專利名稱：腦蛋白水解活性物質、其制備方法、活性和序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腦蛋白水解活性物質，其制備方法以及其活性和序列，屬于藥物領域。
長期以來腦疾病如早老性癡呆、腦卒中、腦缺血引起的并發(fā)癥，一直困擾著人類。各國大批醫(yī)學工作者積極投身于這項事業(yè)，做了大量的研究和工作，也取得了許多喜人的成就。許多藥物相繼問世。奧地利EBEWE藥廠開發(fā)的腦活素便是其中之一。本定經(jīng)過數(shù)年的開發(fā)和研究，研制出了腦活素類似產品一腦蛋白水解液。此項成果已經(jīng)申請國家專利，專利號94104516，并投入了生產，產生了相當大的社會效益。
腦蛋白水解液是動物腦蛋白經(jīng)人工控制的酶降解而產生的器官特異性氨基酸、肽復合物，由于其85％為氨基酸，且其氨基酸彼此間比例與正常腦中者相似，故仍保持其器官特異的“氨基酸”性。這些氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、色氨酸、纈氨酸。其中15％由分子量小于1000d，不具有抗原性的小分子肽組成。
關于此藥已有許多文章報道，其中最重要的作用是它對中毒、缺氧、迷走神經(jīng)刺激有保護作用。當?shù)脱腔杳詴r，它有喚醒作用，對腦細胞的成熟有促進作用。對于腦蛋白水解液作用機理，目前已有大量的研究。根皮甙中毒實驗表明靜脈注射腦活素對動物中毒有保護作用。中毒后腦活素治療組的臨床恢復及腦電圖正?；^快。窒息和缺氧實驗中，腦活素能使之恢復較好。腦活素處理的年幼動物，腦毛細血管網(wǎng)生長較好。腦活素對核糖體有特異作用，刺激腦內蛋白質的合成，刺激間腦一垂體系統(tǒng)釋放生長激素、甲狀腺激素而加速動物的生長和發(fā)育。奧地利進行了有關臨床前的研究，用極譜技術測量腦勻漿的耗氧量。當加腦活素時，其氧代謝明顯受抑制。腦活素能夠降低腦對氧的需要量，從而導致腦對缺氧的耐受性增加。另一方面它也增強需氧代謝，使細胞能完成能量依賴性工作，如蛋白質、神經(jīng)遞質的合成，鐵消耗功能。實驗也顯示用腦活素處理動物后，動物學習成績較好，且能保持好幾天。本室所作的研究也證明了這點。
腦蛋白水解液中，大部分的氨基酸對腦損傷的恢復起著不可忽視的營養(yǎng)作用。另外，其中的肽類具有明顯的生理活性。它們作用于呼吸鏈的某些環(huán)節(jié)，對腦細胞的氧代謝起著重要的調節(jié)作用；同時，它們也影響腦部細胞的蛋白質、多肽的合成，改善腦部的生理功能。許多腦肽的分子量不大，而且某些片段具有原來肽的全部或大部分生物活性；或某些新的強烈的中樞作用。對腦蛋白水解液中這些片段進行分離，研究其生物活性，具有一定理論和實用價值。
在國內外關于腦蛋白水解液的研究，大都集中在其生理活性和藥理作用方面，未見分離純化方面的報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種腦蛋白水解活性物質，該活性組份具有非常高的純度。
本發(fā)明的次一個目的在于，采用現(xiàn)代儀器，對腦蛋白水解液初級產品中的活性成分進行分離，提供一種通過分離和純化的方法制備組成單一、純度極高的腦蛋白活性物質的方法。
本發(fā)明的另一個目的在于通過一系列測定，確定腦蛋白活性物質的純度和序列。
本發(fā)明的再一個目的是采用合成的方法，合成上述腦蛋白活性物質，并進一步測定其純度、序列和理化常數(shù)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下一．腦蛋白水解液的分離和純化在蛋白質與多肽的分離化工作中，常采用的方法有多種，如液相柱層析、電泳法、沉淀法、離心法、薄層法等。其中液相柱層析法由于其分離條件溫和、分辨率高、操作簡單，而得到了廣泛的應用。液相柱層析色譜法一般分為兩類經(jīng)典液相色譜法和高效液相色譜法。在蛋白質和多肽的初級分離中，經(jīng)典的離子交換法和凝膠過濾法常作為首選的方法。高效液相色譜法由于其極高的理論塔板數(shù)而應用于樣品的精細分離，常作為后期純化的有力工具。本發(fā)明主要采用液相層析法對腦蛋白水解液的活性組分進行分離純化。分離采用的方法及過程見圖1。
首先，測定麗寶公司提供的5組初級腦蛋白產品的活性，從中優(yōu)選出活性最強的，進行下一步分離。
蛋白活性測定原理在細胞呼吸時，消耗O2，同時放出CO2。測量呼吸的方法有多種，如化學方法、容積方法、檢壓法、Carsesian浮沉子法及氧電極法。本發(fā)明采用檢壓法測量樣品的活性。瓦氏呼吸儀可以測定組織或微生物進行代謝時所發(fā)生的氣體變化。例如O2的吸收和CO2的排出。
瓦氏呼吸儀測壓法是在定溫和定容的條件下，用壓力的變化來表示組織或細胞代謝時所發(fā)生的氣體變化。由于在呼吸過程中吸收CO2和產生氧氣是同時進行的，所以壓力計所觀察到的壓力變化是氧的吸收量和CO2產生量的總結果。若在反應瓶中加入堿(如KOH)，則呼吸時所產生的CO2被堿所吸收，由此可由壓力的變化測定氧的吸收。本發(fā)明實驗中以耗氧的多少決定供試品生物活性的高低。由測活結果可以看出，第三組樣品的活性最強，因此以下實例中主要進行樣品Ⅲ的分離、純化及進一步分析。
