胎兒dna芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胎兒DNA芯片及其應(yīng)用。該胎兒DNA芯片包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針點(diǎn)陣，所述寡核苷酸探針包含對(duì)應(yīng)于125種懷孕期常見(jiàn)胎兒遺傳性或出生缺陷型疾病相關(guān)基因的寡核苷酸序列，所述125種疾病包括1q21.2缺失或重復(fù)、1q41-q42片段缺失等。藉此該胎兒DNA芯片可構(gòu)建產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查系統(tǒng)。本發(fā)明的胎兒DNA芯片具有平行分析和多重分析特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)125種疾病相關(guān)的遺傳變異，致病區(qū)間分辨率和疾病檢測(cè)準(zhǔn)確度高，可靠性良好，能夠在懷孕早期針對(duì)基因拷貝數(shù)異常引起的常見(jiàn)遺傳病和出生缺陷進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分子診斷，適于臨床應(yīng)用，可對(duì)患病胎兒進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和有效干預(yù)，有助于進(jìn)一步降低出生缺陷的發(fā)生率。
【專利說(shuō)明】胎兒DNA芯片及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因芯片，特別涉及一種用于產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查的胎兒DNA芯片及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著“人類基因組計(jì)劃”的完成，對(duì)生命與疾病本質(zhì)的研究有了重大突破，促進(jìn)了現(xiàn)代基因檢測(cè)手段的進(jìn)步，使人們可以在妊娠早期，對(duì)異常胎兒進(jìn)行染色體畸變和染色體微小異常的產(chǎn)前診斷，防止患兒出生。當(dāng)前，染色體顯帶、比較基因組雜交(CGH)和熒光原位分子雜交(FISH)是分析染色體畸變的主要方法。然而，由于出生缺陷兒染色體常存在多重畸變以及亞顯微水平的畸變，如先天性心臟病、孤獨(dú)癥、智力低下、先天性多發(fā)畸形等常伴有基因組一千到幾十兆堿基的基因拷貝數(shù)異常，這些遺傳物質(zhì)不平衡在遺傳病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。染色體顯帶或CGH受分辨率的限制，難以檢測(cè)出小于IOMb或IMb以下的亞顯微的異常；FISH技術(shù)僅針對(duì)某些特定的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，缺乏整體性，難以對(duì)全基因組進(jìn)行分析。因此，建立嚴(yán)重出生缺陷和遺傳病高通量的早期篩查和診斷的新方法、新技術(shù)平臺(tái)和服務(wù)體系，擴(kuò)大單次檢測(cè)的病種范圍，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
[0003]微陣列比較基因組雜交(Microarray-basedComparative GenomicHybridization, aCGH)是近來(lái)被臨床實(shí)驗(yàn)室采用的、具有革命意義的一種檢測(cè)染色體微小異常的技術(shù)平臺(tái)，其主要原理是:在玻片上以微點(diǎn)陣的形式固定各種探針，組成二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣本中靶分子雜交，通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，對(duì)每一個(gè)探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而能夠高分辨率地檢測(cè)出導(dǎo)致遺傳病或出生缺陷 的基因拷貝數(shù)變異(CNV)，具有自動(dòng)化程度高、檢測(cè)靶分子種類多、效率高、結(jié)果客觀性強(qiáng)等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、高通量檢測(cè)和診斷。
