專利名稱：海洋芋螺鎮(zhèn)痛多肽的制備方法
芋螺屬腹足綱軟體動物，全世界約有500種，遍布世界各暖海區(qū)，我國有芋螺60-70種，主要分布在西沙群島、海南島及臺灣海域。芋螺喜食海水中的蠕蟲及其他軟體動物和魚類，根據(jù)其習(xí)性可分為食魚、食蟲、食螺三種芋螺。芋螺毒素由毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺分泌，多為基因編碼的多肽，由12～40個氨基酸，2～3對二硫鍵組成。這類活性多肽對不同的離子通道及通道亞型具有高度選擇性作用，按其作用靶位可分為α、ω、μ、δ、κ及μ/o等類型。目前已發(fā)現(xiàn)芋螺毒素在疾病治療及診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，其中ω-芋螺毒素MVIIA為N型鈣通道抑制劑，具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用，活性比嗎啡大千倍，且不致癮，由Neurex公司開發(fā)用于鎮(zhèn)痛及神經(jīng)保護(hù)，已進(jìn)入Ⅱ-Ⅲ期臨床試驗(yàn)，見Scott Bowersox等，Drug of Future，1998，23(2)152-160。
SO3芋螺多肽是通過對我國南海的線紋芋螺(Conus Striatus)毒管基因克隆(盧柏松等，科學(xué)通報，44(16)1737-1739，1999)并經(jīng)肽合成而得到的，其氨基酸的序列為CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)，含三對二硫鍵。應(yīng)用熱板法、光熱輻射法及化學(xué)刺激法測定了其對小鼠的鎮(zhèn)痛活性的半數(shù)有效劑量為0.75μg/kg(ED50)，ED50比半數(shù)致死劑量LD50小18000倍，活性比嗎啡大千倍以上。對大鼠脊髓鞘內(nèi)慢性套管給藥0.5μk/kg痛閾提高50％，給藥1.2μg/kg，痛閾提高100％，且作用時間4小時以上，具有良好的藥物發(fā)展前景。
中國專利申請99106070.9(CN1237584A)公開了14種芋螺毒素肽及其基因克隆方法，其中還具體公開了一種肽的大腸桿菌表達(dá)和另一種肽的化學(xué)合成方法。該申請公開的化學(xué)合成方法直接延用了肽合成領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，不適于以高收率高活性獲得較大規(guī)模的肽。
本發(fā)明的目的就是試圖提供一種收率高適于工業(yè)應(yīng)用的制備活性芋螺多肽的方法，使得這類多肽的臨床應(yīng)用成為可能。
本發(fā)明的發(fā)明人對芋螺多肽的制備工藝進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)了一些特別適合于該類多肽的工藝條件，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供一種制備活性芋螺多肽的方法，其包括線性肽的合成、線性肽的折疊和肽純化步驟，其特征在于所述肽折疊是在0.1-2M氯化鈉或硫酸鈉存在下在氧化還原系統(tǒng)中進(jìn)行的。
本發(fā)明線性肽的合成，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法完成。這些方法例如(但不限于)克隆表達(dá)法、化學(xué)合成法，后者包括液相合成和固相合成。關(guān)于固相合成，又分為儀器自動合成和手工合成。關(guān)于芋螺多肽的克隆表達(dá)方法及儀器固相合成參見本申請人的另一專利申請99106070.9(CN1237584A)。本文也給出了SO3線性肽儀器合成的實(shí)施例。簡言之，線性肽的儀器合成采用商業(yè)購買的Rink樹脂和Fmoc氨基酸在肽合成儀上進(jìn)行。對于SO3的Ile15、Alg16和Lys20三個氨基酸采用雙偶合法連接，其余氨基酸均采用單偶合法連接。所得樹脂-肽綴合物用含酚、二巰基乙酸、苯甲硫醚、水和三氟乙酸的裂解試劑裂解并脫保護(hù)。所得游離肽經(jīng)乙醚沉淀、過濾、再于葡聚糖凝膠上純化得到基本純的線性肽。
由于儀器合成的產(chǎn)量有限，申請人研究了適于工業(yè)生產(chǎn)的手工合成方法。該方法還是基于固相合成的原理，從Rink樹脂及Fmoc氨基酸開始，以DCC-HOBt作為活化劑和以哌啶作為脫保護(hù)劑合成的。其中各種氨基酸采用的保護(hù)基分別為Trt(Cys)、Boc(Lys)、Pmc(Arg)、tBu(Ser、Tyr、Thr)、OtBu(Asp)。采用手工合成不僅一批可合成大量肽(數(shù)克到數(shù)百克或更多)，節(jié)約大量溶劑，且主要消耗溶劑廉價易得。
