專利名稱：：一種糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變的檢測方法及其專用芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因分析領(lǐng)域中一種鑒別糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑盒。技術(shù)背景糖尿病作為困擾人類身心健康的一類重大疾病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織指出，2025年全世界將出現(xiàn)3.8億名糖尿病患者。在我國糖尿病發(fā)病率已達(dá)到2%，確診的糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到4000萬人，患者總數(shù)已躋身世界第二位，并以每年100萬的速度遞增。對于確診的糖尿病患者，目前最有效的治療方法就是藥物降糖治療。目前臨床上常用的糖尿病治療藥物如下表所示表l類別代表藥物磺脲類藥物甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、格列本脲、格列吡嗪、格列齊特雙胍類藥物二甲雙胍胰島素增敏劑曲格列酮、羅格列酮促胰島素分泌劑瑞格列奈、那格列奈a-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖、伏格列波糖其他胰島素、中成藥在糖尿病的藥物治療過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)藥物反應(yīng)的個體差異現(xiàn)象，表現(xiàn)為對同一種類和同一劑量的降糖藥物，有的人服用后效果很好，對有的人卻根本沒有作用，有的甚至還會出現(xiàn)毒副作用，這直接導(dǎo)致了大約有30%的糖尿病患者沒有獲得預(yù)期的藥物治療效果，給他們的生命健康帶來了不同程度的危害，增加不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。藥物反應(yīng)個體差異是臨床上極其普遍的現(xiàn)象，產(chǎn)生這種差異的原因有許多，包括性別、年齡、體重、疾病狀況在內(nèi)的多種因素都可以導(dǎo)致不同病人對同一種藥物的反應(yīng)出現(xiàn)量與質(zhì)的差別，然而近20多年來的遺傳藥理學(xué)研究結(jié)果表明其中最重要、最根本的因素是遺傳因素，即藥物代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體(藥物作用靶點(diǎn))的基因多態(tài)性導(dǎo)致了其編碼蛋白的功能改變，進(jìn)一步使血藥濃度和藥物敏感性顯著不同，也就是說，遺傳變異導(dǎo)致了藥物反應(yīng)的個體差異。遺傳變異中最常見的類型是基因突變，經(jīng)過長期的觀察與研究，目前已發(fā)現(xiàn)有許多基因突變與人體對糖尿病治療藥物的反應(yīng)性有關(guān)，這些發(fā)生突變的基因稱為糖尿病藥物治療相關(guān)基因，基因突變的發(fā)生頻率和功能意義在不同的種族間存在著較大的差異，目前已發(fā)現(xiàn)的在亞洲人中常見的糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變及其相關(guān)藥物概括如下表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>rs5219KCNJ11G>A50%磺脲類降糖藥、二甲雙胍rsl2255372TCF7L2G>T2%磺脲類降糖藥、二甲雙胍在傳統(tǒng)的診療模式下，臨床醫(yī)師開處方通常只能憑借他的個人經(jīng)驗(yàn)，對癥選擇某種藥物并估計大致的用藥劑量，但是藥物的種類和劑量是否適合每個不同的患者則不為可知。利用各種基因分型技術(shù)對上述基因突變進(jìn)行檢測，臨床醫(yī)生可以根據(jù)糖尿病患者的上述基因型資料選擇合適的給藥方案，從而提高藥物的療效和降低藥物的毒副反應(yīng)，同時減輕病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對基因型進(jìn)行檢測的方法有很多，最常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR—RFLP法)、序列特異性PCR、手工或自動測序等方法，這些方法不僅操作繁瑣、檢測周期長、無法做到高通量，而且影響檢測結(jié)果的因素眾多，不易控制，難以滿足臨床實(shí)際檢測的要求，目前只在科研領(lǐng)域進(jìn)行。要在臨床進(jìn)行大樣本高通量的基因檢測，目前最理想的方法是基因芯片技術(shù)，與其他技術(shù)相比較，基因芯片具有體積小、重量輕、成本低，便于攜帶，防污染，分析過程高通量、高度自動化和速度快，所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來該種技術(shù)得到了人們的極大關(guān)注并取得了迅速發(fā)展，并有多個基于基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因突變檢測的產(chǎn)品問世。目前用于突變檢測的大多是序列特異性探針雜交法(SSOP)基因芯片技術(shù)，該種技術(shù)利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特點(diǎn)，對發(fā)生突變的眾多基因設(shè)計序列特異性的寡核苷酸探針，將這些探針固定于同一張基片上，將待測的包含突變位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行體外擴(kuò)增后與芯片雜交，根據(jù)雜交的信號判斷突變位點(diǎn)的基因型。這種方法的基本原理是與基因特定序列互補(bǔ)的一段序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)對基因序列的特異性識別。當(dāng)探針的序列與基因序列完全匹配時所形成的雜交體熱穩(wěn)定性高于含有錯配堿基的雜交體，據(jù)此通過控制雜交溫度和其他雜交條件可以使完全匹配的雜交體與含有錯配堿基的雜交體區(qū)分開來，從而達(dá)到基因分型的目的。上述芯片技術(shù)盡管從理論上可以利用含有錯配堿基的探針和目標(biāo)基因形成的雜合體穩(wěn)定性差的現(xiàn)象對基因序列上的堿基變化進(jìn)行檢測，但是往往由于堿基錯配形式不同、基因序列不同、基因高級結(jié)構(gòu)的差異等因素造成實(shí)際情況比理論情況要復(fù)雜得多，為了提高探針對單個堿基變化的檢測準(zhǔn)確率，一般傾向于把探針設(shè)計的較短，但是為了保證探針對基因識別的特異性和維持較高的雜交信號強(qiáng)度又不能使探針過短，而且即使是相同長度的探針也會由于其GC含量不同、所檢測的突變堿基在探針上的相對位置不同等原因使得這種基于探針雜交的過程變得十分復(fù)雜，短探針與靶序列的雜交特異性問題這時候就變得非常突出，具體的表現(xiàn)就是野生型探針和突變型探針在雜交時都會出現(xiàn)非特異性的雜交信號，無法做到檢測信號的"全或無"，必須嚴(yán)格控制雜交條件并反復(fù)摸索才能夠準(zhǔn)確地區(qū)分基因型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述基因突變檢測中存在的問題，提供一種利用基因芯片技術(shù)對糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變進(jìn)行快速、敏感、特異性檢測的方法及其專用芯片和試劑合xm。本發(fā)明所提供的對糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變進(jìn)行檢測的方法，是以待檢測的來自于人體組織的基因組為模板，用針對特定突變位點(diǎn)設(shè)計的引物組和沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片上的等位基因特異性探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定各糖尿病藥物治療相關(guān)基因的突變類型。所述的多重PCR擴(kuò)增可以在一管中進(jìn)行，也可以分為多管進(jìn)行多管多重PCR反應(yīng)。