[0004]目前，市場(chǎng)上基于aCGH技術(shù)的商品化產(chǎn)品主要有Agilent公司推出的44K芯片、244K芯片和IM芯片等，其專門用于全基因組范圍內(nèi)基因拷貝數(shù)變異(CNV)的檢測(cè)。但前述44K和244K芯片還存在諸多不足，例如，這些芯片還涵蓋了一些非致病性的基因拷貝數(shù)變異(CNV)區(qū)段，雖然整體探針數(shù)較多，但是分布到特定基因(尤其是常見(jiàn)致病性基因)上的探針密度相對(duì)較低，不能滿足臨床樣本檢測(cè)“要求高度的準(zhǔn)確性和精密度”的需求。而前述IM芯片雖然涵蓋的基因拷貝數(shù)變異區(qū)段較多，探針密度有一定的提高，但涵蓋過(guò)多冗余的區(qū)間，大大增加了診斷結(jié)果的不確定性和臨床解釋的難度，仍無(wú)法很好的滿足產(chǎn)前臨床檢測(cè)的需求，尤其是其成本十分昂貴，難以進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要目的在于提供一種胎兒DNA芯片，其具有較高的致病區(qū)間分辨率和疾病檢測(cè)準(zhǔn)確度，可靠性良好，可檢測(cè)的病種達(dá)到125種，基本覆蓋了懷孕期常見(jiàn)的胎兒遺傳性疾病和出生缺陷，適合于臨床胎兒樣本產(chǎn)前檢測(cè)，且其成本低廉，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供所述胎兒DNA芯片的應(yīng)用方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0008]—種胎兒DNA芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針點(diǎn)陣，其中，所述寡核苷酸探針包含對(duì)應(yīng)于125種懷孕期常見(jiàn)胎兒遺傳性和出生缺陷型疾病相關(guān)基因的寡核苷酸序列，所述125種疾病包括lq21.2缺失或重復(fù)、Iq41_q42缺失、2ρ15ρ16.1缺失癥候群、2q22.3缺失癥候群、2q37缺失、3q29缺失癥候群、5q21.1_q31.2缺失癥候群、7qll.23重復(fù)、8p23.1缺失癥候群、9p部分單體性綜合癥、9q34.3缺失癥候群、10q22.3-q23.31 缺失、llqll_ql3.3 重復(fù)、15q24 片段缺失、16ρ11.2_ρ12.I 缺失、17ρ11.2重復(fù)、17q21.31缺失、18p缺失癥候群、18q缺失癥候群、22qll.2缺失或重復(fù)、22ql3.3片段缺失癥候群、阿拉吉?dú)W癥候群、甲型地中海貧血、亞伯氏癥候群、雄性激素不敏感癥候群、非倍體變異、天使癥候群、安格曼癥候群、威爾姆氏腫瘤、無(wú)虹膜、性器異常、智能障礙癥候群、巨頭、多發(fā)脂肪瘤和血管瘤綜合癥、基底細(xì)胞痣綜合癥、貝克威思-威德曼綜合癥、兩極情緒違常/躁狂癥、Branchio-Oto-Renal癥候群、布魯頓氏低免疫球蛋白癥、短指發(fā)育不良及性反轉(zhuǎn)、皮膚癥候群、貓眼綜合癥、恰克-馬利-杜斯氏癥、CHARGE聯(lián)合畸形、鎖顱骨發(fā)育異常癥、狄蘭吉氏癥候群、多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤綜合癥、貓鳴癥候群、皮膚松垂癥、胱氨酸血癥、Dandy-Walker癥候群、先天性膈_、顎心面綜合癥(DiGeorge綜合癥)、唐氏綜合癥、杜興氏肌肉萎縮癥、Dyggve-梅爾基奧爾-克勞森綜合癥、Feingold綜合癥、前腦缺損、脆X綜合癥、甘油激酶缺乏癥、Greig頭多并指綜合癥、遺傳性壓力易感性神經(jīng)病變、前腦發(fā)育畸形癥I型、前腦發(fā)育畸形癥2型、前腦發(fā)育畸形癥3型、前腦發(fā)育畸形癥4型、前腦發(fā)育畸形癥5型、前腦發(fā)育畸形癥6型、前腦發(fā)育畸形癥7型、前腦發(fā)育畸形癥9型、嬰兒期痙攣綜合癥、雅各布森綜合癥、joubert氏癥候群、卡門氏癥候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能癥和嗅覺(jué)缺失、蘭-吉綜合癥、 萊希尼亨癥候群、腦白質(zhì)失養(yǎng)癥、平腦癥、男性MECP2拷貝數(shù)變異、Menkes氏癥候群、緬克斯癥候群、孟奇病、小眼球合并皮膚缺損、小腦癥、先天性心臟病、小眼綜合癥、垂體發(fā)育不全小眼綜合癥、無(wú)腦回畸形、粘多糖貯積癥、甲髕骨癥候群、腎消耗病/腎結(jié)核、努南氏癥候群、歐比司癥候群、口面指[趾]綜合癥、帕利斯特-基利安鑲嵌綜合癥、慢性兒童型腦硬化癥、著絲粒周緣區(qū)域缺失、Potock1-Shaffer綜合癥、普瑞德威利癥候群、Prader-Will1-like表型、瑞特氏癥候群、里格爾綜合癥、魯賓斯坦-泰比癥候群、骶骨/肛腸畸形綜合癥、薩一邱氏癥候群、史密斯-馬吉利氏癥候群、腦性巨大畸形、索特斯癥侯群、裂手裂足癥I型、裂手裂足癥3型、端粒及近端區(qū)缺失綜合癥、并多指(趾)畸形、血小板過(guò)低合并橋骨缺失癥候群、Treacher Collins癥候群、楚列雀可林斯癥候群、毛發(fā)-鼻-指(趾)綜合癥、范德伍茲綜合癥、瓦登伯革氏癥候群、威廉氏癥候群、沃夫-賀許宏氏癥、X染色體失活、X連鎖臟器異位癥候群、X連鎖淋巴組織增生綜合癥、Xpll.3缺失伴智障、X連鎖魚鱗病，等等。
[0009]進(jìn)一步的，所述125種疾病相關(guān)基因在染色體上分布的區(qū)段可參閱http://genome, ucsc.edu/。
[0010]進(jìn)一步的，所述探針至少滿足如下設(shè)計(jì)要求:(1)跳過(guò)目標(biāo)序列中重復(fù)的屏蔽區(qū)域；(2)與互補(bǔ)基因序列雜交后的解鏈溫度盡可能接近80°C的解鏈溫度；(3)寡核苷酸長(zhǎng)度在45-60mer之間；(4)寡核苷酸序列中G+C含量在40-60%之間；(5)寡核苷酸序列中避免有5個(gè)以上重復(fù)堿基。[0011]前述的“盡可能”應(yīng)理解為偏差幅度在±5°C以內(nèi)。