一〕經(jīng)典液相色譜法盡管高效液相色譜法得到了迅速、廣泛的應用，但主要應用于后期純化。因為經(jīng)典液相色譜法具有上樣量大、流動相價格相當較低、對儀器、技術的要求相對不高等諸多優(yōu)點因此本發(fā)明首先采用經(jīng)典液相層析法，對樣品進行粗分離；經(jīng)典液相層析法中還包括離子交換法和分子篩凝膠法。
1、離子交換法分離離子交換色譜是目前在蛋白質提純中得到最廣泛應用的方法之一。它利用蛋白質的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強弱不同，采用不同的洗脫強度的流動相，分別將它們洗脫下來。離子交換介質如離子交換纖維素樹酯有開放性的支持骨架，大分子能自由的進入和迅速擴散，因而對樣品的吸附容量較大。離子交換纖維素上的交換基團排列松散，對蛋白、多肽的吸附不太牢固，用溫和的條件使可將其洗脫下來，不至引起分子的變性。離子交換劑分離樣品時，主要依靠增加緩沖溶液的離子強度或改變酸堿度來進行洗脫。由于不同蛋白質的電荷密度分布不同，電荷量不等，等電點的差異以及分子大小的區(qū)別，因而與離于交換劑的結合強度不同，利用一定的置換條件，可將它們逐一分開。本發(fā)明利用二乙胺基纖維素，即DEAE纖維素32對樣品進行初步分離。由初步分離的樣品的活性測定結果可以看出，DEAE離子交換法分離出的1#峰，即第一組樣品DEAE1具有原樣品的大部分活性，應該進一步分離該樣品。
2．凝膠過濾法分離分子篩指的是一些親水性多孔介質。當含有不同大小的分子的混合物流經(jīng)這一介質時，直徑大于孔徑的分子將不能進入麻膠內部，便直接從凝膠粒間隙流出，這稱為全排出。較小分子物質能進入介質內部孔隙，繞道而行，在柱內的保留時間就比較長。這樣，較大分子被先洗脫下來，而較小分子后被洗脫下來，從而達到分離的目的。這種作用被稱為“分子篩”效應。具有這種效應的物質很多，其中效果較好的有葡聚糖凝膠，商品名稱Sephadex、聚丙烯酰胺凝膠，又稱生物膠-P及瓊脂糖凝膠Agrose等。
葡聚糖凝膠是最常用的一種凝膠，由細菌葡聚糖，又稱右旋糖酐，在糖的長鏈間用交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷〔CH2-CH-CH2Cl表氯醇〕交聯(lián)而成；其基本結構如圖6所示；凝膠層析的簡單原理見圖7；圖3a中首先將含有大小分子的樣品液上柱；樣品溶液流經(jīng)層析柱，小分子通過擴散作用進入凝膠顆拉的微孔中，而大分子則被排阻于顆粒之外，因此，大小分子向下移動的速度發(fā)生差異，而將大小分子分離開來；向層析柱頂加入洗脫液，大小分子分開的距離增大，大分子物質行程較短，已流出層析柱，小分子物質尚在行進之中，由此達到分離的目的。本發(fā)明中，采用凝膠過濾法分離離子交換法分離得到的樣品DEAE1，由測定及計算結果可以看出，2號峰的樣品DEX2具有原樣品大部分的活性，應該進一步分離該樣品。
二)高壓液相色譜法分離經(jīng)過經(jīng)典液相色譜法分離的樣品，成分比初提液相對簡單，組分性質已經(jīng)很接近，應采用HPLC進一步分離。與經(jīng)典液相色譜法相比，高效液相色譜法具有分離效率高現(xiàn)已能達到每米10萬理論塔板數(shù)、高速、高壓、分析時間短通常為幾分鐘至幾十分鐘間、檢測靈敏度高如紫外檢測器，靈敏度為10-9g/ml的特點。
1．高效離子交換液相色譜法分離(HPIEC)原理高效離子交換液相色譜的分離原理與經(jīng)典離子交換色譜法原理基本相同。不同的是HPIEC填料能夠耐高壓，具有更高的分辨率。以親水性高聚物凝膠為基質的IEC填料如TSKGELDEAE-5Pw、SP-5PW、CM-5PW等，是目前應用最廣泛的產品。本發(fā)明可以采用上述各種填料，優(yōu)選采用ProGel-TSK DEAE-5PW柱。采用高效離子交換液相色譜法分離采用凝膠過濾法分離得到的樣品SEPHADEX Ⅱ(即DEX Ⅱ)，由測定及計算結果可以看出TSK3號峰的樣品具有原樣品大部分的活性，應該進一步分離該樣品。
2、高效凝膠液相色譜法分離(HPGC)高效凝膠液相色譜法的分離原理與經(jīng)典凝膠色譜法原理基本相似，即在一定離子強度的流動相下，樣品通過凝膠柱時，洗脫順序是分子量從大到小的預序。但由于HPGC填料中硅膠及鍵合相的電荷、極性的影響，其分離又具有獨特性，具有更高的分辨率。本發(fā)明中采用島津高壓液相系統(tǒng)，分離樣品TSK3，由測定及計算結果可以看出PAK2號峰的樣品具有原樣品大部分的活性，應該進一步分離該樣品。
3、高效反相色譜法分離(HPRPC)原理高效反相色譜法又稱非極性鍵合相色譜。鍵合相表面都是極性很小的烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等。最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠，又稱ODS。而洗脫液大都采用強極性溶液如水、醇、乙腈或無機鹽的緩沖液。在這種鍵合相色譜中，極性大的化合物先洗脫(K′小)，極性小的化合物不易洗脫(K′大)。反相色譜在蛋白質、多肽的分離中已得到了廣泛的應用，其主要原因是這個操作系統(tǒng)的簡單性和靈活性。本發(fā)明中采用島津高壓液相系統(tǒng)，分離樣品Pak2，由測定及計算結果可以看出ZBX4號峰的樣品具有原樣品大部分的活性。
