強(qiáng)。苯環(huán)的鄰-取代基可以始終如一地與推導(dǎo)的催化殘基Asp-60的羧酸酯相互作用(X-O距離范圍是2.6-2.8埃，其中X＝O或N)(Hodel等，ActaCrystallogr，A48851-858，1992)(Hyde等，生物化學(xué)雜志，26317857-17871，1988)。抑制劑3的氨基與Asp-60的羧酸酯形成兩個(gè)氫鍵，而一個(gè)氫鍵對(duì)于鄰位-羥基取代的抑制劑。令人感興趣的是，盡管對(duì)于抑制劑3存在兩個(gè)氫鍵，但是，對(duì)于酶抑制作用，其具有比只形成一個(gè)氫鍵的鄰-羥基芳基烷基硫化物抑制劑高的IC50值。
在酶抑制和除草測(cè)試中抑制劑1具有最高活性。其結(jié)構(gòu)提供了對(duì)其效力的解釋。雙鍵帶來(lái)的剛性不干擾疏水性相互作用和范德華力相互作用的潛力，而是由于熵效應(yīng)大概有利于結(jié)合(與飽和C-C鍵的情況相比，結(jié)合時(shí)損失較小的自由度)。此外，在這種構(gòu)象下，膦酸根氧原子中的一個(gè)非常接近Ser-235的羥基，形成一個(gè)強(qiáng)的可能的低屏障，氫鍵(O…O原子間距離確定為2.4埃)(Cleland，W.W.，生物化學(xué)(Biochemistry)31317-319，1992；Cleland等，Science2641887-1890，1994；Gerlt等，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J，Am.Chem.Soc.)11511552-11568，1993；Gerlt等，生物化學(xué)(Biochemistry)32，11943-11952，1993)。這些鍵能具有12-24kcal/mol的解離能，大約比普通氫鍵高10倍。
抑制劑2的鄰-羥基與Asp-60的羧酸酯形成強(qiáng)的相互作用(O…O距離＝2.8埃)。抑制劑3的鄰-氨基與相同的羧酸酯形成兩個(gè)氫鍵(對(duì)所有的其它抑制劑形成一個(gè)氫鍵，其在該位置具有一個(gè)鄰-羥基)。但是，相對(duì)于其它抑制劑來(lái)說(shuō)，兩個(gè)氫鍵的存在不提高該抑制劑對(duì)TRPS的親和性。以與天然底物IGP復(fù)合的TRPS的結(jié)構(gòu)的疊加為基礎(chǔ)可以解釋該化合物的較弱的酶抑制活性。
抑制劑4和5具有2個(gè)獨(dú)特的原子，設(shè)計(jì)這兩個(gè)原子以增強(qiáng)與TRPS的相互作用。出人意料地，抑制劑4環(huán)中的對(duì)-氟取代基不參與任何極性相互作用，并且只接近Ile-153的CD1碳原子(F-C距離＝3.1埃)。抑制劑5的亞砜氧原子看起來(lái)與Tyr-175的羥基形成強(qiáng)氫鍵(O…O距離＝2.6埃)。令人感興趣的是注意到抑制劑5的S-O鍵精化到1.65埃，比DMSO結(jié)晶中S-O鍵距離(1.47埃)長(zhǎng)得多(Martin等，“二甲亞砜”，Wiley Inc.，紐約，NY1975)。但是，1.65埃S-O鍵長(zhǎng)接近DMSO和DMSO-還原酶之間的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的距離(McAlpine等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)275613-23，1998)。在后一種情況下，DMSO與鉬的相互作用消弱了S＝O雙鍵，并且與對(duì)于與過(guò)渡金屬連接的DMSO的小分子研究相吻合(Martin等1975)。這里給出的數(shù)據(jù)提示S＝O…H-O-Tyr-175相互作用強(qiáng)到足以類似地消弱抑制劑5中S＝O雙鍵特征。亞砜與苯環(huán)的共振也可以對(duì)該鍵的長(zhǎng)度和極性的增加有貢獻(xiàn)。