本發(fā)明所涉及的糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)包括CYP2C9*3-I359L(rsl057910)、CYP2C19*2a-I331V(rs3758581)、CYP2C19*2b-E92D(rsl7878459)、CYP2C19*3-W212X(rs4986893)、SLC01B1-V174A(rs4149056)、SLC022A1-P283L(rs4646277)、SLC022A1-P341L(rs2282143)、SLC022A1-M408V(rs628031)、SLC22A2陽A270S(rs316019)、IRS-1-G972A(rsl801278)、PPARG-P12A(rsl805192)、ADIPOQ(rs2241766)、ADIPOQ(+276G/T)、TCF7L2(rsl2255372)、KCNJ11-G15G(rs2241766)。針對上述每一突變位點(diǎn)設(shè)計的引物組包括一對等位基因特異性內(nèi)引物(位于不同的DNA鏈上)和對應(yīng)的兩條外引物，以及各個突變位點(diǎn)共用的一條特異性擴(kuò)增輔助引物。所述等位基因特異性外引物可根據(jù)相應(yīng)的等位基因特異性內(nèi)引物和待擴(kuò)增的基因片段設(shè)計并合成，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員均可以掌握，詳細(xì)操作步驟可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》([美]J.薩姆布魯克著，科學(xué)出版社)。所述等位基因特異性內(nèi)引物的結(jié)構(gòu)如下靠近其5'端的是一段長度為8-15nt的由G和C組成的與模板DNA不匹配的序列；靠近其3'端的是一段包括14-25個堿基的序列，且3'端最后一個堿基恰好位于糖尿病藥物治療相關(guān)基因的一個突變位點(diǎn)上，與該位點(diǎn)的突變型或野生型堿基匹配，其余堿基與突變位點(diǎn)前的相應(yīng)片段完全匹配。擁有該結(jié)構(gòu)的每條等位基因特異性內(nèi)引物和與其對應(yīng)的外引物組成的引物對能夠擴(kuò)增出包括糖尿病藥物治療相關(guān)基因的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段。所述各個位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物(GC-primer)是一段由G和C組成的寡核苷酸序列，用于在反應(yīng)體系中促進(jìn)特異性擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，故名。GC-primer的序列與所述等位基因特異性內(nèi)引物的靠近5'端部分完全相同，用于提高特異性擴(kuò)增片段的產(chǎn)量。所述的共用特異性擴(kuò)增輔助引物的5'端標(biāo)記有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子，這些分子包括地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等，這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法以及各標(biāo)記物的檢測方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明優(yōu)選對共用特異性擴(kuò)增輔助引物的5'端進(jìn)行Cy5標(biāo)記，使得生成的等位基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端帶有熒光標(biāo)記，以便在后繼的掃描過程中讀取結(jié)果。本發(fā)明所述各個突變位點(diǎn)的等位基因特異性內(nèi)引物的序列(靠近3'端的序列)以及各個突變位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物的序列如下表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上表中，針對每一糖尿病藥物治療相關(guān)基因的突變位點(diǎn)設(shè)計了一條野生型等位基因內(nèi)引物(i皿erP-W)序列和一條突變型等位基因內(nèi)引物(innerP-M)序列，在實(shí)際使用中，可選擇一個或多個突變位點(diǎn)的兩個序列的3'端任意連續(xù)17-30個堿基(包括3'端的野生型或突變型堿基在內(nèi))作為內(nèi)引物的序列。另外，為了提高等位基因特異性擴(kuò)增的效率，可以在靠近內(nèi)引物的3'端引入一個人工錯配的堿基，一般是在3'端的倒數(shù)第2或第3位上引入，所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，所述類似物包括尿嘧啶(U)、肽核酸(PNA)和鎖定核酸(LNA)，這屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。本發(fā)明所述的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的若干種寡核苷酸探針。所述的固相支持物可采用基因芯片領(lǐng)域常用的各種材料，如但不限于經(jīng)活性基團(tuán)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片、各種纖維膜、尼龍膜等，用于修飾的活性基團(tuán)如但不限于醛基、氨基、巰基、羧基等，本發(fā)明優(yōu)選醛基化修飾的玻片。所述固定于固相支持物上的寡核苷酸探針針對各糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)設(shè)計，每個糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)對應(yīng)兩組寡核苷酸探針，分別對應(yīng)于野生型等位基因和突變型等位基因，每組探針又包括一條等位基因特異性短探針和一條等位基因特異性長探針。所述的每個突變位點(diǎn)的野生型等位基因特異性探針(包括短探針和長探針)和突變型等位基因特異性探針(包括短探針和長探針)分別與待檢測擴(kuò)增片段的兩條鏈上的相應(yīng)序列匹配。所述的等位基因特異性短探針和與其相應(yīng)的等位基因特異性長探針與同一段待檢測基因片段的同一條鏈上的相應(yīng)序列匹配；所述的等位基因特異性短探針與其中包括糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)的一段序列匹配，探針的長度為14-25nt;所述的等位基因特異性長探針與該基因突變位點(diǎn)下游且不包含該突變位點(diǎn)的一段序列匹配，探針的長度為50-70nt。本發(fā)明所述基因芯片的等位基因特異性短探針的序列來自下述15對單鏈核苷酸片段中的一對或任意多對，由所述15對單鏈核苷酸片段上的包括基因突變位點(diǎn)(方框內(nèi)的堿基)在內(nèi)的任意連續(xù)14-25個堿基組成，所述15對單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是下表中的序列32至序列61。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明所述基因芯片的等位基因特異性長探針根據(jù)每個基因突變位點(diǎn)的序列特點(diǎn)設(shè)計并優(yōu)化，本發(fā)明優(yōu)選的長探針序列為下述15對單鏈核苷酸片段中的一對或任意多對，所述15對單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列63至序列93。