小結五組樣品經(jīng)過測活，選出麗寶Ⅲ號樣品為活性最強者。經(jīng)過DEAE纖維素離子交換、SePhadex凝膠過濾及高效液相色譜法的分離，分離出了活性產物ZBX4，達到了預期的目的。進一步對其進行進一步的分析，測定其氨基酸序列。
二．純度及序列分析一〕純度測定蛋白質、多肽分離純化的目的，就是得到成分單一的樣品。事實上，還沒有一種完全純度測定的方法，只有檢測樣品不純或不均一的方法。純度最終取決于所用的方法的類型和分辨力。用低分辨率的方法證明是純的樣品，改用高分辨率的方法時，就可能證明它不是純的，而且每一種方法只能描述樣品在某一方面的性質。例如，用高分辨率的SDS電泳法進行測定，得到一條帶，這只能說明樣品在分子量方面是均一的。因此，最好的純度標準是建立多種分析方法，從不同的角度分子量、疏水性、帶電性等方面測定樣品的均一性。本發(fā)明利用液相色譜法多柱系統(tǒng)和毛細管電泳法測定純度。
1、高效凝膠排阻色譜法(HPGC)凝膠色譜法是基于分子尺寸進行分離的方法，本發(fā)明用凝膠過濾法檢測樣品在分子量方面的均一性。得到的凝膠過濾結果圖和凝膠過濾三維色譜圖都只給出一個單峰，說明得到純度單一的樣品。
2、高效反相色譜法(HPRPC)高效反相色譜法是基于溶質、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應而建立的一種色譜模式。本發(fā)明利用其檢測樣品極性的均一性。檢測結果表明純度良好。
3、高效毛細管電泳法(HPCE)二〕高效凝膠色譜法測定分子量原理高效凝膠液相色譜法的分離原理與經(jīng)典凝膠色譜法原理基本相似，即在一定離子強度的流動相下，樣品通過凝膠柱時，洗脫預序是分子量從大到小的順序。洗脫時峰的位置和該物質的分子量有直接的定量關系。一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積稱為外水體積V0。不能進入凝膠的那些大分子，當洗脫體積為Vo時，出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內部孔隙的總體積稱為內水體積Vi，能全部透入凝膠的那些小分子，當洗脫體積為V0+Ve時，出現(xiàn)洗脫峰。
將分子篩分配系數(shù)定義為K=Ve/Vi。若樣品分子為球形，Stock半徑為a，并且今凝膠的孔徑是均一的圓錐體，底面的半徑為r根據(jù)理論上的分析，在一定范圍內，K與Loga/r呈直線關系。K=-bLoga/r-c(b,c為常數(shù))。由于分子量和S tock半徑有正比關系，上式也可表示為K=-b′logM+c′由此可作出標準曲線，測定樣品的分子量。
據(jù)文獻報道，采用合適的柱條件和流動相，可測定的蛋白、多肽分子量的范圍可以延伸到1000Dol。本發(fā)明中通過標樣測定，得到標準方程為LogM=-0.20087097X+5.34795Dispersion:0.1297979結合樣品的高效凝膠色譜圖，得到樣品分子量計算結果MN=10(-020087097×9.502+5.34795885)=2749.68三)紫外光譜測定當一定波長范圍的光連續(xù)照射分子或原子時，有一個或幾個波長的光被吸收，這種光譜稱為吸收光譜，所吸收的光處于紫外區(qū)則稱為紫外光譜。
物質對紫外光的吸收，決定于其分子結構、分子中電子的分布和結合。從化學鍵來看，與吸收光譜有關電子的主要有三種形成單鍵的σ電子，形成復鍵的π電子，和未共享的n電子。
多肽與蛋白質中含有肽鍵，是一種共軛體系，在210nm附近有強烈吸收。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸由于含有苯環(huán)，在280nm附近有吸收峰。本實驗利用水作為溶劑，測定樣品的紫外吸收光譜。
四)N末端均一性測定原理聚酰胺是一類化學纖維原料，又稱尼龍。它對許多極性化合物有吸附作用，具有特異的分辨性能，可用于柱層析、薄層層析及薄膜層析。聚酰胺薄膜是將聚酰胺涂布于滌綸片上，形成質地均勻的緊密的多孔薄膜，層析性能十分優(yōu)良。
由于聚酰胺的-C=O基及-NH2基可與被分離物質形成氫鍵，因而可以吸附酸類、酚類、醌類、硝基及氨基化合物等。由于各種物質與聚酰胺形成氫鍵的能力不同，即聚酰胺對各種物質的吸附能力不同，而且在層析過程中，展層溶劑與被分離物質在聚酰胺表面競相形成氫鍵，因此，選擇適當?shù)恼箤尤軇墒垢鞣N待分離物質在聚酰胺表面與溶劑之間有不同的分配系數(shù)，經(jīng)過吸附與解吸附的展層過程，各自按一定秩序分離開來。
熒光試劑Dansyl-Cl(二甲基氨基萘磺酰氯)可與氨基酸結合成帶有熒光的Dansyl-氨基酸，反應原理見圖24。
反應產物DNS一氨基酸在紫外線下具有強烈的綠色熒光，檢測靈敏度可達10-9--10-10摩爾，比二硝基氟苯法高100倍，只需1納摩爾樣品便可進行分析。除DNS一脯氨酸經(jīng)6MHCl于110℃水解過夜有70％被破壞、色氨酸及其DNS衍生物完全破壞外，DNS氨基酸是比較較穩(wěn)的。
五)序列測定酞的氨基酸順序測定主要使用Edman化學降解法，此外還有酶解法、酶解-肽譜重疊法，以及氣譜-質譜聯(lián)用法等。Edma n化學降解法是常用的測序方法。
