專利名稱：通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu),生產(chǎn)生物成像的納米顆粒及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過早期引入不規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，高產(chǎn)率地制備在水溶液內(nèi)具 有高度分散性、生物相容性和靶向性的生物成像的納米顆粒的方法。
背景技術(shù)：
由于建立了在含表面活性劑的有機(jī)溶劑內(nèi)化學(xué)合成具有均勻尺寸分布的疏 水無機(jī)納米顆粒的方法，因此，進(jìn)行了各種嘗試將該方法付諸使用。特別地， 由于在水溶液中制備的納米顆粒顯示出比有機(jī)溶劑和水中制備的那些大得多的 非均勻尺寸分布，是最便宜、最環(huán)境友好，和地球上存在的最有用的溶劑，因 此在有機(jī)溶劑內(nèi)制備的具有均勻尺寸分布的疏水納米顆粒的表面改性以便穩(wěn)定 地分散在水溶液內(nèi)是非常重要的且是研究者的主要關(guān)注領(lǐng)域?？扇芰孔狱c(diǎn)
(quantum dots )或在其中心處僅僅含單一量子點(diǎn)或單一無機(jī)納米顆粒和在其表 面處粘結(jié)具有有用官能團(tuán)的有機(jī)材料的可溶的納米顆?？捎行У赜米魃锍上?材料以及制造一些類型的納米結(jié)構(gòu)，例如生物傳感器或記憶器件的基礎(chǔ)材料。 因此，對(duì)這些納米顆粒的表面改性進(jìn)行了深入的研究。
這種表面改性的常用方法包括下述步驟使疏水納米顆粒與過量含硫醇
(-SH)基的有機(jī)配體反應(yīng)，從而用金屬硫醇鹽(M-S)鍵替代在納米顆粒表面 上的所有表面活性劑配體并向外暴露親水基團(tuán)，從而導(dǎo)致親水納米顆粒；和在 納米顆粒的親水基團(tuán)與官能分子，例如靶向生物分子之間形成共價(jià)鍵，獲得僅 僅在其中心處包括無機(jī)納米顆粒的生物成像的納米顆粒(參見圖l)。這種共價(jià) 鍵由在納米顆粒的親水基團(tuán)和新的官能分子之間的酰胺鍵或酯鍵組成。研究的 主要目的是其中選自胺(NH2)、羧酸(COOH)、硫醇和羥基(OH)中的親 水基團(tuán)借助烴鏈連接到硫醇基上的極性有機(jī)配體。公知這些有機(jī)配體與量子點(diǎn)(例如，CdSe、 ZnS,或核/殼CdSe/CdS、 CdSe/ZnS和類似物)、貴金屬納米顆 粒(例如，Au、 Ag)或氧化鐵磁性納米顆粒容易形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，
所有這些的特征在于在表面上含有豐富的金屬成分。然而，由于在中性或近中 性的溶液內(nèi)羥基或胺基容易聚集且沉淀，因此沒有進(jìn)行進(jìn)一步研究。另一方面， 由于羧酸基在很大程度上以電離狀態(tài)存在于中性溶液內(nèi)，在溶液內(nèi)顯示出高的 分散性和穩(wěn)定性，因此它廣泛地用作親水基團(tuán)以供通過酰胺鍵耦合官能分子到 納米顆粒上。
然而，上述方法必須經(jīng)歷在弱酸性水溶液內(nèi)活化在納米顆粒表面上的羧酸 基的步驟，所述弱酸性水溶液將引起許多納米顆粒聚集和沉淀(WC Chan和S Nie, Science 281: 2016, 1998; Wen Jiaiig, et al.， Chem. Mater. 18: 872, 2006 )。特
別地，在其中磁性納米顆粒的情況下，聚集和沉淀更加嚴(yán)重。聚集和沉淀的這 種納米顆粒難以在下一步中鍵合到官能分子上，和即使進(jìn)行鍵合到官能分子上， 官能分子也僅僅鍵合到聚集的納米顆粒表面上(參見圖1的步驟B，右惻的一 組)。這樣制備的納米顆粒太大，以致于無法沿著血管遷移并顯示出顯著降低 的分散性。此外，在使用量子點(diǎn)的情況下，納米顆粒的熒光顯著下降，這歸因 于自猝滅。由于最終必須除去這些沉淀和僅僅使用溶液層的充分地分散的部分， 因此存在大量的納米顆粒損失的嚴(yán)重問題。
為了克服聚集和沉淀問題，報(bào)道了通過使疏水無機(jī)納米顆粒直接與具有硫 醇基的聚乙二醇(PEG)反應(yīng)，制備具有金屬-硫醇鹽(M-S)鍵的有機(jī)/無機(jī) 復(fù)合納米顆粒的方法(美國(guó)專利No.7,041，371)。然而，所公開的該方法仍然具 有反應(yīng)產(chǎn)率低的問題，這是因?yàn)橥ㄟ^長(zhǎng)烴鏈連接的親水硫醇基必須滲透到被表 面活性劑包圍的納米顆粒的表面內(nèi)。
為了嘗試克服現(xiàn)有技術(shù)中親水納米顆粒聚集和沉淀的問題，本發(fā)明的發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)，因具有均勻結(jié)構(gòu)的親水納米顆粒表面上存在的過量親水基團(tuán)導(dǎo)致的氫 鍵吸引，引起這種聚集和沉淀?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人開發(fā)了在結(jié)構(gòu)上阻礙這 種氫鍵吸引并在整個(gè)反應(yīng)工藝過程中固定單獨(dú)和獨(dú)立的納米顆粒的方法。本發(fā) 明的方法可制備生物成像納米顆粒，在沒有引起聚集和沉淀的情況下，它在其中心處含有單一的顆粒，且顯示出優(yōu)良的物理性能，例如均勻的尺寸分布，高 的分散性和在溶液內(nèi)的穩(wěn)定性，生物相容性、耙向性和類似性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供制備生物成像納米顆粒的方法，其中通過借助部分表 面改性，早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)到納米顆粒的表面內(nèi)，允許在結(jié)構(gòu)上妨礙因納米 顆粒內(nèi)部氫鍵吸引導(dǎo)致的聚集和沉淀現(xiàn)象，從而在沒有損失納米顆粒的情況下， 高產(chǎn)率地在非極性有機(jī)溶劑或水溶液內(nèi)制備具有高分散性和穩(wěn)定性的生物成像 的納米顆粒。
本發(fā)明的另 一 目的是提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的具有高的分散性和穩(wěn)定性 的生物成像的納米顆粒。
本發(fā)明提供制備生物成像的納米顆粒的制備方法，該方法包括
1) 添加l-30當(dāng)量含有通過8-20個(gè)碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的 有機(jī)配體到用表面活性劑保護(hù)的核或核/殼結(jié)構(gòu)的疏水無機(jī)納米顆粒中，從而用 有機(jī)配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S) 鍵，這導(dǎo)致產(chǎn)生其表面僅僅部分改性為親水性質(zhì)且仍然維持它在非極性有機(jī)溶 劑內(nèi)的單獨(dú)的分散性的疏水納米顆粒；
2) 將官能分子鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團(tuán) 上，以提供納米顆粒表面官能度和不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，同時(shí)維持它們單獨(dú)的分散性； 和
3) 用其中至少兩個(gè)親水基團(tuán)通過1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代 在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒 轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒。
此外，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的生物成像的納米顆粒，它僅僅在 其中含通過8 - 20個(gè)碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基團(tuán)的有機(jī)配體引入到 用表面活性劑保護(hù)的核或核/殼疏水納米顆粒表面內(nèi)的部分處部分親水，但整體 上仍然疏水，并維持它們?cè)诜菢O性有機(jī)溶劑內(nèi)單獨(dú)的分散性。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的生物成像的納米顆粒，它具有官能度 和不規(guī)則結(jié)構(gòu)，這歸因于在納米顆粒的表面內(nèi)引入的親水基團(tuán)鍵合到官能分子 上，且僅僅在其中官能分子鍵合到其上的部分處部分親水，但整體上仍然疏水。
