專利名稱：蜜蜂幼蟲在核酸制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蜜蜂幼蟲的用途，尤其是涉及蜜蜂幼蟲在核酸制備中的應(yīng)用。
蜜蜂幼蟲及蛹作為食品及藥品的歷史悠久。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)蜂王幼蟲的藥用價(jià)值，早就有過不少研究。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》載“蜂王幼蟲能去頭瘋，除蟲毒，補(bǔ)虛贏傷中，久服令人光澤，女子顏色不老?！蔽迨甏詠?，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)蜜蜂幼蟲和蛹(我國學(xué)者主要是對(duì)蜂王幼蟲和雄蜂蛹)的營養(yǎng)成份進(jìn)行了大量分析測定工作，一致認(rèn)為蜜蜂幼蟲和蛹是一類低脂肪、高蛋白、營養(yǎng)成份較為齊全的天然食品。
美國學(xué)者Hank將蜜蜂幼蟲和蛹與家庭中常用的幾種食物——牛肉、牛奶、雞蛋和魚肝油的營養(yǎng)成份進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示蜜蜂幼蟲、蛹的蛋白質(zhì)含量略低于牛肉，高于牛奶，與雞蛋的含量相近；脂肪的含量與牛肉、牛奶相接近而大大低于雞蛋中的含量；維生素A的含量低于魚肝油，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它三種食品中的含量。用含蜂王幼蟲的飼料喂養(yǎng)剛斷奶的Wistar大白鼠幼鼠，劑量為1.2g/kg和1.8g/kg，食用劑量為1.2g/kg組的幼鼠在第14天，食用劑量為1.8g/kg組的幼鼠在第14天、21天和28天時(shí)，其體重顯著地高于對(duì)照組，其差異的顯著性分別為p＜0.01,p＜0.05,p＜0.01和p＜0.05。且幼鼠的生長速度與食服蜂王幼蟲的量呈正相關(guān)性。近兩年，我國學(xué)者對(duì)工蜂幼蟲、蛹的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，蜂幼蟲、蛹的主要營養(yǎng)成份與蜂王幼蟲、雄蜂幼蟲和蛹比較接近。其含水量81.69-13.48％，干物質(zhì)含量18.31-26.52％，干物質(zhì)中含蛋白蛋42.36-48.47％、脂肪15.75-20.63％，灰分9.99-18.74％。同時(shí)，富含多種氨基酸，干物質(zhì)中17種氨基酸的含量達(dá)26.35-44.72％，尤以谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和亮氨酸的含量最為豐富。此外，通過對(duì)9日齡幼蟲和19日齡蛹的維生素和10種重要礦物質(zhì)元素含量的測定發(fā)現(xiàn)，工蜂幼蟲、蛹含有非常豐富的維生素和礦物質(zhì)，尤其是Vc和Vd的含量特別多。從營養(yǎng)成份的組成來看，工蜂幼蟲和腎具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。
目前，對(duì)蜜蜂幼蟲和蛹的開發(fā)利用工作還處于起步階段，其主要應(yīng)用情況如下1．在蜜蜂幼蟲、蛹的生產(chǎn)季節(jié)，直接食用。即用油煎、鹽炒蜜蜂幼蟲和蛹，也有同其它食品混合烹制或做湯食用。
2．制做成蜜蜂幼蟲和蛹的罐頭食品。將新鮮的材料或用密(或糖)漬，或用鹽漬保存后，加工成甜味或咸味的各種罐頭食品，能保存較長時(shí)間。
3．制做成保健營養(yǎng)酒。在我國民間有使用蜜蜂幼蟲、蛹配制藥酒的傳統(tǒng)配方和制作工藝，這種營養(yǎng)酒具有祛風(fēng)濕、抗疲勞的作用。
4．與其它食品原料混合配制成各種營養(yǎng)食品。國外許多企業(yè)都在餅干、點(diǎn)心等食品的配方中加入了蜜蜂幼蟲、蛹；近10年來，我國安徽、廣東、湖北、湖南及北京的一些企業(yè)和研究單位開發(fā)了多種以蜜蜂幼蟲和雄蜂蛹為原料的營養(yǎng)液、營養(yǎng)膠囊和沖劑。
5．加工成冰凍干粉或烤干粉后再與其它原料配伍制成營養(yǎng)食品或藥品。七十年代初杭州牛奶公司制藥廠開發(fā)的“蜂皇胎片”(原名蜂皇幼漿片)，可用作治療肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)衰弱、營養(yǎng)不良等疾患的輔助治療藥物。
