本發(fā)明涉及Fe₂O₃納米粒子制備方法，具體涉及一種以膠原蛋白為生物礦化模板制備Fe₂O₃納米粒子的方法，屬于生物無(wú)機(jī)材料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物礦化是指生物體通過(guò)生物大分子的調(diào)控作用生成無(wú)機(jī)礦物質(zhì)的過(guò)程，它是鏈接無(wú)機(jī)與生物之間的橋梁。與一般礦化最大的不同在于，它是生物在特定的部位，在一定的物理化學(xué)條件下，在生物有機(jī)物質(zhì)的參與控制或影響下，將溶液中的離子轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟V物的過(guò)程。像骨骼，鱗片，牙齒等的形成都是自然界中比較常見(jiàn)的生物礦化過(guò)程。與工業(yè)生產(chǎn)條件不同，生物礦化不需要苛刻的條件，它是一個(gè)條件溫和、低耗能且無(wú)污染的物理化學(xué)過(guò)程。生物礦化采用了自然界中比較簡(jiǎn)單且常見(jiàn)的組分，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品從成核到結(jié)晶過(guò)程的調(diào)控。因此，探索并模仿生物礦化中無(wú)機(jī)物在生物分子調(diào)控下的礦化機(jī)理，能為制備具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性能的復(fù)合材料提供新的視角。

α型三氧化二鐵(α-Fe₂O₃)是一種很重要的金屬氧化物，由于其無(wú)毒，無(wú)環(huán)境污染，成本低廉等特點(diǎn)，在閃光涂料、塑料、電子材料以及生物醫(yī)學(xué)工程等方面都有廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)在已經(jīng)建立了α-Fe₂O₃納米材料的多種合成方法，包括：(1)使用三氯化鐵和草酸為原料首先合成氧化鐵的初級(jí)結(jié)構(gòu)，然后再通過(guò)高溫鍛燒合成中空的梭形和球形結(jié)構(gòu)α-Fe₂O₃；(2)使用三氯化鐵和四丁基漠化錢在堿性條件下，經(jīng)過(guò)后處理制備花狀α-Fe2O3納米結(jié)構(gòu)。這些方法有的需要在合成過(guò)程中添加有毒有害的化學(xué)試劑，有的需要經(jīng)過(guò)升溫去除溶劑或摸板等后處理才能得到產(chǎn)物，都相對(duì)比較復(fù)雜，并且存在耗時(shí)耗能和成本較高的缺點(diǎn)。同時(shí)，由于目前對(duì)α-Fe₂O₃納米顆粒形貌和尺寸可控性的基礎(chǔ)研究仍不夠系統(tǒng)和充分，因此為滿足不同需求，采用簡(jiǎn)單、易控、綠色環(huán)保的方法來(lái)調(diào)控α-Fe₂O₃納米顆粒的形貌和尺寸具有十分重要的意義。

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，幾乎分布在所有的組織器官中，它在哺乳動(dòng)物中含量高達(dá)總蛋白量的四分之一。膠原蛋白具有良好的生物相容性，生物降解性，吸收性以及促進(jìn)細(xì)胞形成等諸多功能，因此，在生物醫(yī)用材料、組織工程、化妝品、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明采用重組膠原蛋白作為生物模板，六水合三氯化鐵作為原料，通過(guò)水熱方法，制備了大小和形貌可控的α-Fe₂O₃納米材料。本發(fā)明在整個(gè)合成過(guò)程中無(wú)需添加任何其他化學(xué)試劑或進(jìn)行后處理，簡(jiǎn)單方便，易于操作，具有相當(dāng)?shù)目尚行院蛻?yīng)用價(jià)值，可為規(guī)?；a(chǎn)α-Fe₂O₃納米材料提供基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種以膠原蛋白為生物礦化模板制備Fe₂O₃納米粒子的方法，采用動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)膠原蛋白作為生物模板，六水合三氯化鐵作為原料，通過(guò)水熱方法，制備了大小和形貌可控的α-Fe₂O₃納米材料。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下技術(shù)方案：

一種以膠原蛋白為生物礦化模板制備Fe₂O₃納米粒子的方法，包括如下步驟：

(1)利用生物基因工程技術(shù)制備重組膠原蛋白

①、確定重組膠原蛋白的序列；

重組膠原蛋白的序列為：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，該重組膠原蛋白具備良好的三重螺旋結(jié)構(gòu)，熱變溫度接近37℃；具有整合素的結(jié)合位點(diǎn)GERGFPGERGVE，可以與細(xì)胞很好的粘附；具有肝素的結(jié)合位點(diǎn)GRPGKRGKQGQK，可以與肝素結(jié)合；