最后，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的生物成像的納米顆粒，其中通過 用至少兩個(gè)親水基團(tuán)借助1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代在納米顆粒 表面上殘留的其余表面活性劑，從而在整體上親水，并在水溶液內(nèi)維持它們單 獨(dú)的分散性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于 或等于20納米的圓形形狀且具有熒光性能的核或核/殼納米顆粒或氧化鐵磁性 納米顆粒的條件下，在有機(jī)溶液內(nèi)通過按序偶聯(lián)長(zhǎng)鏈有機(jī)配體和官能分子到納 米顆粒上，和固定該顆粒的均勻度，從而制備具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)的疏水官能的生 物成像的納米顆粒。此外，上述納米顆粒的疏水性轉(zhuǎn)化成親水性，其中引入到 納米顆粒表面內(nèi)的來自不規(guī)則結(jié)構(gòu)的位阻防止納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引，從而
以100%的產(chǎn)率制備能在水溶液內(nèi)維持單獨(dú)的分散性的生物成像的納米顆粒。


參考下述附圖，詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施方案。 圖l描述了制備生物成像的納米顆粒的常規(guī)方法以及每一步中獲得的納米
顆粒的結(jié)構(gòu)；
圖2描繪了根據(jù)本發(fā)明制備生物成像的納米顆粒的方法，以及在每一步中獲 得的納米顆粒的結(jié)構(gòu)；
圖3示出了用作起始材料的量子點(diǎn)和本申請(qǐng)的實(shí)施例1 - 5中制備的量子點(diǎn) 的紅外光譜a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA量子點(diǎn)；b)實(shí)施例l中制備的 CdSe/CdS-DA量子點(diǎn);c)實(shí)施例2中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA) 5量 子點(diǎn)；d)實(shí)施例3中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-en-FA ) 5量子點(diǎn);e) 實(shí)施例4中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點(diǎn)；f)實(shí)施例5 中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5的量子點(diǎn)；圖4示出了用作起始材料的量子點(diǎn)和本申請(qǐng)的實(shí)施例l-5的量子點(diǎn)的透射 電子顯微圖(TEM) : a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA; b)實(shí)施例l中制備 的CdSe/CdS-DA量子點(diǎn);c)實(shí)施例2中制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA ) 5 的量子點(diǎn)；d)實(shí)施例3中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (畫MUA畫en-FA ) 5的量子 點(diǎn)；e )實(shí)施例4中制備的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5的量子點(diǎn);f) 實(shí)施例5中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5的量子點(diǎn)；
圖5示出了分別用作對(duì)照劑和靶向劑的用本申請(qǐng)實(shí)施例4和5的量子點(diǎn)處理 的HT1080細(xì)胞和KB細(xì)胞的熒光顯微圖像QD: CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa ) 5量子點(diǎn)用作對(duì)照；QD-FA: CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA) 5量子點(diǎn)用作靶向劑；+ FA:存在過量游離的FA; -FA: 不存在游離的FA;
圖6示出了本申請(qǐng)的實(shí)施例6中制備的量子點(diǎn)的紅外光譜a) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點(diǎn);b ) CdSe/CdS (-DA) ex ( -MUA-aPEGa) 10量子點(diǎn);c) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 30量子點(diǎn);
圖7示出了本申請(qǐng)實(shí)施例6中制備的量子點(diǎn)的TEM圖像a) CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點(diǎn)；b) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) IO量子 占.
圖8示出了用作起始材料的磁性納米顆粒和本申請(qǐng)實(shí)施例7- ll中制備的磁 性納米顆粒的紅外光譜a)用作起始材料的SPION-OA納米顆粒；b)實(shí)施例 7中制備的SPION (-OA) ex ( MHA ) IO納米顆粒；c)實(shí)施例8中制備的SPION (-OA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX ) 10的納米顆粒;d )實(shí)施例9中制備的SPION (隱MPA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX) 10納米顆粒；e )實(shí)施例10中制備的SPION (-Lys )ex( MHA-aPEGa-MTX ) 10納米顆粒；f)實(shí)施例11中制備的SPION( -OA ) ex ( MHA-en-FA) 5納米顆粒；
圖9示出了用作起始材料的磁性納米顆粒和本申請(qǐng)的實(shí)施例7-IO中制備的 磁性納米顆粒的TEM圖像a)用作起始材料的SPION-OA納米顆粒；b)實(shí)施 例7中制備的SPION ( -OA ) ex ( MHA )10納米顆粒；c)實(shí)施例8中制備的SPION(-OA )ex( MHA畫aPEGa-MTX )IO納米顆粒；d )實(shí)施例9中制備的SPION(陽MPA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX ) IO納米顆粒;e)實(shí)施例10中制備的SPION (-Lys ) ex
(MHA-aPEGa-MTX) 10納米顆粒；
圖10示出了用本申請(qǐng)的實(shí)施例11中制備的SPION (-OA ) ex ( MHA-en-FA ) 5磁性納米顆粒靶向的KB細(xì)胞的核磁共振(NMR)圖像。
具體實(shí)施例方式
制備生物成像的納米顆粒的常規(guī)表面改性方法導(dǎo)致生產(chǎn)率的顯著下降，這 是因?yàn)橥ㄟ^引入親水有機(jī)配體到其表面內(nèi)制備的親水納米顆粒聚集和沉淀，這 種聚集和沉淀歸因于所引入的表面親水基團(tuán)本身在水溶液內(nèi)或者在與生物分子 的鍵合反應(yīng)過程中均勻的結(jié)構(gòu)引起的氫鍵吸引。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在水溶液內(nèi)具有均勻尺寸分布的親水納米顆粒的這種聚集 和沉淀歸因于親水有機(jī)配體的均勻結(jié)構(gòu)引起的納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引。基于 上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人開發(fā)了高產(chǎn)率地單獨(dú)分散在水溶液內(nèi)的生物成像的納米顆粒 的制備方法，其特征在于借助逐漸的表面改性，早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)的官能有 機(jī)物質(zhì)，例如生物相容的分子、靶向分子、絡(luò)合物或其混合物到納米顆粒表面 內(nèi)，從而制備疏水納米顆粒，所述疏水納米顆粒顯示出生物相容性和/或靶向性； 然后將該疏水納米顆粒轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒，這種轉(zhuǎn)化導(dǎo)致抑制因官能有機(jī)物 質(zhì)的位阻引起的納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引。