原理Edman化學降解法(Edman Degradation)是P.Edman于1950年首先提出來的。最初用于N末端分析，即苯異硫氰酸脂(PITC)法。Edman降解試劑(PITC)與多肽鏈的游離末端氨基作用，降解反應可分為三步。
第一步是偶聯(lián)反應 反應在弱堿性介質中進行，PITC只能與未質子化的氨基起作用。
第二步是環(huán)化斷裂反應 第一步反應中形成的PTC-肽在無水強酸介質如三氟乙酸中，是靠近PTC基的肽鍵將發(fā)生斷裂，PTC-氨基酸殘基環(huán)化成噻唑啉酮苯胺(aniline thiazolinine)衍生物。反應需在無水條件下進行，否則其它肽鍵將水解。
第三步是轉化反應 第二步反應中生成的ATZ不穩(wěn)定，難于用來鑒定該氨基酸，因此在酸性水溶液中將它轉變?yōu)镻TH-氨基酸。轉化反應實際又分為二步進行，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸。這是一個非常穩(wěn)定的化合物。PTH-氨基酸在紫外區(qū)有強吸收，最大吸收值在268nm處。PTH-氨基酸可利用各種層析技術分離。由于PITC與肽鏈的游離α末端氨基結合后，只是減弱緊挨PTC基的末端殘基羧基側的肽鍵，因此在無水條件酸作用下，只切下與PITC反應的那個氨基酸殘基。這時剩下的減少了一個殘基的肽鍵便在它的N末端暴露出一個新的游離N末端，又可參加第二輪反應。然后再切下第二個殘基，以此循環(huán)。這樣如果n輪反應，就能測出n個殘基的順序。
利用Edman降解，一次能連續(xù)測出60-70個殘基的肽段的順序，也有報道一次測出90-100個殘基Ⅰ預序的。
經(jīng)臨床證明，腦蛋白水解波對腦缺血、腦損傷有明顯的治療效果。麗寶公司提供的5組樣品，是經(jīng)凝膠過濾初步分離得亞洲粗品。其保留時間依次增加。根據(jù)測活結果來看，其中第三組、第五組樣品有活性。第一組、第二組、第四組樣品沒有活性。這說明這兩組樣品中所含的活性物質是不同的，即腦蛋白水解液中含有多組活性物質。這在以后的實驗中得到了證實。用離子交換法分離到的4組組分中，有兩組具有活性。用超細凝膠過濾分離時，亦有兩組組分表現(xiàn)出活性。這都說明，在此藥中含有多種活性成分。這些組分之間活性的強弱以及相互之間是否存在協(xié)同作用，仍需進一步探討。至于其它組中有些活性為負，可能是因為樣品本身具有抑制呼吸的作用。
在實驗中發(fā)現(xiàn)，各活性組分作用與時間之間存在關系。第三組樣在1.5小時之后，瓦氏呼吸儀測定發(fā)現(xiàn)活性有明顯增加。而第五組樣則沒有明顯的變化。其它3組與對照組沒有明顯差異。這說明第五組樣品以一種直接的作用方式影響細胞的活性，而第三組樣同時也存在一種深層次、間接的作用方式。它可能促進細胞表達某種產物。該產物可以促進細胞的抗缺氧反應，且具有更強的活性。如果這種推論正確的話，該物質應該是激素類或其它基因表達調控因子，而且其作用機理相當復雜，涉及多種生命過程。樣品可以促進細胞對氧的利用，以保證對于細胞至關重要的生命過程得以順利進行；同時它也抑制細胞中對細胞的生存具有次要作用的生命過程的氧消耗，以節(jié)省養(yǎng)分，保證胞能夠在應急狀態(tài)下得以生存。因此，該物質存在兩種作用，一是正調控，激活或促進細胞合成應急狀態(tài)下細胞生存所必須的蛋白質，從表現(xiàn)上看即細胞的氧耗增加。二是負調控作用，樣品直接或通過激活細胞內的活性物質或促進細胞合成活性物質，抑制細胞非必須生命過程對氧的消耗。這是基因表達調控中一種普遍的機理。即通過一種或幾種因子，在不同的分子層次，調控細胞的行為，以適應環(huán)境。
在葡聚糖凝膠過濾中，由于Sephadex具有一定的吸附作用，所以加入適當離子強度的鹽是必要的，而且流動相的pH值對分離效果也有影響，在實驗中，我們采用0.05M的磷酸鹽緩沖液，即可以維持流動相PH值的穩(wěn)定性，又使流動相的離子強度得到增加，避免凝膠基質對樣品的吸附，以免影響樣品的分離效果。
在反相色譜中，在流動相為水時，樣品保留時間較短，各樣品不能完全分開。所以我們加入了KH2PO4增加流動相的離子強度，使流動相的表面張力增加，產生疏溶劑化效應，從而增加樣品的保留，但是峰擴展明顯。因為有機溶劑可以改善峰形和保留時間，因此有加入了5％的甲醇。峰形良好。
多肽分子量的測定，對于大分子蛋白質來說，只要保持一定的離子強度，分離效果就比較理想，保留時間具有線性關系。但對于多肽小分子，還需要加入SDS或鹽酸胍。加入鹽酸胍時，溶劑的粘度比較大，流速不能太高。在實驗中，不加SDS時，多肽標準出峰時間不存在線性關系。無法進行分子量的計算。根據(jù)文獻報道，我們加入了0.2％的SDS，分離效果良好。
三．腦蛋白活性物質的人工合成采用合成方法合成上述經(jīng)過分離得到的腦蛋白活性物質，測定其理化常數(shù)和序列結構，證明與上述腦蛋白活性物質相同。
本發(fā)明公開了腦蛋白水解液中分離和提純活性物質的方法，并對所得的到活性物質進行了活性、純度、分子量、氨基酸序列及末端分析，得到了一種單一、高純的腦蛋白活性物質，進一步采用合成的方法，合成了上述腦蛋白活性物質，經(jīng)分析證明，其組成、結構及氨基酸序列與分離得到的腦蛋白活性物質完全相同，對于腦蛋白類新藥的研究和開發(fā)，具有重要意義。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明。


