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4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法

文檔序號:3285499閱讀:2573來源:國知局
4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法。本發(fā)明提供檢測糖代謝標記的方法和提供更為接近天然產(chǎn)物的標簽,并在標簽不發(fā)生化學反應的基礎(chǔ)上實現(xiàn)對標簽的直接檢測。在無需有毒催化劑等的條件下,運用納米金表面增強拉曼技術(shù)實現(xiàn)對特殊拉曼信號標簽標記的細胞表面糖檢測。
【專利說明】4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學糖生物學領(lǐng)域,尤其涉及4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物正交反應在化學生物學領(lǐng)域有非常廣泛的運用,是一種兩步化學標記法。在糖生物學領(lǐng)域,第一步,通過有機合成方法在天然單糖分子上修飾生物正交基團(例如:疊氮或端炔,最為常用),而后通過生物體自身代謝被整合到生物糖鏈中;第二步,通過上一步的整合后,天然糖鏈中帶有了一個化學報告基團,用一個攜帶生物正交互補的基團的分子,通過化學反應的方式對目標分子進行檢測、成像和分離。雖然這種兩步化學標記法在生物分子的檢測、成像和分離方面,尤其是生物分子動態(tài)變化方面,取得了重要的進展;然而,此方法仍存在一系列的問題需要研究者們解決。一,合成修飾上的正交基團對分子單體本身的理化性質(zhì)有一定的改變;二,后續(xù)的化學反應檢測體系的生物相容性問題;三,活體動態(tài)標記很受限制。
[0003]針對這些問題,研究者們的解決思路集中在改善化學反應的生物相容性方面;以Ac4ManNAz生物代謝標記為例,其方略為:
[0004]以銅催化疊氮與炔[3+2]環(huán)加成反應為例。此反應催化用的的Cu (I)的細胞毒性非常強,研究者們把重心一方面放在開發(fā)配體來降低其毒性,并提高反應速率上(以BTTAA最為常用),另一方面放在活化炔上(以環(huán)辛炔及其衍生物最為成功)。配體的方法雖然能夠很大程度地加快反應速率,但Cu (I)的毒性只能得到一定程度的降低;而活化炔的方法不使用Cu (I)催化劑,僅通`過環(huán)張力和共軛的方式來降低環(huán)加成反應的活化能,實現(xiàn)提高反應速率的目的。活化炔的方法最大的缺點就是炔的活化很復雜,合成成本高、吸附背景高、相對于催化反應速率慢、而且生物相溶性問題也未得到很好的解決。
[0005]拉曼(Raman)是一種非化學標記的成像和檢測方法,可以對特定的具有Raman信號的基團進行檢測和成像。在細胞的Raman成像中,存在一段Raman信號沉默的區(qū)域(1800-2800^1),即此區(qū)域內(nèi)沒有細胞的任何信號。所以,使用Raman信號在此沉默區(qū)域的目標基團作為天然糖衍生物的修飾基團(例如,炔基的Raman信號在2100CHT1左右)進行細胞甚至活體切片的Raman檢測和成像。然而,Raman信號相對于熒光信號來說非常弱,其對于細胞膜上富含的磷脂的檢測和成像都顯得有些困難(需要使用功率較強的激光器),那么對于細胞膜表面的少量的含Raman信號基團的非天然糖的檢測和成像更是不可實現(xiàn)。
[0006]表面增強拉曼(SERS)是Au、Ag等金屬表面對于Raman信號的一種增強現(xiàn)象,一般可以實現(xiàn)IO6-1O12的增強效果。這一增強很可能就使得細胞膜表面的少量的含Raman信號基團的非天然糖的檢測和成像成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷,提供4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法,在標簽不發(fā)生化學反應的基礎(chǔ)上實現(xiàn)對標簽的直接檢測。
[0008]具體地,本發(fā)明提供一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子,其通過下述方法制備:
[0009]I)將HAuCl4 (氯金酸)水溶液加熱至回流,在攪拌下加入檸檬酸鈉溶液;
[0010]2)室溫冷卻,獲得金納米粒子晶種;
[0011]3)將獲得的金納米粒子晶種加入超純水中,在攪拌下加入檸檬酸鈉、HAuCl4和鹽酸羥胺溶液,室溫攪拌,獲得金納米粒子;
[0012]4)向獲得的金納米粒子中加入4-巰基苯硼酸的乙醇溶液,室溫攪拌8-24小時,即得所述4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子。
[0013]優(yōu)選地,步驟I)所述HAuCl4水溶液的質(zhì)量濃度為0.01%,檸檬酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為1%。
[0014]優(yōu)選地,步驟3)中檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為1%、HAuCl4的質(zhì)量濃度為1%,的鹽酸羥胺溶液的濃度為10mM。
[0015]所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子可以用于檢測細胞表面糖標記。
[0016]本發(fā)明還提供一種檢測細胞表面糖標記的方法,其包含以下步驟:
[0017]I)使用含非天然單糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;
[0018]2)將培養(yǎng)的細胞與權(quán)利要求1制備的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子的溶液共孵育,使4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子結(jié)合到細胞表面的唾液酸上;