特別地，本發(fā)明制備生物成像的納米顆粒的方法包括下述步驟
1 )添加l - 30當(dāng)量含有通過8 - 20個(gè)碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的 有機(jī)配體到用表面活性劑保護(hù)的核或核/殼結(jié)構(gòu)的疏水無機(jī)納米顆粒中，從而用 有機(jī)配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S) 鍵，這導(dǎo)致產(chǎn)生其表面僅僅部分改性為親水性質(zhì)且仍然維持它在非極性有機(jī)溶 劑內(nèi)的單獨(dú)的分散性的疏水納米顆粒；
2)將官能分子鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團(tuán) 上，以提供納米顆粒表面官能度和不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，同時(shí)維持它們單獨(dú)的分散性；和
3)用其中至少兩個(gè)親水基團(tuán)通過1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代
在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒
轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒。
如上所述，常規(guī)的方法可通過在含表面活性劑的有機(jī)溶液內(nèi)合成具有均勻 尺寸分布的疏水納米顆粒，在納米顆粒和有機(jī)配體(所述有機(jī)配體含有用短烴
鏈連接的硫醇基和親水基團(tuán))之間形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，從而允許親
水官能團(tuán)向外暴露，固定納米顆粒粉末的親水性。然而，具有向外暴露的親水 基團(tuán)的這些親水納米顆粒極其容易聚集和沉淀，因此該納米顆粒不可能與其他 生物大分子成功地形成酰胺鍵或酯鍵。由于這一原因，沒有關(guān)于高產(chǎn)率地成功 制備在其中心處含有單一納米顆粒的生物成像納米顆粒的報(bào)道。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如圖l所示，含具有向外暴露的胺或羧基的親水納米顆粒的 各種親水納米顆粒容易聚集和沉淀，這歸因于在納米顆粒表面上規(guī)則地自組裝
的過量親水官能團(tuán)引起納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引。為了防止這一現(xiàn)象，如圖2 所示，本發(fā)明通過借助部分表面改性，引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)到納米顆粒表面內(nèi)，首 次確立了完全抑制納米顆粒內(nèi)部氫鍵吸引的最佳條件。在這些條件下，在沒有 引起任何聚集或沉淀的情況下，納米顆粒彼此獨(dú)立地分散。首先，在納米顆粒 表面上存在的僅僅一部分表面活性劑被含有通過8-20個(gè)碳原子的烴鏈連接的 硫醇基和親水基團(tuán)的有機(jī)配體替代，從而導(dǎo)致在它們之間形成金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵。之后，引入到納米顆粒表面上的親水基團(tuán)與具有生物相容性和靶 向性的官能分子耦合，從而賦予納米顆粒官能度和不規(guī)則的結(jié)構(gòu)。如此制備的 疏水官能的納米顆粒本身可有效地用于特定目的的生物成像，例如體外細(xì)胞實(shí) 驗(yàn)。隨后，其余表面活性劑被含有通過1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的至少兩個(gè)親 水基團(tuán)的有機(jī)配體替代，從而將疏水納米顆粒轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒。結(jié)果，納 米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引立體受阻，因此可高產(chǎn)率地制備在其中心處僅僅含有單 一納米顆粒且顯示出改進(jìn)的分散性和穩(wěn)定性的生物成像的納米顆粒。 參考圖2，更詳細(xì)地描述本發(fā)明制備生物成像的納米顆粒的方法。在步驟l)中，對(duì)疏水納米顆粒進(jìn)行部分表面改性(參見圖2的步驟C)。 向含具有核10或核/殼12結(jié)構(gòu)并用表面活性劑14保護(hù)的無機(jī)納米顆粒的有機(jī)溶
液中添加小量有機(jī)配體20,所述有機(jī)配體20含有能與納米顆粒表面上的金屬元 素形成化學(xué)鍵的硫醇基和親水基團(tuán)，其中這兩個(gè)基團(tuán)通過8-20個(gè)碳原子的烴鏈 連接，然后在劇烈攪拌下使該混合物反應(yīng)。優(yōu)選添加用量為l-30當(dāng)量的有機(jī)配 體。結(jié)果，僅僅一部分表面活性劑被有機(jī)配體替代，和被替代的有機(jī)配體與納 米顆粒表面上的金屬元素形成金屬-硫醇鹽(M-S鍵)。
在上述步驟中，無機(jī)納米顆粒具有核或核/殼結(jié)構(gòu)，其中它們的表面而不是 內(nèi)部，化學(xué)計(jì)量地富含金屬元素，和所述金屬元素能與有機(jī)配體中的硫醇基借 助金屬-硫醇鹽(M-S)共價(jià)鍵化學(xué)鍵合。優(yōu)選地，無機(jī)納米顆粒是貴金屬納 米顆粒、氧化鐵磁性納米顆?；虬雽?dǎo)體納米顆粒，所述納米顆粒選自由屬于周 期表第II族的鋅、鎘和鉛中的一種元素和選自屬于周期表第VI族的硫、硒和碲 中的一種元素組成。更優(yōu)選，無機(jī)納米顆粒的實(shí)例包括CdSe、 ZnS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 PbS、 Au、 Ag、 Fe203、 Fe304和類似物，其中可沒有限制地使用由 能與硫醇基形成共價(jià)鍵的物質(zhì)組成的任何納米顆粒。
由于鍵合到無機(jī)納米顆粒表面上的有機(jī)配體在分子內(nèi)含有至少一個(gè)硫醇基 和至少一個(gè)親水基團(tuán)，因此它可與無機(jī)納米顆粒形成至少一個(gè)金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵，并提供至少一個(gè)鍵合位點(diǎn)以供與其他生物分子18，例如生物相容 分子、靶向分子、絡(luò)合物(生物相容-靶向分子)或其混合物耦合。
此外，在有機(jī)配體內(nèi)的烴鏈長(zhǎng)度優(yōu)選范圍為8-20,以便維持納米顆粒的疏 水性。若烴鏈的長(zhǎng)度小于8，則納米顆粒存在損失其疏水性的危險(xiǎn)。此外，存在 親水基團(tuán)包埋在表面活性劑下面的危險(xiǎn)，這歸因于其鏈長(zhǎng)太短，所述危險(xiǎn)可引 起包埋的親水基團(tuán)難以與官能分子形成共價(jià)鍵的問題。不存在烴鏈長(zhǎng)度超過20 的有機(jī)配體，但如果它被開發(fā)的話，則也可使用這一配體。所添加的有機(jī)配體 的用量范圍優(yōu)選為1-30當(dāng)量。在添加小于或等于l當(dāng)量的情況下，可能的情況 是，在最初狀態(tài)下保持的納米顆粒不具有被替代的有機(jī)配體，從而引起生產(chǎn)率 下降。在添加大于30當(dāng)量的情況下，有機(jī)配體過度引入到納米顆粒表面上，從而增強(qiáng)了納米顆粒之間的氫鍵吸引，并引起納米顆粒聚集和沉淀。
能借助納米顆粒中的金屬元素和有機(jī)配體中的硫醇基之間的金屬-硫醇鹽 (M-S)共價(jià)鍵，化學(xué)鍵合到無機(jī)納米顆粒表面上的有機(jī)配體的數(shù)量隨粒度而
