專利名稱：一種表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以硼酸表面修飾的金片或金顆粒，本發(fā)明也涉及順式二羥基生物分子 的識別、固載、傳感、富集、分離或檢測。
背景技術(shù)：
順式二羥基生物分子，包含糖蛋白、糖肽、核苷、核苷酸、兒茶酚胺、糖類和RNA等， 是一類特別的化合物，是目前蛋白質(zhì)組學、代謝組學、糖組學和RNA研究等領(lǐng)域中的重要 研究對象。對這些生物分子的選擇性富集和高效分離具有重要意義。糖基化對于蛋白質(zhì) 的折疊、運輸、定位起著重要作用[參見kience，2001, 291 (5512) 2364-2369]，并 參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導、免疫應(yīng)答等諸多重要的生物進程[參見Cell，2006，126(5): 855-867]。蛋白質(zhì)的糖基化普遍發(fā)生在細胞外環(huán)境的蛋白質(zhì)中，許多臨床的生物標志物及 治療的靶標都是糖蛋白。核苷、核苷酸、兒茶酚胺是多種疾病的臨床生物標志物。多糖在自 然界分布極廣，有的是構(gòu)成動植物骨架結(jié)構(gòu)的組成成分，如纖維素；有的是作為動植物儲藏 的養(yǎng)分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，如人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球 菌細胞壁中的多糖有抗原作用。取代硼酸是一類獨特的配基，能與順式二羥基化合物在堿性條件下結(jié)合形成穩(wěn)定 的絡(luò)合物，當介質(zhì)的pH切換為酸性時，絡(luò)合物解吸釋放出順式二羥基化合物。取代硼酸具 有三個顯著的優(yōu)點1)共價結(jié)合，親和力強；2)可逆反應(yīng)，結(jié)合/解吸過程容易控制；3)在 酸性條件下解吸，解吸條件的質(zhì)譜兼容性好。這些優(yōu)點使得取代硼酸是非常理想的親和配 基，特別適合于以質(zhì)譜為核心的組學分析方法。近年來，以硼酸功能化納米材料為基礎(chǔ)的樣 品分離富集方法也在蛋白質(zhì)組學研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，由于中性條件下硼酸親和 能力極弱，導致操作過程要求在堿性環(huán)境中進行，這增加了目標生物分子降解的風險以及 操作的不便。目前，有三種方法可以克服上述常規(guī)硼酸親和能力弱的缺點。第一，在苯環(huán)硼酸基 對位或間位引入強吸電子基團，如砜基[參見Anal. Biochem. , 2008, 372，227-236]；第 ^,Wulff ^A [#BPure and Applied Chemistry, 1982, 54, 2093-2102. ； Angewandte Chemie, 1995，107, 1958-1979.]提出，在苯環(huán)硼酸基鄰位引入引入胺基，其氮原子與硼原 子形成B-N配位(milff Type)；第三，在苯環(huán)硼酸基鄰位引入含有氧原子的基團，其氧原子 與氮原子形成 B-O 配位[J. Am. Chem. Soc. , 2006，128，4226-4227; J. Org. Chem., 2008, 73，6471-6479]。上述三種方式都可以有效的提高硼酸在中性pH環(huán)境下親和能力， 但是他們同時也有一個明顯的缺陷在含有功能化基團的苯硼酸苯環(huán)上引入基團需要繁瑣 的步驟和大量的工作，例如合成4- (3-烯丁基砜基)苯硼酸和milff類型對烯基本硼酸分 別需要3步和5步，且產(chǎn)率分別不足30%和15%。
本發(fā)明的克服現(xiàn)有技術(shù)路線的不足，提供一種便捷地制備高親和力硼酸修飾材料 的方法，所得材料可應(yīng)用于生物分子的識別、固載化、提純、富集、分離和檢測等領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，它是在金片或金顆粒表面以化學 結(jié)合方法將3-噻吩硼酸和巰基乙胺通過自組裝進行硼酸功能化修飾得到的硼酸修飾的金 片或金顆粒，生成的硼酸修飾表面具有分子間B-N配位作用，能在中性條件下抓取順式的 1，2-二羥基化合物。上述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，所述的金顆?？梢允墙鸺{米 顆粒。上述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，所述的金片可以是載體上涂 布或化學制備有金膜層的材料。一種制備上述表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒的方法，它包括以下步驟 步驟1.配制3-噻吩硼酸-巰基乙胺溶液
將3-噻吩硼酸和巰基乙胺以物質(zhì)的量之比為1 1的比例溶于體積比為1 9的乙醇-超 純水中，濃度為2. 5 mM ；