如下
圖1．為本發(fā)明的蛋白的分離和純化的流程圖2．為為麗寶公司5組樣品的活性3．為梯度洗脫裝置4．為DEAE離子交換法分離麗寶公司第三組樣品洗脫液的分離色譜5．為DEAE離子交換法分離麗寶公司第三組樣品得到的四組樣品的活性6．葡聚糖凝膠的基本結構7．凝膠層析的簡單原理圖8．凝膠過濾分離樣品DEAEI洗脫液的分離色譜9．凝膠過濾分離樣品DEAEI得到的四組樣品的活性10．高效離子交換液相色譜法分離SEPHADEX Ⅱ洗脫液的分離色譜11．高效離子交換液相色譜法分離SEPHADEX Ⅱ洗脫峰的活性12．高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3流出液的分離色譜13．高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3流出樣品的活性14．高效反相色譜法分離樣品Pak2流出液的分離色譜15．高效反相色譜法分離樣品Pak2流出樣品的活性16．樣品ZBX4的凝膠過濾結果17．樣品ZBX4的凝膠過濾三維色譜18．高效反相色譜19．高效毛細管電泳法測定純度的譜20．標準多肽樣品的高效凝膠色譜21．多肽分子量標準曲線圖22．本發(fā)明樣品的高效凝膠色譜23．本發(fā)明樣品的紫外光譜圖24．標準氨基酸的N-末端測定結果25．樣品的N-末端測定結果圖實施例一．麗寶公司初級腦蛋白產品5組樣品活性測定實驗中采用瓦氏呼吸儀Warburg系統(tǒng)12062型，由Braun-Melsungen生產；已標化無側臂反應瓶；YQ-3型高速勻漿機；清潔級雄性豚鼠250±10；試劑采用10％氫氧化鉀溶液，0.2M磷酸緩沖液pH7.4。
樣品取麗寶公司提供樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，各稱取50mg，溶于0.5ml蒸餾水，振蕩混勻。迅速處死豚鼠，取肝，稱量肝組織4g，加入24ml磷酸緩沖液，6000rpm勻漿30秒，過濾。稱量膽酸鈉5g，氯化鈉23g分別溶解后合并。加入伊文思藍100mg，加水定容至500ml，再加幾滴香草酚酒精溶液防腐得Brodie液。
測定步驟開電源，調攪拌速度，保持水浴溫度為37±0.1℃。準備空白、對照品和供試品的反應瓶；按表1順序加入溶液。打開壓力計毛細管活塞，將錐形瓶連接到相應的壓力計上；將錐形瓶完全浸入水浴，打開振蕩馬達，調頻率為100轉/分；反應瓶進行溫度和壓力補嘗；20分鐘后，利用旋鈕調節(jié)每個壓力計右側管為150刻度處，記錄A1。-密閉整個系統(tǒng)，反應15分鐘，記錄左側管讀數(shù)為E1；打開壓力計活塞，重調壓力計右側管為150刻度處，記錄A2；關上壓力計活塞，重新啟動裝置，過去時5分鐘，記錄E2。-打開壓力計活塞，重調壓力計右側管為150刻度處，記錄A3；關上壓力計活塞，重新啟動裝置，過去時5分鐘，記錄E3。
表1