6．配制動(dòng)物飼料。我國很多地方試用蜜蜂幼蟲、蛹的干粉作飼料添加劑喂養(yǎng)雞、鴨、魚、奶牛等禽畜和某些珍稀動(dòng)物，取得了可喜的成效。
可見，當(dāng)前對(duì)蜜蜂幼蟲和蛹僅限于其中蛋白質(zhì)含量、活性酶、微量元素和維生素等營養(yǎng)成份的研究，開發(fā)和利用的產(chǎn)品形式仍停止在原料的粗加工階段。
近年來，隨著營養(yǎng)學(xué)研究向分子水平推出，核酸被認(rèn)為是繼蛋白質(zhì)、脂肪、糖類之后人類認(rèn)識(shí)和利用的一種新的有機(jī)營養(yǎng)素。由于生命的一些最根本的現(xiàn)象如生長、遺傳、變異等都與核酸有密切關(guān)系。因此，核酸被認(rèn)為是創(chuàng)造生命、保護(hù)生命、延長生命的根本物質(zhì)，對(duì)人體健康長壽有限重要作用，現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)把核酸稱作“生命之源”，核酸營養(yǎng)則被認(rèn)為是當(dāng)代營養(yǎng)保健的最高層次。補(bǔ)充核酸，調(diào)節(jié)人體營養(yǎng)平衡，具有保健益智、延緩衰老、增強(qiáng)人體免疫的作用，特別是對(duì)心腦血管疾病、糖尿病等疾病的預(yù)防、治療有顯著作用。
目前，從組織或細(xì)胞中提取核酸都采用生物學(xué)研究的經(jīng)典方法，但這些方法存在周期長，提取成本高等缺點(diǎn)，因而僅限于實(shí)驗(yàn)室小量、高純度的提取，不適用于大量、高純度核酸制劑的制備。為獲取充足的核酸營養(yǎng)，人們相繼發(fā)明了作為營養(yǎng)補(bǔ)給的核酸的制備方法，如在1996年3月6日發(fā)明專利公報(bào)上公開的一種從天然植物細(xì)胞中提取核酸的生產(chǎn)工藝(申請(qǐng)?zhí)?4115437.8)，它以大豆粕為原料，但以植物細(xì)胞為原料制取的核酸含量較低，純化、提純的成本較高。1994年10月19日發(fā)明專利公報(bào)上公開了一種人體胎盤為原料，在-10℃—-70℃迅速冷凍，并在低溫下破碎胎盤組織，采用透析方法提取高濃度核酸，但隨著計(jì)劃生育工作的展開，其原料來源日益減少，而且制備條件比較苛刻，周期長、成本高，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，有人發(fā)明了“從雞血中提取核酸及核蛋白的方法”(專利號(hào)97115706)，雖然雞血原料來源較廣泛，但影響雞血質(zhì)量的因素眾多，核酸質(zhì)量難以控制，而且制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期較長。對(duì)核酸的深入研究表明，人體對(duì)核酸的吸收和利用處于寡聚核苷酸、核苷酸水平。而現(xiàn)有技術(shù)都未提供寡聚核苷酸、核苷酸的制備方法。
本發(fā)明的目的是提供蜂幼蟲、蛹的新用途，特別是在制備核酸、寡聚核苷酸和核苷酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的是提供從蜂幼蟲、蛹中提取核酸、寡聚核苷酸、核苷酸的制備工藝和方法。
本發(fā)明對(duì)蜂幼蟲、蛹的核酸含量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)蜂幼蟲、蛹的核酸平均含量為4941mg/100g，遠(yuǎn)大于魷魚280mg/100g、牛肉100mg/100g，雞肝420mg/100g和紅豆306mg/100g，是一般動(dòng)植物組織細(xì)胞核酸含量的5-15倍。隨后，本發(fā)明采用核酸一般粗提工藝進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，檢測提取物中核酸含量為72690-86936mg/100g。這提示蜂幼蟲、蛹有可能成為核酸生產(chǎn)的重要物質(zhì)來源，使蜂幼蟲、蛹用于提取核酸、寡聚核苷酸和核苷酸成為可能，并具有更大的優(yōu)勢。