TRPS與抑制劑1，4和5的復(fù)合物中，膦酸根的一個(gè)氧原子和Ser-235的羥基氧原子之間的距離精化為小于或等于2.5埃，意味著在酶-抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定作用中涉及強(qiáng)的非常短的氫鍵。每一種抑制劑的該氫鍵的具體距離如下抑制劑1，2.4埃；抑制劑2，2.6埃；抑制劑3，2.7埃；抑制劑4，2.5埃；和抑制劑5，2.5埃。在下面很多復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)過(guò)抑制劑1，4和5這樣非常短的氫鍵羧基肽酶(Kim等，生物化學(xué)(Biochemistry)295546-5555，1990；Kim等，生物化學(xué)(Biochemistry)308171-8180，1991)，嗜熱菌蛋白酶(Holden等，生物化學(xué)(Biochemistry)268542-8553，1987；Tronrud等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)157261-268，1986)，penicillopepsin(Fraser等，生物化學(xué)(Biochemistry)315201-5214，1992)，HIV-蛋白酶(Abdel-Meguid等，生物化學(xué)(Biochemistry)327972-7980，1993)，和endothiapepsin(Dealwis，C.，Thesis，Birkbeck College，1993)，一系列膦酸酯和次膦酸酯抑制劑作為肽水解的過(guò)渡狀態(tài)的類似物起作用。在所有的這些復(fù)合物中，含磷基團(tuán)中氧原子中的一個(gè)表現(xiàn)出與谷氨酸或天冬氨酸殘基的一個(gè)羧酸氧原子的相互作用。氫鍵距(O-O距離)范圍是2.2至2.5埃。有人提出這樣短的非常強(qiáng)的低屏障(barrier)氫鍵(LBBB)對(duì)酶催化具有明顯的貢獻(xiàn)(Cleland1992；Frey等，Science2641927-1930)。但是，酶活性位點(diǎn)中存在LBHBs最近在理論上是有爭(zhēng)議的(分子力學(xué)和ab initio(量子力學(xué))計(jì)算)(Scheiner等，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1176970-6975；Washsel等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9313665-70，1996)和NNM光譜數(shù)據(jù)(Ash等，Science 2781128-32，1997)。
但是，在該實(shí)施例中，在催化機(jī)理中沒(méi)有涉及非常短的氫鍵。酶-配體復(fù)合物中有兩個(gè)非常短氫鍵的另外的例子，從化學(xué)上最接近這里給出的結(jié)構(gòu)中觀察到的。在胞苷脫氨酶與TSα抑制劑的復(fù)合物中，在抑制劑的醇羥基和具有2.4埃確定的O-O原子間距的谷氨酸羧基氧原子之間發(fā)生相互作用(Xiang等，生物化學(xué)(Biochemistry)344516-23，1995)。在溶菌酶三糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)了天冬氨酸羧基和三糖的糖部分的羥基之間非常類似的鍵(Strynadka等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)220401-424)。在胞苷脫氨酶情況下，羥基是區(qū)別底物胞苷的過(guò)渡態(tài)和基態(tài)的優(yōu)勢(shì)特征。但是，在溶菌酶的情況下，在遠(yuǎn)離提示發(fā)生的糖的配糖鍵裂解的位點(diǎn)(B位點(diǎn))觀察到該特殊的氫鍵(D和E位點(diǎn)的連接)。因此它只是賦與對(duì)于該酶的配體更高的親和性。
在本發(fā)明的酶-抑制劑的情況下，對(duì)這些氫鍵的考慮使人理解抑制劑1與α亞基活性位點(diǎn)更強(qiáng)的結(jié)合。大概，與磷?；Y(jié)合的α-β雙鍵的存在提高了其氧原子上的電子密度，并且有效地提高它們形成強(qiáng)氫鍵的趨勢(shì)。明顯注意到TRPS與抑制劑3的復(fù)合物的情況下，在生物學(xué)和酶抑制測(cè)試中具有最弱活性的化合物，在該系列復(fù)合物中(P-)O…H-O距離最大。這是第一次在酶-抑制劑復(fù)合物中觀察到膦?；鹾痛剂u基氧之間這樣的強(qiáng)氫鍵。
抑制劑和底物(IGP)結(jié)合的比較。本發(fā)明的抑制劑的膦酸根基團(tuán)和苯環(huán)的鄰-取代基的位置和相互作用與TRPS-IGP復(fù)合物中IGP的各膦酸根基團(tuán)和吲哚氮原子的位置和相互作用非常類似。但是，苯環(huán)和烷基的實(shí)際位置和取向與IGP的吲哚環(huán)和甘油基鏈的明顯不同。令人感興趣的是，在鄰-羥基化合物中，苯環(huán)看起來(lái)就吲哚平面來(lái)說(shuō)傾斜大約30°，而含有鄰-氨基的抑制劑其苯環(huán)幾乎與那個(gè)平面平行。因?yàn)樵趦深惢衔镏懈鳝h(huán)和相應(yīng)的烷基鏈之間的角大致相同(90°)，分別在膦酸酯和IGP的烷基和甘油基鏈之間發(fā)現(xiàn)了取向的相同差異。只有抑制劑3不是如此。