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>rsl805192w-長探針GTCATACTTGTAATCTGCAACCACTGGATCTGTTCTTGTGAATGGAATGTSEQIDNO:82M-長探針TATCACAAAACAGCCTAGACAGCACTAATAAGGTGGTTATGTTCTTTTCTSEQIDNO:83rs2241766W-長探針CTGTGATGAAAGAGGCCAGAAACATTCTTACCTGGATCTCCTTTCTCACCSEQIDNO:84M-長探針TGGGAAAATTAGAGGAGTGTCATCTGTGCAATCACTGAATTCATAATCTTSEQIDNO:85rsl501299w-長探針GAATCAGAATATGAATGTACTGGGAATAGGGATGAGGGTGAAGATGGGAA卿工DN0:86M-長探針AGAGATTAGACAGGGGAGGAGGGGCAGCTAAAGATGGCTCAGGCAAACAASEQIDNO:87rs5219w-長探針GTTCTGCACGATGAGGATCAGGATGGCCAGTGGGCACTCCTCAGTCACCASEQIDNO:88M-長探針GAAGTGAAGTGGGACCCAGGTGGAGGTAAGGAAGAGTCTGGTGGGGAGTTSEQIDNO:89rsl2255372w-長探針TGGGATGGGCTGATGGGTTGAATGTGGGGTATGAAAGAAAAGAGCAATCGSF,QIDNO:90M-長探針CATTTGATGATTGTTTTGTTAATGGCTTGCAGGTCAGATTTTCATCTTTTSEQIDN0:91在匕述設(shè)計的各探針序列的基礎(chǔ)上，為了控制雜交過程中各種因素對雜交信號值的干擾和對雜交過程進(jìn)行評估，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可通過本領(lǐng)域熟知的方法設(shè)計并合成芯片質(zhì)控對照、陰性對照、陽性對照、空白對照等質(zhì)控探針。在上述設(shè)計的各探針序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行探針合成，并通過對探針3'端或5'端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來增加雜交容量以及對其3，端或5'端進(jìn)行化學(xué)集團(tuán)修飾(比如氨基化修飾)，使探針能通過化學(xué)鍵結(jié)合到相應(yīng)的固相支持物上(如醛基化玻片)；本發(fā)明優(yōu)選對探針的3'端進(jìn)行氨基修飾，其相較5'端修飾的探針具有更好的雜交效果。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測上述糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變的試劑盒，其至少包括本發(fā)明的上述引物(包括內(nèi)引物、外引物和/或特異性擴(kuò)增輔助引物，不同位點(diǎn)的上述引物可以分開放置，也可以組成引物混合物)和基因芯片(包括固相支持物和寡核苷酸探針，探針可以固定在固相支持物上，也可不固定在固相支持物上)，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包含下述試劑中的一種或幾種從待檢樣本中提取DNA的樣本處理試劑；PCR擴(kuò)增試劑；雜交試劑；顯色試劑。上述樣本處理試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑以及顯色試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的指示自行配制。本發(fā)明的試劑盒中還可以包括相應(yīng)的陰性對照和/或陽性對照樣本。本發(fā)明的引物(包括內(nèi)引物、外引物和/或特異性擴(kuò)增輔助引物)、芯片(包括固相支持物、短探針、長探針、各種指控探針)及其試劑盒(包括引物、芯片和/或其他試劑)可以針對表2中的一個基因突變進(jìn)行設(shè)計，也可以組合用于檢測多個基因突變。用上述引物組進(jìn)行的等位基因特異性PCR擴(kuò)增的原理如下(參見圖1):1)野生型等位基因內(nèi)引物和突變型等位基因內(nèi)引物分別與模板DNA雙鏈的兩條單鏈互補(bǔ)，且3'端正好與SNP位點(diǎn)重合，而引物的3'端是否與模板匹配決定了引物的延伸反應(yīng)是否可以進(jìn)行下去；只有當(dāng)野生型等位基因存在時(即基因型為野生型純合子或突變雜合子)，野生型等位基因內(nèi)引物(Innerprimer-W)和與之對應(yīng)的野生型等位基因外引物(Outerprimer-W)才可以擴(kuò)增出包括相應(yīng)待檢測基因突變位點(diǎn)的野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；只有當(dāng)突變型等位基因存在時(即基因型為突變型純合子或突變雜合子)，突變型等位基因內(nèi)引物(Innerprimer-M)和與之對應(yīng)的突變型等位基因外引物(Outerprimer-M)才可以擴(kuò)增出包括相應(yīng)待檢測基因突變位點(diǎn)的突變型堿基在內(nèi)的核苷酸片段。2)在引物的3'端倒數(shù)第2或第3位處引入一個人工錯配的堿基，可以提高上述延伸反應(yīng)的特異性。3)所述各個位點(diǎn)共用的特異性擴(kuò)增輔助引物(GC-primer)的序列與內(nèi)引物的5'端部分完全一致，在PCR反應(yīng)的最初循環(huán)，該引物不起作用，一旦內(nèi)引物中的任一條或兩條同時與模板結(jié)合并延伸，與之相對應(yīng)的外引物向其5'端方向延伸，就形成了一段可以與GC序列完全互補(bǔ)的序列，在以下的循環(huán)延伸反應(yīng)中，將以此片段為模板，在GC-primer和外引物的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，這樣可以使特異性延伸產(chǎn)物的量增加。對GC-primer進(jìn)行5'端標(biāo)記，可以使生成的等位基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端也帶有標(biāo)記，可以被用來方便地對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，避免了對每個待檢測基因突變位點(diǎn)的每條引物都進(jìn)行標(biāo)記的麻煩。常見的組合包括1、以SEQIDNO.1-8、SEQIDNO.19-20和SEQIDNO.27-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32-39、SEQIDNO.50-51和SEQIDNO.58-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-69、SEQIDNO.80-81和SEQIDNO.88-91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列，這樣組成的芯片檢測系統(tǒng)，可用于檢測與磺脲類降糖藥(甲苯磺丁脲、格列本脲等)的反應(yīng)性密切相關(guān)的rsl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rsl801278、rs5219、rsl2255372這7種基因突變，確定患者對磺脲類降糖藥的個體反應(yīng)性。2、以SEQIDNO.11-18和SEQIDNO.27-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.42-49和SEQIDNO.58-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.72-79和SEQIDNO.88-91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列，這樣組成的芯片檢測系統(tǒng)，可用于檢測與雙胍類降糖藥(二甲雙胍)的反應(yīng)性密切相關(guān)的rs4646277、rs2282143、rs628031、rs316019、rs5219、rsl2255372這6種基因突變，確定患者對雙胍類降糖藥的個體反應(yīng)性；3、以SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.9-10所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32-33和SEQIDNO.40-41所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-63和SEQIDNO.70-71所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