結果計算1、原理通過壓力計左側毛細管讀出液面水平，由液面高度差算出以mm表示的壓力差，進而得出以μl表示的正常條件下的O2消耗量，乘以錐形瓶常數(shù)所得的數(shù)值即為ΔO2。
2、公式ΔO2=(D1+D2+D3)×KA1=初始值(mm)E2=中間階段值(mm)D1=A1-E1(mm)A2=中間階段重新調整后的初始值(mm)E2=中間階段值(mm)D2=A2-E2(mm)余依此類推K錐形瓶常數(shù)3、活力計算Rs-BB×100%]]>其中Rs=樣品ΔO2；B=空白ΔO2通過上述計算，得出活力結果，選出活力最高者進行下一步液相分離。
結論表2列出了麗寶公司5組樣品的活性測定；表3．列出了活性計算結果。
表2

表3

圖2為麗寶公司5組樣品的活性圖。
實施例二．經(jīng)典液相色譜法分離腦蛋白水解液實驗材料稱取麗寶公司提供的腦蛋白水解液凍干品樣品Ⅲ500mg，溶于10ml蒸餾水；玻璃柱尺寸14mm(ID)×95mm。試劑A液pH9.0磷酸氫二鈉溶液；B液取A液500ml，加NaCl14.6g。
實驗方法取30g凝膠，懸浮于500ml水中，過夜；傾去上清懸液，如此反復3次，超聲20分鐘得到實驗凝膠。向玻璃柱內緩緩加入凝膠懸液；柱下端流速控制為1ml/min。當凝膠層到達距上端3cm時，用一稠布蓋住凝膠床的表面；連接蠕動泵、檢測器及積分儀；以1ml/min純水洗滌凝膠柱2小時；更換流動相為0.5M的NaOH；洗滌2小時，用水洗滌至中性后，再用0.5M的HCl洗滌平衡凝膠柱1小時；水洗過夜；用磷酸鹽緩沖液平衡柱3小時；上樣0.5ml，以1ml/min的流速梯度洗脫；檢測波長280nm；梯度洗脫；圖3為梯度洗脫裝置，該裝置由兩個容器組成，一個是貯液瓶，一個是混合瓶。兩個瓶通過上端連接管利用虹吸原理相通；混合瓶出口處同蠕動泵2相連，混合瓶內有電磁攪拌裝置1，貯液瓶內裝有B液，混合瓶內裝有A液，兩瓶內液體體積相等，液面相平。
按洗脫圖，依次收集各組分峰；然后把各樣品通過SeghadexG10柱脫鹽、凍干、稱量150mg，溶于1ml水，樣品的分離色譜圖見圖4；采用前面的方法測定活性，樣品四個峰測活結果見表4-5,DEAE離子交換法分離出的四組樣品的活性圖見圖5。通過上述測定可見DEAE離子交換法分離出的1#峰，即第一組樣品DEAEI具有原樣品的大部分活性。
表4 DEAE離子交換法分離出的四組樣品測活結果

表5 DEAE離子交換法分離出的四組樣品的活性計算結果

實施例三．分子篩凝膠法分離DEAEI實驗中采用離子交換洗脫樣品DEAEI，玻璃柱尺寸20mm(ID)×90cm；0.05mol/L,pH7.4磷酸鹽緩沖液，0.05％ NaN3水溶液；0.2％藍葡聚糖水溶液；稱取本品3g，溶于是15ml水中作為蛋白水解液的流動相。
取SephadexG25凝膠50g，將凝膠懸浮于2000ml水，過夜；傾去上清懸液，如此反復3次。超聲20分鐘，裝入玻璃柱內，柱下端流速控制為1ml/min；當凝膠層到達距主端3cm時，用一稠布蓋住凝膠床的表面；連接蠕動泵、檢測器及積分儀；以1ml/min純水洗滌凝膠12小時，更換為0.05M磷酸鹽緩沖液，平衡凝膠柱2小時，層析床應均勻，無紋路、氣泡，加入藍葡聚糖，色譜帶應該應均勻、平整；向色譜柱上樣0.5ml，以1ml/min的流速洗脫；檢測波長280nm，分別收集洗脫液按順序依次為DEX1、DEX2、DEX3、DEX4，樣品分離色譜圖見圖8，重復上樣，各取2ml用同前方法測活，結果見表6-6a及圖9。由測定及計算結果可以看出，表6 凝膠過濾分離樣品DEAEI得到的四組樣品的測活結果

表6a 凝膠過濾分離樣品DEAEI得到的四組樣品的活性計算結果

實施例四．高效離子交換液相色譜法分離Sephadex凝膠過濾洗脫樣品SEPHADEX Ⅱ(即DEX Ⅱ)；A液0.1MTris-HCl緩沖液；B液取A液500ml，加入氯化鈉14.6g，兩液均用0.45μm膜過濾。
儀器采用島津高壓液相系統(tǒng)，包括LC-1OAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO-1OA柱箱，F(xiàn)RC10A收集器，Progel TSKDEAE-5PW柱[4.6mm(ID)×25cm 5μm]梯度程序A B0min 100％ 030min 0 100％流速1ml/min，線性梯度。
分離時，以A液平衡柱30min，進樣10μl，收集洗脫液，重復進樣，色譜圖見圖10，分布收集洗脫液，按順序依次為TSK1、TSK2、TSK3、TSK4、TSK5、TSK6、TSK7、TSK8、TSK9、TSK10，洗脫液用Sephdex G10柱脫鹽，凍干；再各取10mg凍干品，溶于0.5ml水，方法同前測活，結果見表7-8和圖11，由上述表和圖可以看出TSK3號峰的樣品具有原樣品大部分的活性。
表7 高效離子交換液相色譜法分離SEPHADEX Ⅱ所得樣品的測活結果

表8 高效離子交換液相色譜法分離SEPHADEX Ⅱ所得樣品的活性計算結果

實施例五．高效凝膠液相色譜法分離(HPGC)采用島津高壓液相系統(tǒng)，包括LC-1OAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO-1OA柱箱，F(xiàn)RC1 OA收集器，Protein-pak 60柱[7.8mm(ID)×300mm)；流動相為pH6.5、濃度0.05M、過0.45μm膜的磷酸鹽緩沖液；樣品為稱取TSK3 60mg，溶于3ml水。
分離時用流動相平衡柱40min，進樣50μl，反復進樣，分步收集洗脫峰，依次為PAK1、PAK2、PAK3，分離色譜圖見圖12，各取2ml方法同前測活，結果見表9-10及圖13；由上述表和圖可以看出PAK2號峰的樣品具有原樣品大部分的活性。
表9 高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3流出樣品測活結果