本發(fā)明所述的蜜蜂幼蟲、蛹包括蜂王幼蟲、雄蜂幼蟲及蛹、工蜂幼蟲及蛹。其中，蜂王幼蟲、雄蜂幼蟲和工蜂幼蟲在68-72小時(shí)采集，雄蜂蛹在22-22天采集，工蜂蛹在16-18天采集。
從蜜蜂幼蟲、蛹中提取核酸的方法，包括將蜜蜂幼蟲(干粉或新鮮蟲體)或蛹通過勻漿、細(xì)胞裂解、有機(jī)溶劑抽提、核酸沉淀與離心分離、核酸干品制備。
1)勻漿、細(xì)胞裂解取新鮮蜜蜂幼蟲、蛹或蜜蜂幼蟲干粉，在-4℃—0℃條件下，加入蜜蜂幼蟲體積的5-10倍的提取液A(Tris-HCL PH6.4∶EDTA PH8.0=5∶1(mol/l))，勻漿，過濾；或取冷凍蜜蜂幼蟲、蛹，在真空、室溫條件下解凍，解凍后立即加入提取液A勻漿，過濾。
2)核酸溶液的抽提可采用下述方法之一。
a去垢劑法用陰離子去垢劑如十二烷基磺酸鈉、磺酸十二烷基鋰、磺酸十二烷肌氨酸鈉、脫氧膽酸鈉等，最好是用20％十二烷基磺酸鈉，加入量為濾液體積的1/100，并用10％-20％的氫氧化鈉調(diào)PH至9.0，處理約40分鐘，在0℃-4℃,6000-8000rpm離心20分鐘，過濾，取上清得到核酸溶液；b苯酚法向?yàn)V液中加入等體積的水飽和新蒸餾苯酚，混勻，震蕩，6000-8000rpm冷凍離心，取上清，得到核酸溶液；3)核酸沉淀、離心分離及核酸純化干品的制備向上清液中加入2.5倍體積的2％乙酸鈉的無水乙醇或乙醚即得核酸沉淀，將沉淀干燥即得核酸干品。
從蜜蜂幼蟲、蛹中提取核酸的另一種方法，包括將蜜蜂幼蟲(干粉或新鮮蟲體)或蛹通過勻漿、細(xì)胞裂解、沉淀核蛋白與蛋白質(zhì)、有機(jī)溶劑抽提、離心分離、核酸干品制備。
1)勻漿、細(xì)胞裂解向原料中加入其體積5-10倍的蒸餾水，放入勻漿器中直接勻漿，過濾；2)沉淀核蛋白和蛋白質(zhì)直接向?yàn)V液中加入預(yù)冷無水乙醇，混勻，以3000rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)操作一次。
3)核酸溶液的抽提。
向沉淀物中加入氯仿-甲醇(2∶1v/v)，混勻，以3000rpm離心10分鐘，取上清，重復(fù)操作一次，即得核酸溶液。
4)沉淀核酸、離心分離、制備核酸干品。方法同上。
上述方法制得的核酸粗提物，可進(jìn)一步提純。提純后的核酸可根據(jù)需要作為化妝品等產(chǎn)品的原料，或再進(jìn)一步降解成寡聚核苷酸或核苷酸。
本發(fā)明的特點(diǎn)1．取材新穎開辟了蜂幼蟲、蛹的新的利用途徑，當(dāng)前，對(duì)蜂幼蟲、蛹的研究與開發(fā)僅限于蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分的研究。而本發(fā)明的研究表明，在蜜蜂幼蟲、蛹中，核酸含量明顯高于現(xiàn)有所有動(dòng)植物組織細(xì)胞中的核酸含量。這意味著從蜜蜂幼蟲中提取核酸將有資源優(yōu)勢。國內(nèi)外利用蜜蜂幼蟲提取核酸尚屬首次。
2、原料來源豐富，不受限制。我國是世界上最大的養(yǎng)蜂大國，養(yǎng)蜂資源豐富，現(xiàn)有蜂群約600群，按每年群產(chǎn)幼蟲、蛹2千克計(jì)算，全國的年生產(chǎn)能力可達(dá)1.2萬噸。
3、原料質(zhì)量利于控制、穩(wěn)定。將蜜蜂幼蟲加工成幼蟲干粉，工藝成熟、簡單、成本低。而且加工制得的干粉在室溫下，保質(zhì)期為半年。
4、粗提物中核酸含量高達(dá)86.93％(質(zhì)量比)，可直接滿足核酸營養(yǎng)制劑的需要。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化制成含量大于98％的高純度的核酸，耗時(shí)短，成本低。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案用進(jìn)一步的說明
定磷法測定核酸含量1．樣品消化取5mg核酸干品，置于消化瓶中，加入1ml濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑變成蛋黃色，取下稍冷，加10滴30％過氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無色，稍冷卻，加1ml水，于100℃加熱10分鐘。冷至室溫，用蒸餾水定容到50ml.。