對(duì)催化劑機(jī)理的提示。假設(shè)α-反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)涉及四面體碳原子。該項(xiàng)研究中所有的芳基硫基烷基膦酸酯抑制劑中的C-S-C在108°和110°之間變化，這非常接近四面體配位原子預(yù)期的值(109°28’)。這意味著硫原子在過(guò)渡態(tài)中模擬推導(dǎo)的四面體碳原子。因此，對(duì)抑制劑和酶之間的相互作用的分析在理解催化機(jī)理中是有用的。
借助于三個(gè)官能團(tuán)形成α亞基活性位點(diǎn)中的過(guò)渡態(tài)B1H，B2，和B3。事先Asp-60和Glu-49分別鑒定為B2和B3，但是B1H的鑒定沒(méi)有結(jié)論(Rhee等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2738553-5，1998)。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)證實(shí)了這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即Asp-60和堿基(B2)一樣起著重要的催化作用，從吲哚氮原子(-NH-)奪取質(zhì)子并且有利于IGP的假吲哚互變異構(gòu)。在所有的復(fù)合物中，苯環(huán)的鄰-取代基，其是處于與吲哚的NH-相當(dāng)?shù)奈恢貌⑶冶憩F(xiàn)出對(duì)環(huán)的類似的電子效果，與該特殊的天冬氨酸殘基的羧酸根相互作用。本發(fā)明的抑制劑在烷基的C-4上不具有任何極性取代基(氫鍵供體)，其與IGP的吲哚的C3’等價(jià)。這樣的一個(gè)基團(tuán)有可能模擬IGP的C3’-OH的相互作用。我們的抑制劑中不存在這樣的基團(tuán)限制了就堿基B3來(lái)說(shuō)從這些結(jié)構(gòu)排除的結(jié)論。但是，TRPS的αD60N突變體與天然底物IGP的復(fù)合物的最近公開的結(jié)構(gòu)(Rhee等，1998)闡明Glu-49的羧酸氧原子的一個(gè)與IGP的C3’-OH之間的強(qiáng)氫鍵(IGP的C3’等價(jià)于本發(fā)明抑制劑的烷基的C-4)，意味著該基團(tuán)事實(shí)上作為在催化過(guò)程中將C3’-OH去質(zhì)子化并且有利于IGP裂解的堿。
表23晶體參數(shù)，數(shù)據(jù)和精化統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)
對(duì)于所有的數(shù)據(jù)和對(duì)于最高分辨率槽中的數(shù)據(jù)給出了完全度，RM，和<I/σ(I)>，Rm＝∑|I<I>|/∑/.對(duì)于下面原子模型中的殘基沒(méi)有清楚的電子密度α1，α188-193，α268，β1，β394-397.其它原子在所有的情況下代表PLP和各復(fù)合物中相應(yīng)的瞵酸酯抑制劑。對(duì)于主鏈(mc)和側(cè)鏈(sc)蛋白原子和水分子(wat)給出了平均熱B因子。<esd>是通過(guò)SIGMAA方法評(píng)估的平均坐標(biāo)(coordinate)誤差。實(shí)施例19在化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索以發(fā)現(xiàn)改進(jìn)抑制劑結(jié)合或除草活性的新的化合物或化合物片段可以產(chǎn)生新的合成構(gòu)想。下面給出了一個(gè)實(shí)施例，使用用于該目的的Ludi程序(MSI)。設(shè)計(jì)上，Ludi是一個(gè)“產(chǎn)生構(gòu)想”的工具。需要本領(lǐng)域技術(shù)人員分析其產(chǎn)生的命中片段。這里證明這樣的方法使得合成化學(xué)家發(fā)現(xiàn)修飾起始的先導(dǎo)位點(diǎn)以快速提高期望的化合物的特性。
