一株具有降解菲能力的菌株的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于對菲具有降解能力的一株細菌技術領域。
【背景技術】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是 POPs 中最常見且危害極大的一類優(yōu)先控制的污染物，普遍存在于人類生活的自然環(huán)境，如大氣、水體、土壤中。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有200多種PAHs，常見的如菲、萘、蒽、芘等，其中大部分具有致癌、致畸、致突變“三致效應”，對人體健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了嚴重威脅。通過微生物來降解多環(huán)芳烴是一種經(jīng)濟而有效的環(huán)境修復方式。有的湖泊水體PAHs污染較為嚴重，尤其是底泥中多環(huán)芳烴含量更高，但對于湖泊被污染的水體尤其是高原湖泊被污染的水體例如昆明滇池水體中利用微生物對多環(huán)芳烴的降解研究尚未開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明通過多次實驗設計，獲得了一株具有高效降解菲能力的細菌，有助于解決水體、土壤等環(huán)境中多環(huán)芳烴污染問題，本發(fā)明采用如下技術方案實現(xiàn):
[0004]本發(fā)明從污染的湖泊(滇池)水體篩選的一株能降解多環(huán)芳烴菲的細菌，經(jīng)過鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus, sp)，編號為Y2菌株；該細菌在添加有菲的培養(yǎng)基中生長，能夠有效的降解菲；當菲濃度為50ug/L?5000ug/L時，在72h內(nèi)具有較高的降解率；具體實驗步驟如下:(1)活化菌種:從平板中挑取少量芽孢桿菌(Bacillus, sp) Y2菌株到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于人工氣候振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0005](2)接種培養(yǎng):將細菌活化擴大培養(yǎng)后，用無機鹽培養(yǎng)基洗滌并重懸，然后接種到含有一定濃度的菲一無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，置于人工氣候振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0006](3)取樣:定時取樣20ml?50ml的菌液，離心10?20min，將離心后上清液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，菌體用蒸餾水重懸后轉(zhuǎn)移到離心管中，采用反復凍融法破壁；將破壁后的菌體轉(zhuǎn)移到分液漏斗中；
[0007](4)液液萃取:向分液漏斗中加入2?5ml的二氯甲烷，上下劇烈搖動4?6分鐘，期間不斷放氣；靜置2?6分鐘后，收集有機相于玻璃瓶中，重復三次萃??；最后一次收集有機相后，棄水相，用1?2ml 二氯甲烷沖洗分液漏斗；
[0008](5)離心破乳:在振蕩萃取過程中產(chǎn)生高度乳化層，收集乳化層于離心管中，低溫離心10?20min ;離心后明顯的分為了雜質(zhì)層和有機相層，用吸管吸取有機相到(4)中玻璃瓶中；棄雜質(zhì)，用1?2ml 二氯甲烷沖洗離心管，有機相匯集到玻璃瓶中；
[0009](6)濃縮定容:將收集到的有機相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干后，加入甲醇充分溶解固體物質(zhì)。濃縮甲醇定容到0.5?1ml，經(jīng)0.22um有機濾頭過濾后，用高效液相色譜檢測菲的含量;
[0010](7)定量:配制一系列濃度的菲標準品溶液，相同色譜條件檢測菲的含量，采用外標法求得樣品的菲含量，與理論值作對比，求得降解率。
[0011]本發(fā)明涉及到的溶解菲的過程中，用乙醇作為助溶劑溶解菲，再添加到培養(yǎng)基中，不會析出形成白色固體漂浮物，這樣可以增大菲于細菌的接觸，同時乙醇濃度不高于
0.05%時，對細菌生長幾乎沒有影響。
[0012]本發(fā)明涉及到的配制不同濃度的菲的方法為，用乙醇作為助溶劑溶解菲，再添加到培養(yǎng)基中，不會析出形成白色固體漂浮物，這樣可以增大菲于細菌的接觸，同時乙醇濃度不高于0.05 %時，對細菌生長幾乎沒有影響。
[0013]本發(fā)明涉及到的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法為，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法為，以總體積1L計:
[0014]準確稱取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20_25g (制備固體培養(yǎng)基時加入，液體則不用)，加入蒸餾水充分溶解，定容至1L，121°C高溫滅菌30min，冷卻后調(diào)節(jié)PH =
7.0后使用。
[0015]本發(fā)明涉及到的無機鹽(MSM)培養(yǎng)基配制方法為，以總體積1L計:
[0016](1)配制高濃度的母液，其中(順4)#04濃度為100g/L，Na2HP04濃度為80g/L，ΚΗ2Ρ04濃度為 20g/L，MgS0 4.7Η20 濃度為 20g/L，F(xiàn)eCl3.6Η20 濃度為 5g/L，(ΝΗ4)6Μο7024.4Η20濃度為 lg/L，CaCl2.2H20 濃度為 lOg/L ;
