專利名稱：一種顯花植物株型相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一種顯花植物株型相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及擬南芥的一種株型相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類一直對形形色色的植物形態(tài)是如何形成的具有濃厚的興趣。近年來的分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究表明植物的莖干系統(tǒng)在植物多種形態(tài)的發(fā)生中起著重要的作用。莖干系統(tǒng)的形態(tài)建成起始于一個小小的初生莖端分生組織(SAM)，在胚胎形成時期它就已經(jīng)出現(xiàn)，植物的主軸由它形成。種子萌發(fā)后又出現(xiàn)一些分生組織，它們形成各種分枝，這些分生組織何時發(fā)育、何處發(fā)育，對每種植物來說是不盡相同的。各種分生組織一起活動，形成了千姿百態(tài)的植物形態(tài)，盡管后天的環(huán)境因素會起一些影響，但是各種植物的株型是先天遺傳因素決定的。
在被子植物中，側(cè)向枝條大多是由腋生分生組織產(chǎn)生的。它的發(fā)育有兩個主要階段腋生分生組織在葉腋中形成以及隨后腋芽的生長。在許多植物中，包括模式植物擬南芥，腋生分生組織的生長是被初生花序所抑制的，這種現(xiàn)象通常被稱作頂端優(yōu)勢。通常認(rèn)為激素，特別是生長素和細(xì)胞分裂素，對于這一過程起著重要的作用。但是，具體的調(diào)控機(jī)制及遺傳路徑仍不清楚。近來，分離株型改變的突變體已經(jīng)成為研究這種現(xiàn)象的有力手段。這些突變體可以被分為兩類在第一類中，突變并不影響腋生分生組織的早期發(fā)育，因此突變體中增加的分枝只是歸因于側(cè)芽的抑制被解除。擬南芥的生長素不敏感突變體axr1-12(Stirnberg et al.1999)及玉米突變體tb1(Doebleyet al.1997)就屬于這種情況；在第二類中，突變影響了側(cè)芽的早期發(fā)育，包括西紅柿中的突變體blind，torosa，ls(Schmitz and Theres 1999)以及擬南芥REVOLUTA基因的功能喪失突變體，這個基因是頂端分生組織發(fā)育所必需的，且抑制腋生分生組織形成(Talbert et al.1995)。
目前，改變植物的株型，需要突變某個株型相關(guān)基因，還沒有提到通過轉(zhuǎn)入某個基因，使其異位表達(dá)就能改變植物的株型的例子。這種通過直接表達(dá)基因改變株型的方法在生產(chǎn)實(shí)踐中更為簡便可行。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種株型相關(guān)基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的株型相關(guān)基因，名稱為SAA(Sami Arabidopsis)，來源于哥倫比亞生態(tài)型的擬南芥(Columbia)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1244個堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1244位堿基，不含內(nèi)含子。
擬南芥株型相關(guān)基因SAA編碼蛋白SAA，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由395個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的SAA基因的過量表達(dá)(overexpression)導(dǎo)入植物細(xì)胞，或者在其他植物中找到與SAA同源的基因異位表達(dá)，植物的株型就發(fā)生改變。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因可廣泛用于改變植物株型的基因工程育種中。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為SAA基因異位表達(dá)后產(chǎn)生多片莖生葉的照片及對照野生型擬南芥莖生葉的照片圖2為基因異位表達(dá)后產(chǎn)生多個頂端分生組織的照片、對照及對照野生型擬南芥單個頂端分生組織的照片圖3為構(gòu)建的表達(dá)載體的物理圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例中所用的植物材料野生型Columbia植株種植于營養(yǎng)土中。溫室條件為16小時光照，8小時黑暗，22℃恒溫。采集4周大的葉片用于提取基因組DNA。同時，采用去除初生花序一周后的植物做植物轉(zhuǎn)化的材料。
實(shí)施例1、SAA的克隆及異位表達(dá)載體構(gòu)建
www.TAIR.org網(wǎng)站得到at4g22390的序列，設(shè)計(jì)引物。
引物15’CAC-CAC-AAA-ATG-GCG-GAA-TGT-CCG-ACG-GAT-CTC 3’，引物25’GAG-AAG-GGC-ATA-CCA-CCT-TTT-AGT-ACT-CTT-TGG 3’。
參照Paterson et al(1993)的方法提取擬南芥Columbia野生型基因組DNA作為以下PCR反應(yīng)的模板20μl體系，內(nèi)含10×PCR緩沖液2μl，2.5mM dNTP mix1.6μl，5μM的引物1和引物2各2.0μl，pyrobest酶(Takara)0.1μl。在PE9600儀上擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min，94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 1min，共計(jì)35個循環(huán)；72℃延伸7min，將獲得的PCR產(chǎn)物，用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit純化PCR產(chǎn)物，測序?yàn)镾EQ ID №1的DNA序列。將純化產(chǎn)物克隆進(jìn)入pENTR-TOPO載體中(invitrogen)，再利用LR重組體系(invirtrogen)重組進(jìn)入植物表達(dá)載體pPTV中。
