專利名稱：隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型關(guān)于一種提供高于傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限分辨率(200nm)的隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，特別是涉及一種利用寬譜光源作為熒光分子活化的光源，基于單熒光分子檢測和中心定位技術(shù)的超高分辨率的隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)熒光顯微鏡在生物和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要的作用，是生命科學(xué)研究的必備工具。但是，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率受光學(xué)衍射極限的限制，難以實(shí)現(xiàn)高于200nm的分辨率。近年來，哈佛大學(xué)及其它大學(xué)的幾位學(xué)者提出可以將熒光分子活化與單分子中心定位技術(shù)相結(jié)合，突破光學(xué)衍射極限，實(shí)現(xiàn)納米尺度的分辨率(20-50nm)。這種技術(shù)的核心是通過特定波長的光照射使熒光分子發(fā)光并且進(jìn)入暗態(tài)，然后用另一波長的活化光使暗態(tài)的熒光分子活化重新具備發(fā)光的能力，通過控制活化光的功率密度，使得成像區(qū)域中隨機(jī)恢復(fù)的熒光分子之間的距離大于光學(xué)衍射極限，從而能被傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨。連續(xù)記錄這些單個(gè)熒光分子的圖像，并進(jìn)行單分子中心精確定位，最后通過重建獲得具有納米尺度分辨率的熒光圖像。對于傳統(tǒng)的商業(yè)或研究用隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM), —般的激發(fā)光光源和活化光光源都用激光器，通過聲光可調(diào)濾光器(AOTF)的控制進(jìn)行激發(fā)光和活化光的照明。然而，這種方法的缺點(diǎn)是激光器或聲光可調(diào)濾光器的價(jià)格比較昂貴，成本較高。

實(shí)用新型內(nèi)容基于隨機(jī)光學(xué)重建的概念，同時(shí)為了克服現(xiàn)有超高分辨率顯微鏡的復(fù)雜性和高成本，本實(shí)用新型之一目的在于提供一種新的隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡系統(tǒng)，其通過外置照明系統(tǒng)與熒光顯微鏡組合，將普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺提供納米分辨率的超高分辨顯微鏡，且其成本大大低于商品化的同類顯微鏡產(chǎn)品。為達(dá)上述及其它目的，本實(shí)用新型提出一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，包括用于放置樣品的載物臺，緊挨該載物臺下方設(shè)置的物鏡，其中，該顯微鏡還包括:雙濾光片層，設(shè)置于該載物臺下方，包含兩層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒；活化光光源產(chǎn)生模塊，用于產(chǎn)生活化光光源，產(chǎn)生的光源經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及該物鏡后照于該載物臺的樣品表面；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，產(chǎn)生激發(fā)光，經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照于該載物臺的樣品表面。進(jìn)一步地，該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬鹵素?zé)艋騆ED燈產(chǎn)生。[0011 ] 進(jìn)一步地，該光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴(kuò)束、聚焦后，從上層右口導(dǎo)入，經(jīng)上層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進(jìn)行照明，提供活化光。進(jìn)一步地，該上層電動(dòng)濾光片盒中的二向色鏡周期性轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。進(jìn)一步地，該顯微鏡利用一電動(dòng)快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。[0014]進(jìn)一步地，該激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊包括激光產(chǎn)生器、擴(kuò)束裝置及聚焦裝置，該激光產(chǎn)生器激發(fā)光，經(jīng)過該擴(kuò)束裝置擴(kuò)束、該聚焦裝置聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照于該載物臺的樣品表面。進(jìn)一步地，該激光產(chǎn)生器為半導(dǎo)體激光器，該半導(dǎo)體激光器經(jīng)過擴(kuò)束、聚焦，從該顯微鏡的后口進(jìn)入該顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照于樣品表面。進(jìn)一步地，該顯微鏡于成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實(shí)時(shí)調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。進(jìn)一步地，該顯微鏡于普通單濾光片層的倒置熒光顯微鏡上改造而成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡通過于普通的單濾光片層的熒光顯微鏡增加一層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒，并利用汞燈等寬譜、便宜的光源作為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡活化光光源，實(shí)現(xiàn)了將一臺普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺超高分辨顯微鏡的目的，大幅降低了實(shí)現(xiàn)超高分辨成像所需要的成本。

圖1為本實(shí)用新型一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下通過特定的具體實(shí)例并結(jié)合附圖說明本實(shí)用新型的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容輕易地了解本實(shí)用新型的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本實(shí)用新型亦可通過其它不同的具體實(shí)例加以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不背離本實(shí)用新型的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。圖1為本實(shí)用新型一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖。如圖1所示，本實(shí)用新型一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，是在普通倒置熒光顯微鏡上進(jìn)行改造形成的，該普通倒置熒光顯微鏡為單濾光片層的顯微鏡，本實(shí)用新型之隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，包括:載物臺10、雙濾光片層11、活化光光源產(chǎn)生模塊12以及激光光光源產(chǎn)生模塊13。其中載物臺10用于放置試樣，緊挨著載物臺10下方設(shè)有物鏡(圖中未示出)，雙濾光片層11，設(shè)置于載物臺下方，是在原有的單濾光片層基礎(chǔ)上增加一層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒形成的，一層用于走激光光路，一層走活化光光路；活化光光源產(chǎn)生模塊12，用于產(chǎn)生活化光光源，其產(chǎn)生的光源經(jīng)過擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進(jìn)行照明，提供活化光，活化光光源產(chǎn)生模塊12可利用汞燈產(chǎn)生活化光光源，也可以利用金屬鹵素?zé)?