優(yōu)選具有已知抑制劑的TS的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被用作模板。但是，通過(guò)從蛋白質(zhì)的組裝中將其去除并且將其保留為用于展示目的分離實(shí)體中的拷貝，則可以在這里描述的計(jì)算機(jī)方法中將該抑制劑忽略。(整個(gè)過(guò)程使用人-機(jī)對(duì)話的圖解包InsightII(MSI)進(jìn)行。但是，可以在獨(dú)立模式中可以使用下面列出的設(shè)置運(yùn)行LUDI程序)。
使用表24給出的參數(shù)使用Biosym Fragment Library(MSI)(1996版本)。表24
檢索中心設(shè)定為接近抑制劑環(huán)系的位置，連接基團(tuán)的中心，或者磷酸根/膦酸根基團(tuán)的大約位置，或者試圖充以新的片段的任何其它位點(diǎn)。程序計(jì)算出檢索中心的截留半徑的稱之為相互作用位點(diǎn)，例如氫鍵位點(diǎn)，范德華作用表面等。來(lái)自該數(shù)據(jù)庫(kù)的片段然后放置在該結(jié)合位點(diǎn)的模型中，優(yōu)化置換之后，計(jì)算評(píng)分，其描述補(bǔ)償特征的匹配。留下高分片段用于隨后的相互作用分析。該輪完全后，利用程序InsightII(MSI)中涉及的相互作用圖解能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠分析命中物。這些片段通常只代表抑制劑分子的一部分，因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)中的片段太小其本身不能代表高特異性和緊密結(jié)合的化合物。
這樣的檢索的第一個(gè)結(jié)果是得到抑制劑沒(méi)有完全進(jìn)入的位點(diǎn)的更好的知識(shí)。例如，圖6證明發(fā)現(xiàn)很多延伸進(jìn)入IPP抑制劑沒(méi)有填充的底物結(jié)合位點(diǎn)的一部分的片段。修飾作用，例如向吲哚(例如5-氟-吲哚-丙醇-3-膦酸)殘基的C5位或者{4-芳基-硫基丁基}-膦酸衍生物的C5位加上甲氧基或鹵原子。
對(duì)發(fā)現(xiàn)的片段進(jìn)一步評(píng)價(jià)合成的可行性，即更大抑制劑意義上合成片段的可能性。例如，需要對(duì)符合吲哚基殘基結(jié)合空穴的片段評(píng)價(jià)它們與硫基芳基(thioaryl)-liker合成連接的可能性。
還有將影響決定怎樣使用計(jì)算機(jī)建議的片段的其它補(bǔ)充的考慮。對(duì)很多片段發(fā)現(xiàn)連接基團(tuán)區(qū)，其來(lái)自氫鍵與酶。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，LUDI程序評(píng)分功能中涉及的那些相互作用的焓幾乎不在由于溶液中抑制劑的水合作用和熵效應(yīng)的缺少的相關(guān)的抑制劑結(jié)合的真實(shí)自由能降低中反映。但是，當(dāng)涉及其它目的的合成變化時(shí)，可以考慮這樣的變化。例如，研究過(guò)該酰胺鍵的連接基團(tuán)變化，其使得氫鍵在連接基團(tuán)區(qū)相互作用，并且同時(shí)引入“代謝操作”以降低抑制劑在農(nóng)作物中的壽命。此外，可以使用新的合成策略。例如，很多片段表明OH基團(tuán)可以置換吲哚NH基團(tuán)。事實(shí)上，最好的除草劑系列中有具有羥基的化合物。圖7說(shuō)明命中片段(Hit19)，其中給出了{(lán)4-[2-氨基-5-甲氧基-苯基]硫基}丁基}-膦酸的氨基之間的一個(gè)重疊。實(shí)施例20同源性模建抑制劑的有效設(shè)計(jì)，在分子水平上對(duì)結(jié)合抑制劑的理解和各種農(nóng)作物和雜草中抑制劑的結(jié)合特異性至少部分基于TS酶活性位點(diǎn)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)模型的知識(shí)。
如果可獲得關(guān)于最相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)信息，則同源性模建方法是產(chǎn)生高度精確結(jié)構(gòu)的有效途徑。
該實(shí)施例描述玉米αTS亞基蛋白質(zhì)模型的產(chǎn)生。類似地，可以產(chǎn)生全酶，并且通過(guò)類似步驟也能獲得其它物種的模型。