[0019]3)使用拉曼光譜儀檢測細胞膜表面的拉曼標簽信號,根據(jù)采集的信號判斷細胞表面是否存在所述非天然單糖。
[0020]優(yōu)選地,所述非天然單糖為含疊氮、炔基或氘代甲基的非天然單糖。更優(yōu)選地,所述非天然單糖為Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
[0021]優(yōu)選地,所述細胞為HeLa和/或CHO細胞。所述Ac4ManNAz的濃度范圍為0.01 μ M至 100 μ Μ。
[0022]更優(yōu)選地50 μ M的Ac4ManNAl培養(yǎng)CHO細胞時,孵育時間最少為34小時。
[0023]本發(fā)明提供4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子及用其檢測細胞表面糖標記的方法,檢測糖代謝標記,并提供了更為接近天然產(chǎn)物的標簽,在標簽不發(fā)生化學反應的基礎(chǔ)上實現(xiàn)對標簽的直接檢測。在無需有毒催化劑等的條件下,運用納米金表面增強拉曼技術(shù)實現(xiàn)對特殊拉曼信號標簽標記的細胞表面糖檢測的方法。這種方法在無需有毒催化劑等的條件下,運用納米金表面增強拉曼技術(shù)實現(xiàn)對特殊拉曼信號標簽標記的細胞表面糖檢測的方法。這種方法實現(xiàn)了高靈敏度的檢測。而且該方法適用于各種細胞表面非天然糖的檢測。
[0024]為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂,下文特舉較佳實施例,并配合附圖,作詳細說明如下。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是使用納米金表面增強拉曼技術(shù)實現(xiàn)對特殊拉曼信號標簽標記的細胞表面糖檢測的示意圖。[0026]圖2是Raman光譜儀的暗場成像,圖中的亮點(箭頭所示)表示金納米粒子。
[0027]圖3和圖4分別是CHO和HeLa細胞中檢測細胞膜表面的疊氮和炔基的Raman信號。
[0028]圖5和圖6分別是CHO和HeLa細胞中檢測氘代甲基的Raman信號。
【具體實施方式】
[0029]請參照圖1,其是使用納米金表面增強拉曼技術(shù)實現(xiàn)對特殊拉曼信號標簽標記的細胞表面糖檢測的示意圖,非天然的單糖(以式I的Ac4ManNAz為例)被代謝到細胞表面后變?yōu)榉翘烊坏耐僖核?式II的NeuNAz),4-巰基苯硼酸(MPBA)修飾的金納米粒子(AuMPBA)與唾液酸8,9-位上兩個羥基反應生成如圖所示的產(chǎn)物。通過金納米粒子(AuNPs)的表面增強拉曼就可以實現(xiàn)對非天然Raman標簽的檢測。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子,其特征在于,其通過下述方法制備: 1)將HAuCl4水溶液加熱至回流,在攪拌下加入檸檬酸鈉溶液; 2)室溫冷卻,獲得金納米粒子晶種; 3)將獲得的金納米粒子晶種加入超純水中,在攪拌下加入檸檬酸鈉、HAuCl4和鹽酸羥胺溶液,室溫攪拌,獲得金納米粒子; 4)向獲得的金納米粒子中加入4-巰基苯硼酸的乙醇溶液,室溫攪拌8-24小時,即得所述4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子,其特征在于,步驟I)所述HAuCl4水溶液的質(zhì)量濃度為0.01%,檸檬酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子,其特征在于,步驟3)中檸檬酸鈉的質(zhì)量濃度為1%、HAuCl4的質(zhì)量濃度為1%,的鹽酸羥胺溶液的濃度為10mM。
4.權(quán)利要求1所述的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子在檢測細胞表面糖標記中的應用。
5.一種檢測細胞表面糖標記的方法,其特征在于,包含以下步驟: O使用含非天然單糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞; 2)將培養(yǎng)的細胞與權(quán)利要求1制備的4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子的溶液共孵育,使4-巰基苯硼酸修飾的金納米粒子結(jié)合到細胞表面的唾液酸上; 3)使用拉曼光譜儀檢測細胞膜表面的拉曼標簽信號,根據(jù)采集的信號判斷細胞表面是否存在所述非天然單糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述非天然單糖為含疊氮、炔基或氘代甲基的非天然單糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述非天然單糖為Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一項所述的方法,其特征在于,所述細胞為HeLa和/或CHO細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述Ac4ManNAz的濃度范圍為0.01 μ M至100 μ Μ。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,50μ M的Ac4ManNAl培養(yǎng)CHO細胞時,孵育時間最少為34小時。
【文檔編號】B22F9/24GK103674925SQ201210342478
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】陳興, 田中群, 田向東, 林亮, 洪森煉 申請人:北京大學
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