②、合成編碼重組膠原蛋白的核酸；

合成編碼步驟①重組膠原蛋白的核酸，構(gòu)建導(dǎo)入上述核酸的質(zhì)粒，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3菌株；

③、重組膠原蛋白的制備與純化；

將冰凍在-80℃的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中融化，將感受態(tài)細(xì)胞與3-5ul質(zhì)粒混合，混合體在冰浴中30min后再放入42℃水浴中90s，然后再放入冰浴中2min；在上述混合體中加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，再放置于37℃恒溫?fù)u床中1hrs，然后在4℃，4000rpm條件下離心20min，棄去上層清液；使細(xì)菌在剩余培養(yǎng)液中重新懸浮后，將培養(yǎng)液均勻涂布到37℃的AMP培養(yǎng)平板上，置于37℃恒溫?fù)u床中過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落放入100ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床過(guò)夜進(jìn)行增菌培養(yǎng)；將100ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌倒入1L LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；待OD值達(dá)到0.8-1范圍，將搖床溫度調(diào)為25℃，加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，恒溫過(guò)夜培養(yǎng)；

將上述蛋白已表達(dá)的細(xì)菌在低溫離心機(jī)中離心，使菌體與培養(yǎng)基分離，離心條件：12000rpm，4℃，離心1.0-3.0min；將離心后的菌體用A緩沖液溶解，A緩沖液為20mM咪唑，20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH為7.4；將細(xì)菌懸濁液放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行細(xì)胞破碎，即可釋放出蛋白并且蛋白會(huì)溶于A緩沖液中；超聲時(shí)需將細(xì)菌懸濁液放于冰浴中，以防溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白變性；將破碎完的懸濁液再次離心，使細(xì)胞碎片與蛋白溶液分離，離心條件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，此即為粗蛋白溶液；將粗蛋白過(guò)濾后，通過(guò)液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化；后經(jīng)凍干，得到白色絮狀固體；此固體放于-20℃冰箱保存，使用時(shí)通過(guò)稱重法標(biāo)定濃度。

(2)α-Fe₂O₃納米材料的制備

①、重組膠原蛋白與六水合三氯化鐵均勻混合溶液的配制；

在1ml水中加入1-50mg六水合三氯化鐵和0-10mg膠原蛋白固體，混合均勻，緩慢攪拌5-90min后，得到淡黃色透明且均勻的液體；

②、利用水熱反應(yīng)釜制備納米級(jí)α-Fe₂O₃；

將所得混合液倒入5ml水熱反應(yīng)釜中，放入馬弗爐內(nèi)以3-18℃/min的速度升溫至120-200℃，并在該溫度下反應(yīng)1-15hrs；

③、純化并干燥保存制備的納米材料；

待水熱反應(yīng)釜冷卻到室溫后，將產(chǎn)物通過(guò)離心分離，離心條件為1200r，棄去上清液，留下固體；并用去離子水分散固體，再離心純化3-5次，在50-80℃恒溫干燥箱中干燥。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟③純化后得到的重組膠原蛋白的純度達(dá)到95％以上。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述的膠原蛋白固體加入量為0.1-5mg，膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-0.5wt％。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述的六水合三氯化鐵固體加入量為2.7-27mg，鐵(III)的濃度分布從0.01到0.1mol/L。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述的六水合三氯化鐵和膠原蛋白混合液緩慢攪拌時(shí)間為20-50min。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述的混合液在馬弗爐內(nèi)以3-10℃/min的速度升溫至140-180℃，并在該溫度下反應(yīng)6-12hrs。

本發(fā)明公開(kāi)的一種以膠原蛋白為生物礦化模板制備Fe₂O₃納米粒子的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：在整個(gè)合成過(guò)程中無(wú)需添加任何其他化學(xué)試劑或進(jìn)行后處理，簡(jiǎn)單方便，易于操作，具有相當(dāng)?shù)目尚行院蛻?yīng)用價(jià)值，可為規(guī)模化生產(chǎn)α-Fe₂O₃納米材料提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為制備的α-Fe₂O₃納米材料的粉末X射線多晶衍射(XRD)圖；