從公開的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得玉米αTS的氨基酸序列(登記號(hào)pirS56665)。使用Quanta程序(MSI)，在對(duì)比步驟中用缺陷設(shè)置對(duì)比玉米酶的序列和幾種已知的αTS結(jié)構(gòu)的αTS序列(登記號(hào)pdbtrs，pdbtys，和復(fù)合物TS/{4-[2-氨基-5-甲氧基-苯基)硫基]丁基}-膦酸和TS/{4-[2-氨基-5-氯代苯基]硫基}丁基}-膦酸。
以其最精化模式使用程序”modeler”(MSI)，產(chǎn)生50個(gè)玉米酶模型并且評(píng)分。然后使用程序prochek(Laskowski等，J.Appl.Cryst.，26283-291)，將5個(gè)最好的評(píng)分模型詳細(xì)分析。這使得鑒定模型中低質(zhì)量并且需要另外的精化的區(qū)。在這種情況下，證明該結(jié)構(gòu)具有非常好的質(zhì)量并且不需要進(jìn)一步進(jìn)行另外的精化。將抑制劑分子放置到模型中，首先將它們放到類似于模板結(jié)構(gòu)的位置的蛋白質(zhì)模型中。然后使用以合適的勢(shì)能函數(shù)為基礎(chǔ)的方法優(yōu)化抑制劑的取向和周圍的氨基酸。玉米酶的結(jié)合位點(diǎn)分析表明氨基酸組成中只有非常少的幾個(gè)變化影響αTS活性位點(diǎn)中底物/抑制劑結(jié)合。這樣的進(jìn)化遠(yuǎn)親生物體之間高度保守位點(diǎn)表明農(nóng)作物物種中氨基酸的小心突變證明是有益的，因?yàn)閷?duì)新的除草劑可能沒(méi)有大量的天然抗性。為了選擇有潛力的突變位點(diǎn)，首先選擇在結(jié)合抑制劑中直接涉及的氨基酸。例如，特別有利的突變的位點(diǎn)是(1)接近結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)口位置的那些和(2)不直接接觸底物但是與幾種抑制劑緊密接觸的那些(本文描述的)。對(duì)于產(chǎn)生除草劑抗性突變，那些殘基是非常令人感興趣的。這樣的位點(diǎn)可以是，例如αAla129或αLeu153(參見圖8)。下面的表列出了沙門氏菌屬和玉米酶中在底物/抑制劑結(jié)合中直接涉及的相應(yīng)的位點(diǎn)。
表25來(lái)自沙門氏菌屬和玉米的TS中的相應(yīng)的位點(diǎn)。
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本發(fā)明不局限于這里描述的具體實(shí)施方案的范圍。事實(shí)上，除了這里描述的以外，從上述描述和附圖，本發(fā)明的各種各樣的修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)變得顯而易見。這樣的修飾落在后面的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
要進(jìn)一步理解所有的大小和所有的分子量或分子質(zhì)量值是大約的，提供是為了說(shuō)明。
本說(shuō)明書中引述的專利，專利申請(qǐng)，方法和公開物其全文在這里引作參考。
權(quán)利要求
1.一種鑒定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步驟(i)向包括色氨酸合酶(TS)或至少一個(gè)其亞基的體外測(cè)試中加入一種試驗(yàn)化合物，采用所述體外測(cè)試適用于檢測(cè)所述TS或其亞基的活性；和(ii)測(cè)定所述化合物是否抑制色氨酸合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該方法用于鑒定通過(guò)結(jié)合到TSα亞基活性位點(diǎn)抑制色氨酸生物合成的化合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述TS或者其亞基是粗植物提取物，部分純化的TS或者其亞基，重組產(chǎn)生的TS或者其亞基，或者它們的組合。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述粗植物提取物來(lái)自菠菜，番茄和玉米。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述TS是重組產(chǎn)生的植物TSα亞基，TSβ亞基或者它們的組合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述TS來(lái)自擬南芥。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述TS是來(lái)自微生物或藻類的TSα亞基，TSβ亞基或者它們的組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)試是補(bǔ)償測(cè)試，包括(i)缺失內(nèi)源TS活性的生物體和(ii)能補(bǔ)償所述缺陷的TS。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法鑒定的除草抑制劑。