實(shí)施例2、異位表達(dá)植株的獲得將構(gòu)建好的載體(如圖3所示)用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。挑一個陽性菌落于10ml含有Spe/Gen的YEB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24小時，以1∶500的比例接入400ml含有Spe/Gen的YEB培養(yǎng)基中繼續(xù)在28℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8。4000g室溫離心20分鐘收集菌體，重新懸浮于滲透液(0.5xMS鹽，1xB5有機(jī)生長物質(zhì)，5％蔗糖，0.044μM 6BA，0.005％ Silwet L-77)至OD600達(dá)到0.8。將植物倒置浸入滲透液中，放入密閉容器中抽真空至0.05Mpa，放置5分鐘后緩慢放氣，取出植物繼續(xù)正常培養(yǎng)。收集種子，干燥后鋪在篩選平板上(0.5xMS鹽，1xB5有機(jī)生長物質(zhì)，1％蔗糖，0.8％瓊脂糖，pH5.7，50mg/l慶大霉素)，4℃放置3天后，轉(zhuǎn)入溫室繼續(xù)培養(yǎng)至抗性苗出現(xiàn)。將抗性苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，單棵收集種子再次鋪在篩選平板上100粒種子，選取抗性苗/死亡苗比例為3∶1的平板上的抗性苗繼續(xù)于營養(yǎng)土中培養(yǎng)，單棵收集種子再次鋪在篩選平板上100粒種子，選取全部為抗性苗平板上的植株于營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)施例3、野生型擬南芥和異位表達(dá)擬南芥的表型觀察結(jié)果在相同培養(yǎng)條件下，同時播種野生型Columbia和純合異位表達(dá)植株3個株系于營養(yǎng)土中。同野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株有以下表型1)次生花序抽苔早于初生花序在正常條件下，野生型擬南芥的初生花序首先抽苔(圖2A)，然后腋生花序開始抽苔，初生花序被人為除去后，次生花序才會繼續(xù)發(fā)育并抽苔。但是異位表達(dá)植物的初生花序還未抽苔，次生花序就抽苔開花(圖1C，D，E；圖2B，C，D，E，F(xiàn))。
2)腋生花序處的莖生葉產(chǎn)生蓮座狀葉在正常條件下，野生型擬南芥的腋生花序葉只長一片(圖1A，B)。但是異位表達(dá)植物的腋生花序葉卻有若干不等的數(shù)目，株系1長出了2片腋生花序葉(圖1D)，株系2長出了3片腋生花序葉(圖1E)，株系3甚至長出8片腋生花序葉，形成又一個蓮座狀結(jié)構(gòu)(圖1B)。
3)出現(xiàn)多個頂端分生組織在正常條件下，野生型擬南芥只有一個初生莖端分生組織，在胚的形態(tài)建成階段就已形成，隨著它的不斷分裂分化形成植物的主軸(圖2A)，其他的次生分生組織處于被抑制的狀態(tài)。但是異位表達(dá)植物卻同時出現(xiàn)多個大小相似的莖端分生組織。株系1有3個莖端分生組織(圖2B，C)；株系2出現(xiàn)4個莖端分生組織(圖2D，E，F(xiàn))。
序列表<160>2<210>1<211>1185<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)<400>1atggcggaat gtccgacgga tctcatcaac gaaatgtttc tccgtctcag agcaactacg 60ctcgtaaagt gtcgcgtcct ctcaaagcct tgcttctctt tgatcgacag tcccgagttc 120gtctcatctc atctccgtcg cagactcgaa acgggagaac atctcatgat cttactccga 180ggacctcgtc ttctacgcac ggtggagcta gactcgcctg agaacgtctc cgacatccct 240catcctttac aagccggagg ttttacagag gtttttggtt catttaacgg tgtcataggg 300ttatgtaact ctcctgttga tctagcgatc tttaatcctt cgactaggaa gattcaccgt 360ttaccaattg agccaattga tttcccagaa cgtgacatca ctcgtgagta tgtgttttac 420ggtttgggtt atgattctgt gggcgatgac tttaaagttg tgaggattgt tcagtgtaag 480cttaaagaag gtaaaaagaa atttccttgc cctgttgaag tcaaagtttt cagcttgaag 540aagaattcgt ggaagagagt gtgtcttatg ttcgagtttc agattctttg gatttcgtac 600tattaccatc tcttgcctcg tcgtggctat ggtgtggttg ttaacaacca tcttcactgg 660attttgcctc gaaggcaggg agtcattgcc tttaacgcga taatcaaata tgatcttgcc 720tctgatgaca ttggagtcct cagtttccca caggagcttt acattgaaga taacatggat 780attggtgtgt tagatggctg cgtttgtttg atgtgttacg acgagtatag ccatgttgat 840gtttgggttt tgaaagagta tgaggattat aaatcttgga ctaagctgta tagggtgccg 900aaaccagaga gtgttgaatc ggttgagttc attagacctc tgatctgttc caaggacagg 960agcaagattt tgctggagat taacaatgcg gcgaatctca tgtggtttga tttggaaagt1020cagagtctta caactgccgg aatagagtgt gatagttcat ttaccgcaga catcctcgtg1080agtagccttg ttttgggatg taaaggagat cctactcaag ctcagcgcag taaagatcag1140aagatgatgc caaagagtac taaaaggtgg tatgcccttc tctag1185<210>2<211>395<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana(L.)HEYNH.)<400>2