表10 高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3流出樣品活性計算結果

實施例六．高效反相色譜法分離(HPRPC)本發(fā)明中采用島津高壓液相系統(tǒng)，包括LC-1OAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO-1OA柱箱，F(xiàn)RC1 OA收集器，樣品Pak2，柱Zorbax300SB-C18[4.6mm(ID)×150mm)，試劑0.05MKH2PO4、0.1％三氯乙酸、5％甲醇水混合溶液，超聲20min,0.45μm膜過濾。
用流動相平衡柱40min，待基線走平穩(wěn)，開始進樣，進樣量100μl，收集洗脫峰，分離色譜圖見圖14，反復進樣，收集洗脫液，按順序依次為ZBX1、ZBX2、ZBX3、ZBX4、ZBX5；將收集的樣品凍干，各溶于1ml水，取0.5ml方法同前測活，結果見表11-12及圖15；由上述表和圖可以看出ZBX4號峰的樣品具有原樣品大部分的活性。
表11 高效反相色譜法分離樣品Pak2流出樣品測活結果

表12 高效反相色譜法分離樣品Pak2流出樣品的活性計算結果

實施例七．高效凝膠排阻色譜法(HPGC)測定純度儀器采用島津高壓波相系統(tǒng)，包括LC-1OAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO-1OA柱箱；流動相為0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)；柱為Waters Protein-pak 60[7.8mm(ID)×300mm]；樣品ZBX4，流速1ml/min，進樣量20μl；結果見圖16-17，圖中都只有一個單峰，說明得到純度單一的樣品。
實施例八．高效反相色譜法(HPRPC)測定純度儀器采用島津高壓液相系統(tǒng)，包括LC-1OAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO-1OA柱箱，柱YWG-C181[4.6mm(ID)×250mm]北京北分儀器技術公司，流動相5％甲醇，柱溫35℃，流速1ml/min，進樣量20μl；檢測結果見圖18，除在初期有一個小峰外，樣品峰主要在保留時間為6.976MIN出現(xiàn)，證明純度良好。
實施例九．高效毛細管電泳法測定純度儀器采用Waters Quanta 4000E毛細管電泳儀，柱CEleet-P175 75μm(ID)×57.5cmSupelco，流動相0.1M磷酸二氫鈉一磷酸緩沖液，pH2.5，檢測波長214nm，上樣量10μl，結果見圖19。
實施例十．高效凝膠色譜法(HPGC)測定分子量儀器采用島津高壓及相系統(tǒng)，包括LC-IOAT泵，SPD-MXA檢測器，CTO一1OA柱箱，液動相0.1M磷酸鹽緩沖液0.2％SDS(pH7.0)，柱TSK-GEL 2000SW[7.5mm(ID)×300mm)，流速1ml/min，多肽標準取多肽標準1μl，稀釋20倍，上樣4μl；樣品上樣10μl。根據(jù)多肽標準品峰，見圖20，得到標準曲線表，見表13，繪制標準曲線圖21，再結合高效凝膠色譜的測定結果，見圖22，計算樣品分子量為2749.68。
表13