列，這樣組成的芯片檢測系統(tǒng)，可用于檢測與氯苯茴酸類降糖藥(瑞格列奈、那格列奈)的反應(yīng)性密切相關(guān)的rsl057910、rs4149056這2種基因突變，確定患者對氯苯茴酸類降糖藥的個體反應(yīng)性；4、以SEQIDNO.21-26所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.52_57所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDN0.82-87所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列，這樣組成的芯片檢測系統(tǒng)，可用于檢測與噻唑啉二酮類類降糖藥(羅格列酮等)的反應(yīng)性密切相關(guān)的rs1805192、rs2241766、rsl501299這3種基因突變，確定患者對噻唑啉二酮類類降糖藥的個體反應(yīng)性；較為優(yōu)選的實(shí)施方案為，以SEQIDNO.1-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列，這樣組成的芯片檢測系統(tǒng)，可用于檢測與上述各類降糖藥的反應(yīng)性密切相關(guān)的rsl057910、rs3758581、rsl7878459、rs4986893、rs4149056、rs4646277、rs2282143、rs628031、rs316019、rsl801278、rsl805192、rs2241766、rsl501299、rs5219、rsl2255372這15種基因突變，確定患者對各類常見降糖藥的個體反應(yīng)性。本發(fā)明的基因芯片可以根據(jù)點(diǎn)樣區(qū)域的數(shù)目分為1人份、2人份和多人份不等，本發(fā)明根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的需要優(yōu)選2人份的設(shè)計方案，即在基片上設(shè)置2個點(diǎn)樣區(qū)域，分別點(diǎn)上所需的探針，一次可檢測2份生物樣品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括1、可以全面、系統(tǒng)、高通量地檢測已知的與糖尿病治療藥物反應(yīng)個體差異密切相關(guān)的基因突變，并可針對不同藥物制定出相應(yīng)的調(diào)整方案。2、與PCR—RFLP和測序法相比較，本發(fā)明環(huán)境污染輕，操作簡單快捷。3、與常用的SSOP芯片相比較，本發(fā)明通過等位基因特異性擴(kuò)增和設(shè)置兩對等位基因特異性探針(短探針和長探針)，極大的提高了探針雜交的特異性，可以克服SSOP芯片檢測中不可避免的非特異性雜交現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)野生型探針與突變型探針檢測的"全或無"，極大地提高了芯片檢測的準(zhǔn)確性和特異性。4、另外，本發(fā)明沒有在每個等位基因特異性引物上設(shè)置標(biāo)記，而是將標(biāo)記統(tǒng)一設(shè)置在特異性擴(kuò)增輔助引物上，一次標(biāo)記就可以滿足各種等位基因特異性擴(kuò)增的需要，減少了芯片檢測的成本。圖l本發(fā)明技術(shù)路線圖；圖2為實(shí)施例1雙探針基因突變檢測芯片平面圖；圖3為實(shí)施例2芯片掃描圖；圖4為糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的流程圖；具體實(shí)施方式下面，結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。本實(shí)施例中的探針和引物的設(shè)計與合成、芯片制備等均是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟練掌握的技能，詳細(xì)操作步驟可參閱《分子克隆試驗(yàn)指南》(([美]J.薩姆布魯克著，科學(xué)出版社)實(shí)施例1基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的制備。1、制備流程見附圖4。2、制備所需的主要原輔材料及儀器設(shè)備表6<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3、詳細(xì)制備過程3.1芯片檢測位點(diǎn)的選取<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本實(shí)施例的等位基因特異性長探針序列如圖5所示。上述等位基因特異性短探針和長探針在確定序列構(gòu)成后委托上海Irwitrogen公司合成。3.3芯片制備第一步處理基片——選用76咖X25mmXlmm超平片，將超平片浸于新配的重鉻酸鉀洗液中，放置7天后，用去離子水清洗，晾干；配制氨基硅烷的乙醇溶液，濃度分別為2%,將玻片浸入上述溶液中分別作用15分鐘，取出用去離子水洗凈，晾干；將上述氨基化處理的超平片分別浸入5X的戊二醛PBS(O.2mol/1M，pH8.0)溶液中，分別作用30分鐘，PBS溶液清洗晾干。第二步設(shè)置點(diǎn)樣區(qū)域——按圖2所示的糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變檢測芯片平面結(jié)構(gòu)圖，在一塊玻璃介質(zhì)的基片上劃分為兩個基因探針點(diǎn)樣區(qū)域，每個點(diǎn)樣區(qū)域的面積為10mm*12mm,在每個點(diǎn)樣區(qū)域內(nèi)如表8所示呈陣列式分布以下基因探針，其中W-短探針、W-長探針、M-短探針、M-長探針分別代表每個基因突變位點(diǎn)的野生型等位基因短探針、野生型等位基因長探針、突變型等位基因短探針、突變型等位基因長探針。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>第三步點(diǎn)樣與點(diǎn)樣后處理——探針溶液各取2ul，用點(diǎn)樣儀按上述格式打印到處理過的基片上；室溫干燥放置18小時；干燥后立即使用或貯存于4'C備用。3.4引物的設(shè)計與合成根據(jù)表3的序列，結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選取每個位點(diǎn)的innerP-W和innerP-M兩個序列的3'端連續(xù)17-30個堿基(包括3'端的野生型或突變型堿基在內(nèi))作為該位點(diǎn)野生型等位基因內(nèi)引物和突變型等位基因內(nèi)引物的序列，為提高等位基因特異性擴(kuò)增的特異性，在每個序列的3'端倒數(shù)第3個堿基處引入一個人工錯配的堿基。其具體序列如下表所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>相應(yīng)的野生型等位基因外引物和突變型等位基因外引物利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的設(shè)計方法確定其序列。特異性擴(kuò)增輔助引物的序列如SEQIDN0:31所示。上述確定了序列的引物委托上海Irwitrogen公司合成，所有等位基因特異性內(nèi)引物的5'端均連接上了與特異性擴(kuò)增輔助引物完全相同的一段GC序列，特異性擴(kuò)增輔助引物的5'端用熒光分子Cy5進(jìn)行標(biāo)記。3.5基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變芯片檢測系統(tǒng)的構(gòu)成。檢測系統(tǒng)主要由寡核苷酸芯片、雜交液、洗滌母液、各檢測基因位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液(包括引物、dNTP、buffer等)、沒有3，-5，端外切酶活性的DNA聚合酶和陽性參照DNA標(biāo)本等組分構(gòu)成，寡核苷酸芯片4'C冷藏保存，其他組分于-2(TC冷凍保存，其中PCR反應(yīng)液需避光。實(shí)施例2用實(shí)施例1的芯片檢測系統(tǒng)檢測已知基因型的臨床樣本的糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變。