[0012]進(jìn)一步的，所述寡核苷酸探針以陣列方式排布在固相載體上，形成分辨率在IMb以內(nèi)的探針微陣列。
[0013]進(jìn)一步的，至少對(duì)于其中選定的一種以上寡核苷酸探針而言，其至少在固相載體上重復(fù)點(diǎn)樣兩次，形成均勻分布的探針重復(fù)點(diǎn)。另外，大于300個(gè)對(duì)照探針至少重復(fù)5次。
[0014]進(jìn)一步的，所述寡核苷酸探針在固相載體上的排布順序至少滿足如下要求:對(duì)照探針占比大于1%，探針間的間距一般大于200bp，探針效能分，其平均值大于0.75 (利用eArray網(wǎng)站中Genomic Tiling功能計(jì)算),重復(fù)探針的數(shù)量大于300個(gè),重復(fù)次數(shù)為2-5次，優(yōu)選為5次。更具體的，還可將這些探針在空白芯片上的有序排列組合，包括其名稱、序列、位置、種類、排布方式等保存在“設(shè)計(jì)文件”(design file)中。
[0015]進(jìn)一步的，所述固相載體上至少還分布有陰性對(duì)照點(diǎn)和陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)。這些對(duì)照探針占比大于1%。
[0016]進(jìn)一步的，所述固相載體包括玻片，當(dāng)然亦可為業(yè)界習(xí)用的其它載體，如高分子材
料基質(zhì)等。
[0017]—種產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查系統(tǒng),包括:
[0018]前述胎兒DNA芯片，
[0019]至少用以掃描與待檢樣品反應(yīng)后的所述胎兒DNA芯片，并采集相應(yīng)探針雜交信號(hào)的圖像處理單元，以及，
`[0020]至少用以處理所述探針雜交信號(hào)，并輸出篩查結(jié)果的數(shù)據(jù)處理單元，
[0021]其中，所述數(shù)據(jù)處理單元內(nèi)還包含用以將每一探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)文件(design file)。
[0022]一種胎兒DNA芯片讀取方法，包括:
[0023]將待檢樣品和參照樣本與前述胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交；
[0024]以圖像處理單元掃描與采集所述胎兒DNA芯片上呈現(xiàn)的探針雜交信號(hào)；
[0025]以及，以數(shù)據(jù)處理單元處理所述探針雜交信號(hào)，并輸出篩查結(jié)果，
[0026]其中，所述數(shù)據(jù)處理單元內(nèi)還包含用以將每一探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)文件
[0027]—種產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查方法,包括:
[0028]將經(jīng)過(guò)標(biāo)記物標(biāo)記的待檢樣品及參照樣本與前述胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交，之后，利用圖像處理單元掃描與采集雜交反應(yīng)后芯片上相應(yīng)探針雜交信號(hào)，其后將探針雜交信號(hào)輸入數(shù)據(jù)處理單元，并依據(jù)預(yù)存的設(shè)計(jì)文件，將探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品是否存在致病性的拷貝數(shù)變異進(jìn)行自動(dòng)化判斷，并輸出篩查結(jié)果。
[0029]在一更為具體的實(shí)施例中，利用前述產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查的過(guò)程可以包括:將分別經(jīng)過(guò)Cy3和Cy5熒光染料標(biāo)記的待檢樣本及參照樣本與前述胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交，之后，利用圖像處理單元掃描與采集雜交反應(yīng)后芯片上相應(yīng)探針雜交信號(hào)，其后將探針雜交信號(hào)輸入數(shù)據(jù)處理單元，并依據(jù)預(yù)存的設(shè)計(jì)文件，將探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品的分析，并輸出篩查結(jié)果。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點(diǎn):[0031](I)去除了部分已知常見(jiàn)的沒(méi)有致病性的或未知臨床意義的CNV探針，可以減少背景噪，使檢測(cè)數(shù)據(jù)更易于后期分析，同時(shí)，去除了未知臨床意義的CNV，從而避免了未知臨床意義的CNV帶來(lái)的臨床解釋困難的問(wèn)題，例如，醫(yī)生無(wú)法跟患者解釋和交代病情的尷尬；