變化，且范圍可以是1-150。然而，證實(shí)若形成大于或等于30個(gè)M-S鍵且生物
相容分子鍵合到其上，則納米顆粒簇將形成聚集體，且不會(huì)分散在任何種類的 溶劑中。因此，適合于借助納米顆粒中的金屬元素和有機(jī)配體中的硫醇基之間
的金屬-硫醇鹽(M-S)共價(jià)鍵，化學(xué)鍵合到無機(jī)納米顆粒表面上的有機(jī)配體 的數(shù)量范圍優(yōu)選為1 - 30。在納米顆粒表面處形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的有機(jī)配體的合適 實(shí)例包括，但不限于，巰基十一烷酸、巰基十二烷酸、巰基十六烷酸和類似物。
即使在上述步驟中部分表面改性的無機(jī)納米顆粒含有向外暴露的親水基 團(tuán)，由于親水基團(tuán)連接到其上的烴鏈長(zhǎng)度長(zhǎng)，因此它們實(shí)際上沒有顯示出親水 性。此外，由于親水基團(tuán)的數(shù)量顯著低于疏水表面活性劑，因此這些納米顆粒 仍然顯示出疏水性，且因此容易分散在無機(jī)溶劑內(nèi)。
在步驟2)中，官能分子，例如生物相容分子、靶向分子、絡(luò)合物或其混合 物鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒表面上引入的親水基團(tuán)上，從而產(chǎn)生具有不 規(guī)則結(jié)構(gòu)的疏水納米顆粒。由于如此制備的納米顆粒仍然疏水或者為兩性，因 此它們?nèi)菀追稚⒃诜菢O性溶劑內(nèi)且可用于生物成像的特定目的，例如體外細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)中。
在步驟3)中，將含有通過l-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的至少兩個(gè)親水基團(tuán)的 有機(jī)配體16加入到步驟2)制備的納米顆粒中，以替代在納米顆粒表面上殘留的 其余表面活性劑，這將導(dǎo)致疏水納米顆粒轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒。在這一步驟中 的有機(jī)配體的合適實(shí)例包括，但不限于，巰基己酸、巰基乙酸、巰基丙酸、二 巰基琥珀酸、2-巰基乙醇、2-氨基乙二硫醇、賴氨酸、精氨酸、氨基戊酸和類
根據(jù)步驟l)和2)引入到納米顆粒表面內(nèi)的不規(guī)則結(jié)構(gòu)在維持單獨(dú)的分散 性方面扮演重要的作用，因?yàn)榛旧戏乐沽丝赡茉诓襟E3 )中出現(xiàn)的納米顆粒內(nèi) 部的氫鍵鍵合。此外，在步驟3)中引入的有機(jī)配體的1-7個(gè)碳原子的短烴鏈增加有機(jī)物質(zhì)的極性，從而改進(jìn)在水中的分散性。
本發(fā)明中所使用的官能分子是合成聚合物或生物成分，它們?cè)跊]有引起副 作用的情況下，顯示出高的生物相容性，且根據(jù)其條件具有生物降解性和各種 物理狀態(tài)，例如溶液、凝膠或膜。由于它們?cè)谄湟粋€(gè)或兩個(gè)端基處含有選自胺 基、醛基和羧酸基中的一個(gè)官能團(tuán)，因此該官能分子可與納米顆粒中的親水基 團(tuán)形成酰胺或酯鍵。這種官能分子例舉生物相容分子、耙向分子、絡(luò)合物(生 物相容-靶向分子)或其混合物。
優(yōu)選適合于本發(fā)明的生物相容分子在其兩個(gè)端基處含有選自胺基、醛基和 羧酸基中的一個(gè)官能團(tuán)，或者在一個(gè)端基處含有這些官能團(tuán)之一，和在另一端 基處含有具有1-7個(gè)碳原子的烷氧基或羥基。這些生物相容分子的合適實(shí)例可
包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚 (DL-丙交酯)(PDLLA)、聚-DL-丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)、殼聚糖、 藻酸、透明質(zhì)酸、膠原、肝素、聚(e-己內(nèi)酯)和類似物。
此外，本發(fā)明所使用的靶向分子可在體內(nèi)被特異地識(shí)別，含有胺基、醛基、 羧酸基、羥基和硫醇基之一，因此可借助酰胺鍵、酯鍵和硫酯鍵之一，連接到 有機(jī)配體或生物相容分子上。這些靶向分子的實(shí)例可包括，但不限于，葉酸、 氨甲喋呤(MTX)、對(duì)某一細(xì)胞具有選擇性的肽(例如RGD肽或tat肽)，或者 與一些抗原選擇性反應(yīng)的抗體(例如對(duì)鏈霉抗生物素蛋白特異的生物素，對(duì)PSA 特異的PSA抗體)。
此外，生物相容分子和靶向分子可以以絡(luò)合物形式或其混合物形式使用， 其中所述絡(luò)合物借助酰胺鍵或酯鍵偶聯(lián)它們而制備。
含這些生物相容分子、靶向分子、生物相容-靶向絡(luò)合物的官能分子或其 混合物在其一個(gè)或兩個(gè)端基處含有選自胺基、瞎基和羧酸基中的一個(gè)官能團(tuán)， 因此它們可與步驟2)中單獨(dú)地分散的納米顆粒中的羧酸、羥基或胺基形成酰胺 鍵或酯鍵，產(chǎn)生在其表面處具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)的納米顆粒。
如圖1的步驟B中所述，由于制備納米顆粒的常規(guī)方法進(jìn)行聚集形式的親水 納米顆粒的酰胺或酯鍵鍵合反應(yīng)，因此官能分子僅僅鍵合到聚集納米顆粒的表面上，且不可能接觸聚集體內(nèi)部存在的納米顆粒，從而使得不可能進(jìn)行所得的 鍵合反應(yīng)。這一問題引起生物成像的納米顆粒的生產(chǎn)率下降且無法執(zhí)行成像功 能。
然而，如圖2的步驟D中所述，本發(fā)明的方法首先通過分步的部分表面改性, 用借助8-20個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體來部分替代納米顆粒表面處存在 的表面活性劑，然后將該官能分子偶聯(lián)到在納米顆粒表面內(nèi)引入的這些有機(jī)配 體上，從而制備具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)的疏水官能的納米顆粒。然后用借助1-7個(gè)碳 原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代在納米顆粒表面處的其余表面活性劑，從而將 納米顆粒的疏水性轉(zhuǎn)化成親水性。根據(jù)本發(fā)明的方法，由于納米顆粒內(nèi)部的氫 鍵吸引導(dǎo)致的納米顆粒的聚集和沉淀受到在其表面上引入的不規(guī)則結(jié)構(gòu)的立體 阻礙，因此容易以100%的產(chǎn)率制備在其中心處含有單一納米顆粒的有機(jī)/無機(jī) 絡(luò)合物納米顆粒，同時(shí)在沒有損失量子點(diǎn)的情況下維持其量子效率。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于 或等于20納米的圓形形狀且具有熒光性能的核或核/殼納米顆粒或氧化鐵磁性 納米顆粒的條件下，在有機(jī)溶液內(nèi)通過按序偶聯(lián)長(zhǎng)鏈有機(jī)配體和官能分子到納 米顆粒上，和固定該顆粒的均勻度，從而制備具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)的疏水官能的生 物成像的納米顆粒。此外，上述納米顆粒的疏水性轉(zhuǎn)化成親水性，其中引入到 納米顆粒表面內(nèi)的來自不規(guī)則結(jié)構(gòu)的位阻防止納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引，從而 以100%的產(chǎn)率制備能在水溶液內(nèi)維持單獨(dú)的分散性的生物成像的納米顆粒。
此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，只要在納米顆粒表面上的金屬元素可與具有硫 醇基的有機(jī)配體形成共價(jià)鍵，則與內(nèi)部無機(jī)納米顆粒的組成組分無關(guān)，納米顆 粒能借助有機(jī)配體的親水基團(tuán)鍵合到官能分子上。因此，本發(fā)明的方法可有效 地用于制備含有各種單一納米顆粒，以及量子點(diǎn)和磁性納米顆粒的有機(jī)/無機(jī)絡(luò) 合物納米顆粒。