10.一種通過(guò)選擇具有下式I的抑制劑的化學(xué)修飾鑒定能抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法 其中Y是氫或鹵素；Z是NH2或OR2；R2是氫，C1-C4-烷基羰基或苯甲?；?；n是0，1或2的整數(shù)；W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自獨(dú)立地是氫，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亞甲基或堿金屬，銨或有機(jī)銨陽(yáng)離子，所述方法包括(i)產(chǎn)生作為與TS的復(fù)合物的式I的抑制劑的三維模型；(ii)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)確定TS和式I的抑制劑之間的有利的和不利的相互作用；(iii)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)對(duì)式I的抑制劑設(shè)計(jì)修飾以優(yōu)化所述抑制作用的結(jié)合親合力。
11.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括利用選自下面的檢測(cè)測(cè)試具有根據(jù)步驟(iii)確定的修飾的化合物適用來(lái)測(cè)定TS的抑制的體外測(cè)試，適用來(lái)利用表達(dá)內(nèi)源或異源TS酶的生物體測(cè)定TS抑制劑的體內(nèi)測(cè)試，適用來(lái)測(cè)定除草活性的體內(nèi)測(cè)試，色氨酸逆轉(zhuǎn)測(cè)試以及它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法鑒定的除草抑制劑。
13.一種鑒定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步驟(i)測(cè)定色氨酸合酶(TS)的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)；和(ii)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)模建一種化合物到所述結(jié)合位點(diǎn)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中利用X-射線晶體學(xué)，計(jì)算機(jī)模建技術(shù)或者它們的組合測(cè)定所述TS的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序Affinity，LUDI或Receptor進(jìn)行所述步驟(ii)。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述步驟(ii)包括應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序Alignment，Cat Shape或APEX對(duì)比靶抑制劑與模板抑制劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述模板抑制劑具有下式I 其中Y是氫或鹵素；Z是NH2或OR2；R2是氫，C1-C4-烷基羰基或苯甲?；籲是0，1或2的整數(shù)；W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自獨(dú)立地是氫，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亞甲基或堿金屬，銨或有機(jī)銨陽(yáng)離子。