2．制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液(5ug/ml)0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml，用水補(bǔ)足到3ml，含磷量分別為0,2.5,5,7.5,10,12.5,15ug，加定磷試劑3ml后搖勻，45℃置放20分鐘，于660nm處測取OD值，并以含磷量為橫坐標(biāo)，OD660為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．核酸中總磷量的測定取稀釋后的消化液1ml，加水2ml，定磷試劑3ml，搖勻，45℃放置20分鐘，于660nm處讀取OD值?？瞻讓?duì)照同樣操作。
4．樣品中無機(jī)磷含量的測定取未消化的樣品液1ml用水定容到50ml.從中取1ml，加2ml水，3ml定磷試劑，搖勻后保溫，然后讀取OD660。
5．經(jīng)換算，樣品中核酸含量為86.93％。
實(shí)施例2取蜜蜂幼蟲干粉，在-4℃—0℃條件下，加入蜜蜂幼蟲體積的8倍的提取液A，勻漿，過濾。用去垢劑法提取得到核酸溶液，向核酸溶液中加入2.5倍體積的2％乙酸鈉的無水乙醇或乙醚即得核酸沉淀，將沉淀干燥即得核酸干品。
權(quán)利要求
1.一種蜜蜂幼蟲、蛹的新用途，即蜜蜂幼蟲、蛹用于提取核酸。
2.一種從蜜蜂幼蟲、蛹中提取核酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)勻漿、細(xì)胞裂解取新鮮蜜蜂幼蟲、蛹或蜜蜂幼蟲干粉，在-4℃—0℃條件下，加入蜜蜂幼蟲體積的5-10倍的提取液A，勻漿，過濾；或取冷凍蜜蜂幼蟲、蛹，在真空、室溫條件下解凍，解凍后立即加入提取液A勻漿，過濾；2)用去垢劑法或苯酚法提取，得到核酸溶液；3)向核酸溶液中加入2.5倍體積的2％乙酸鈉的無水乙醇即得核酸沉淀，將沉淀干燥即得核酸干品。
3.一種從蜜蜂幼蟲、蛹中提取核酸的方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)勻漿、細(xì)胞裂解，2)直接向?yàn)V液中加入預(yù)冷無水乙醇，混勻，以3000rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)操作一次，3)向沉淀物中加入氯仿-甲醇，混勻，以3000rpm離心10分鐘，取上清，重復(fù)操作一次，得到核酸溶液。4)沉淀核酸、離心分離、制備核酸干品。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的蜜蜂幼蟲、蛹包括蜂王幼蟲、雄峰幼蟲及蛹、工蜂幼蟲及蛹。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于蜂王幼蟲、雄峰幼蟲、工蜂幼蟲取68-72小時(shí)的幼蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于雄峰蛹取20-22天的蛹。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于工蜂蛹取16-18天的蛹。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜜蜂幼蟲、蛹的新用途,即用于提取核酸,以及從蜜蜂幼蟲、蛹中提取核酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案開辟了蜜蜂幼蟲、蛹的新的利用途徑,其原料來源豐富,不受限制,原料質(zhì)量利于控制、穩(wěn)定,方法簡單、成本低。其粗提物中核酸含量高達(dá)86.93%(質(zhì)量比),可直接滿足核酸營養(yǎng)制劑的需要。可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化制成含量大于98%的高純度的核酸。因此,本發(fā)明具有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07H1/08GK1306004SQ0012814
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期2000年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月25日
發(fā)明者陳明勝, 金建忠, 田育紅, 潘愛平 申請(qǐng)人:武漢市康源蜂業(yè)有限公司