[0032](2)增加了跟疾病相關(guān)的探針的密度，大大提高了致病區(qū)間的分辨率，例如，分辨率可高達(dá)950bp，同時(shí)還可提高疾病檢測(cè)的準(zhǔn)確度，換言之，若多個(gè)探針同時(shí)異常，其提示疾病的可靠程度也隨之增加；
[0033](3)將檢測(cè)的病種定位在懷孕期常見(jiàn)的胎兒遺傳性疾病和出生缺陷上，增加種類達(dá)到125種，因此更加適合于臨床胎兒樣本產(chǎn)前檢測(cè)；
[0034](4)從成本上比，本發(fā)明的胎兒DNA芯片比Agilent公司商品化的244K和IM的芯片低，但其對(duì)產(chǎn)前胎兒樣本的異常檢出能力超過(guò)了 244K的精度，某些區(qū)域的分辨率甚至也超過(guò)了 IM的芯片。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1是本發(fā)明一典型實(shí)施例中胎兒DNA芯片與Agilent商品化244K芯片探針的檢測(cè)探針密度對(duì)比圖，其中，A為采用Agilent公司市售的244K芯片對(duì)一例21-三體樣本檢測(cè)的結(jié)果為采用本發(fā)明芯片對(duì)同一樣本檢測(cè)的結(jié)果，其探針密度較高。
[0036]圖2a是本發(fā)明一典型實(shí)施例中胎兒DNA芯片與Agilent商品化244K芯片的信噪比情況比較圖，其中，A為采用Agilent公司市售的244K芯片對(duì)一例21-三體樣本檢測(cè)的結(jié)果為采用本發(fā)明芯片對(duì)同一樣本檢測(cè)的結(jié)果，其上導(dǎo)致背景噪的探針都被去除了 ；
[0037]圖2b是圖2a的局部放大圖；
[0038]圖3是本發(fā)明又一典型實(shí)施例中胎兒DNA芯片(44K，A所示)與Agilent公司的商品化芯片(B所示)、Aff ymetrix公司及Illumina公司的SNP芯片(C所示)的比較圖?！柏Q線”標(biāo)示探針的位置及數(shù)量，本發(fā)明的胎兒DNA芯片覆蓋到致病區(qū)的探針?lè)植驾^為均勻而且
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[0039]圖4是本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中胎兒DNA芯片的使用方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]生命科學(xué)領(lǐng)域的研究人員悉知，在人類基因組中包含有30億個(gè)堿基，而迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7000多種致病基因，因此，若要實(shí)現(xiàn)全部致病基因的臨床診斷，其在現(xiàn)有技術(shù)條件下是極難實(shí)現(xiàn)的。這就意味著，在當(dāng)前，為滿足臨床應(yīng)用的需求，則需要從中選擇哪些序列優(yōu)先放置到芯片上。
[0041]一般而言，選擇要被芯片涵蓋的序列的常規(guī)途徑包括:一、根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定需要囊括哪些常見(jiàn)病種和致病區(qū)間或致病基因；二、通過(guò)前期試驗(yàn)驗(yàn)證，選擇那些誤差較小、信號(hào)較正常的探針序列。
[0042]迄今業(yè)界的研究人員也沒(méi)有能夠達(dá)成這樣的目的，即，選擇出合適的序列，并藉此形成芯片，繼而在臨床實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查，并取得較為理想的篩查結(jié)果。例如，盡管前述Agilent公司推出的商業(yè)化44K芯片、244K芯片和IM芯片等在一定程度上也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)某些病種的篩查，但其存在前述的諸多缺陷，如背景噪高、精密度低或成本高昂等。
[0043]鑒于這種現(xiàn)狀，本案發(fā)明人經(jīng)大量的臨床實(shí)踐和研究，提出了本發(fā)明的胎兒DNA芯片，其在增加特異性和準(zhǔn)確度、降低成本效益比、提高檢出率具有很大優(yōu)勢(shì)，適用于產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0044]本發(fā)明的胎兒DNA芯片包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含對(duì)應(yīng)于125種懷孕期常見(jiàn)胎兒遺傳性和出生缺陷型疾病相關(guān)基因的寡核苷酸序列，所述125種疾病包括lq21.2缺失或重復(fù)、Iq41_q42缺失、2ρ15ρ16.1缺失癥候群、2q22.3缺失癥候群、2q37缺失、3q29缺失癥候群、5q21.1_q31.2缺失癥候群、7qll.23重復(fù)、8p23.1缺失癥候群、9p部分單體性綜合癥、9q34.3缺失癥候群、10q22.3_q23.31缺失、llqll-ql3.3 重復(fù)、15q24 片段缺失、16pl1.2_pl2.1 缺失、17pll.2 重復(fù)、17q21.31 