線性肽的折疊是肽合成中的重要步驟，因?yàn)橹挥谐收_折疊的構(gòu)象形式時肽才具有其生物活性，而無論是經(jīng)原核細(xì)胞的表達(dá)還是經(jīng)化學(xué)合成的肽都是無活性的包涵體、線性肽等形式。線性肽的折疊是肽合成的一個必經(jīng)步驟，其效率直接影響肽合成的收率。申請人現(xiàn)令人驚異地發(fā)現(xiàn)，在0.1-2M的氯化鈉或硫酸鈉存在下在氧化還原系統(tǒng)中進(jìn)行線性肽的折疊，與現(xiàn)有技術(shù)相比，芋螺多肽的折疊效率有顯著提高。
在本發(fā)明的方法中，氯化鈉或硫酸鈉的濃度為0.1-2M，優(yōu)選0.2-1M，最優(yōu)選為約0.5M。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的氧化還原系統(tǒng)為含有半胱氨酸和胱氨酸的緩沖液。在該實(shí)施方案中，半胱氨酸與胱氨酸的摩爾比優(yōu)選為20∶1至2∶1，優(yōu)選15∶1至5∶1，最優(yōu)選約10∶1。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的氧化還原系統(tǒng)為含有二硫蘇糖醇的緩沖液。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的氧化還原系統(tǒng)為含有還原型和氧化型谷胱甘肽的緩沖液。在此實(shí)施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比優(yōu)選為20∶1至2∶1，更優(yōu)選是15∶1至5∶1，最優(yōu)選約10∶1。
在上述實(shí)施方案中，所述緩沖液優(yōu)選為醋酸銨緩沖液或磷酸鹽緩沖液或者Tris·HCl緩沖液。緩沖液的pH值為約7.0-8.2。
折疊效率的測定是通過HPLC測定的，通過測定正確折疊主峰面積與全部折疊峰的總面積之間的比例，可確定折疊效率。
折疊好的芋螺多肽溶液需要進(jìn)一步濃縮、純化及必要時的鹽形式的轉(zhuǎn)換，才有形成適于藥用的產(chǎn)品。當(dāng)然，本發(fā)明包括采用本發(fā)明方法折疊后的各種形式的芋螺多肽產(chǎn)品，無論其是否經(jīng)過濃縮、純化或鹽形式的轉(zhuǎn)換。所述濃縮、純化和鹽的轉(zhuǎn)換可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行。現(xiàn)有技術(shù)中報道的芋螺多肽的濃縮純化是采用凍干-HPLC純化工藝。即多肽折疊溶液中乙酸酸化后凍干，然后用HPLC純化。此工藝不適于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本申請人研究開發(fā)出HPLC濃縮、離子交換濃縮、常壓反相濃縮或超濾濃縮加HPLC純化的方法。優(yōu)選HPLC及離子交換濃縮濃縮法。
最后，為了制備成臨床應(yīng)用的制劑，若產(chǎn)品呈三氟乙酸鹽形式，則還需進(jìn)行鹽形式的轉(zhuǎn)換。典型地，將含三氟乙酸的肽溶于乙酸中，通過葡聚糖凝膠柱，再用乙酸洗脫，然后收集目標(biāo)成分并凍干可得乙酸鹽形式的純化肽。當(dāng)然根據(jù)臨床應(yīng)用的需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員能將這種多肽轉(zhuǎn)變成各種適宜的鹽形式。
本發(fā)明方法獲得的活性多肽適于以肽的常規(guī)形式給藥，優(yōu)選以注射途徑給藥。對于多肽無菌注射液的制備，可將純化肽溶于無菌生理鹽水，經(jīng)過濾除菌，然后用生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度，分裝在不同規(guī)格的安瓿中并密封。
上述本發(fā)明方法特別適用于稱為SO3的芋螺多肽，其氨基酸序列如下CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)。
下面以SO3多肽為例以實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1 SO3線性肽的合成方法A儀器合成采用Fmoc/HoBt/DCC方法，利用Rink樹脂及Fmoc氨基酸，合成步驟參考儀器合成手冊進(jìn)行。為反應(yīng)完全，在哌啶脫保護(hù)及偶合時間上分別適當(dāng)延長，哌啶的第一個脫保護(hù)，3min延長為5min，第二次脫保護(hù)由15min改為30min，偶合時間上增加20min。Ile15、Arg16、Lys20三個氨基酸較難以接上，采用雙偶合方法，其余采用單偶合。
合成量為0.25mol，得肽-樹脂1.50g，總偶合率為95％。1.5g肽樹脂在如下裂解試劑中進(jìn)行脫去保護(hù)基1.5g苯酚，0.5mL 1，2-二巰基乙醇，1mL苯甲基硫醚，1mL蒸餾水，20mL三氟乙酸，攪拌2.5h，過濾，用2mL三氟乙酸洗滌，再用無水二氯乙烷洗滌，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸至8mL，加入大量冰冷乙醚，立即產(chǎn)生沉淀，過濾，用乙醚洗滌四次，然后用20％的乙酸溶解粗肽，冷凍干燥，得粗肽610mg。