實施例十一．紫外光譜測定利用水作為溶劑，采用日立3201紫外分光光度計測定樣品的紫外吸收光譜。結果見圖23．實施例十二．N末端均一性測定1．樣品的Dansyl化取樣品0.1ml，加入DNS-Cl 0.6ml(2.5mg/ml)，用三乙胺調到ph9.0-9+.1，混勻，塞好，于40℃烘箱中DNS化2小時。反應后取出，于真空干燥器中抽去丙酮。
2．DNS一樣品的酸水解向上述DNS化的樣品中加入0.5ml 5.7M的鹽酸溶液使之溶解，再轉移到硬質玻璃的水解管中用火焰封管，110℃水解18小時。水解后除去封口，將水解液移出，放到5ml小管中，抽出鹽酸，再加少量鹽酸，再抽出鹽酸至干。
3．加入0.5ml水溶解，再加1ml乙酸乙脂萃取，萃取2-3次，合并萃取液，蒸去乙酸乙脂，然后加入0.1ml丙酮溶解，備用。
4．標準氨基酸的DNS化稱取氨基酸標準品1ml(18種氨基酸)，溶于0.5ml0.2M碳酸氫鈉溶液中。加入0.5mIDNS-Cl丙酮溶液，40℃烘箱中DNS化1小時，于真空干燥器中抽出丙酮。然后，用1M鹽酸溶液將DNS化的氨基酸酸化到PH2-3，再用乙酸乙脂萃取2-3次，每次用1ml，合并萃取液，蒸去乙酸乙脂，加入0.1ml丙酮溶解。
5．聚酰胺表膜的剪裁將聚酰胺薄膜剪裁成7厘米×7厘米大小兩張。距兩邊0.5厘米處各劃一直線，在點樣處劃一交叉十字。
6．點樣DNS一標準氨基酸、樣品水解液分別用毛細管取樣，于聚酰胺膜上點樣。
7．展層將聚酰胺薄膜的光面向外，聚酰胺面向內，箍一個尼龍條圈，置于小干燥器內的小培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中盛有層析溶劑Ⅰ[85％甲酸∶水=1.5∶100(V∶V)〕。待溶劑前沿將達到膜邊緣時，取出，用吹風機吹干。然后將薄膜換90°方向，于展層溶濟Ⅱ[苯∶冰乙酸=9∶1(V∶V))中進行展層，待溶劑前沿將達到膜邊緣時，取出，吹干。
8．檢測于紫外檢測燈下觀察。DNS一氨基酸為綠色，DNS-CI產物為藍色熒光。用鉛筆將各熒光區(qū)劃下。確定樣品N末端的數(shù)目及氨基酸種類，標準氨基酸的N一末端測定結果圖見圖25，樣品的測定結果見圖26，根據(jù)測試結果，可以認為所得樣品只有一個N-末端，為精氨酸。
實施例十三．序列測定儀器LF3000 Protein Sequencer Beckman。
實施例十四．腦蛋白活性物質的化學合成采用多肽合成儀，按照測定的序列逐步合成腦蛋白活性物質，并測定所合成腦蛋白活性物質的理化常數(shù)和序列分步。
實施例十五．腦蛋白活性物質的化學合成用合成的方法，合成上述腦蛋白活性物質，并測定所合成腦蛋白活性物質的理化常數(shù)和序列分步，與分離得到的活性物質基本相同。
權利要求
1．一種腦蛋白水解活性物質，其特征在于(1)測定初級腦蛋白水解樣品的活性；(2)取初級腦蛋白水解樣品中活性最高的樣品用DEAE離子交換法分離，得到活性最高的樣品DEAEI；(3)用分子篩凝膠法分離DEAEI，得到活性最高的樣品DEX2；(4)用高效離子交換液相色譜法分離DEX2，得到活性最高的樣品TSK3；(5)用高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3，得到活性最高的樣品PAK2；(6)用高效反相色譜法分離PAK2，得到具有原樣品大部分活性的樣品ZBX4為腦蛋白水解活性物質。
2．根據(jù)權利要求1所述的腦蛋白水解活性物質，其特征在于所述腦蛋白水解活性物質在高效凝膠排阻色譜、凝膠過濾三維色譜、高效反相色譜、高效毛細管電泳譜圖和高效凝膠色譜法測定分子量的譜圖中顯示一個單峰。
3．根據(jù)權利要求2所述的腦蛋白水解活性物質，其特征在于所述腦蛋白水解活性物質在高效凝膠排阻色譜、高效反相色譜、高效毛細管電泳譜圖中的吸收峰分別為t=9.886、6.976合24；分子量為2749.68。
4．根據(jù)權利要求1所述的腦蛋白水解活性物質，其特征在于所述腦蛋白水解活性物質只一個N-末端，為精氨酸。
5．根據(jù)權利要求1所述的腦蛋白水解活性物質，其特征在于所述腦蛋白水解活性物質在紫外光譜上有特定的吸收并具有特定的序列。
6．根據(jù)權利要求1所述的腦蛋白水解活性物質，其特征在于所述腦蛋白水解活性物質為一純蛋白。
7．一種制備腦蛋白水解活性物質的方法，其特征在于(1)測定初級腦蛋白水解樣品的活性；(2)取初級腦蛋白水解樣品中活性最高的樣品用DEAE離子交換法分離，得到活性最高的樣品DEAEI；(3)用分子篩凝膠法分離DEAEI，得到活性最高的樣品DEX2；(4)用高效離子交換液相色譜法分離DEX2，得到活性最高的樣品TSK3；(5)用高效凝膠液相色譜法分離樣品TSK3，得到活性最高的樣品PAK2；(6)用高效反相色譜法分離PAK2，得到具有原樣品大部分活性的樣品ZBX4為腦蛋白水解活性物質。
8．根據(jù)權利要求7所述的制備腦蛋白水解活性物質的方法，其特征在于(1)用瓦氏呼吸儀測壓法測定初級腦蛋白水解樣品的活性；(2)DEAE離子交換法分離取初級腦蛋白水解樣品中活性最高的樣品，上樣0.5ml，以1ml/min的流速梯度洗脫；檢測波長280nm；(3)采用SephadexG25凝膠用分子篩凝膠法分離DEAEI，上樣0.5ml，以1ml/min的流速洗脫；檢測波長280nm，得到活性最高的樣品DEX2；(4)用Progel TSK DEAE-5PW柱高壓液相系統(tǒng)，進樣10μl的高效離子交換液相色譜法分離DEX2，得到活性最高的樣品TSK3；(5)用高效凝膠液相色譜法Protein-pak60柱高壓液相系統(tǒng)，流動相為pH6.5、濃度0.05M、的磷酸鹽緩沖液，分離樣品TSK3，得到活性最高的樣品PAK2；(6)用高效反相色譜法，Zorbax 300SB-C18柱高壓液相系統(tǒng)，0.05MKH2PO4、0.1％三氯乙酸、5％甲醇水混合溶液分離PAK2，得到具有原樣品大部分活性的樣品ZBX4為腦蛋白水解活性物質。
9．一種制備腦蛋白水解活性物質的方法，其特征在于采用合成的方法合成腦蛋白水解活性物質。
全文摘要
本發(fā)明公開了從腦蛋白初級水解液中分離和提純活性物質的方法,并對所得的到活性物質進行了活性、純度、分子量、氨基酸序列及末端分析,得到了高效凝膠排阻色譜、高效反相色譜法和高效毛細管電泳具有單一峰的一種高純腦蛋白活性物質,進一步采用合成的方法,合成了上述腦蛋白活性物質,經(jīng)分析證明,其組成、結構及氨基酸序列與分離得到的腦蛋白活性物質完全相同,本發(fā)明對于腦蛋白類新藥的研究和開發(fā),具有重要意義。
文檔編號C07K1/00GK1313290SQ0010344
公開日2001年9月19日 申請日期2000年3月14日 優(yōu)先權日2000年3月14日
發(fā)明者徐康森 申請人:中國藥品生物制品檢定所