缺失、18p缺失癥候群、18q缺失癥候群、22qll.2缺失或重復(fù)、22ql3.3片段缺失癥候群、阿拉吉?dú)W癥候群、甲型地中海貧血、亞伯氏癥候群、雄性激素不敏感癥候群、非倍體變異、天使癥候群、安格曼癥候群、威爾姆氏腫瘤、無(wú)虹膜、性器異常、智能障礙癥候群、巨頭、多發(fā)脂肪瘤和血管瘤綜合癥、基底細(xì)胞疲綜合癥、貝克威思_威德曼綜合癥、兩極情緒違常/躁狂癥、Branchio-Oto-Renal癥候群、布魯頓氏低免疫球蛋白癥、短指發(fā)育不良及性反轉(zhuǎn)、皮膚癥候群、貓眼綜合癥、恰克-馬利-杜斯氏癥、CHARGE聯(lián)合畸形、鎖顱骨發(fā)育異常癥、狄蘭吉氏癥候群、多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤綜合癥、貓鳴癥候群、皮膚松垂癥、胱氨酸血癥、Dandy-Walker癥候群、先天性膈S1、顎心面綜合癥(DiGeorge綜合癥)、唐氏綜合癥、杜興氏肌肉萎縮癥、Dyggve-梅爾基奧爾-克勞森綜合癥、Feingold綜合癥、前腦缺損、脆X綜合癥、甘油激酶缺乏癥、Greig頭多并指綜合癥、遺傳性壓力易感性神經(jīng)病變、前腦發(fā)育畸形癥I型、前腦發(fā)育畸形癥2型、前腦發(fā)育畸形癥3型、前腦發(fā)育畸形癥4型、前腦發(fā)育畸形癥5型、前腦發(fā)育畸形癥6型、前腦發(fā)育畸形癥7型、前腦發(fā)育畸形癥9型、嬰兒期痙攣綜合癥、雅各布森綜合癥、joubert氏癥候群、卡門氏癥候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能癥和嗅覺(jué)缺失、蘭-吉綜合癥、萊希尼亨癥候群、腦白質(zhì)失養(yǎng)癥、平腦癥、男性MECP2拷貝數(shù)變異、Menkes氏癥候群、緬克斯癥候群、孟奇病、小眼球合并皮膚缺損、小腦癥、先天性心臟病、小眼綜合癥、垂體發(fā)育不全小眼綜合癥、無(wú)腦回畸形、粘多糖貯積癥、甲髕骨癥候群、腎消耗病/腎結(jié)核、努南氏癥候群、歐比司癥候群、口面指[趾]綜合癥、帕利斯特-基利安鑲嵌綜合癥、慢性兒童型腦硬化癥、著絲粒周緣區(qū)域缺失、Potock1-Shaffer綜合癥、普瑞德威利癥候群、Prader-Will1-like表型、瑞特氏癥候群、里格爾綜合癥、魯賓斯坦-泰比癥候群、骶骨/肛腸畸形綜合癥、薩一邱氏癥候群、史密斯-馬吉利氏癥候群、腦性巨大畸形、索特斯癥侯群、裂手裂足癥I型、裂手裂足癥3型、端粒及近端區(qū)缺失綜合癥、并多指(趾)畸形、血小板過(guò)低合并橋骨缺失癥候群、Treacher Collins癥候群、楚列雀可林斯癥候群、毛發(fā)-鼻-指(趾)綜合癥、范德伍茲綜合癥、瓦登伯革氏癥候群、威廉氏癥候群、沃夫-賀許宏氏癥、X染色體失活、X連鎖臟器異位癥候群、X連鎖淋巴組織增生綜合癥、Xpll.3缺失伴智障、X連鎖魚鱗病J等等。
[0045]其中，所述125種疾病相關(guān)基因在染色體上分布的區(qū)段如前所述。
[0046]進(jìn)一步的講，本發(fā)明中前述探針設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則:(1)跳過(guò)重復(fù)的屏蔽區(qū)域
(2)解鏈溫度(Tm)盡可能接近80°C的解鏈溫度(3)探針長(zhǎng)度在45-60mer之間(4)探針的G+C含量40-60%之間；(5)避免有5個(gè)以上重復(fù)堿基。
[0047]依據(jù)前述原則，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用業(yè)界悉知的各類方式，并結(jié)合人類全基因序列，實(shí)現(xiàn)探針的設(shè)計(jì)。[0048]其中，人類全基因序列可從NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)得到。
[0049]作為其中一種可選的實(shí)施方式，可以使用Agilent公司eArray在線軟件(https://earray.chem.agilent.com)進(jìn)行基因組疊瓦式設(shè)計(jì)目標(biāo)區(qū)探針。
[0050]作為其中另一種可選實(shí)施方式,亦可使用eArray軟件直接從安捷倫公司超過(guò)2800萬(wàn)個(gè)CGH探針庫(kù)中查找篩選符合目的基因區(qū)域的探針組。
[0051]本案發(fā)明人實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，依據(jù)前述原則設(shè)計(jì)的探針的有效性均可被良好驗(yàn)證。
[0052]進(jìn)一步的，通過(guò)將前述的寡核苷酸探針以陣列方式排布在固相載體上，形成探針微陣列，從而獲得胎兒DNA芯片。
[0053]另外，所述胎兒DNA芯片還可包含陰性和陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)和探針重復(fù)點(diǎn)來(lái)確保結(jié)果的
可靠性。
[0054]其中的探針重復(fù)點(diǎn)系通過(guò)將選定的寡核苷酸探針至少在固相載體上重復(fù)點(diǎn)樣兩次到五次而形成。
[0055]又及，為便于探知胎兒DNA芯片上每一探針與待檢樣本中特定序列完全結(jié)合與否，在待檢樣本和參照樣本上分別連接Cy3和Cy5熒光染料，從而直觀的獲得探針信號(hào)。
[0056]進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，還可依據(jù)設(shè)定規(guī)則將每一選定探針?lè)植荚谔篋NA芯片上的選定位置，再通過(guò)檢測(cè)與記錄在芯片上的每一選定位置的探針與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)所釋放的標(biāo)準(zhǔn)探針信號(hào)，從而可將芯片的每一位置所釋放的探針信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段定位關(guān)聯(lián)，進(jìn)而可以獲得相應(yīng)的計(jì)算軟件可讀形式的設(shè)計(jì)文件。
[0057]繼而，在對(duì)待檢樣`品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過(guò)將待檢樣品與胎兒DNA芯片上的探針雜交反應(yīng)時(shí)所釋放的探針信號(hào)與前述設(shè)計(jì)文件中的標(biāo)準(zhǔn)探針信號(hào)進(jìn)行比對(duì)，即可獲知其指示的相應(yīng)染色體區(qū)段信息。
[0058]進(jìn)一步的，所述寡核苷酸探針在固相載體上的排布順序至少滿足如下要求:對(duì)照探針占比大于1%，探針間的間距一般大于200bp，探針效能分，其平均值大于0.75 (利用eArray網(wǎng)站中Genomic Tiling功能計(jì)算)，重復(fù)探針的數(shù)量大于300個(gè),重復(fù)次數(shù)為2_5次，優(yōu)選為5次，這些探針在空白芯片上的有序排列組合，其名稱、序列、位置、種類、排布方式等可保存在“設(shè)計(jì)文件”(design file)中。
[0059]在本發(fā)明的一具體應(yīng)用方案中，本發(fā)明探針合成、芯片制作、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及結(jié)果分析可通過(guò)如下過(guò)程實(shí)現(xiàn)，即:
[0060]根據(jù)設(shè)計(jì)好的探針序列，委托Agilent公司采用SurePrint寡核苷酸噴墨打印技術(shù)在經(jīng)過(guò)處理的玻片表面上直接原位合成。芯片打印完成后即可構(gòu)成高密度的DNA微陣列，同時(shí)還在玻片上均勻設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)和探針重復(fù)點(diǎn)。最后，將干燥的胎兒DNA芯片放回潔凈的芯片盒中避光真空保存?zhèn)溆谩?br> [0061]在本發(fā)明的一可行實(shí)施方案中，藉由該胎兒DNA芯片，可構(gòu)建一種產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查系統(tǒng)，其可以包括:
[0062]前述胎兒DNA芯片，
[0063]至少用以掃描與待檢樣品反應(yīng)后的所述胎兒DNA芯片，并采集相應(yīng)探針雜交信號(hào)的圖像處理單元，以及，
[0064]至少用以處理所述探針雜交信號(hào)，并輸出篩查結(jié)果的數(shù)據(jù)處理單元，
[0065]其中，所述數(shù)據(jù)處理單元內(nèi)還包含用以將每一探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)文件。
[0066]相應(yīng)的產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查方法可以包括:
[0067]將經(jīng)過(guò)標(biāo)記物標(biāo)記的待檢樣品及參照樣本與前述胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交，之后，利用圖像處理單元掃描與采集雜交反應(yīng)后芯片上相應(yīng)探針雜交信號(hào)，其后將探針雜交信號(hào)輸入數(shù)據(jù)處理單元，并依據(jù)預(yù)存的映射文件，將探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品的分析，并輸出篩查結(jié)果。
[0068]本發(fā)明的提供的胎兒DNA芯片具有平行分析和多重分析特點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)125種疾病相關(guān)的基因拷貝數(shù)變異，能夠在懷孕早期針對(duì)異常表型胎兒進(jìn)行常見(jiàn)遺傳病和出生缺陷準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和評(píng)估，實(shí)現(xiàn)對(duì)患病胎兒進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和有效干預(yù)，進(jìn)一步減低出生缺陷的發(fā)生率。
