用于操作和成像顯微樣本的方法和光學(xué)布置的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種方法，其中用操作光操作樣本，并且其中借助于SPIM技術(shù)在使用呈照明光片的形式的照明光(特別是用于熒光激發(fā)的激發(fā)光)的照明下成像樣本。
[0002]此外本發(fā)明涉及一種光學(xué)布置，其用于操作樣本并且用于借助于SP頂技術(shù)在使用呈照明光片的形式的照明光(特別是用于熒光激發(fā)的激發(fā)光)的照明下成像樣本。
【背景技術(shù)】
[0003]在其中進(jìn)行分層照明樣本的SP頂技術(shù)(單平面照明顯微術(shù))允許更快速地感測(cè)圖像數(shù)據(jù)并且例如比樣本的斑型掃描樣本影響更小。SP頂技術(shù)的應(yīng)用的一個(gè)已知領(lǐng)域是熒光顯微術(shù)的領(lǐng)域，樣本中的熒光團(tuán)用激光激發(fā)。在SPIM技術(shù)中，激發(fā)僅僅發(fā)生在照明光片(也稱為“光條”)中。由此避免由其它平面中的照明光產(chǎn)生的樣本的損傷。
[0004]在DE 102 57 423 A1中描述了根據(jù)SP頂方法操作的光學(xué)裝置。使用該顯微法，用細(xì)光條照明樣本，同時(shí)垂直于照明光條的平面發(fā)生觀察。照明和檢測(cè)在這里經(jīng)由兩個(gè)獨(dú)立的光束路徑發(fā)生，每個(gè)光束路徑具有獨(dú)立的光學(xué)器件，特別是具有彼此垂直的兩個(gè)獨(dú)立物鏡。光條由照明物鏡并且由放置在它前面的圓柱形光學(xué)器件生成。為了圖像采集，樣本移動(dòng)通過(guò)相對(duì)于檢測(cè)器靜止的光條，以便使用平面檢測(cè)器分層采集熒光和/或散射光。由此獲得的層圖像數(shù)據(jù)然后可以組合成對(duì)應(yīng)于樣本的三維圖像的數(shù)據(jù)集。該文獻(xiàn)未公開樣本的操作。
[0005]DE 20 201 110 077 U1公開了一種用于在SP頂顯微術(shù)的背景下照明樣本的布置。該布置包括用于生成光束的光源，用于從光束生成光條的裝置，以及至少一個(gè)物鏡，所述至少一個(gè)物鏡包括具體化為并且旨在將來(lái)自樣本的檢測(cè)光直接地或間接地輸送到檢測(cè)器的光學(xué)器件。此外該布置包括位于物鏡的光學(xué)器件后面、用于轉(zhuǎn)向光條的轉(zhuǎn)向裝置。
[0006]SPIM技術(shù)和光學(xué)樣本操作的組合在原理上是很吸引人的，原因是具有低樣本影響的很快的SP頂技術(shù)很好地適合于觀察特別是較大的、活的有機(jī)物的操作的效果。
[0007]從DE 10 2007 047 464 A1已知可用附加的操作光源，其操作光經(jīng)由透鏡布置和反射鏡布置經(jīng)由照明物鏡耦合到照明光束路徑中。替代地，相同文獻(xiàn)附加地提出借助于雙色鏡將操作光耦合到檢測(cè)光束路徑中，并且通過(guò)檢測(cè)物鏡將它引導(dǎo)到樣本上。
[0008]在該類型的一個(gè)操作光經(jīng)由照明光束路徑并且經(jīng)由檢測(cè)光束路徑輸送到樣本的實(shí)施例中，三個(gè)分束器和兩個(gè)光闌必須費(fèi)力地插入光束路徑中。該設(shè)置的優(yōu)點(diǎn)在于可以從兩個(gè)方向發(fā)生操作。在另一方面，這導(dǎo)致復(fù)雜的光學(xué)配置并且至少在照明側(cè)導(dǎo)致光損失。
