本發(fā)明涉及應(yīng)用生物技術(shù)原理人工培育真菌的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛹蟲草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）。蛹蟲草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲草素的主要來源，具有很高的開發(fā)利用價值。因野生的蟲草十分稀少，資源極缺，為滿足市場需求，正積極推進(jìn)蟲草的人工培育，而且人工培育的蟲草有效成分接近野生，部分含量甚至高于野生幾倍或者幾十倍。

在目前的相關(guān)技術(shù)中，通常都是試管種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)液中，再以20℃以下200轉(zhuǎn)/分鐘發(fā)酵培養(yǎng)7天，即可得到液體生產(chǎn)種。但是，在這個搖床培養(yǎng)的過程中不能給液體菌種定時補(bǔ)充氧氣，且液體菌種只能填充搖瓶容積的30%以下，存在搖制時間長、污染率高、發(fā)菌時間慢、菌種濃度低和生產(chǎn)效率不高等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法，包括以下步驟：

1）將蛹蟲草的純菌種接種到液體培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)得到萌發(fā)初期的液體菌種；

2）將搖床得到的液體菌種轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中，通入無菌空氣發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵菌種。

本發(fā)明提供的蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法，獲得的菌種活力高，菌球繁殖速度快，污染率低，從而提高了蛹蟲草子實體的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。

進(jìn)一步，所述步驟1）中的純菌種通過孢子彈射或組織分離后得到。

進(jìn)一步，所述步驟1）中的液體培養(yǎng)液按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.001份。

進(jìn)一步，所述步驟1）中的液體培養(yǎng)液按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。

進(jìn)一步，所述步驟2）中的發(fā)酵培養(yǎng)液按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯4.6-5份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.25-0.3份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.09-0.1份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.001份。

進(jìn)一步，所述步驟2）中的發(fā)酵培養(yǎng)液按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氫鉀0.1份，硫酸鎂0.1份，脫脂蠶蛹粉0.1份，水50份，維生素b10.001份。

進(jìn)一步，所述蛋白胨中總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。

進(jìn)一步，所述步驟1）中，以200r/min搖床培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為20-23℃。

進(jìn)一步，所述步驟2）中，通入無菌空氣培養(yǎng)5天，培養(yǎng)溫度為20-21℃。

進(jìn)一步，所述步驟2）中，在避光的環(huán)境下發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步，制備培養(yǎng)液所使用的水為礦泉水或蒸餾水，ph值為6-7。

本發(fā)明蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法可廣泛用于蛹蟲草的培育中，從而提高蛹蟲草子實體的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。

本發(fā)明提供一種培育蛹蟲草的方法，包括：將上述蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法制備的發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接至子實體培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

進(jìn)一步，將上述蛹蟲草液體發(fā)酵菌種的培育方法制備的發(fā)酵菌種轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基，放置到暗培室避光培養(yǎng)得到菌絲體，將菌絲體轉(zhuǎn)色，進(jìn)行子實體培養(yǎng)。

本發(fā)明采用搖床培養(yǎng)與發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合的方式，解決了背景技術(shù)存在的問題。并且，使用的培養(yǎng)液可提供最合適的碳氮比，營養(yǎng)更全面，使蟲草在發(fā)菌過程中發(fā)菌快、穩(wěn)定，減少菌種的退化，增強(qiáng)抵抗力。與采用傳統(tǒng)發(fā)菌方法和配方的培養(yǎng)液相比，本發(fā)明雜菌污染率降低了15%，后期蛹蟲草產(chǎn)量增加了10%-15%。

具體實施方式

在一個具體的實施方案中，實施步驟例如包括：配制搖瓶液體培養(yǎng)液及發(fā)酵罐發(fā)酵液，將固體菌種轉(zhuǎn)接到液體三角瓶培養(yǎng)基中，在20-23℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)2-3天得到液體菌種，將所述得到的液體菌種轉(zhuǎn)接到滅菌好的發(fā)酵罐中，在20-21℃發(fā)酵5天即可得到發(fā)酵菌種，將所述發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到子實體培養(yǎng)基上，放置到暗培室避光培養(yǎng)得到菌絲體，將菌絲體轉(zhuǎn)色、進(jìn)行子實體培養(yǎng)，即可得到高產(chǎn)、蟲草素含量高的子實體。

在蛹蟲草的液體菌種發(fā)酵方法中，不同階段按照不同的配方及不同方法進(jìn)行菌種的制作：將固體試管種轉(zhuǎn)接到液體搖床培養(yǎng)液中，通過一段時間的培養(yǎng)得到搖床液體菌種；將搖床液體菌種轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間得到發(fā)酵罐菌種；將發(fā)酵菌種進(jìn)行稀釋轉(zhuǎn)接到子實體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間見光，進(jìn)行子實體培養(yǎng)，即可得到污染率低、高產(chǎn)的蟲草子實體。通過不同的培養(yǎng)條件控制蛹蟲草菌種不同時期的生長特性，其中的發(fā)酵過程可使菌種穩(wěn)定、高效的繁殖和生長，因此其產(chǎn)量高，蟲草素含量高。

本發(fā)明的方法對蛹蟲草菌種的選擇沒有特別要求。

以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但這些內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領(lǐng)域的常規(guī)操作進(jìn)行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養(yǎng)基的組分購自北京奧博星。

實施例（發(fā)酵菌種）

第一步配制搖床培養(yǎng)液

液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。

具體操作如下：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補(bǔ)至1137ml，然后分別加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，脫脂蠶蛹粉2.0g，維生素b10.02g，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約280ml，將裝有液體三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，滅菌后取出放涼備用。