上述610mg粗肽溶于10％的乙酸中，將冷凍干燥后的粗肽溶于10％的乙酸中，過Sephadex G-25(26×400mm)，10％乙酸洗脫，254nm記錄，收集主峰并凍干，得較純肽500mg。方法B手工合成選用Rink樹脂及Fmoc保護(hù)氨基酸(保護(hù)基分別是(Trt(Cys)，Boc(Lys)，Pmc(Arg)，t-Bu(Ser，Tyr，Thr)，OtBu(Asp))，DCC-HOBt為活化劑，哌啶脫保護(hù)。接肽方法NMP1×1min30％哌啶/DMF 1×530％哌啶/DMF 1×40NMP2×1CH2Cl21×1MeOH(i-PrOH) 2×1CH2Cl23×1NMP1×1Fmoc-AA/HBTU，DIEA 1～2hNMP2×1minMeOH 2×1CH2Cl22×1NMP1×1檢測(重縮合、封閉、下一循環(huán))合成量為1.88mmol，得肽-樹脂10g，偶合率為79.4％。
肽樹脂裂解6g肽-樹脂置于裂解試劑(3g苯酚，1mL 1，2-二巰基乙醇，2mL苯甲基硫醚，2mL蒸餾水，40mL三氟乙酸)，其余步驟同方法A。得粗肽4.2g。
3.2g粗肽溶于10％的乙酸中，將冷凍干燥后的粗肽溶于10％的乙酸中，過Sephadex G-25(36×700mm)，10％乙酸洗脫，254nm記錄，收集主峰并凍干，得較純肽2.8g。實(shí)施例2 氧化折疊在4～8℃將線性肽溶于含氧化還原劑及絡(luò)合劑(EDTA)的緩沖液中(pH7.9左右)，用HPLC檢測折疊過程。折疊完成后，用乙酸酸化緩沖液pH為一定值，然后用各種純化方法進(jìn)行純化。方法A在半胱氨酸存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸銨或0.05～0.1mol/L的磷酸鹽或Tris·HCl緩沖液(pH均為7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的半胱氨酸及0.08～0.72的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、2～0.1mol/L氯化鈉或2～0.1mol/L硫酸鈉及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下攪拌1-5天，折疊效率為10-50％。
A1．0.5mol/L醋酸銨(pH為7.9)緩沖液中加入1.0mmol/L半胱氨酸及0.1mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或2mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌2天，折疊效率為35％。
A2．0.05mol/L的磷酸鹽(pH為7.9)緩沖液中加入1.0mmol/L的半胱氨酸及0.2mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.2mol/L氯化鈉或0.5mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌2天，折疊效率為30％。
A3．0.1mmol/L Tris·HCl緩沖液(pH7.9)中加入1.0mmol/L的半胱氨酸及0.1mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、1mol/L氯化鈉或2mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌3天，折疊效率為30％。方法B在還原性谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸銨或0.05～0.1mol/L的磷酸鹽或Tris·HCl緩沖液(pH均為7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的還原性谷胱甘肽及0.08～0.72的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、2～0.1mol/L氯化鈉或2～0.1mol/L硫酸鈉及0.2～2mg/ml SO3、4-8℃下攪拌1-5天，折疊效率為10-60％。
B1．0.5mol/L醋酸銨(pH為7.9)緩沖液中加入1.0mmol/L的還原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或2mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌3天，折疊效率為40％。
B2．0.05mol/L磷酸鹽(pH為7.9)緩沖液中加入1.0mmol/L的還原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或1mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌3天，折疊效率為30％。