18.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括精化所述化合物在結(jié)合位點(diǎn)中的位置的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述精化步驟利用選自下面的方法進(jìn)行能量最小化，分子力學(xué)，分子動(dòng)力學(xué)和Metropolis Monte Carlo。
20.根據(jù)權(quán)利要求13鑒定的除草抑制劑。
21.一種鑒定抑制色氨酸(TS)生物合成的化合物的方法，包括下面的步驟(i)分析一種已知的抑制劑當(dāng)與TS鍵合時(shí)的構(gòu)象；(ii)設(shè)計(jì)模擬所述抑制劑的結(jié)構(gòu)的化合物；(iii)改進(jìn)步驟(ii)中設(shè)計(jì)的化合物的結(jié)構(gòu)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中通過(guò)用所述已知抑制劑為模板對(duì)電子數(shù)據(jù)庫(kù)檢索來(lái)進(jìn)行所述步驟(ii)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述已知抑制劑具有下式I 其中Y是氫或鹵素；Z是NH2或OR2；R2是氫，C1-C4-烷基羰基或苯甲酰基；n是0，1或2的整數(shù)；W是-(CH2)4-，-CH2CH＝CHCH2-或-CH2CH2CH＝CH-；和R和R1各自獨(dú)立地是氫，C1-C4-烷基，C1-C4-烷基羰基氧基亞甲基或堿金屬，銨或有機(jī)銨陽(yáng)離子。
24.權(quán)利要求21的方法，通過(guò)保留對(duì)結(jié)合TS必需的原子和基團(tuán)的位置并且略去，修飾或添加不必需的原子或基團(tuán)來(lái)進(jìn)行所述步驟(ii)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法鑒定的除草抑制劑。
26.一種鑒定抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法，包括下面的步驟(i)通過(guò)對(duì)已知的TS結(jié)構(gòu)的同源性模建來(lái)產(chǎn)生植物TS的結(jié)構(gòu)模型。(ii)設(shè)計(jì)符合所述產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)模型的結(jié)構(gòu)的化合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述步驟(i)包括(a)選擇一個(gè)模板TS分子，(b)對(duì)比模板TS分子的氨基酸序列與靶TS分子的氨基酸序列，和(c)利用蛋白質(zhì)同源性建模產(chǎn)生靶TS分子的計(jì)算機(jī)模型。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述已知的TS得自沙門氏菌屬。
29.一種鑒定有潛力的除草劑-抗性色氨酸合酶(TS)變體蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括(i)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)將除草劑放置于TS蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中；(ii)在所述TS蛋白質(zhì)中選擇一個(gè)氨基酸位置作為突變的靶位，其中根據(jù)(i)中獲得的結(jié)構(gòu)預(yù)計(jì)所述位置的該氨基酸直接或間接參與除草劑結(jié)合但是對(duì)于TS活性不是必需的；(iii)突變編碼所述靶TS蛋白質(zhì)的DNA，產(chǎn)生編碼包括至少一個(gè)氨基酸突變的變體TS蛋白質(zhì)的突變DNA；(iv)在其中產(chǎn)生包含所述氨基酸突變的所述變體TS的條件下在細(xì)胞中表達(dá)所述突變DNA；(v)在沒(méi)有和在有至少一種除草劑存在下對(duì)所述變體TS蛋白質(zhì)測(cè)試催化活性；和(vi)重復(fù)步驟(iii)-(v)，直到鑒定第一種除草劑抗性TS變體蛋白質(zhì)，具有(1)沒(méi)有除草劑存在下，(A)單獨(dú)足以保持其在其中被表達(dá)的細(xì)胞的存活的催化活性；或(B)與也在所述細(xì)胞中表達(dá)的任何除草劑抗性TS變體蛋白質(zhì)結(jié)合足以保持其在其中被表達(dá)的細(xì)胞的存活的催化活性，其中所述任何除草劑抗性TS變體蛋白質(zhì)與所述第一種TS變體蛋白質(zhì)可以是相同或不同的；其中所述細(xì)胞的存活需要TS活性；和(2)與野生型TS相比對(duì)至少一種除草劑更具有抗性的催化活性。
