專利名稱：生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用動物軟骨生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和骨鈣粉的制備方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate, CS)是由葡萄糖醒酸(GlcA)和不同硫酸化取代的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)組成的長鏈生物大分子聚合物，屬于糖胺聚糖類物質，廣泛存在于豬、牛、羊、鱷魚 、鯊魚等軟骨組織中。具有降血脂、抗腫瘤、抗衰老、治療關節(jié)炎及神經痛等作用，是藥品、食品、化妝品、保健品等領域重要的生化原料。蛋白胨主要作為微生物的培養(yǎng)基，是重要的生化試劑。膠原肽易于消化吸收，具有保護胃粘膜，防止胃潰瘍，促進鈣吸收，防治骨質疏松，促進皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，以及降低血清中膽固醇含量等多方面的生理功能，是食品、醫(yī)藥領域重要的添加劑，市場需求量不斷增加，應用前景廣闊。利用各種動物來源的軟骨為原料，單一生產不同結構的硫酸軟骨素越來越不適應當今社會發(fā)展要求，如何高效利用生物資源、降低環(huán)境污染并提高軟骨的綜合利用率，已經成為社會關注的熱點話題。鑒于軟骨中含有較高的硫酸軟骨素、蛋白、膠原肽及活性鈣等成分，充分利用各種活性成分并分別制成純度較高的系列產品，可以明顯提高軟骨在食品、醫(yī)藥領域的應用價值。在動物軟骨資源利用發(fā)面，天津科技大學陳寧(專利申請?zhí)?200410072346.9)以及南京工業(yè)大學楊文革等(專利申請?zhí)?201110098394.5)曾采用酶法提取硫酸軟骨素，雖然解決了堿法生產硫酸軟骨素易造成生產周期長、產品質量差和環(huán)境污染等弊端，但沒有同時解決蛋白和膠原肽產品回收技術問題；日照眾山生物科技有限公司(專利申請?zhí)?200710113240.2)雖采用酶法和超濾技術獲得硫酸軟骨素，但也缺乏回收蛋白和膠原肽工藝技術；浙江澳興生物科技有限公司(專利申請?zhí)?200910154187.X)雖報導了從鯊魚中提取鯊魚軟骨素方法，但沒有綜合利用鯊魚膠原蛋白和鯊魚骨鈣；青島大學高華等(專利申請?zhí)?200610043357.3)曾采用酶法從軟骨中連續(xù)提取硫酸軟骨素和蛋白，但由于采用大量乙醇沉淀工藝、造成成本高，且沒有解決回收膠原肽及軟骨鈣技術問題；上海阿敏生物技術有限公司(專利申請?zhí)?200710040969.1)采用酶法從牛骨中聯(lián)產膠原蛋白和硫酸軟骨素，但沒有進一步回收骨中活性鈣；郭秀明和曹榮軍雖采用復合酶法生產動物軟骨鈣粉、軟骨素和膠原蛋白的技術(專利申請?zhí)?200610044758.0和201010258319.6)，但采用乙醇沉淀技術，且不能將蛋白胨和膠原肽有效分離，生產周期長且成本高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用動物軟骨生產硫酸軟骨素并聯(lián)產膠原肽、蛋白胨和軟骨鈣粉的提取制備方法，解決硫酸軟骨素制備過程中的膠原肽及軟骨鈣回收，以及生產周期長且成本高等問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是:一種生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，將動物軟骨粉碎、酶解、分離得到清液和沉淀(骨渣)；清液經過脫鹽、脫色、脫腥、超濾分離、濃縮和噴霧干燥，分別獲得硫酸軟骨素、蛋白胨和膠原肽；沉淀經過洗滌、氧化脫色、干燥和粉碎得到軟骨鈣粉。