B3．0.1mol/L Tris·HCl(pH為7.9)緩沖液中加入1.0mmol/L的還原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或2mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌3天，折疊效率為30％方法C在二硫蘇糖醇存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸銨或0.05～0.1mol/L的磷酸鹽或Tris·HCl緩沖液(pH均為7.0-8.2)中加入0.8～2.2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、2～0.1mol/L氯化鈉或2～0.1mol/L硫酸鈉及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下攪拌3-5天，折疊效率為10-30％。
C1．0.5mol/L醋酸銨緩沖液(pH為7.9)中加入1.2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或1mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌5天，折疊效率為20％。
C2．0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH為7.9)中加入1.2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、0.5mol/L氯化鈉或1mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌5天，折疊效率為25％。
C3．0.1mol/L Tris·HCl緩沖液(pH為7.9)中加入1.2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉、1.0mol/L氯化鈉或1mol/L硫酸鈉及0.2mg/ml SO3，4℃下攪拌5天，折疊效率為25％。對比實(shí)施例不加氯化鈉或硫酸鈉情況下折疊0.1～0.5mol/L醋酸銨或0.05～0.1mol/L的磷酸鹽或Tris·HCl緩沖液(pH均為7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的半胱氨酸及0.08～0.72的胱氨酸或0.8～7.2mmol/L的還原性谷胱甘肽及0.08～0.72的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸鈉及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下攪拌1-5天，折疊效率為5-20％。
此外增加磷酸鹽或Tris·HCl濃度將導(dǎo)致折疊溶液產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。
增加醋酸銨濃度也可達(dá)到較高產(chǎn)率，但中和緩沖液需消耗大量醋酸，此外大量的醋酸給后面的純化帶來麻煩，并需稀釋。
在實(shí)施例2方法A、B和C的相同條件但不加氯化鈉或硫酸銨的情況下折疊，折疊效率見下表
實(shí)施例3 SO3的純化方法A凍干-HPLC純化工藝SO3折疊完成后，加乙酸酸化，凍干，然后HPLC純化(C18，21.1×250mm，洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-30％B，流速為8ml/min)。收率15％。方法BHPLC濃縮-HPLC純化工藝SO3折疊完成后，加乙酸(2000ml緩沖液，加乙酸100ml)調(diào)pH＜4.5，過濾，上反相柱吸附(C18柱，30×250mm)，柱流速3-5ml/min，吸附結(jié)束后用水沖洗，然后進(jìn)行梯度洗脫(洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-40％B，流速為8ml/min)，收集主峰及其他峰，凍干，多聚體可用純乙腈洗脫，從收集液減壓蒸去乙腈，凍干。