[0069]關(guān)于本發(fā)明中芯片的基礎(chǔ)制作工藝等，還可參考如下文獻(xiàn):[0070]1.Leung TY, VogeI I, Lau TK, Chong W，Hyett JA, Petersen OB, ChoyKff.“Identification of submicroscopic chromosomal aberrations in fetuses withincreased nuchal translucency and apparently normal karyotype，，，((UltrasoundObstet Gynecol)), 2011Sep; 38 (3): 314-9.[0071]2.陳瑛蔡光偉，“采用微陣列-比較基因組雜交進(jìn)行產(chǎn)前診斷的局限性和困難”，《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志》，2011年第I期，p47-51.[0072]3.Chen Y, Mao J, Sun Y, Zhang Q, Cheng HB, Yan WH, Choy Kff, Li H.“A novelmutation of GATA4in a familial atrial septal defect”， 《Clin Chim Acta》，2010Novll;411(21-22):1741-5.[0073]4.Chan L, Choy K, Leung T, Lau T.“Prenatal diagnosis by array-comparativegenomic hybridization”，《Expert Opin Med Diagn)), 2009Nov; 3 (6): 649-57.[0074]參閱圖5,在本發(fā)明的一較為優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種DNA胎兒芯片的使用方法可以包括如下步驟:
[0075]1.熱裂解
[0076]將待測(cè)樣本基因組DNA (gDNA)和參照樣本的gDNA各I μ g加入0.5mL離心管中，補(bǔ)足去離子水(dH20)至20.2 μ L,加 5 μ L隨機(jī)引物(Random Primers), 95°C孵育3分鐘,立即置冰上冷卻。
[0077]2.熒光標(biāo)記
[0078]( I)配制標(biāo)記混合體系，如下:
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種胎兒DNA芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針點(diǎn)陣，其特征在于，所述寡核苷酸探針包含對(duì)應(yīng)于125種懷孕期常見(jiàn)胎兒遺傳性和出生缺陷型疾病相關(guān)基因的寡核苷酸序列，所述125種疾病包括lq21.2缺失或重復(fù)、Iq41_q42缺失、2ρ15ρ16.1缺失癥候群、2q22.3缺失癥候群、2q37缺失、3q29缺失癥候群、5q21.1_q31.2缺失癥候群、7qll.23重復(fù)、8p23.1缺失癥候群、9p部分單體性綜合癥、9q34.3缺失癥候群、10q22.3-q23.31 缺失、llqll_ql3.3 重復(fù)、15q24 片段缺失、16ρ11.2_ρ12.I 缺失、17ρ11.2重復(fù)、17q21.31缺失、18p缺失癥候群、18q缺失癥候群、22qll.2缺失或重復(fù)、22ql3.3片段缺失癥候群、阿拉吉?dú)W癥候群、甲型地中海貧血、亞伯氏癥候群、雄性激素不敏感癥候群、非倍體變異、天使癥候群、安格曼癥候群、威爾姆氏腫瘤、無(wú)虹膜、性器異常、智能障礙癥候群、巨頭、多發(fā)脂肪瘤和血管瘤綜合癥、基底細(xì)胞痣綜合癥、貝克威思-威德曼綜合癥、兩極情緒違常/躁狂癥、Branchio-Oto-Renal癥候群、布魯頓氏低免疫球蛋白癥、短指發(fā)育不良及性反轉(zhuǎn)、皮膚癥候群、貓眼綜合癥、恰克-馬利-杜斯氏癥、CHARGE聯(lián)合畸形、鎖顱骨發(fā)育異常癥、狄蘭吉氏癥候群、多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤綜合癥、貓鳴癥候群、皮膚松垂癥、胱氨酸血癥、Dandy-Walker癥候群 、先天性膈_、顎心面綜合癥、唐氏綜合癥、杜興氏肌肉萎縮癥、Dyggve-梅爾基奧爾-克勞森綜合癥、Feingold綜合癥、前腦缺損、脆X綜合癥、甘油激酶缺乏癥、Greig頭多并指綜合癥、遺傳性壓力易感性神經(jīng)病變、前腦發(fā)育畸形癥I型、前腦發(fā)育畸形癥2型、前腦發(fā)育畸形癥3型、前腦發(fā)育畸形癥4型、前腦發(fā)育畸形癥5型、前腦發(fā)育畸形癥6型、前腦發(fā)育畸形癥7型、前腦發(fā)育畸形癥9型、嬰兒期痙攣綜合癥、雅各布森綜合癥、joubert氏癥候群、卡門氏癥候群、促性腺激素分泌不足的低性腺功能癥和嗅覺(jué)缺失、蘭-吉綜合癥、萊希尼亨癥候群、腦白質(zhì)失養(yǎng)癥、平腦癥、男性MECP2拷貝數(shù)變異、Menkes氏癥候群、緬克斯癥候群、孟奇病、小眼球合并皮膚缺損、小腦癥、先天性心臟病、小眼綜合癥、垂體發(fā)育不全小眼綜合癥、無(wú)腦回畸形、粘多糖貯積癥、甲髕骨癥候群、腎消耗病/腎結(jié)核、努南氏癥候群、歐比司癥候群、口面指/趾綜合癥、帕利斯特-基利安鑲嵌綜合癥、慢性兒童型腦硬化癥、著絲粒周緣區(qū)域缺失、Potock1-Shaffer綜合癥、普瑞德威利癥候群、Prader-Will1-like表型、瑞特氏癥候群、里格爾綜合癥、魯賓斯坦-泰比癥候群、骶骨/肛腸畸形綜合癥、薩一邱氏癥候群、史密斯-馬吉利氏癥候群、腦性巨大畸形、索特斯癥侯群、裂手裂足癥I型、裂手裂足癥3型、端粒及近端區(qū)缺失綜合癥、并多指/趾畸形、血小板過(guò)低合并橋骨缺失癥候群、Treacher