30.權(quán)利要求29的方法，其中步驟(ii)中誘變的所述靶是選自下面的氨基酸αY102，αA129，αI153，αL177，αF212，βI326，βP318和它們的任何組合。
31.一種定量測(cè)定TSα反應(yīng)的體外測(cè)試，包括IGP底物的濃度小于10×TS酶的Km，其中所述測(cè)試在微量滴定板中進(jìn)行。
32.權(quán)利要求31的測(cè)試，其中所述IGP底物的濃度是大約1×到大約2×TS酶的Km。
33.一種定量測(cè)定TSβ反應(yīng)的體外測(cè)試，包括三相液體分離步驟，其中所述分離步驟在微量滴定板中進(jìn)行。
34.一種通過(guò)選擇已知抑制劑的化學(xué)修飾鑒定能抑制色氨酸合酶(TS)的化合物的方法，包括(i)產(chǎn)生作為與TS的復(fù)合物的所述已知抑制劑的三維模型；(ii)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)確定TS和所述已知抑制劑之間的有利的和不利的相互作用；和(iii)應(yīng)用計(jì)算機(jī)模建技術(shù)對(duì)所述已知抑制劑設(shè)計(jì)修飾以優(yōu)化所述抑制作用的結(jié)合親合力。
35.權(quán)利要求34的方法，進(jìn)一步包括利用選自下面的檢測(cè)測(cè)試具有根據(jù)步驟(iii)確定的修飾的化合物適用來(lái)檢測(cè)TS的抑制的體外測(cè)試，適用來(lái)利用表達(dá)內(nèi)源或異源TS酶的生物體檢測(cè)TS抑制劑的體內(nèi)測(cè)試，適用來(lái)測(cè)定除草活性的體內(nèi)測(cè)試，色氨酸逆轉(zhuǎn)測(cè)試以及它們的組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求34鑒定的除草抑制劑。
37.權(quán)利要求16的方法，其中所述模板抑制劑是一種抑制劑的抽象，通過(guò)用符號(hào)置換部分或全部的模板抑制劑確定所述抽象，所述符號(hào)是應(yīng)用的計(jì)算機(jī)程序中理解的，代表元素，芳香基，帶電荷或部分帶電荷基團(tuán)，氫鍵供體和受體，和疏水性部分。
38.一種鑒定抑制色氨酸生物合成的化合物的方法，包括下面的步驟(i)向包括色氨酸合酶(TS)或至少一個(gè)其亞基的體外測(cè)試中加入一種試驗(yàn)化合物，所述體外測(cè)試被適用來(lái)測(cè)定色氨酸生物合成；和(ii)測(cè)定所述化合物是否取消了色氨酸生物合成。
39.一種鑒定表達(dá)一種潛在的除草劑-抗性色氨酸合酶(TS)變體蛋白質(zhì)的生物體的方法，所述方法包括提供一種缺失內(nèi)源TS活性的生物體；提供包括編碼一種除草劑敏感的TS的序列的多核苷酸，所述除草劑敏感的TS具有補(bǔ)償所述內(nèi)源TS活性缺陷的性質(zhì)；在所述多核苷酸中產(chǎn)生突變來(lái)產(chǎn)生包括編碼一個(gè)變體TS蛋白質(zhì)的序列的多核苷酸；和通過(guò)在所述缺失內(nèi)源TS活性的生物體中表達(dá)所述變體TS蛋白質(zhì)來(lái)篩選具有暴露給至少一種TS抑制劑仍然存活的性質(zhì)的生物體。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定用作除草劑的色氨酸合酶(TS)的抑制劑的方法,TS抑制除草劑,設(shè)計(jì)對(duì)本發(fā)明的除草劑和其它已知除草劑有抗性的TS酶變體的方法,TS酶變體本身,編碼這些TS酶變體的多核苷酸,表達(dá)TS酶變體的植物,和控制雜草的方法。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1371428SQ00804650
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月5日
發(fā)明者S·羅達(dá)維, K－H·奧特, C·蘭格溫, L·薩羅金, G·卡克弗達(dá) 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司