具體工藝步驟如下:(I)將動物軟骨進行粉碎，粒度為20-60目，加入純化水和氯化鈉攪拌均勻，并升溫到75-95 °C預處理0.5-2小時；(2)將步驟(I)中料液冷卻，利用氫氧化鈉將其調節(jié)pH值6.5-9.0，用復合蛋白酶進行酶解，酶解溫度為48-55°C，酶解時間為4-12h ；其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶(膠原酶)混合而成，各自的含量范圍分別占動物軟骨干重的0.5%-1.0%、0.5%-1.0%和1.0-2.0% ；(3)將步驟⑵中的料液pH值調至4.0-6.5，在80_90°C加熱將酶滅活30-60分鐘； (4)將步驟(3)中的料液分離，分別獲得清液和沉淀(骨渣)；(5)將步驟(4)中的清液進行超濾分離，得到超濾內液和超濾外液，超濾外液為含有膠原肽的水溶液，超濾內液為含有硫酸軟骨素和蛋白胨的水溶液，超濾外液經納濾脫鹽濃縮后，再經精制和噴霧干燥，得到膠原肽；(6)向步驟(5)中超濾內液加入食品級酒精，至酒精最終體積濃度為60-80%，靜置2-6小時得到沉淀，得到沉淀和上清液，沉淀經氧化(H2O2)脫色后，無水乙醇脫水，經減壓干燥得到硫酸軟骨素；上清液經濃縮后，噴霧干燥得到蛋白胨。在步驟(I)中，動物軟骨重量與加入純化水的體積比例是1:3-8 (W/V)，加入氯化鈉的量為動物軟骨重量的1%_3% (W/W)。在步驟(2)中，復合蛋白酶的加酶量為動物軟骨干重的0.3-3% (ff/ff)o在步驟(3)中，所述的料液在滅酶前，需要調整pH值至4.0-6.5。在步驟(4)中，所述的料液分離為離心分離或過濾分離。在步驟(4)中，所述的沉淀(骨渣)經過純水洗滌、氧化脫色(H202)、干燥和粉碎，獲得軟骨鈣粉。在步驟(5)中，所述的超濾分離為超濾膜分離或樹脂分離，超濾膜分離所用膜截留分子量為10kD-30kD。在步驟(5)中，所述的精制，是指通過納濾脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥獲得不同分子量膠原肽。在步驟￠)中，所述的上清液中含有酒精和蛋白胨，經過減壓濃縮蒸餾，回收酒精后，殘余物經噴霧干燥得到蛋白胨。本發(fā)明的優(yōu)點在于:1、本發(fā)明通過采用生物酶解并結合納濾、超濾和噴霧干燥等先進產業(yè)化技術，可以連續(xù)分離獲得軟骨素、蛋白胨、膠原肽及軟骨鈣，該聯(lián)產工藝比單產工藝設備利用率高，節(jié)約能源和輔料，顯著降低生產成本。2、本發(fā)明利用生物酶法制備系列生物產品，條件溫和，能耗低，產品純度高、質量
穩(wěn)定可靠。3、本發(fā)明生產出的硫酸軟骨素各項指標均符合最新國家標準、美國標準和歐洲標準，硫酸軟骨素含量高達98%以上。
4、本發(fā)明制備的膠原肽的分子量為300-3000道爾頓，容易被人體吸收利用。5、本發(fā)明實現(xiàn)了軟骨資源的高效綜合利用，極大地減少廢水排放和環(huán)境污染問題。6、本發(fā)明從動物軟骨中連續(xù)大量獲得硫酸軟骨素、蛋白胨、膠原肽和骨軟骨鈣粉，可以進行噸級規(guī)模的產業(yè)化生產運行，技術可靠、產品質量穩(wěn)定，實現(xiàn)了動物骨類資源的高效利用。經過專利檢索，目前國內外還沒有該類工藝技術應用于工業(yè)化生產。


圖1為本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素的紅外光譜圖；圖2為本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素二糖組成分析HPLC譜圖；圖3為本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素醋酸纖維素膜電泳圖；圖4為本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素多角激光散射儀分子量分析圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1將IOOkg鯊魚軟骨(包括鯊翅骨、鯊脊椎骨和鯊頭骨)粉碎，粒度為20目，加入500kg純化水，加入氯化鈉3kg，升溫到90°C，保持0.5小時，降溫至51°C，利用氫氧化鈉將其pH調整至8.5，然后加入3kg的復合蛋白酶(其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶混合而成，各自的含量分別為軟骨干重的0.5%、0.5%和1%)，在51°C下攪拌酶解8h，利用鹽酸將料液調整至pH = 4.5，升溫到90°C滅酶30min，過濾分離后得到骨渣和清液，骨渣經純水洗滌、氧化脫色(H202)、干燥和粉碎后得到軟骨鈣粉。