[0009]科技出版物“Selectiveplane illuminat1n microscopy techniques indevelopmental b1logy，，，Huisken 等人，Development 136，1963-1975 (2009)，公開了一種該類型的裝置，其中附加地提供其光經(jīng)由檢測(cè)物鏡聚焦到樣本上的光操作激光器。從“Three-dimens1nal laser microsurgery in light-sheet based microscopy (SPIM)，，，Engelbrecht 等人，Optica Express 6420，Vol.15，N0.10 (2007)，獲知很相似的布置。Yanik等人的文章，“Technologies for Micromanipulating, Imaging, and Phenotyping SmallInvertebrates and Vertebrates^, Annu.Rev.B1med.Eng.2011 ; 13:185-217，也公開了類似的裝置和方法，其中樣本通過(guò)毛細(xì)管被栗送。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]所以本發(fā)明的目的是描述一種方法，其允許特別通用和靈活的樣本操作和樣本成像。
[0011]該目的由一種方法實(shí)現(xiàn)，其特征在于操作光和照明光都由下列聚焦:
[0012]a.布置在物鏡工作位置的相同物鏡，或
[0013]b.相繼被帶到物鏡工作位置的不同物鏡；
[0014]并且在穿過(guò)所述物鏡之后，操作光和/或照明光借助于轉(zhuǎn)向裝置以這樣的方式轉(zhuǎn)向使得它相對(duì)于所述物鏡的光軸成不同于零度的角傳播。
[0015]本發(fā)明的另一目的是描述一種前述類型的光學(xué)布置，其使用簡(jiǎn)單的光學(xué)配置允許特別通用和靈活的樣本操作和樣本成像。
[0016]該目的由一種光學(xué)布置實(shí)現(xiàn)，其特征在于操作光和照明光都由下列聚焦:
[0017]a.布置在物鏡工作位置的相同物鏡，或
[0018]b.相繼被帶到物鏡工作位置的不同物鏡；
[0019]并且轉(zhuǎn)向照明光和/或操作光的轉(zhuǎn)向裝置在位于物鏡工作位置的所述物鏡的下游。
[0020]本發(fā)明使得能夠很靈活地并且以單獨(dú)地可適應(yīng)于特定應(yīng)用的方式操作和觀察樣本。特別地能夠用操作光從不同方向照射樣本。例如，也允許用操作光從很不相同的方向同心地和(需要時(shí))周期性地重復(fù)照射感興趣的同一個(gè)樣本區(qū)域；這隨后詳細(xì)地進(jìn)行解釋。本發(fā)明也使得能夠執(zhí)行感興趣的樣本區(qū)域的相干、同時(shí)照明。
[0021]也能夠特別有利地以類似于在例如用于腫瘤治療的放射療法中使用的立體定向輻射的方式用操作光照射感興趣的樣本區(qū)域?？梢岳缤ㄟ^(guò)借助于優(yōu)選地在所有三個(gè)空間方向上可調(diào)節(jié)的合適移位臺(tái)移位樣本定位樣本區(qū)域，樣本安裝在所述移位臺(tái)上。移位臺(tái)可以特別地具體化為以機(jī)動(dòng)方式可調(diào)節(jié)。
[0022]本發(fā)明還具有的很特別優(yōu)點(diǎn)是照明光和操作光可以從不同方向照射樣本。因此，例如在轉(zhuǎn)向裝置相對(duì)于物鏡的移位中，和/或由于用于操作光和/或照明光的可調(diào)節(jié)光束偏轉(zhuǎn)裝置的使用，在入射到樣本上的可能方向和角度方面幾乎沒(méi)有限制。特別地，用戶不限于僅僅沿著物鏡的光軸或垂直于物鏡的光軸用照明光和/或操作光照射樣本。