步驟2.將金片、金顆?；蛘咻d體上涂布或化學制備有金膜層的材料置于步驟1配制 的3-噻吩-巰基乙胺溶液中，在室溫下反應(yīng)12小時，即得到自組裝的表面具有高親和力硼 酸修飾的金片或金顆粒，其原理見圖1所示。上述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，具有在中性條件下抓取順式 的1，2-二羥基化合物的能力，可應(yīng)用于含順式二羥基生物分子的識別、固載、傳感、富集、 分離或檢測中。本發(fā)明首次描述了一種高親和力硼酸修飾材料及其制備方法，該方法使硼酸基團 對順式二羥基化合物的親和力大幅度提升。實驗結(jié)果表明，存在B-N配位作用的硼酸修飾 材料在中性PH條件下親和能力得到提高，彌補了硼酸在中性pH條件下親和力弱的缺陷。此 外，常規(guī)硼酸在堿性環(huán)境中具有對順式二羥基化合物的親和能力，但呈電負性，這對帶電目 標分子產(chǎn)生電荷的吸引或排斥，導致特異性降低；相比而言，存在B-N配位作用的硼酸在生 理PH條件下即具備順式二羥基化合物的高親和力，且整個硼酸修飾基團呈電中性，電荷引 入的影響消除，提高了特異性。


圖1.金表面自組裝硼酸修飾材料原理示意圖。圖2.高親和力硼酸修飾材料(a)和傳統(tǒng)硼酸修飾材料(b)對腺苷在不同pH值下 的萃取物的毛細管電泳分析結(jié)果比較，腺苷濃度為1 mg/mL，樣品背景為不同pH值的100 mM磷酸鹽緩沖液。圖3.對糖蛋白的專一萃取的基體輔助激光解吸離子化時間飛行質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)分析比較。i) RNase A和RNase B (摩爾的量的比1 1)混合樣品質(zhì)譜譜圖；ii)高親 和力硼酸修飾材料在RNase A和RNase B (摩爾的量的比1 1)樣品中的萃取物質(zhì)譜譜圖； iii)傳統(tǒng)硼酸修飾材料在RNase A和RNase B(摩爾的量的比1 1)樣品中的萃取物質(zhì)譜譜圖?；旌蠘悠分蠷Nase A和RNase B均為濃度7 ‘ 1(Γ5 M的100 mM醋酸胺溶液，ρΗ 7.4。圖4.高親和力硼酸修飾MALDI-TOF MS靶板對糖蛋白的特異性抓取。i) RNase B和Myoglobin (摩爾的量的比1 1)混合樣品質(zhì)譜譜圖；ii)高親和力硼酸修飾靶板抓取 RNase B和Myoglobin (摩爾的量的比1 100)樣品中的糖蛋白質(zhì)譜譜圖。Myoglobin的濃 度為 7 ‘ Kr6 M。圖5. (a)高親和力硼酸修飾材料掃描電鏡形貌(放大倍數(shù)30萬)；(b)高親和力 硼酸修飾靶板外形照片。
具體實施例方式實施例1
高親和力硼酸修飾金表面芯片
將金表面芯片放入80%乙醇溶液中超聲波處理15分鐘，取出用流水緩慢沖洗后氮氣吹 干。將芯片置于離心管中，加入98 % H2SO4和30 % H2O2 (體積比73)混合溶液，室溫孵化 2小時。取出用超純水洗凈，氮氣吹干。將金表面芯片固定于支架上，4°C儲存。清洗處理過 的金表面芯片置于3-噻吩硼酸和巰基乙胺按照物質(zhì)的量之比1 1配制的乙醇與超純水(體 積比1:9)的溶液中，室溫反應(yīng)12小時，得到高親和力硼酸修飾金表面芯片。該金表面芯片 可應(yīng)用于表面等離子共振技術(shù)和石英晶體微天平等進行生物分子相互作用的表征。實施例2
高親和力硼酸修飾磁性納米材料
金納米顆粒制備(參見J. Am. Chem. Soc. , 1998，120, 1959-1964)。胺基功能化磁 性 I^e3O4 納米材料制備(參見 Chem. Eur. J.，2006, 12，6341-6347)0 !^3O4Au 納米材 料的合成，取胺基功能化磁性狗304納米材料(自制或市購)分散在乙醇中(4 mL， 4X1012 顆粒/mL)置于圓底燒瓶內(nèi)，加入金納米顆粒(40 mL， 7X1012顆粒/mL)，室溫攪拌2小 時，制得 ^304/Αιι納米材料，將所得的i^304/Au納米材料稱取30 mg在乙醇中超聲分散，加 入3-噻吩硼酸和巰基乙胺按照物質(zhì)的量之比1:1配制在乙醇與超純水(體積比1:9)的溶 液40 mL，室溫攪拌12小時，得高親和力硼酸修飾磁性納米材料，其掃描電鏡形貌如圖5(a) 所示。稱取所得i^304/Au納米材料30 mg在乙醇中超聲分散，加入3_噻吩硼酸的乙醇與 超純水(體積比1:9)的溶液40 mL，室溫攪拌12小時，得傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料。所得 材料經(jīng)真空干燥備用。各稱取1 mg高親和力硼酸修飾磁性納米材料和傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料置于 200微升塑料離心管中，加入含有分析物腺苷的溶液20微升(ρΗ 7. 4或8. 5)，震蕩1小時。 用100微升IOOmM含600mM NaCl的醋酸銨溶液和100微升IOOmM的醋酸銨溶液個清洗3 次后，加入20微升IOmM醋酸進行解吸。