[0017](2)分別取上述母液 10ml(NH4)2S04，10ml Na2HP04，10ml KH2P04，10ml MgS04.7Η20，lml FeCl3.6H20，lml (NH4)6Mo7024.4H20，10mlCaCl2.2H20 加入容量瓶中，加入蒸餾水定容至1L，121°C高溫滅菌30min，冷卻后調(diào)節(jié)PH = 7.0后使用。
[0018]本發(fā)明的有意效果為，該細菌在添加有菲的培養(yǎng)基中生長，能夠有效的降解菲；當菲濃度為50ug/L?5000ug/L時，在72h內(nèi)具有較高的降解率。
【具體實施方式】
[0019]下面就具體實驗結(jié)果對本發(fā)明做進一步闡釋和補充，如下。
[0020]從污染的滇池湖泊水體篩選的一株能降解多環(huán)芳烴菲的細菌，經(jīng)過鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus, sp)，編號為Y2菌株；該細菌在添加有菲的培養(yǎng)基中生長，能夠有效的降解菲；當菲濃度為50ug/L?5000ug/L時，在72h內(nèi)具有較高的降解率。
[0021]1、實施例一
[0022](1)活化菌種:從平板中挑取少量芽孢桿菌(Bacillus.sp)Y2菌株到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于人工氣候振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為:溫度30 °C，150r/min，培養(yǎng)12h0
[0023](2)接種培養(yǎng):將細菌活化擴大培養(yǎng)后0D600達到0.8，用無機鹽培養(yǎng)基洗滌并重懸后，接種到菲濃度為50ug/L濃度的菲一無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，以空白不加菲為對照，設置三個平行，細菌接種量為10ml，總體積為200ml，助溶劑乙醇比例為0.05%。置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為??溫度30°C，150r/min，培養(yǎng)時間為72h ；
[0024](3)取樣:在 0h，24h，48h，72h 取樣 30ml 菌液，8000r，4°C 離心 lOmin。將離心后上清液轉(zhuǎn)移到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中。菌體用蒸餾水重懸后轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，-80°C與37°C之間反復凍融數(shù)次，破壁。將破壁后的菌體轉(zhuǎn)移到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中。
[0025](4)液液萃取:向分液漏斗中加入5ml 二氯甲烷。上下劇烈搖動5分鐘，期間不斷放氣。靜置5分鐘后，收集有機相于20ml玻璃瓶中，重復三次萃取。最后一次收集有機相后，棄水相，用2ml 二氯甲烷沖洗分液漏斗。
[0026](5)離心破乳:在振蕩萃取過程中產(chǎn)生高度乳化層，收集乳化層于離心管中，10000r/min，4°C離心15min。離心后明顯的分為了雜質(zhì)層和有機相層，用吸管吸取有機相到(4)中玻璃瓶中。棄雜質(zhì)，用2ml 二氯甲烷沖洗離心管，有機相匯集到玻璃瓶中。
[0027](6)濃縮定容:將收集到的有機相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干后，加入甲醇充分溶解固體物質(zhì)。濃縮甲醇定容到0.5ml，經(jīng)0.22um有機濾頭過濾后，用液相色譜檢測菲含量。
[0028](7)高效液相色譜檢測，條件如下:
[0029]流動相:0min 80%甲醇+20%雙蒸水
[0030]15min 100% 甲醇+0%雙蒸水
[0031]流速:lml/min波長:254nm 進樣量:50ul 柱溫:35°C
[0032](8)定量:配制濃度為 10ug/L，20ug/L，30ug/L，40ug/L，50ug/L，60ug/L 的菲標準品溶液，相同色譜條件檢測菲的含量，采用外標法求得樣品的菲含量，與理論值作對比，求得降解率。
[0033]本發(fā)明在菲濃度為50ug/L時，細菌在24h時可降解15.63 %，在48h時可降解46.09%，在 72h 時可降解 71.09%。
[0034]2、實施例二
[0035](1)活化菌種:從平板中挑取少量芽孢桿菌(Bacillus.sp)Y2菌株到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于人工氣候振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為:溫度30 °C，150r/min，培養(yǎng)12h0
[0036](3)接種培養(yǎng):將細菌活化擴大培養(yǎng)后0D600達到0.8，用無機鹽培養(yǎng)基洗滌并重懸后，接種到菲濃度為500ug/L濃度的菲一無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，以空白不加菲為對照，設置三個平行，細菌接種量為10ml，總體積為200ml，助溶劑乙醇比例為0.05%。置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為??溫度30°C，150r/min，培養(yǎng)時間為72h ；
[0037](3)取樣:在 0h，24h，48h，72h 取樣 30ml 菌液，8000r，4°C 離心 lOmin。將離心后上清液轉(zhuǎn)移到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中。菌體用蒸餾水重懸后轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，-80°C與37°C之間反復凍融數(shù)次，破壁。將破壁后的菌體