Met Ala Glu Cys Pro Thr Asp Leu Ile Asn Glu Met Phe Leu Arg1 5 10 15Leu Arg Ala Thr Thr Leu Val Lys Cys Arg Val Leu Ser Lys Pro20 25 30Cys Phe Ser Leu Ile Asp Ser Pro Glu Phe Val Ser Ser His Leu35 40 45Arg Arg Arg Leu Glu Thr Gly Glu His Leu Met Ile Leu Leu Arg50 55 60Gly Pro Arg Leu Leu Arg Thr Val Glu Leu Asp Ser Pro Glu Asn65 70 75Val Ser Asp Ile Pro His Pro Leu Gln Ala Gly Gly Phe Thr Glu80 85 90Val Phe Gly Ser Phe Asn Gly Val Ile Gly Leu Cys Asn Ser Pro95 100 105Val Asp Leu Ala Ile Phe Asn Pro Ser Thr Arg Lys Ile His Arg110 115 120Leu Pro Ile Glu Pro Ile Asp Phe Pro Glu Arg Asp Ile Thr Arg125 130 135Glu Tyr Val Phe Tyr Gly Leu Gly Tyr Asp Ser Val Gly Asp Asp140 145 150Phe Lys Val Val Arg Ile Val Gln Cys Lys Leu Lys Glu Gly Lys155 160 165Lys Lys Phe Pro Cys Pro Val Glu Val Lys Val Phe Ser Leu Lys170 175 180Lys Asn Ser Trp Lys Arg Val Cys Leu Met Phe Glu Phe Gln Ile185 190 195Leu Trp Ile Ser Tyr Tyr Tyr His Leu Leu Pro Arg Arg Gly Tyr200 205 210Gly Val Val Val Asn Asn His Leu His Trp Ile Leu Pro Arg Arg215 220 225Gln Gly Val Ile Ala Phe Asn Ala Ile Ile Lys Tyr Asp Leu Ala230 235 240
Ser Asp Asp Ile Gly Val Leu Ser Phe Pro Gln Glu Leu Tyr Ile245 250 255Glu Asp Asn Met Asp Ile Gly Val Leu Asp Gly Cys Val Cys Leu260 265 270Met Cys Tyr Asp Glu Tyr Ser His Val Asp Val Trp Val Leu Lys275 280 285Glu Tyr Glu Asp Tyr Lys Ser Trp Thr Lys Leu Tyr Arg Val Pro290 295 300Lys Pro Glu Ser Val Glu Ser Val Glu Phe Ile Arg Pro Leu Ile305 310 315Cys Ser Lys Asp Arg Ser Lys Ile Leu Leu Glu Ile Asn Asn Ala320 325 330Ala Asn Leu Met Trp Phe Asp Leu Glu Ser Gln Ser Leu Thr Thr335 340 345Ala Gly Ile Glu Cys Asp Ser Ser Phe Thr Ala Asp Ile Leu Val350 355 360Ser Ser Leu Val Leu Gly Cys Lys Gly Asp Pro Thr Gln Ala Gln365 370 375Arg Ser Lys Asp Gln Lys Met Met Pro Lys Ser Thr Lys Arg Trp380 385 390Tyr Ala Leu Leu ter39權(quán)利要求
1.一種擬南芥株型相關(guān)基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述擬南芥株型相關(guān)基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.擬南芥株型相關(guān)蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID№2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述擬南芥株型相關(guān)蛋白是序列表中SEQ ID №2。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求1所述基因在培育不同株型植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬南芥株型相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的擬南芥株型相關(guān)基因SAA，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明所提供的擬南芥株型相關(guān)基因SAA編碼蛋白SAA，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因可廣泛用于培育改變株型的植物品種。
文檔編號C07H21/00GK1609217SQ20031010220
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者王蕾, 董麗, 薛勇彪 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所