[0023]特別地也考慮到這點(diǎn)，本發(fā)明具有的很特別優(yōu)點(diǎn)是可以在很大程度上免除在長(zhǎng)的子光束路徑之間的費(fèi)力切換和用于耦入或耦出操作光的大量雙色鏡，即使根據(jù)本發(fā)明的布置的通用性實(shí)際上大于從現(xiàn)有技術(shù)已知的布置。當(dāng)使用多個(gè)長(zhǎng)的、不同的光束路徑時(shí)必然產(chǎn)生的不穩(wěn)定性和附加成本由此被避免。
[0024]實(shí)際上在這方面能夠有利地在隨后的時(shí)間改裝掃描顯微鏡，特別是共焦掃描顯微鏡，以便產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)布置和/或以便執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法，而沒(méi)有大的技術(shù)費(fèi)用。
[0025]例如可以借助于光學(xué)樣本操作執(zhí)行很精確的、微創(chuàng)的顯微操作。例如在波長(zhǎng)和/或光功率水平和/或強(qiáng)度方面和/或在一個(gè)或多個(gè)操作光束的幾何形狀方面的操作光的性質(zhì)優(yōu)選地適合于該特定應(yīng)用。例如，操作光可以是脈沖的。也能夠使用非脈沖操作光。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的布置在該背景下優(yōu)選地包含光源，特別是激光光源，其適合于特定應(yīng)用或適應(yīng)于特定應(yīng)用，特別是在前述的性質(zhì)方面。在根據(jù)本發(fā)明的光學(xué)布置的背景下，例如，同一個(gè)照明裝置可以用于生成操作光和照明光。然而也可能存在不同的光源以便生成操作光和照明光。
[0027]紫外(UV)光是例如可以用于細(xì)胞消融、DNA切割和顯微切片的高能量光。然而，405nm的普通波長(zhǎng)也可以用于光激活和光轉(zhuǎn)換?？梢?VIS)光可以用于熒光染料的漂白實(shí)驗(yàn)(FRAP—光漂白之后的熒光恢復(fù))。然而，可見光也可以用于光激活和光轉(zhuǎn)換。使用紅外(IR)光，可以通過(guò)突然升高溫度(例如水溫度)、通過(guò)在很小體積內(nèi)用紅外光照射以高度受控、很低沖擊和局部限制方式引入損傷。由組織直接吸收同樣是可能的。IR光也可以與光學(xué)鑷子結(jié)合使用。另外，由于生物結(jié)構(gòu)經(jīng)由多光子(MP)激發(fā)原理與紅外操作光相互作用的事實(shí)，紅外操作光可以用于前面描述的過(guò)程，如細(xì)胞消融、光漂白、光激活和光轉(zhuǎn)換。
[0028]有利地，相比于從現(xiàn)有技術(shù)已知的裝置特別地也能夠根據(jù)本發(fā)明在必要時(shí)從明顯多于僅僅兩個(gè)方向操作樣本。可調(diào)節(jié)光束偏轉(zhuǎn)裝置(例如串聯(lián)連接的兩個(gè)檢流計(jì)鏡，一個(gè)在X方向上偏轉(zhuǎn)并且一個(gè)在Y方向上偏轉(zhuǎn))的使用允許例如使用斑點(diǎn)、線性和自由可選擇區(qū)域操作照明執(zhí)行操作。特別地能夠以受控方式通過(guò)用操作光照射操作任何形狀的感興趣的樣本區(qū)域(R0I)。
[0029]轉(zhuǎn)向裝置例如可以包括一個(gè)或多個(gè)反射鏡。反射鏡特別地可以是平坦的。然而例如如果照明光和/或操作光沿著反射鏡表面連續(xù)地移動(dòng)和/或如果要獲得附加聚焦，則反射鏡也可以是彎曲的。替代地或附加地，轉(zhuǎn)向裝置也可能包括至少一個(gè)棱鏡或至少一個(gè)雙色分束器。
[0030]在一個(gè)可能的實(shí)施例中，規(guī)定操作光和照明光通過(guò)布置在物鏡工作位置的相同