解吸液利用毛細管電泳儀和MALDI-TOF MS進行檢 測分析。對傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料和高親和力硼酸修飾磁性納米材料在不同ρΗ條件 下的親和能力分別進行考察(見圖2)。高親和力硼酸修飾磁性納米材料在ρΗ 3 7.0時能 夠?qū)ο佘者M行抓取，而傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料在PH 3 8.0時才能夠?qū)ο佘者M行抓取， 高親和力硼酸修飾磁性納米材料相比于傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料的抓取PH降低了 1個PH單位。兩種材料的親和能力也通過對RNase A和RNase B (摩爾的量的比1 1)混合樣 品中RNase B的特異性抓取得到驗證(見圖3)。N-糖蛋白RNase B被高親和力硼酸修飾磁 性納米材料特異性萃取，非糖蛋白RNase A保留在萃取液中；而在相同pH條件下N-糖蛋白 RNase B不能被傳統(tǒng)硼酸修飾磁性納米材料萃取。這說明在中性條件下B-N配位作用使硼 酸的親和能力得到提升。實施例3
高親和力硼酸修飾MALDI MS靶板
在Bal-Tec S⑶500濺射鍍膜系統(tǒng)對云母片表面涂布金納米涂層，系統(tǒng)設(shè)定壓力 6X10—4 mbar，電流25 mA，時間200 S。得到的具有金涂層云母置于3-噻吩硼酸和巰基 乙胺按照物質(zhì)的量之比1:1配制的乙醇與超純水(體積比1:9)的溶液中，反應(yīng)12小時，得 到高親和力硼酸修飾的云母片。將該云母片用導電膠粘在MALDI MS靶板上，如圖5 (b)所 示。在高親和力硼酸修飾靶板上樣2微升，一小時后移除，用5微升IOOmM含600mM NaCl 的醋酸銨溶液和5微升IOOmM的醋酸銨溶液各清洗3次后，進行2微升醋酸上樣，待樣品干 燥后滴加基質(zhì)，進行質(zhì)譜分析。第一次上樣為待分析樣品，上樣的過程是萃取分離的過程， 其中萃取物是目標分子被固載至靶板表面，移除的是萃余液。經(jīng)反復清洗后，表面不再有萃 余液。第二次上樣為醋酸，醋酸為解吸液，目的是使目標分子與靶板脫離，以便質(zhì)譜分析。高親和力硼酸修飾靶板對含有RNase B和Myoglobin混合樣品中N-糖蛋白RNase B進行了純化，結(jié)果也證明高親和力硼酸基團對RNase B的親和能力以及特異性(見圖4)。
權(quán)利要求
1.一種表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，其特征是它是在金片或金顆粒 表面以化學結(jié)合方法將3-噻吩硼酸和巰基乙胺通過自組裝進行硼酸功能化修飾得到的硼 酸修飾的金片或金顆粒，生成的硼酸修飾表面具有分子間B-N配位作用，能在中性條件下 抓取順式的1，2- 二羥基化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，其特征是所 述的金顆粒是金顆?；蚪鸺{米粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，其特征是所 述的金片是金金屬片或者是載體上涂布或化學制備有金膜層的材料。
4.一種制備權(quán)利要求1所述表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒的方法，其特 征是它包括以下步驟步驟1.配制3-噻吩硼酸-巰基乙胺溶液將3-噻吩硼酸和巰基乙胺以物質(zhì)的量之比為1 1的比例溶于體積比為1 9的乙醇-超 純水中，濃度為2. 5 mM ；步驟2.將金片、金顆?；蛘咻d體上涂布或化學制備有金膜層的材料置于步驟1配制 的3-噻吩-巰基乙胺溶液中，在室溫下反應(yīng)12小時，即得到自組裝的表面具有高親和力硼 酸修飾的金片或金顆粒。
5.權(quán)利要求1所述的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，在含順式二羥基生 物分子的識別、固載、傳感、富集、分離或檢測中應(yīng)用。
全文摘要
一種表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，它是在金片或金顆粒表面以化學結(jié)合方法將3-噻吩硼酸和巰基乙胺通過自組裝進行硼酸功能化修飾得到的硼酸修飾的金片或金顆粒，生成的硼酸修飾表面具有分子間B-N配位作用，能在中性條件下抓取順式的1,2-二羥基化合物，因此，本發(fā)明的表面具有高親和力硼酸修飾的金片或金顆粒，可應(yīng)用于含順式二羥基生物分子的識別、固載、傳感、富集、分離或檢測。
文檔編號C23C22/58GK102061463SQ20101057006
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者劉震, 梁靚 申請人:南京大學