另外，即使在無機(jī)納米顆粒和有機(jī)配體之間的共價(jià)鍵不是金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵，當(dāng)借助分步的部分表面改性，使胺基、羧酸基或羥基在引入到納 米顆粒表面內(nèi)的有機(jī)配體末端處暴露時(shí)，這種親水基團(tuán)也可鍵合到官能分子上，形成能立體阻礙納米顆粒內(nèi)部氫鍵鍵合的不規(guī)則結(jié)構(gòu)，然后將上述納米顆粒轉(zhuǎn) 化成親水納米顆粒。結(jié)果，本發(fā)明的方法可有效地應(yīng)用于在轉(zhuǎn)化成親水納米顆 粒之前和之后，制備各種單獨(dú)分散的生物成像的納米顆粒。
此外，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的方法制備的在其中心處含有單一無機(jī)納米 顆粒的生物成像的納米顆粒。
由于本發(fā)明生物成像的納米顆粒含有長(zhǎng)烴鏈鍵合到在其中心處具有核或核 /殼結(jié)構(gòu)的無機(jī)納米顆粒表面上的有機(jī)配體，因此該納米顆粒僅僅在其中有機(jī)配 體鍵合到其上的部分親水，但在其中有機(jī)配體沒有鍵合的部分內(nèi)仍然大多數(shù)疏 水(本發(fā)明方法的步驟l)。此外，通過形成酰胺鍵或酯鍵，偶聯(lián)官能分子到所 述納米顆粒的親水基團(tuán)上，本發(fā)明可制備具有不規(guī)則表面結(jié)構(gòu)的疏水納米顆粒 (本發(fā)明方法的步驟2)。此外，本發(fā)明可提供親水納米顆粒，其中在所述納米 顆粒表面上殘留的其余表面活性劑可被具有至少兩個(gè)親水基團(tuán)的有機(jī)配體的短 鏈替代，從而導(dǎo)致將其疏水性轉(zhuǎn)化成親水性。如此制備的親水納米顆?？稍谡?個(gè)工序過程中，在水溶液內(nèi)維持其單獨(dú)的分散性，這是因?yàn)榧{米顆粒內(nèi)部的氫 鍵鍵合受到引入到納米顆粒表面內(nèi)的不規(guī)則結(jié)構(gòu)的位阻干擾(本發(fā)明方法的步 驟3 )。
本發(fā)明的親水生物成像的納米顆粒含有能在單一的納米顆粒表面處形成氫 鍵的許多親水有機(jī)配體，但官能分子在納米顆粒的一些部分處偶聯(lián)到有機(jī)配體 的長(zhǎng)烴鏈上，這些部分將得使納米顆粒具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)。由于這種不規(guī)則結(jié)構(gòu) 顯示出對(duì)在納米顆粒當(dāng)中形成氫鍵的位阻效應(yīng)，因此可制備具有均勻尺寸分布、 高的化學(xué)穩(wěn)定性、在水溶液內(nèi)的分散性、生物相容性、靶向性、光度和光穩(wěn)定 性的納米顆粒且沒有因聚集和沉淀導(dǎo)致?lián)p失納米顆粒。
因此，本發(fā)明的納米顆粒不僅可有效地用作生物成像材料，而且作為基礎(chǔ) 醫(yī)療材料用于高效診斷和治療疾病上。
詳細(xì)地參考下述實(shí)施例，描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不打算限制本發(fā)明的范圍。
在下述實(shí)施例中，具有核/殼結(jié)構(gòu)的疏水納米顆粒CdSe/CdS-ODA用作量子點(diǎn)用起始材料，它具有在其表面上配位的十八烷基胺(ODA)表面活性劑。根 據(jù)JJ Li等人，Journal of the American Chemical Society 125: 12567-12575 ( 2003 ) 和WWYu等人，Chemistry of Materials 15: 2854-2860 (2003 )所述的方法，在 CdSe核納米顆粒表面上各自按序生長(zhǎng)Cd、 S、 Cd、 S和Cd,其中各自為0.5層(總 計(jì)2.5層)。
此外，在下述實(shí)施例中，疏水氧化鐵納米顆粒Fe203-OA用作磁性納米顆粒 用起始材料，它具有在其表面上配位的油酸(OA)表面活性劑。根據(jù)K. Woo,等 人，Chemistry of Materials 16: 2814-2818( 2004 )和K. Woo等人，IEEE Transactions onmagnetics41,4137-4139(2005 )所述的方法，在惰性氛圍內(nèi)合成Fe203或Fe304 納米顆粒并與10mol。/。前體Fe (CO) 5混合，從而制備在其表面處含有化學(xué)計(jì)量 地過量的鐵成分的磁性納米顆粒。然而，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，顯而易 見的是，與制備方法無關(guān)，若疏水納米顆粒在其表面處的金屬成分比化學(xué)計(jì)量 的豐富，則可沒有區(qū)分地在實(shí)施例1 _ 11中使用它們。
此外，在下述實(shí)施例中的術(shù)語(-DA) ex和(-OA) ex是代表在納米顆粒表 面處過量癸胺或油酸的符號(hào)。盡管它們當(dāng)中的一些配體被具有硫醇基的其他配 體替代，但由于其下降效果不顯著，和仍然存在過量的DA或OA,因此，它們 被沒有區(qū)分地描述為(-DA) ex或(-OA) ex。
實(shí)施例l:通過表面配體交換，制備半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS-DA
真空蒸發(fā)5ml CdSe/CdS-ODA疏水量子點(diǎn)溶液(8xl(T5M)，以除去溶劑， 并分散在20ml氯仿內(nèi)。向這一分散體中添加1000當(dāng)量癸胺(DA),并在黑暗的 惰性氛圍內(nèi)攪拌該混合物2天?；旌纤萌芤号c丙酮，并離心，分離沉淀。如此 制備的沉淀分散在氯仿內(nèi)，制備20ml CdSe/CdS-DA溶液(2xlO-5M)。用紅夕卜 分光計(jì)和透射電子顯微鏡(TEM)分析CdSe/CdS-DA樣品，其中分別在圖3 (b) 和圖4(b)中示出了結(jié)果。通過在TEM圖像內(nèi)，CdSe/CdS-DA量子點(diǎn)比 CdSe/CdS-ODA之間的距離短，來證實(shí)發(fā)生了表面配體的交換。
實(shí)施例2:制備部分表面改性的半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)向17ml實(shí)施例1制備的CdSe/CdS-DA溶液中添加5當(dāng)量巰基十 一 烷酸 (MUA),并在黑暗的惰性氛圍內(nèi)攪拌19小時(shí)。濃縮所得溶液，并與丙酮混合， 和離心分離沉淀。如此制備的沉淀分散在氯仿內(nèi)，制備17mlCdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液(2xlO-5M)。用紅外分光計(jì)和透射電子顯微鏡(TEM )分 析所得樣品，其中分別在圖3 (c)和圖4 (c)中示出了結(jié)果。TEM圖像證實(shí)， 不再發(fā)生納米顆粒的自組裝，這歸因于部分替代MUA引起的其均勻結(jié)構(gòu)的破 壞，正如圖2的步驟C所示。
實(shí)施例3:制備靶向疏水的半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS ( -DA ) ex (-MUA-en-FA) 5
用氯仿稀釋2ml實(shí)施例2制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液到10ml 的最終體積。在添加5當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC )到該稀釋劑中并在黑暗 的惰性氛圍內(nèi)攪拌3小時(shí)之后，向其中添加50當(dāng)量如下所述制備的en-FA并進(jìn)一 步攪拌2小時(shí)。濃縮所得溶液，并與丙酮混合，和離心分離沉淀。將如此制備的 沉淀分散在氯仿內(nèi)，制備10ml CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-en-FA ) 5溶液 (4xlO—6M)。用紅外分光計(jì)和TEM分析en-FA鍵合到MUA上，其中分別在圖3 (d)和圖4 (d)中示出了結(jié)果。
制備靶向分子葉酸(FA)和乙二胺(en)的絡(luò)合物en-FA 將441mg ( lmmol)葉酸加入到10ml干餾的甲苯中，攪拌l小時(shí)，然后進(jìn)行 真空蒸發(fā)，除去甲苯和濕氣。在將所得殘?jiān)芙庠诙谆柞０?DMF)內(nèi)之 后，將含該混合物的燒瓶浸泡在冰洛中并攪拌10分鐘。將226mg( l.lmmol)DCC 加入到該混合物中，并進(jìn)一步攪拌18小時(shí)。將2.5ml乙二胺(en)溶解在20ml DMF 內(nèi)，向其中添加所述混合物，然后攪拌3小時(shí)，向所得溶液中添加水和乙腈，形 成沉淀，并用相同的溶劑重結(jié)晶，從而獲得224mgen-FA。