清液經20kD超濾膜分離，獲得膠原肽溶液和粗硫酸軟骨素溶液。膠原肽溶液經過納濾(截留分子量300Da)脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥，獲得無腥味的膠原肽(分子量1.2-2.8kD)。粗軟骨素溶液加入食品級酒精至酒精最終體積濃度為70%，靜置2-4小時得到沉淀，經無水乙醇沉淀得到硫酸軟骨素粗品，該粗品經過進一步氧化(H2O2)脫色后，無水乙醇脫水，減壓干燥獲得精品鯊魚硫酸軟骨素(分子量25-65kD)。將上述體積濃度為70%的酒精沉淀后上清液進行減壓濃縮回收酒精，殘余物經過噴霧干燥得到鯊魚蛋白胨。實施例2將IOOkg牛軟骨(包括牛鼻骨和牛喉管)粉碎，粒度為60目，加入500kg純化水，力口入氯化鈉1kg，升溫到80°C，保持I小時，降溫至48°C，利用氫氧化鈉將其pH調整至8.5，然后加入2kg的復合蛋白酶(其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶混合而成，各自的含量為軟骨干重的0.5%，0.5%和1.0%)，在48°C下攪拌酶解6h，利用鹽酸將料液PH調整至6.0,升溫到90°C滅酶40min，過濾分離后得到骨渣和清液，骨渣經純水洗滌、氧化脫色(H202)、干燥和粉碎后得到高骨鈣粉。清液經IOkD超濾膜分離，獲得膠原肽溶液和粗硫酸軟骨素溶液。膠原肽溶液經過納濾(截留分子量300Da)脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥，獲得牛膠原肽(分子量1.8-7.2kD)。粗軟骨素溶液加入食品級酒精至酒精最終體積濃度為 70%， 靜置3-5小時得到沉淀，經無水乙醇沉淀得到硫酸軟骨素粗品，該粗品經過進一步氧化(H2O2)脫色后，無水乙醇脫水，減壓干燥獲得牛硫酸軟骨素(分子量15-35kD)。將上述體積濃度為70%的酒精沉淀后上清液進行減壓濃縮回收酒精，殘余物經過噴霧干燥得到牛蛋白胨。實施例3將IOOkg鯊魚軟骨(包括鯊翅骨、鯊脊椎骨和鯊頭骨)粉碎，粒度為40目，加入600kg純化水，加入氯化鈉2kg，升溫到95°C，保持0.5小時，降溫至55°C，利用氫氧化鈉將其pH調整至7.5，然后加入2.5kg的復合蛋白酶(其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶混合而成，各自的含量分別為軟骨干重的1.0%，0.5%和1.5%)，在55°C下攪拌酶解4h，利用鹽酸將料液調整至pH = 5.0，升溫到80°C滅酶60min，過濾分離后得到骨渣和清液，骨渣經純水洗滌、氧化脫色(H202)、干燥和粉碎后得到軟骨鈣粉。清液經20kD超濾膜分離，獲得膠原肽溶液和粗硫酸軟骨素溶液。膠原肽溶液經過納濾(截留分子量300Da)脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥，獲得無腥味的膠原肽(分子量0.7-2.2kD)。粗軟骨素溶液加入食品級酒精至酒精最終體積濃度為60%，靜置2-4小時得到沉淀，經無水乙醇沉淀得到硫酸軟骨素粗品，該粗品經過進一步氧化(H2O2)脫色后，無水乙醇脫水，減壓干燥獲得精品鯊魚硫酸軟骨素(分子量37-65kD)。將上述體積濃度為60%的酒精沉淀后上清液進行減壓濃縮回收酒精，殘余物經過噴霧干燥得到鯊魚蛋白胨。實施例4將IOOkg牛軟骨(包括牛鼻骨和牛喉管)粉碎，粒度為20目，加入400kg純化水，力口入氯化鈉2kg，升溫到75°C，保持2小時，降溫至50°C，利用氫氧化鈉將其pH調整至9.0，然后加入2kg的復合蛋白酶(其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶混合而成，各自的含量分別為軟骨干重的0.5%，1%和1%)，在48°C下攪拌酶解12h，利用鹽酸將料液PH調整至5.5，升溫到85°C滅酶30min，過濾分離后得到骨渣和清液，骨渣經純水洗滌、氧化脫色(H2 02)、干燥和粉碎后得到高骨鈣粉。清液經IOkD超濾膜分離，獲得膠原肽溶液和粗硫酸軟骨素溶液。