1、臨床樣本的處理采集某己知基因型(用金標(biāo)準(zhǔn)測序法確定)的待檢測個體的外周靜脈血2ml，使用ProraegaDNA抽提試劑盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提試劑進(jìn)行抽提，兩種方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。DNA濃度應(yīng)大200ng/ul,用紫外分光光度計檢測A260/A280比值，此比值應(yīng)介于1.601.80之間。經(jīng)測序檢測，該樣本的15個糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變的基因型為rsl057910-麗、rs3758581-觀、rsl7878459-WW、rs4986893-WW、rs4149056-廳、rs4646277-麗、rs2282143-麗、rs628031-畫、rs316019-WW、rsl801278-WM、rsl805192—WW、rs2241766-麗、rsl501299-麗、rs5219-麗、rsl22553722-WW。2、PCR擴(kuò)增針對每個突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系為模板DNA50ng;野生型等位基因外引物O.4timol/L;突變型等位基因外引物O.4nmol/L;野生型等位基因內(nèi)引物0.7mjiio1/L;突變型等位基因內(nèi)引物O.7jimol/L;特異性擴(kuò)增輔助引物0.7nmol/L;HotstarTaqDNA聚合酶O.375U，2.5咖ol/L的dNTP混合物L(fēng)2ul;IO倍濃度的PCRBufer1.5ul;滅菌蒸餾水(使最終體積為20ul)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性6min,熱循環(huán)40次(95°C,30S;56°C，30s;72°C，40s)，72。C延伸10rain，4。C保存。本實(shí)施例共擴(kuò)增對應(yīng)15個基因檢測位點(diǎn)的15管PCR產(chǎn)物。用PCR方法擴(kuò)增染色體基因特定片段的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，其中的關(guān)鍵在于引物設(shè)計，利用本發(fā)明公布的引物序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或有關(guān)文獻(xiàn)確定反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，獨(dú)立完成該操作步驟。3、芯片雜交取經(jīng)43。C預(yù)熱的雜交液7.5yL，加入15管PCR產(chǎn)物各3"L，混勻，全部吸取混合液轉(zhuǎn)移到芯片的點(diǎn)樣區(qū)域；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進(jìn)43"C水浴保溫2小時。本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員依照經(jīng)驗(yàn)可以確定有關(guān)緩沖液、樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。4、洗片打開雜交艙，取出芯片，用洗滌液漂洗30秒，再置于去離子水中于室溫洗滌30秒，取出，在離心機(jī)上瞬時離心30秒，甩去芯片上殘留液體。5、掃描將干燥后的芯片立即用GenePix4100A掃描儀掃描,PMT設(shè)置為600,激光波長為635nm;掃描圖像用掃描儀自帶的圖像分析軟件GenePix6.0對掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析,并保存分析結(jié)果。通過芯片掃描儀得到的掃描圖譜為一矩陣圖譜，探針分布如表8所示，當(dāng)某一位點(diǎn)的野生型短探針和長探針同時出現(xiàn)信號時該位點(diǎn)為野生型，當(dāng)該位點(diǎn)的突變型短探針和長探針同時出現(xiàn)信號時該位點(diǎn)為突變型，當(dāng)四個探針同時出現(xiàn)信號時為雜合子。芯片掃描結(jié)果如下-行數(shù)位點(diǎn)1-5點(diǎn)6-10點(diǎn)11-15點(diǎn)16-20點(diǎn)1rsl057910有信號有信號無信號無信號2rs3758581有信號有信號有信號有信號3rsl7878459有信號有信號無信號無信號4rs4986893有信號有信號無信號無信號5rs4149056無信號無信號有信號有信號6rs4646277有信號有信號無信號無信號7rs2282143有信號有信號有信號有信號8rs628031無信號無信號有信號有信號9rs316019有信號有信號無信號無信號10rsl801278有信號有信號有信號有信號11rsl805192有信號有信號無信號無信號12rs2241766有信號有信號無信號無信號13rsl501299有信號有信號有信號有信號14rs5219有信號有信號無信號無信號15rsl2255372有信號有信號無信號無信號由掃描圖可知本發(fā)明的基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針芯片檢測系統(tǒng)在進(jìn)行檢測時無非特異性雜交現(xiàn)象出現(xiàn)。6、分析確定基因型利用與芯片檢測系統(tǒng)配套的結(jié)果分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析與整理，由上述雜交圖掃描結(jié)果可確定各位點(diǎn)的基因型如下rsl057910-WW、rs3758581-WM、rsl7878459-WW、rs4986893-WW、rs4149056-醒、rs4646277-WW、rs2282143-WM、rs628031-醒、rs316019-WW、rsl801278-WM、rsl805192—WW、rs2241766-WW、rsl501299-WM、rs5219—WW、rsl22553722-WW。與測序結(jié)果相對照，所有位點(diǎn)的檢測結(jié)果均準(zhǔn)確無誤。以上對本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明做出各種改變和調(diào)整，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。序列表<110>中南大學(xué)<120>—種基于等位基因特異性擴(kuò)增的雙探針基因突變檢測方法及其專用芯片和試劑盒〈160〉151<170>Patentlnversion3.5〈210〉1<211>30<212>腿<213>人工序列<400〉1atgctgtggtgcacgaggtccagagataca30〈210〉2〈211>30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2atggggcaggctggtggggagaaggtcaag30<210〉3〈211>30<212〉薩〈213〉人工序列<400〉3ctaaagtccaggaagagattgaacgtgtca30<210>4<211〉30〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉4ctgcatgcaggggctccggtttctgccaac30<210>5<211〉3028<212>DNA〈213〉人工序列<400>5gtgaaggaagccctgattgatcttggagag30<210〉6<211>30<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉6agtgggaaatggcctcttccagaaaactcg30<210〉7<211>30<212〉DNA<213〉人工序列<400>7tgaaaacatcaggattgtaagcaccccctg30<210>8〈211〉30<212>DNA<213>人工序列〈400>8gaagcaaaaaacttggccttacctggatct30<210>9〈211〉30<212>DNA<213〉人工序列<400>9ggaatctgggtcatacatgtggatatatgt30〈210〉10〈211>30<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉10<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><212>DNA<213〉人工序列<400〉16gcaggctgcccccgccaacaaatttgacac30<210>17<211>30<212〉DNA<213〉人工序列<400〉17ctcactggaggtggttgcagttcacagttg30<210>18<211>30<212>DNA<213〉人工序列<400>18atagagcaagaagaagaagttgggcagaga30<210〉19<211>30<212>DNA<213〉人工序列■〉19agatgggcagactgggccctgcacctcccg30〈210〉20<211〉30<212>腿<213〉人工序列〈400>20ccgggtaggcctgcaaatgctagcagccct30〈210〉21<211>30〈212〉■<213>人工序列<400〉21ccatggttgacacagagatgccattctggc30<210>22<211〉30<212>腿<213〉人工序列<400〉22atccacggagctgatcccaaagttggtggc30〈210〉23<211〉30<212〉DNA<213〉人工序列<400〉24gctgttctactgctattagctctgcccggt30<210〉23<211>30<212〉DNA〈213〉人工序列<400>24ggcccttgagtcgtggtttcctggtcatgc30<210>25〈211〉30<212>DNA〈213〉人工序列〈400>25cctcctacactgatataaactatatgaagg30<210>26〈211〉30<212>DNA<213〉人工序列〈400〉26tgtgtctaggccttagttaataatgaatga30<210>27<211〉30<212>DNA<213>人工序列<400〉27tgctgacacgcctggc,ggaccctgccg30<210〉28<211>30<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉28cctccgctg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>DNA<213〉人工序列<400〉88gttctgcacgatgaggatcaggatggccagtgggcactcctcagtcacca50<210〉89<211〉50<212>DNA〈213>人工序列〈400〉89gaagtgaagtgggacccaggtggaggtsaggs卿gtctggtgggg3gtt50〈210〉90<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>90tgggatgggctgatgggttgaatgtggggtatgaa卿aa卿gcaatcg50<210>91<211〉50<212>DNA<213〉人工序列<400>91catttgatgattgttttgttaatggcttgcaggtcagattttcatctttt50<210>92<211〉18<212>DNA<213〉人工序列<400〉92aggtcaatgt8tctctgg〈210>93<211〉18〈212〉DNA<213〉人工序列<400>93gagataccttgaccttct18<210>94<211>17<212〉DNA<213〉人工序列<400>94ctgccaatgacacgttc17<210>95<211〉17<212>DNA〈213〉人工序列<400〉95acgtgtcgUggcagaa17<210>96<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉96cagaaaactcctctccaagat21<210>97〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉97atcttggagacgagttttctg21〈210>98〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<400>98tt3CCtgg3tCC3gggggtgC〈210>99〈211>13〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉99caccccctagatc<210>100<211>13<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉100ccatgaacacata<210>101<211〉14〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉101tatatgcgttcatg<210>102<211>14<212〉廳<213>人工序列〈400〉102gactccggcacaca〈210〉103〈211>16<212〉DNA<213>人工序列<400>103鄉(xiāng)tgtgtgctggagt<210>104<211>16〈212〉DNA<213〉人工序列<400>104caggcgcggcgtgcgg<210>105<211〉16<212>DNA〈213〉人工序列<400>105cgcacgctgcgcctga<210>106〈211〉16<212〉畫〈213〉人工序列<400〉106atttgacstggccatg<210>107<211>16<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉107ccatggccgtgtcaaa〈210〉108〈211〉15<212〉腿<213〉人工序列<400〉108tgggcagagcaactg〈210〉109<211>15<212〉麗<213〉人工序列<400〉109ttcacagtttctctg<210〉110<211>13<212〉腿<213>人工序列〈400〉110gcsgccccgggElg<210>111〈211>13〈212〉賺<213>人工序列<400>111acctcccaggget<210〉112<211〉15<212>DNA〈213>人工序列<400>112tggtgggcceigaMg<210>113<211〉15<212>DNA<213>人工序列<400>113ttctgggccaccaac<210〉114<211>15〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉114tggtcatgaccgggc<210>115<211〉15<212>DNA<213〉人工序列<400>115ctgcccgggcatgac<210>116<211〉16<212>醒<213>人工序列<400>116taatgaatgccttcat<210>117〈211〉16<212>DNA<213〉人工序列<400>117tatatgasgtcattca〈210〉118〈211>14<212>DNA<213〉人工序列<400>118ctgggctcggcagg<210>119<211>14<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉119ccctgccaagccca<210〉120<211>17<212>DNA<213〉人工序列<400〉120aatatggtcattcttgc<210>121<211〉17<212〉DNA<213>人工序列<400>121gcaagaattacc3tatt<210>122<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<400〉122gcacgaggtccagagattca<210〉123<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>123caggctggtggggagaaggtctag〈210〉124<211>23<212>DNA<213〉人工序列<400>124ccaggaagagattgaacgtgcca1717202423<210〉125〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列<400〉125caggggctccggtttctgcctac<210〉126<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉126agccctgattgatcttggacag<210〉127<211>22〈212>DNA<213〉人工序列〈400〉127atggcctcttccagaaaacacg<210>128<211〉21〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉128caggattgtaagcaccccatg<210〉129<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>129acttggccttacctggacct〈210〉130<211>24〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉130tgggtcatacatgtggatataagt<210〉131232222212024<211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉131acgaagcatattacccatgatcg〈210〉132〈211〉21<212〉醒〈213〉人工序列〈400>132tggtgttcgcaggtgtgtacc〈210〉133<211〉24〈212〉腿〈213>人工序列〈400〉133ataacagccaccgaggggacttca<210>134<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<400〉134atttgcagacctgttccgcacacc<210>135<211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉135tgaaggtgcgcttcctcaggctca〈210〉136〈211〉24〈212〉薩<213>人工序列<400〉136tgggccgcatctaccccatggaca<210〉137<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<400〉137tgcccccgccaacaaatttgatac<210〉138<211〉25<212>腿<213〉人工序列<400>138tggaggtggttgcagttcac聊tg<210〉139<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<400〉139agaagaagaagttgggcagtga<210〉140<211〉22<212>DNA<213>人工序列〈400〉140agactgggccctgcacctctcg<210〉141<211〉21<212>DNA<213>人工序列<400〉141taggcctgcaaatgctagcagcact<210>1422<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<400〉142ttgacacagagatgccattctcgc<210〉143<211>26<212〉膽〈213〉人工序列<400〉143acggagctgstcccaaEigttggttgc<210〉144<211〉25<212〉DNA<213〉人工序列<400〉144tctactgctattagctctgcccagt<210>145<211>25<212〉DNA<213〉人工序列<400〉145ttgagtcgtggtttcctggtcacgc<210>146<211>22<212>DNA<213>人工序列<4。0>146actgatataaactatatgatgg〈210〉147〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列2426252522<400〉147taggccttagttaataatgattga<210〉148<211〉23〈212〉腿<213>人工序列<400〉1483CgCCtggCag3gg3CCCtg3Cg<210>149<211〉23〈212〉腿<213>人工序列<400〉149tggcgggcacggtacctgggUt<210>150<211〉26<212〉DNA<213>人工序列<400〉150tgcccaggaatatccaggcaagactg〈210〉151<211〉23〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉151tgagtaattatxagetatatgtta242323262權(quán)利要求1、一種對糖尿病藥物治療相關(guān)基因的突變進(jìn)行檢測的方法，是以待檢測的來自于人體組織的基因組為模板，用如下引物組和沒有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定各糖尿病藥物治療相關(guān)基因的突變類型；所述引物組包括一對或一對以上的延伸方向相反的等位基因特異性內(nèi)引物和對應(yīng)的兩條外引物以及一條共用的特異性擴(kuò)增輔助引物；所述外引物和所述等位基因特異性內(nèi)引物組成的每對引物能擴(kuò)增包括糖尿病藥物治療相關(guān)基因的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；所述等位基因特異性內(nèi)引物的5’端是一段由G和C組成的與模板DNA不匹配的序列，序列長度為8-15nt；所述等位基因特異性內(nèi)引物的3’端包括14-25個堿基，3’端最后一個堿基恰好位于糖尿病藥物治療相關(guān)基因的一個突變位點(diǎn)上，與該位點(diǎn)的突變型或野生型堿基匹配，3’端的其余堿基與突變位點(diǎn)前的相應(yīng)片段完全匹配；所述的共用特異性擴(kuò)增輔助引物是一段由G和C組成，并與所述等位基因特異性內(nèi)引物的5’端完全相同的序列；所述探針針對各糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)設(shè)計，所述的每個糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)對應(yīng)兩組寡核苷酸探針，分別為野生型等位基因特異性探針和突變型等位基因特異性探針，每組探針又包括一條等位基因特異性短探針和一條等位基因特異性長探針；所述的每個突變位點(diǎn)的野生型等位基因特異性探針和突變型等位基因特異性探針，分別與待檢測擴(kuò)增片段的兩條鏈上的相應(yīng)序列匹配；所述的等位基因特異性短探針和與其相應(yīng)的等位基因特異性長探針與同一段待檢測基因片段的同一條鏈上的相應(yīng)序列匹配；所述的等位基因特異性短探針與其中包括糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)的一段序列匹配，探針的長度為14-25nt；所述的等位基因特異性長探針與該基因突變位點(diǎn)下游且不包含該突變位點(diǎn)的一段序列匹配，探針的長度為50-70nt；所述等位基因特異性內(nèi)引物與包含一個糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變位點(diǎn)的野生型或突變性堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配，且3’末端恰好為基因突變位點(diǎn)；所述糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變類型為CYP2C9*3-I359L(rs51038296)、CYP2C19*2a-I331V(rs3758581)、CYP2C19*2b-E92D(rs17878459)、CYP2C19*3-W212X(rs4986893)、SLCO1B1-V174A(rs4149056)、SLCO22A1-P283L(rs4646277)、SLCO22A1-P341L(rs2282143)、SLCO22A1-M408V(rs628031)、SLC22A2-A270S(rs316019)、IRS-1-G972A(rs1801278)、PPARG-P12A(rs1805192)、ADIPOQ(rs2241766)、ADIPOQ(+276G/T)、TCF7L2(rs12255372)、KCNJ11-G15G(rs2241766)中的至少一種；根據(jù)上述所選取的糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變類型來選擇引物組和探針；所述特異性擴(kuò)增輔助引物和各等位基因特異性內(nèi)引物的5’端部分的序列是序列表中的序列1；所述等位基因特異性內(nèi)引物的3’端部分來自下述30種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，由所述30種單鏈核苷酸片段上的包括3’末端堿基在內(nèi)的15-30個任意連續(xù)堿基組成，所述30種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的SEQIDNO.2至31；所述等位基因特異性短探針來自下述30種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，由所述30種單鏈核苷酸片段上的包括基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的任意連續(xù)14-25個堿基組成，所述30種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的SEQIDNO.32至62；所述等位基因特異性長探針為下述30種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，所述30種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的SEQIDNO.63至93。