實(shí)施例4:制備生物相容和水溶性半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5
用氯仿稀釋0.5ml實(shí)施例2制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA ) 5溶液到最 終2.5ml的體積。在將6當(dāng)量的DCC加入到稀釋劑中并在黑暗的惰性氛圍內(nèi)攪拌3小時(shí)之后，向其中添加7當(dāng)量的0，0，-雙(2-氨乙基)聚乙二醇(aPEGa， MW 1,000) 并進(jìn)一步攪拌16小時(shí)。濃縮所得溶液，與丙酮混合，并離心，分離沉淀。將如 此制備的沉淀分散在氯仿內(nèi)，制備10mlCdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5 溶液(lxlo-6M)。
隨后，向如此制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5溶液中添加100 當(dāng)量，其中0.05 M NaOH和0.05 M巰基丙酸(MPA )在其內(nèi)溶解的甲醇溶液并 攪拌。在將蒸餾水加入到所得溶液中，提取產(chǎn)物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙 酯(l/4)的混合溶劑，并離心，以沉淀形式分離產(chǎn)物。將如此制備的沉淀分散 在PBS緩沖液(pH 7.4)內(nèi)，制備10ml、 1xl(y6M的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5溶液。通過紅外分光計(jì)和TEM證實(shí)了 aPEGa有利地鍵合到 MUA上且用MPA成功地取代可DA,其中圖3 (e)和圖4 (e)分別示出了結(jié)果。
實(shí)施例5:制備靶向、生物相容和水溶性半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS(-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5和利用它的生物成像
用氯仿稀釋2ml實(shí)施例2制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液到最終 10ml的體積。在將6當(dāng)量的DCC加入到稀釋劑中并在黑暗的惰性氛圍內(nèi)撹拌3小 時(shí)之后，向其中添加15當(dāng)量如下所述制備的aPEGa-FA并進(jìn)一步攪拌16小時(shí)。濃 縮所得溶液，與丙酮和甲醇混合，并離心，分離沉淀。將如此制備的沉淀分散 在氯仿中,制備4ml CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5溶液(1 x 1(T5M )。
隨后，將100當(dāng)量通過溶解0.05M NaOH和0.05M MPA制備的甲醇溶液加入 到CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa-FA) 5溶液中并攪拌。在將蒸餾水加入 到所得溶液中提取產(chǎn)物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙烯酯(1/4)的混合溶劑， 并離心，以沉淀形式分離產(chǎn)物。將如此制備的沉淀分散在PBS緩沖液(pH7.4) 內(nèi)，制備10ml、 4xlO-6M的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5溶液。 通過紅外分光計(jì)和TEM證實(shí)了 aPEGa-FA有利地鍵合到MUA上且用MPA成功地 取代DA，其中分別在圖3 (f)和圖4 (f)中示出了結(jié)果。
為了檢驗(yàn)以上制備的FA-鍵合的量子點(diǎn)CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5是否對(duì)某些細(xì)胞系顯示出選擇性，分別在存在或不存在FA ( 9x 10-6 M )的情況下，在含F(xiàn)A-鍵合的量子點(diǎn)CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5 (2xl(T7M)或不含F(xiàn)A的量子點(diǎn)CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5 (2xl(T7M)的PBS溶液內(nèi)，培養(yǎng)具有葉酸受體的KB細(xì)胞(人 纖維肉瘤細(xì)胞，ATCC， Manassas, VA)和不具有葉酸受體的HT1080細(xì)胞(人皮 樣肉瘤癌細(xì)胞，ATCC, Manassas, VA)，并在37。C下保溫15小時(shí)。在完成培養(yǎng) 之后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞三次，并固定在載玻片的表面上。釆用熒光顯微鏡 觀察細(xì)胞，其中圖5示出了結(jié)果。
如圖5所示，當(dāng)在培養(yǎng)溶液內(nèi)不存在游離FA時(shí)，與沒有顯示出靶向性的量 子點(diǎn)CdSe/CdS ( -MPA ) ex (畫MUA-aPEGa ) 5相比，顯示出耙向性的量子點(diǎn) CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5被較大量地選擇性轉(zhuǎn)移到具有FA 受體的KB細(xì)胞內(nèi)。另一方面，當(dāng)在培養(yǎng)溶液內(nèi)存在豐富的游離FA時(shí)，在KB細(xì) 胞和HT 1080細(xì)胞之間不存在選擇性，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)游離FA鍵合到相應(yīng)的受 體上。
通過鍵合生物相容分子aPEGa和耙向分子FA,制備aPEGa-FA 將441mg ( lmmol) FA加入到10ml干餾甲苯中，撹拌l小時(shí)，然后進(jìn)行真空 蒸發(fā)，除去甲苯和濕氣。在將所得殘?jiān)芙庠?4mlDMF內(nèi)之后，將含該混合物 的燒瓶浸泡在冰洛內(nèi)并攪拌10分鐘。在將226mg ( l.lmmol) DCC加入到該混合 物中并攪拌18小時(shí)之后，向其中添加lmmolaPEGa并進(jìn)一步攪拌3小時(shí)。將二乙 醚加入到所得溶液中，形成沉淀，并用相同的溶劑重結(jié)晶，獲得179mg aPEGa-FA。
實(shí)施例6:制備半導(dǎo)體納米顆粒CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa) n ( n=5 、 10或30)
用氯仿稀釋0.5ml實(shí)施例l制備的CdSe/CdS-DA溶液，制備最終體積為10ml 的三種稀釋劑。向每一稀釋劑中分別添加5、 10和30當(dāng)量MUA,并在黑暗的惰 性氛圍內(nèi)攪拌19小時(shí)。濃縮每一溶液，與甲醇混合，形成沉淀，然后離心，分 離它。將如此制備的沉淀溶解在氯仿中，制備2.5ml每一CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) n ( n=5 、 10或30)溶液(4xlO—6M)。向以上制備的每一CdSe/CdS (陽DA ) ex (-MUA ) n (n=5、 10或30)溶液 中分別添加5.5、 11和33當(dāng)量的DCC，并在黑暗的惰性氛圍內(nèi)攪拌3小時(shí)。隨后， 向每一溶液中添加6、 12和36當(dāng)量的aPEGa并進(jìn)一步攪拌16小時(shí)。濃縮每一溶液， 與甲醇混合，形成沉淀，并離心，分離它。將如此制備的沉淀分散在氯仿內(nèi)， 制備10ml每一CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa ) n (n=5、 10或30)溶液 (lxl(T6M)。通過紅外光譜(圖6)證實(shí)在所有這三種情況下，aPEGa成功地 鍵合到MUA上。