膠原肽溶液經過納濾(截留分子量300Da)脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥，獲得牛膠原肽(分子量0.6-13kD)。粗軟骨素溶液加入食品級酒精至酒精最終體積濃度為80%，靜置3-5小時得到沉淀，經無水乙醇沉淀得到硫酸軟骨素粗品，該粗品經過進一步氧化(H2O2)脫色后，無水乙醇脫水，減壓干燥獲得牛硫酸軟骨素(分子量12-35kD)。將上述體積濃度為80%的酒精沉淀后上清液進行減壓濃縮回收酒精，殘余物經過噴霧干燥得到牛蛋白胨。上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設計構思并不局限于此，凡利用此構思對本發(fā)明進行非實質性的改動，均應屬于侵犯本發(fā)明保護范圍的行為。從圖1可看出，在3506CHT1處為多糖類物質0_H伸縮振動，2908(^1處為糖環(huán)C-H鍵的伸縮振動:1652(31^1為葡萄糖醛酸中C=O伸縮振動，1563CHT1為氨基半乳糖中N-H彎曲振動，HHcnT1和1375CHT1處為羧基C-O伸縮振動和羥基O-H變角振動峰，1067cm^和1131CHT1為糖環(huán)內醚C-O-C伸縮振動峰:1256(^1處為硫酸酯基中S=O伸縮振動峰，823CHT1為糖分子中乙酰氨基半乳糖C6位羥基被硫酸基取代C6-O-S伸縮振動峰，表明該多糖是硫酸軟骨素C。從圖2可知，硫酸軟骨素經過軟骨素酶ABC (EC4.2.2.4)完全降解后，經HPLC分析(色譜柱Agilent XDB-C18柱)，產物主要含有3個組分，經過與標準品比較證明，21.92min為不飽和葡萄糖醛酸(AUA)與6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc6S)組成的二糖(AUA-GalNAc6S，即Λ Di_6S) ；23.22min為不飽和葡萄糖醛酸與4-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc4S)組成的二糖(Λ UA_GalNAc4S，即Λ Di_4S) ；29.97min為不飽和2-硫酸葡萄糖糖醛酸(AUA2S)與6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc6S)組成的二糖(AUA2S-GalNAc6S，即AD1-2S6S)。AD1-2S6S是鯊魚硫酸軟骨素中特有的二糖成分，硫酸軟骨素C中Λ D1-6S含量較高，而硫酸軟骨素A中Λ D1-4S含量較高，通過計算它們之間的比例，可以確定原料來源。圖3為本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素C與其他來源制備的結構不同的硫酸軟骨素(CSD為鯊魚頭骨純化的硫酸軟骨素D; CSA為從豬軟骨制備的硫酸軟骨素A ；CSC為Sigma公司鯊魚硫酸軟骨素C標準品；HP為豬內腸肝素；CSB為豬皮中制備的硫酸軟骨素B)電泳分析結果。從圖3中可以看出，本發(fā)明制備的硫酸軟骨素(Shark)純度高，且電泳遷移率和Sigma公司產品一直，表明為S魚硫酸軟骨素C。從圖4可以看出，本發(fā)明制備的鯊魚硫酸軟骨素純度較高，經過多角激光散射儀分析，其絕對峰位分子量為5.2萬道爾頓，其分布范圍是3.7-6.5萬道爾頓。本發(fā)明制備的鯊魚膠原肽氨基酸組成和相對比例見表I。從表I數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明的鯊魚軟骨來源的膠原肽中甘氨酸含量最高(20.12%)，丙氨酸次之(14.19%)，且脯氨酸含量達11.5%，表明其為膠原物質。表I鯊魚膠原肽氨基 酸組成分析結果
權利要求