Collins癥候群、楚列雀可林斯癥候群、毛發(fā)-鼻-指/趾綜合癥、范德伍茲綜合癥、瓦登伯革氏癥候群、威廉氏癥候群、沃夫-賀許宏氏癥、X染色體失活、X連鎖臟器異位癥候群、X連鎖淋巴組織增生綜合癥、Xpll.3缺失伴智障、X連鎖魚鱗病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎兒DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針至少滿足如下設(shè)計(jì)要求:(1)跳過(guò)目標(biāo)序列中重復(fù)的屏蔽區(qū)域；(2)與互補(bǔ)基因序列雜交后的解鏈溫度盡可能接近80°C的解鏈溫度；(3)寡核苷酸長(zhǎng)度在45-60mer之間；(4)寡核苷酸序列中G+C含量在40-60%之間；(5)寡核苷酸序列中避免有5個(gè)以上重復(fù)堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎兒DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針以陣列方式排布在固相載體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的胎兒DNA芯片，其特征在于，至少對(duì)于其中選定的一種寡核苷酸探針而言，其至少在固相載體上重復(fù)點(diǎn)樣兩次，形成均勻分布的探針重復(fù)點(diǎn)，并且，所述固相載體上至少還均勻分布有陰性對(duì)照點(diǎn)和陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的胎兒DNA芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針在固相載體上的排布順序至少滿足如下要求:對(duì)照探針占比大于1%，探針間的間距大于200bp，探針效能分的平均值大于0.75，重復(fù)探針的數(shù)量大于300個(gè)，重復(fù)次數(shù)為2-5次。
6.一種產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查系統(tǒng)，其特征在于，包括: 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的胎兒DNA芯片， 至少用以掃描與待檢樣品反應(yīng)后的所述胎兒DNA芯片，并采集相應(yīng)探針雜交信號(hào)的圖像處理單元，以及， 至少用以處理所述探針雜交信號(hào)，并輸出篩查結(jié)果的數(shù)據(jù)處理單元， 其中，所述數(shù)據(jù)處理單元內(nèi)還包含用以將每一探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)文件。
7.一種胎兒DNA芯片讀取方法，其特征在于，包括: 將待檢樣品和參照樣本與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交； 以圖像處理單元掃描與采集所述胎兒DNA芯片上呈現(xiàn)的探針雜交信號(hào)； 以及，以數(shù)據(jù)處理單元處理所述探針雜交信號(hào)，并輸出篩查結(jié)果， 其中，所述數(shù)據(jù)處理單元內(nèi)還包含用以將每一探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)的設(shè)計(jì)文件。
8.一種產(chǎn)前遺傳學(xué)篩查方法，其特征在于，包括: 將經(jīng)過(guò)標(biāo)記物標(biāo)記的待檢樣品及參照樣本與權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的胎兒DNA芯片上的探針競(jìng)爭(zhēng)性雜交，之后，利用圖像處理單元掃描與采集雜交反應(yīng)后芯片上相應(yīng)探針雜交信號(hào)，其后將探針雜交信號(hào)輸入數(shù)據(jù)處理單元，并依據(jù)預(yù)存的設(shè)計(jì)文件，將探針雜交信號(hào)與相應(yīng)染色體區(qū)段進(jìn)行定位關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品是否存在致病性的拷貝數(shù)變異進(jìn)行自動(dòng)化判斷，并輸出篩查結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK103740827SQ201410013123
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】蔡光偉, 梁德楊, 陳瑛 申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)深圳研究院