將滅菌放涼的三角瓶培養(yǎng)基放置于超凈工作臺上紫外線滅菌30min，再將試管固體菌種在無菌的環(huán)境下轉(zhuǎn)接到三角瓶液體培養(yǎng)液中，在22℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)3天得到液體菌種。

注：培養(yǎng)基的配制一定要嚴(yán)格控制質(zhì)量和數(shù)量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養(yǎng)得到更好的釋放，應(yīng)在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。

第二步配制發(fā)酵罐發(fā)酵液并滅菌

發(fā)酵罐液體培養(yǎng)液按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氫鉀0.1份，硫酸鎂0.1份，脫脂蠶蛹粉0.1份，水50份，維生素b10.001份。

具體操作如下：稱取馬鈴薯4800g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補(bǔ)至50升，然后分別加入1000g葡萄糖，蛋白胨250g，磷酸二氫鉀100g，硫酸鎂100g，脫脂蠶蛹粉100g，維生素b11g；溶解攪拌均勻倒至發(fā)酵罐中進(jìn)行高溫滅菌。

發(fā)酵罐滅菌流程：（本發(fā)酵罐用于液體菌種發(fā)酵）首先將發(fā)酵罐內(nèi)外膽的排氣閥門打開，確定內(nèi)外膽無壓力，然后關(guān)閉下閥門；在外膽中注入清水至外膽2/3處關(guān)閉上閥門，將配制好的溶液倒至發(fā)酵罐中；蓋好蓋子旋緊四周緊固螺母；開啟電源總開關(guān)；接通加熱電源加熱至125℃保溫15分鐘，按照順序開啟閥門，菌種輸出閥及下級閥；管道消毒二級閥、管道消毒一級閥、清潔空氣閥、一級過濾器排氣閥，最后開啟蒸汽閥門，保持15分鐘，注意各管道排放蒸汽的均勻性。按照順序再關(guān)閉各個閥門，先干燥一級過濾器，接通氣源，開一級過濾器排氣閥，開中間排氣閥，保持20分鐘，至在中間排氣閥手感干燥，關(guān)閉中間排氣閥，開二級過濾器閥門，保持20分鐘，至該閥門手感干燥，關(guān)閉閥門。關(guān)閉加熱電源，自然冷卻至100℃以下，此時內(nèi)膽壓力表顯示0.1mpa，開一分鐘一級過濾器排氣閥，隨后關(guān)閉該閥，開啟氣泵，打開氣源，清潔空氣閥，保持內(nèi)膽正壓0.05mpa。開啟熱水閥，再打開外膽的進(jìn)水閥，用冷水將熱水頂出，控制好水的流量，冷卻內(nèi)膽溶液至常溫18℃。

將加料口的火焰圈加入95%的酒精，并點燃，先少量開排氣閥，使壓力降至0.02mpa并保持，開加料口到剛松動并旋下，按照無菌操作放入附近的無菌盒子中，再將上述得到的液體菌種轉(zhuǎn)接到滅菌好的發(fā)酵罐料口，隨后按照無菌操作取出加料口，在火焰圈上消毒，蓋上旋緊，再開全上排氣閥。

第三步培養(yǎng)發(fā)酵菌種液

將接種好的稀釋罐菌液轉(zhuǎn)移到消毒好的避光培養(yǎng)間中，通好無菌空氣氣流量60l/min，培養(yǎng)溫度為21℃，發(fā)酵5天，即可得到發(fā)酵菌種。

所得發(fā)酵菌種經(jīng)過稀釋再轉(zhuǎn)接至子實體培養(yǎng)基上，再經(jīng)過培養(yǎng)轉(zhuǎn)色以及子實體培養(yǎng)得到污染率低、產(chǎn)量高的子實體。

對比例（搖制菌種）

配制搖床培養(yǎng)液

液體培養(yǎng)基按照重量份數(shù)計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。

具體操作如下：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補(bǔ)至1137ml，然后分別加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，脫脂蠶蛹粉2.0g，維生素b10.02g，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約280ml，將裝有液體三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，滅菌后取出放涼備用。

將滅菌放涼的三角瓶培養(yǎng)基放置于超凈工作臺上紫外線滅菌30min，再將試管固體菌種在無菌的環(huán)境下轉(zhuǎn)接到三角瓶液體培養(yǎng)液中，在22℃下以200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)8天得到液體菌種。

注：培養(yǎng)基的配制一定要嚴(yán)格控制質(zhì)量和數(shù)量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養(yǎng)得到更好的釋放，應(yīng)在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。

所得液體菌種經(jīng)過稀釋再轉(zhuǎn)接至子實體培養(yǎng)基上，再經(jīng)過培養(yǎng)轉(zhuǎn)色以及子實體培養(yǎng)得到子實體（該部分的操作與實施例相同）。

比較結(jié)果：菌種轉(zhuǎn)接至子實體培養(yǎng)基后，實施例的雜菌污染率相比對比例降低15%，實施例的后期產(chǎn)量相比對比例增加13%。

另外，相比較于搖床制作的液體菌種，發(fā)酵菌種比搖床菌種發(fā)的更快更均勻。比較在子實體上的發(fā)菌，發(fā)酵菌種6-7天即可發(fā)滿，搖床菌種則需要10-12天。比較轉(zhuǎn)色時間，發(fā)酵菌種接種的后期需要2天轉(zhuǎn)色，而搖床菌種接種的后期則需要4天轉(zhuǎn)色。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的科技人員本發(fā)明可以有更多改變和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)均包含在本發(fā)明內(nèi)。