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的多重PCR擴(kuò)增在一管中進(jìn)行，或分為多管進(jìn)行多管多重PCR反應(yīng)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述等位基因特異性內(nèi)引物引入人工錯配堿基；所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物；所述類似物包括尿嘧啶、肽核酸和鎖定核酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的共用特異性擴(kuò)增輔助引物帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子。5、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于所述糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變類型為CYP2C9*3-1359L(rs51038296)、CYP2C19*2a_I331V(rs3758581)、CYP2C19*3-W212X(rs4986893)、SLC01B卜V174A(rs4149056)、SLC022A:L-P341L(rs2282143)、SLC22A2-A270S(rs316019)、IRS-1-G972A(rs薩278)、PPARG-P12A(rsl805192)中的至少一種，以及相應(yīng)的引物組和探針。、6、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于以SEQIDN0.1-8、SEQIDNO.19-20和SEQIDNO.27-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32-39、SEQIDNO.50-51和SEQIDNO.58-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-69、SEQIDNO.80-81和SEQIDNO.88-91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列。7、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于以SEQIDNO.11-18和SEQIDN0.27-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.42-49和SEQIDNO.58-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.72-79和SEQIDNO.88_91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列。8、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于以SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.9-10所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32_33和SEQIDNO.40-41所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-63和SEQIDN0.70-71所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列。9、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在于以SEQIDNO.21-26所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.52-57所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.82-87所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列。10、根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其特征在以SEQIDNO.1-30所示的序列作為擴(kuò)增樣本所需的內(nèi)引物序列，以SEQIDNO.32-61所示的序列作為制備芯片所需的短探針序列，以SEQIDNO.62-91所示的序列作為制備芯片所需的長探針序列。11、一種基因芯片，包括基底和固定于所述基底上的探針，其特征是所述探針為可分別與各種糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變所在核酸進(jìn)行雜交的寡核苷酸片段，每個基因突變位點(diǎn)包括一對等位基因特異性短探針，包括野生型等位基因特異性短探針和突變型等位基因特異性短探針；和一對等位基因特異性長探針，包括野生型等位基因特異性長探針和突變型等位基因特異性長探針；所述的等位基因特異性短探針來自下述15對單鏈核苷酸片段中的一對或任意多對，由所述15對單鏈核苷酸片段上的包括基因突變位點(diǎn)在內(nèi)的任意連續(xù)14-25個堿基組成，所述15對單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的SEQIDNO.32至62;對應(yīng)地，所述等位基因特異性長探針為下述15對單鏈核苷酸片段中的一對或任意多對，所述15對單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的SEQIDNO.63至93。12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的基因芯片，其特征在于所述固定于基底上的探針還包括陰性參照探針和陽性參照探針。13、一種試劑盒，包括引物組和探針芯片；其中所述引物組為權(quán)利要求1、3至10中所說的引物組；其中所述的探針芯片為權(quán)利要求6或7所述的芯片。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種對糖尿病藥物治療相關(guān)基因突變進(jìn)行檢測的方法及其專用芯片和試劑盒。該方法是以待檢測的來自于人體組織的基因組為模板，用針對特定突變位點(diǎn)設(shè)計的引物組和沒有3’-5’端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片上的等位基因特異性探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定各糖尿病藥物治療相關(guān)基因的突變類型；本發(fā)明可以全面、系統(tǒng)、高通量地檢測已知的與糖尿病治療藥物反應(yīng)個體差異密切相關(guān)的基因突變，極大地提高了芯片檢測的準(zhǔn)確性和特異性。文檔編號C12Q1/68GK101619351SQ200910042600公開日2010年1月6日申請日期2009年1月23日優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日發(fā)明者瑋冀,周宏灝申請人:中南大學(xué)