、LED燈等寬譜、便宜的光源，在本實(shí)用新型較佳實(shí)施例中，活化光光源產(chǎn)生模塊12的光源為一 100W的汞燈光源，汞燈光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴(kuò)束、聚焦后，從上層右口導(dǎo)入，經(jīng)上層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進(jìn)行照明，提供活化光；激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊13，包括激光產(chǎn)生器130、擴(kuò)束裝置131及聚焦裝置132，激光產(chǎn)生器130用于產(chǎn)生激發(fā)光光源，其經(jīng)過擴(kuò)束裝置131擴(kuò)束、聚焦裝置132聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進(jìn)行照明，提供激發(fā)光，在本實(shí)用新型較佳實(shí)施例中，激光產(chǎn)生器130為半導(dǎo)體激光器，半導(dǎo)體激光器經(jīng)過擴(kuò)束、聚焦，從顯微鏡的后口進(jìn)入顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進(jìn)行照明，提供激發(fā)光。當(dāng)然，除此之外，與普通倒置熒光顯微鏡一樣，本實(shí)用新型之隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡還需CCD圖像傳感器，在此不予贅述。成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實(shí)時(shí)調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。成像過程中，可利用Micro Manager軟件控制上層自動(dòng)濾光片盒中的二向色鏡周期性的轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光，以滿足STORM的成像要求，也可通過在活化光源前增加一電動(dòng)快門以提供周期性的活化光，滿足STORM的成像要求。綜上所述，本實(shí)用新型一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡通過于普通的單濾光片層的突光顯微鏡增加一層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒，并利用萊燈等寬譜、便宜的光源作為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡活化光光源，實(shí)現(xiàn)了將一臺普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺超高分辨顯微鏡的目的，分辨率達(dá)到幾十納米。上述實(shí)施例僅例示性說明本實(shí)用新型的原理及其功效，而非用于限制本實(shí)用新型。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本實(shí)用新型的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾與改變。因此，本實(shí)用新型的權(quán)利保護(hù)范圍，應(yīng)如權(quán)利要求書所列。
權(quán)利要求1.一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，包括用于放置樣品的載物臺，緊挨該載物臺下方設(shè)置物鏡，其特征在于，該顯微鏡還包括: 雙濾光片層，設(shè)置于該載物臺下方，包含兩層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒； 活化光光源產(chǎn)生模塊，用于產(chǎn)生活化光光源，產(chǎn)生的光源經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及該物鏡后照于該載物臺的樣品表面；以及 激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，產(chǎn)生激發(fā)光，經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照于該載物臺的樣品表面。
2.如權(quán)利要求1所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，其特征在于:該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬鹵素?zé)艋騆ED燈產(chǎn)生。
3.如權(quán)利要求2所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡，其特征在于:該光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴(kuò)束、聚焦后，從上層右口導(dǎo)入，經(jīng)上層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進(jìn)行照明，提供活化光。
4.如權(quán)利要求3所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡,其特征在于:該上層電動(dòng)濾光片盒中的二向色鏡周期性轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。
5.如權(quán)利要求3所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡,其特征在于:該顯微鏡利用一電動(dòng)快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。
6.如權(quán)利要求1所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡，其特征在于:該激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊包括激光產(chǎn)生器、擴(kuò)束裝置及聚焦裝置，該激光產(chǎn)生器激發(fā)光，經(jīng)過該擴(kuò)束裝置擴(kuò)束、該聚焦裝置聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照于該載物臺的樣品表面。
7.如權(quán)利要求6所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡,其特征在于:該激光產(chǎn)生器為半導(dǎo)體激光器，該半導(dǎo)體激光器經(jīng)過擴(kuò)束、聚焦，從該顯微鏡的后口進(jìn)入該顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照于樣品表面。
8.如權(quán)利要求1所述的一種隨機(jī)光學(xué)重建突光顯微鏡，其特征在于:該顯微鏡于普通單濾光片層的倒置熒光顯微鏡上改造而成。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種隨機(jī)光學(xué)重建熒光顯微鏡，包括載物臺、CCD及緊挨載物臺下方的物鏡，其中，該顯微鏡還包括雙濾光片層，設(shè)置于該載物臺下方，包含兩層電動(dòng)轉(zhuǎn)換的濾光片盒；活化光光源產(chǎn)生模塊，用于產(chǎn)生活化光光源，產(chǎn)生的光源經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一層電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及該物鏡后照于該載物臺的樣品表面；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)擴(kuò)束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動(dòng)濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照于該載物臺的樣品表面，本實(shí)用新型可以使得傳統(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率從光學(xué)衍射極限(200nm)提高到納米尺度(20-50nm)，且實(shí)現(xiàn)的成本遠(yuǎn)低于目前的商業(yè)化超高分辨率顯微鏡產(chǎn)品。
文檔編號G02B21/06GK202956343SQ20122063341
公開日2013年5月29日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者邵志峰, 李小衛(wèi), 袁志偉, 翟人寬, 孫潔林 申請人:上海交通大學(xué)