將凍干的主峰，再次進(jìn)行反相HPLC分離(C18柱，21.1×250mm，洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-30％B，流速為8ml/min)。經(jīng)高壓反相濃縮及初步純化后，該步純化所得主峰，純度在50-90％之間，再經(jīng)一步高壓反相純化，產(chǎn)品純度可達(dá)99％以上，收率達(dá)15～20％。方法C離子交換濃縮-HPLC純化工藝SO3折疊完成后，加乙酸(2000ml緩沖液，加乙酸40ml)，調(diào)pH5.0-5.2，過濾，稀釋至NH4Ac濃度為0.22M，上BiO-Rex70離子柱(H+)，流速5ml/min，吸附結(jié)束后，用水沖洗，然后用50％乙酸洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸，凍干。凍干的主峰用高壓反相制備柱(C18柱，21.1×250mm，洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-30％B，流速為8ml/min)進(jìn)行分離。SO3經(jīng)離子交換層析后，純化所得主峰，純度為50％-70％，主峰收率為20-30％，進(jìn)一步反相純化可得99％的產(chǎn)品。方法D常壓反相濃縮-HPLC純化工藝SO3折疊完成后，加乙酸(2000ml緩沖液，加乙酸100ml)調(diào)pH＜4.5，過濾，上Source RPC30或Poros反相柱吸附(1.5×50)，柱流速3-5ml/min，吸附結(jié)束后用水沖洗，然后進(jìn)行梯度洗脫，收集主峰及其他峰，凍干，多聚體可用純乙腈洗脫，從收集液減壓蒸去乙腈，凍干。
將凍干的主峰進(jìn)行反相HPLC分離(C18柱21.1×250mm，洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-30％B，流速為8ml/min)。制備的SO3產(chǎn)率為15-25％(相對線性肽)。方法E超濾濃縮-HPLC純化工藝SO3折疊完成后，調(diào)pH為3.5，稀釋一倍，用YM1(截留分子量為1000Da)超濾膜過濾，壓力0.35Mpa，然后用水稀釋，再超濾，收集母液，凍干。干粉用HPLC純化(C18柱，21.1×250mm，洗脫液A為0.1％的三氟乙酸，洗脫液B為100％的乙腈，梯度為1-40min，10-30％B，流速為8ml/min)。制備的SO3產(chǎn)率為15-20％(相對線性肽)。實(shí)施例4 SO3純品的緩沖液交換及制劑將500mg含有三氟乙酸的SO3肽溶解于20％的乙酸中，過Sephadex G-25柱(26×400mm)，用20％乙酸洗脫，于254nm記錄，收集主峰并凍干，得含醋酸的純肽420mg。然后在無菌間用少量高壓滅菌生理鹽水溶解，用滅菌的0.2μm聚醚砜濾膜過濾除菌，以生理鹽水稀釋，分裝成不同規(guī)格制劑。
權(quán)利要求
1．一種制備活性芋螺肽的方法，包括線性肽的合成、線性肽折疊和肽純化，其特征在于所述線性肽折疊是在0.1-2M氯化鈉或硫酸鈉存在下在氧化還原系統(tǒng)中進(jìn)行的。
2．權(quán)利要求1的方法，其中氯化鈉或硫酸鈉的濃度為0.2-1M。
3．權(quán)利要求2的方法，其中氯化鈉或硫酸鈉的濃度為約0.5M。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化還原系統(tǒng)為含有半胱氨酸和胱氨酸的緩沖液。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化還原系統(tǒng)為含有還原型及氧化型谷胱甘肽的緩沖液。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化還原系統(tǒng)為含有二硫蘇糖醇的緩沖液。
7．權(quán)利要求1的方法，其中所述芋螺多肽為具有如下序列的稱為SO3的多肽CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)。
8．權(quán)利要求1的方法，其中線性肽的合成是利用肽合成儀的自動合成或手工合成。
9．權(quán)利要求8的方法，其中線性肽的合成是采用固相手工合成法。
10．權(quán)利要求1的方法，其中肽的純化包括肽折疊溶液的濃縮和HPLC純化和必要時的鹽的轉(zhuǎn)換。
11．權(quán)利要求10的方法，其中濃縮步驟采用凍干法、HPLC濃縮法、離子交換濃縮法、常壓反相濃縮法或超濾濃縮法。
12．權(quán)利要求11的方法，其中濃縮步驟采用HPLC濃縮法。
13．權(quán)利要求10的方法，其中鹽轉(zhuǎn)換為肽的三氟乙酸鹽轉(zhuǎn)換為乙酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備活性芋螺多肽的方法,包括線性肽的合成、線性肽折疊和肽純化,其特征在于所述線性肽折疊是在0.1-2M氯化鈉或硫酸鈉存在下在氧化還原系統(tǒng)中進(jìn)行的。據(jù)本發(fā)明方法可以獲得高效率高活性的芋螺多肽,適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07K14/435GK1296012SQ0012852
公開日2001年5月23日 申請日期2000年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月24日
發(fā)明者戴秋云, 黃培堂, 周艷榮, 劉鳳云 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所