此外，在圖7的TEM圖像中發(fā)現(xiàn)，盡管在CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG) 5情況下，納米顆粒內(nèi)部的氫鍵鍵合吸引不明顯，但在CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEG) IO情況下，這種作用足夠強(qiáng)，以致于誘導(dǎo)納米顆粒聚集。在上 式中，當(dāng)n為5和10時(shí)，納米顆粒充分地分散在氯仿內(nèi)，但當(dāng)n為30時(shí)，納米顆粒 形成不溶于任何溶劑內(nèi)的聚集體，這是因?yàn)榧{米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引太強(qiáng)，結(jié) 果不可能產(chǎn)生聚集的納米顆粒的TEM圖像。根據(jù)這些結(jié)果，證實(shí)當(dāng)在納米顆粒 的表面處具有均勻結(jié)構(gòu)的親水基團(tuán)的數(shù)量增加時(shí)，納米顆粒內(nèi)部的氫鍵吸引可 能不可控地增加。
還發(fā)現(xiàn)，在棄置的上清液內(nèi)不存在可檢測(cè)的熒光，這表明產(chǎn)率為100%,所 述上清液通過在實(shí)施例l-6中的反應(yīng)之后添加不溶性溶劑到量子點(diǎn)溶液內(nèi)并離 心所得溶液而獲得。
實(shí)施例7:制備部分表面改性的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA )
10
用乙醇洗滌2ml粒度為8納米的疏水SPION-OA (用油酸保護(hù)的超級(jí)順磁氧 化鐵納米顆粒)的磁性納米顆粒溶液2次，在20ml甲苯內(nèi)分散，然后加熱到IOO 'C。向該混合物中添加10當(dāng)量巰基十六烷酸(MHA)，回流l小時(shí)并冷卻。在 濃縮2ml所得溶液之后，向其中添加小量乙醇，然后通過使用磁力分離部分表面 改性的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA) 10。用紅外分光計(jì)和TEM分析 所分離的部分表面改性的磁性納米顆粒，其中分別在圖8 (b)和圖9 (b)中示 出了結(jié)果。在TEM圖像中，SPION (-OA ) ex (-MHA ) IO納米顆粒之間的距離類似于SPION-OA的原因是如圖2的步驟C所述，用比OA短2個(gè)碳鏈的MHA零星 取代部分OA。此外，紅外光譜證實(shí)在約3300cm"處的O-H峰因取代MHA而增力口。 實(shí)施例8:制備靶向、生物相容和疏水的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) 10
向18ml實(shí)施例7中制備的SPION (陽OA) ex (-MHA ) 10溶液(3xl(T7M)中 添加30當(dāng)量DCC并攪拌3小時(shí)。在將30當(dāng)量aPEGa-MTX溶解在小量如下所述制 備的DMF內(nèi)之后，將所得溶液加入到所述混合物中并攪拌16小時(shí)。在濃縮所得 溶液并與乙醇混合之后，通過使用磁力分離SPION ( -OA ) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) 10并分散在9ml氯仿內(nèi)。用紅外分光計(jì)和TEM分析1 ml 分散體，其中分別在圖8 (c)和圖9 (c)中示出了結(jié)果。在TEM圖像中發(fā)現(xiàn)， 磁性納米顆粒打破因自組裝導(dǎo)致的六面體排列，并零星地散射，從而證明引入 了歸因于aPEGa-MTX的不規(guī)則結(jié)構(gòu)。此外，在紅外光譜中還證實(shí)，分別在約1100 和1630cm"處檢測(cè)到PEG和MTX的特征峰。
通過鍵合生物相容分子aPEGa到乾向分子MTX上，制備aPEGa-MTX 在將454mg ( lmmol) MTX (甲氨喋呤，美國(guó)參考標(biāo)準(zhǔn))溶解在14ml干餾 DMF內(nèi)之后，將含該混合物的燒瓶浸泡在冰洛中并攪拌10分鐘。將226mg (Ummol)DCC加入到燒瓶中并攪拌18小時(shí)。向其中添力口lmmol aPEGa并進(jìn)一 步攪拌3小時(shí)。向所得溶液中添加二乙醚，形成沉淀，并用相同的溶劑重結(jié)晶， 從而獲得13 8mgaPEGa-MTX 。
實(shí)施例9:制備耙向、生物相容和水溶性磁性納米顆粒SPION (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-MTX ) 10
向8ml實(shí)施例8制備的SPION ( -OA ) ex (國(guó)MHA-aPEGa-MTX ) 10溶液 (6xl(T7M )中添加150當(dāng)量通過溶解0.05M MPA和0.05M NaOH而制備的甲醇溶 液并攪拌2小時(shí)。將甲醇加入到所得溶液中并離心，獲得固體SPION (-MPA) ex (-而A-aPEGa-MTX ) 10。將SPION (-MPA ) ex (-MUA曙aPEGa-MTX ) 10 分散在16mlPBS緩沖液(pH7.4)內(nèi)。用紅外光譜和TEM分析lml的分散體， 其中圖8 (d)和圖9 (d)分別示出了結(jié)果。紅外光譜發(fā)現(xiàn)，C-H峰的強(qiáng)度顯著下降，這是因?yàn)楫?dāng)用MPA替代OA時(shí)，碳鏈長(zhǎng)度下降。此外，TEM圖像證實(shí)， 盡管當(dāng)制備樣品時(shí)，因使用水溶液引起的表面張力導(dǎo)致的疊加效應(yīng)，但明顯地 觀察到顆粒間的距離。
實(shí)施例10:制備乾向、生物相容和水溶性磁性納米顆粒SPION (-Lys) ex
(-MUA-aPEGa-MTX ) 10
向6ml實(shí)施例7和8中制備的SPION (-OA ) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) IO溶液
(6xl(T7M)中添加1000當(dāng)量四辛基溴化銨(TOAB)并撹拌16小時(shí)。將6ml、 O.IM的賴氨酸(Lys)水溶液加入到該混合物中并攪拌19小時(shí)?；旌纤萌芤?與甲醇，并通過使用磁力分離SPION (-Lys ) ex (-MUA-aPEGa-MTX ) 10納米 顆粒。用5ml甲苯和5ml乙醇洗滌分離的納米顆粒，并分散在PBS緩沖液(pH 7.4 ) 內(nèi)。用紅外光譜和TEM分析lml分散體，其中圖8(e)和圖9(e)分別示出了結(jié) 果。紅外光譜發(fā)現(xiàn)，C-H峰的強(qiáng)度顯著下降，這是因?yàn)橛觅嚢彼崽娲薕A。此 外，TEM圖像證實(shí)，盡管當(dāng)制備樣品時(shí)，因使用水溶液引起的表面張力導(dǎo)致的 疊加效應(yīng)，但明顯地觀察到顆粒間的距離。
實(shí)施例ll:制備靶向、生物相容和疏水的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex
(-MHA-en-FA) 5和利用它的生物成像
用乙醇洗滌2ml粒度為ll納米的疏水SPION-OA磁性納米顆粒溶液
(3x10-6M) 2次，在20ml甲苯內(nèi)分散，然后加熱到100'C。將5當(dāng)量巰基十六烷 酸(MHA)加入到該混合物中，回流l小時(shí)并冷卻。向所得溶液中添加15當(dāng)量 DCC,并在黑暗的惰性氛圍內(nèi)攪拌3小時(shí)。向其中添加16當(dāng)量通過在小量DMF 內(nèi)溶解而制備的實(shí)施例13制備的en-FA并攪拌16小時(shí)。在濃縮所得溶液之后，向 其中添加小量乙醇，并通過使用磁力分離SPION (-OA) ex (-MHA-en-FA) 5 納米顆粒。將分離的納米顆粒分散在10ml氯仿內(nèi)。在圖8(f)中示出了這些納 米顆粒的紅外光譜，證明在約1630cm"處檢測(cè)到FA的特征峰。
在稀釋以上制備的SPION (-OA ) ex (-MHA-en-FA ) 5溶液到1 x 10^M的最 終濃度時(shí)，在培養(yǎng)皿內(nèi)均勻地噴灑lml稀釋劑，并自然干燥。第二天，用70%乙 醇和UV給培養(yǎng)皿滅菌，培養(yǎng)2xl05個(gè)細(xì)胞的人上皮癌細(xì)胞系KB細(xì)胞(ATCCManassas, VA )，然后在37。C的恒溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)。收集培養(yǎng)的細(xì)胞并 進(jìn)一步在未處理的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)。為了比較納米顆粒的耙向行為，如上所 述進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，所不同的是將10嗎/ml FA加入到培養(yǎng)溶液中。用磁共振成 像(MRI)分析每一種如此處理的細(xì)胞，其中在圖10中示出了結(jié)果。定量分析 MR圖像的結(jié)果是，證實(shí)在細(xì)胞表面上共存的過量游離FA占據(jù)受體，從而導(dǎo)致 靶向的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA-en-FA ) 5的乾向性下降10% 。這 些結(jié)果暗含疏水磁性納米顆粒通過鍵合的FA顯示出顯著有意義的靶向性。