圖2為制備的α-Fe₂O₃納米材料的X射線光電子能譜(XPS)圖；

圖3為制備的α-Fe₂O₃納米材料的熱重分析(TGA)圖；

圖4為制備的α-Fe₂O₃納米材料的掃描電鏡，透射電鏡，電子衍射以及能量散射X射線分析圖；

圖5為不同濃度的重組膠原蛋白對(duì)α-Fe₂O₃納米顆粒結(jié)構(gòu)的影響；

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

如圖1-圖5所示，一種以膠原蛋白為生物礦化模板制備Fe₂O₃納米粒子的方法，包括如下步驟：

(1)利用生物基因工程技術(shù)制備重組膠原蛋白

①、確定重組膠原蛋白的序列；

重組膠原蛋白的序列為：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，該重組膠原蛋白具備良好的三重螺旋結(jié)構(gòu)，熱變溫度接近37℃；具有整合素的結(jié)合位點(diǎn)GERGFPGERGVE，可以與細(xì)胞很好的粘附；具有肝素的結(jié)合位點(diǎn)GRPGKRGKQGQK，可以與肝素結(jié)合；

②、合成編碼重組膠原蛋白的核酸；

合成編碼步驟①重組膠原蛋白的核酸，構(gòu)建導(dǎo)入上述核酸的質(zhì)粒，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3菌株；

③、重組膠原蛋白的制備與純化；

將冰凍在-80℃的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中融化，將感受態(tài)細(xì)胞與3-5ul質(zhì)?；旌?，混合體在冰浴中30min后再放入42℃水浴中90s，然后再放入冰浴中2min；在上述混合體中加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，再放置于37℃恒溫?fù)u床中1hrs，然后在4℃，4000rpm條件下離心20min，棄去上層清液；使細(xì)菌在剩余培養(yǎng)液中重新懸浮后，將培養(yǎng)液均勻涂布到37℃的AMP培養(yǎng)平板上，置于37℃恒溫?fù)u床中過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落放入100ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床過(guò)夜進(jìn)行增菌培養(yǎng)；將100ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌倒入1L LB培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；待OD值達(dá)到0.8-1范圍，將搖床溫度調(diào)為25℃，加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，恒溫過(guò)夜培養(yǎng)；

將上述蛋白已表達(dá)的細(xì)菌在低溫離心機(jī)中離心，使菌體與培養(yǎng)基分離，離心條件：12000rpm，4℃，離心1.0-3.0min；將離心后的菌體用A緩沖液溶解，A緩沖液為20mM咪唑，20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，pH為7.4；將細(xì)菌懸濁液放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行細(xì)胞破碎，即可釋放出蛋白并且蛋白會(huì)溶于A緩沖液中；超聲時(shí)需將細(xì)菌懸濁液放于冰浴中，以防溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白變性；將破碎完的懸濁液再次離心，使細(xì)胞碎片與蛋白溶液分離，離心條件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，此即為粗蛋白溶液；將粗蛋白過(guò)濾后，通過(guò)液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化；后經(jīng)凍干，得到白色絮狀固體；此固體放于-20℃冰箱保存，使用時(shí)通過(guò)稱重法標(biāo)定濃度。

(3)α-Fe₂O₃納米材料的制備

①、重組膠原蛋白與六水合三氯化鐵均勻混合溶液的配制；

在1ml水中加入1-50mg六水合三氯化鐵和0-10mg膠原蛋白固體，混合均勻，緩慢攪拌5-90min后，得到淡黃色透明且均勻的液體；

②、利用水熱反應(yīng)釜制備納米級(jí)α-Fe₂O₃；

將所得混合液倒入5ml水熱反應(yīng)釜中，放入馬弗爐內(nèi)以3-18℃/min的速度升溫至120-200℃，并在該溫度下反應(yīng)1-15hrs；

③、純化并干燥保存制備的納米材料；

待水熱反應(yīng)釜冷卻到室溫后，將產(chǎn)物通過(guò)離心分離，離心條件為1200r，棄去上清液，留下固體；并用去離子水分散固體，再離心純化3-5次，在50-80℃恒溫干燥箱中干燥。

其中，步驟③純化后得到的重組膠原蛋白的純度達(dá)到95％。

其中，步驟(2)中所述的膠原蛋白固體加入量為1mg，膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1wt％。

其中，步驟(2)中所述的六水合三氯化鐵固體加入量為16mg，鐵(III)的濃度分布從0.06mol/L。

其中，步驟(2)中所述的六水合三氯化鐵和膠原蛋白混合液緩慢攪拌時(shí)間為30min。

其中，步驟(2)中所述的混合液在馬弗爐內(nèi)以5℃/min的速度升溫至160℃，并在該溫度下反應(yīng)10hrs。

以上所述為本發(fā)明的一個(gè)示范性實(shí)施案例的細(xì)節(jié)。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中根據(jù)具體的制備條件可以有各種更改和變化，并不用于限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。