1.一種生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于，將動物軟骨粉碎、酶解、分離得到清液和沉淀；清液經過脫鹽、脫色、脫腥、超濾分離、濃縮和噴霧干燥，分別獲得硫酸軟骨素、蛋白胨和膠原肽；沉淀經過洗滌、氧化脫色、干燥和粉碎得到軟骨鈣粉；具體工藝步驟如下: (1)將動物軟骨進行粉碎，加入純化水和氯化鈉攪拌均勻，并升溫到75-95°C預處理0.5-2小時； (2)將步驟⑴中料液冷卻，利用氫氧化鈉將其調節(jié)pH值6.5-9.0，用復合蛋白酶進行酶解，酶解溫度為48-55°C，酶解時間為4-12h ； 其中，復合蛋白酶為胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和膠原蛋白水解酶混合而成，各自的含量范圍分別占動物軟骨干重的0.5%-1.0%、0.5%-1.0%和1.0-2.0% ； (3)將步驟⑵中的料液pH值調至4.0-6.5，在80-90°C加熱將酶滅活30-60分鐘； (4)將步驟(3)中的 料液分離，分別獲得清液和沉淀； (5)將步驟(4)中的清液進行超濾分離，得到超濾內液和超濾外液，超濾外液為含有膠原肽的水溶液，超濾內液為含有硫酸軟骨素和蛋白胨的水溶液，超濾外液經納濾脫鹽濃縮后，再經精制和噴霧干燥，得到膠原肽； (6)向步驟(5)中超濾內液加入食品級酒精，至酒精最終體積濃度為60-80%，靜置2-6小時得到沉淀，得到沉淀和上清液，沉淀經氧化脫色后，無水乙醇脫水，經減壓干燥得到硫酸軟骨素；上清液經濃縮后，噴霧干燥得到蛋白胨。
2.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(I)中，動物軟骨重量與加入純化水的體積比例是1:3-8，加入氯化鈉的量為動物軟骨重量的1%_3%。
3.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(2)中，復合蛋白酶的加酶量為動物軟骨干重的0.3-3%。
4.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(3)中，所述的料液在滅酶前，用鹽酸調整pH值至40-65。
5.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(4)中，所述的料液分離為離心分離或過濾分離。
6.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(4)中，所述的沉淀經過純水洗滌、氧化脫色、干燥和粉碎，獲得軟骨鈣粉。
7.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(5)中，所述的超濾分離為超濾膜分離或樹脂分離，超濾膜分離所用膜截留分子量為10kD-30kD。
8.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟(5)中，所述的精制，是指通過納濾脫鹽后，采用活性炭脫色、離子交換樹脂除腥，超濾分離濃縮后噴霧干燥獲得不同分子量膠原肽。
9.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:在步驟￠)中，所述的上清液中含有酒精和蛋白胨，經過減壓濃縮蒸餾，回收酒精后，殘余物經噴霧干燥得到蛋白胨。
10.根據(jù)權利要求1所述生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和軟骨鈣粉的方法，其特征在于:動物軟骨進行粉 碎的粒度為20-60目。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用動物軟骨生產硫酸軟骨素并聯(lián)產蛋白胨、膠原肽和骨鈣粉的制備方法，屬于生物技術領域。該方法的步驟為，將動物軟骨粉碎、酶解、分離得到清液和沉淀；清液經過脫鹽、脫色、脫腥、超濾分離、濃縮和噴霧干燥，分別獲得硫酸軟骨素、蛋白胨和膠原肽；沉淀經過洗滌、氧化脫色、干燥和粉碎得到軟骨鈣粉。本發(fā)明工藝的特點是連續(xù)獲得蛋白胨、膠原肽、硫酸軟骨素和軟骨鈣粉，實現(xiàn)了動物軟骨資源的高效利用，不僅降低了生產成本，也減少了廢液、廢渣的產生及環(huán)境的污染，該技術可以實現(xiàn)產業(yè)化。本發(fā)明解決硫酸軟骨素制備過程中的膠原肽及軟骨鈣回收，以及生產周期長且成本高等問題。
文檔編號C01B25/42GK103114116SQ201310027690
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權日2013年1月24日
發(fā)明者林麗艷 申請人:林麗艷