盡管相對(duì)于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案描述和闡述了本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域的 技術(shù)人員來說，顯而易見的是，可在沒有脫離本發(fā)明的寬泛的原理和教導(dǎo)的情 況下，各種變化和改性是可能的，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)僅僅通過所附的權(quán)利要求的范圍 來限制。
權(quán)利要求
1、一種通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆粒的方法，其特征在于，該方法包括1)添加1-30當(dāng)量含有通過8-20個(gè)碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的有機(jī)配體到用表面活性劑保護(hù)的核或核/殼結(jié)構(gòu)的疏水無機(jī)納米顆粒中，從而用有機(jī)配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，從而導(dǎo)致制備其表面僅僅部分改性為親水性質(zhì)且仍然維持它在非極性有機(jī)溶劑內(nèi)的單獨(dú)的分散性的疏水納米顆粒；2)將官能分子鍵合到在步驟1)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團(tuán)上，以提供納米顆粒表面官能度和不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，同時(shí)維持它們單獨(dú)的分散性；和3)用其中至少兩個(gè)親水基團(tuán)通過1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的無機(jī)納米顆粒是貴金屬納米顆粒、氧化鐵納 米顆?；虬雽?dǎo)體納米顆粒，所述納米顆粒選自由屬于周期表第II族的鋅、鎘和 鉛中的一種元素和選自屬于周期表第VI族的硫、硒和碲中的一種元素組成。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，所述無機(jī)納米顆粒選自CdSe、 ZnS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 Au、 Ag、 Fe203和Fe304。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的有機(jī)配體包括在配體分子內(nèi)的至少一個(gè)硫醇 基和至少一個(gè)親水基團(tuán)，其中親水基團(tuán)選自胺基、羧酸基、羥基和硫醇基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的有機(jī)配體選自巰基十一烷酸、巰基十二烷酸和巰基十六烷酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，能借助金屬-硫醇鹽鍵鍵合到納米顆粒表面上的步驟l)的有機(jī)配體數(shù)量范圍為1-30。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟2)的官能分子是生物相容分子、靶向分子、其絡(luò) 合物，或其混合物，它含有與其一個(gè)或兩個(gè)端基相連的選自胺基、醛基、羧酸 基、羥基和硫醇基中的親水基團(tuán)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟3)的有機(jī)配體含有至少兩個(gè)親水基團(tuán)，其中親水 基團(tuán)選自胺基、羧酸基、羥基和硫醇基。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟3)的有機(jī)配體選自巰基己酸、巰基乙酸、巰基丙 酸、二巰基琥珀酸、2-巰基乙醇、2-胺基乙二硫醇、賴氨酸、精氨酸和胺基戊 酸。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，生物相容分子在兩個(gè)端基處含有選自胺基、醛基和羧 酸基中的親水基團(tuán)，或者在一個(gè)端基處含有選自胺基、醛基和羧酸基的親水基 團(tuán)和在另一端基處含有具有l(wèi)-7個(gè)碳原子的烷氧基或羥基。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米 顆粒的方法，其特征在于，生物相容分子選自聚乙二醇、葡聚糖、聚(L-丙交 酯)、聚(DL-丙交酯)、聚-DL-丙交酯/乙交酯共聚物、殼聚糖、藻酸、透明 質(zhì)酸、膠原、肝素和聚(s-己內(nèi)酯)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，靶向分子可在體內(nèi)特異地識(shí)別，含有選自胺基、羧酸 基、羥基和硫醇基中的親水基團(tuán)，且可通過形成酰胺鍵、酯鍵或硫酯鍵，與生 物相容分子相連。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米 顆粒的方法，其特征在于，靶向分子是葉酸、氨甲喋呤、對(duì)特定細(xì)胞具有選擇 性的肽，或者與特定抗原選擇性反應(yīng)的抗體。
14、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法中的步驟l)制備的生物成像的納米顆粒，它僅僅在納米顆粒表面的一部分處親水，其特征在于，含有通過8-20個(gè)碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的有機(jī)配體被引入到用表面活性劑保護(hù)的核或核/殼結(jié)構(gòu)的疏水無機(jī)納米顆 粒內(nèi)，但整體上仍然疏水，且維持它們?cè)诜菢O性有機(jī)溶劑內(nèi)單獨(dú)的分散性。
15、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法中的步驟2)制備的生物成像的納米顆粒，其特征在于，它具有歸因于 官能分子鍵合到在權(quán)利要求14的納米顆粒表面內(nèi)引入的親水基團(tuán)上導(dǎo)致的官能 度和不規(guī)則結(jié)構(gòu)，且僅僅在其中官能分子鍵合到其上的納米顆粒的一部分表面 處親水，但整體上仍然疏水。
16、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像納米顆 粒的方法中的步驟3)制備的生物成像的納米顆粒，其特征在于，通過用含至少 兩個(gè)親水基團(tuán)通過1-7個(gè)碳原子的烴鏈連接的有機(jī)配體替代權(quán)利要求15的納米 顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將它完全轉(zhuǎn)化成親水納米顆粒，并維 持它們?cè)谒芤簝?nèi)的單獨(dú)的分散性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)生物成像的納米顆粒及其制造方法。本發(fā)明的目的是提供制備生物成像納米顆粒的方法，其中通過借助部分表面改性，早期引入不規(guī)則結(jié)構(gòu)到納米顆粒的表面內(nèi)，允許在結(jié)構(gòu)上妨礙因納米顆粒內(nèi)部氫鍵吸引導(dǎo)致的聚集和沉淀現(xiàn)象，從而在沒有損失納米顆粒的情況下，高產(chǎn)率地在非極性有機(jī)溶劑或水溶液內(nèi)制備具有高分散性和穩(wěn)定性的生物成像的納米顆粒。
文檔編號(hào)C01G11/02GK101422621SQ20081010046
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者文智炯, 禹庚子 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院