專利名稱：隨機光學重建熒光顯微鏡及其實現(xiàn)方法
技術領域：
本發(fā)明關于一種提供高于傳統(tǒng)光學衍射極限分辨率(200nm)的隨機光學重建突光顯微鏡及其實現(xiàn)方法，特別是涉及一種利用寬譜光源作為熒光分子活化光源，基于單熒光分子檢測和中心定位技術的超高分辨率的隨機光學重建熒光顯微鏡及其實現(xiàn)方法。
背景技術：
傳統(tǒng)熒光顯微鏡在生物和醫(yī)學研究中發(fā)揮著重要的作用，是生命科學研究的必備工具。但是，傳統(tǒng)光學顯微鏡的分辨率受光學衍射極限的限制，難以實現(xiàn)高于200nm的分辨率。近年來，哈佛大學及其它大學的幾位學者提出可以將熒光分子活化與單分子中心定位技術相結(jié)合，突破光學衍射極限，實現(xiàn)納米尺度的分辨率(20-50nm)。這種技術的核心是通過特定波長的光照射使熒光分子發(fā)光并且進入暗態(tài)，然后用另一波長的活化光使暗態(tài)的熒光分子活化重新具備發(fā)光的能力，通過控制活化光的功率密度，使得成像區(qū)域中隨機恢復的熒光分子之間的距離大于光學衍射極限，從而能被傳統(tǒng)光學顯微鏡分辨。連續(xù)記錄這些單個熒光分子的圖像，并進行單分子中心精確定位，最后通過重建獲得具有納米尺度分辨率的熒光圖像。對于傳統(tǒng)的商業(yè)或研究用隨機光學重建顯微鏡(STORM), —般的激發(fā)光光源和活化光光源都用激光器，通過聲光可調(diào)濾光器(AOTF)的控制進行激發(fā)光和活化光的照明。然而，這種方法的缺點是激光器或聲光可調(diào)濾光器的價格比較昂貴，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
基于隨機光學重建的概念，同時為了克服現(xiàn)有超高分辨率顯微鏡的復雜性和高成本，本發(fā)明之目的在于提供一種新的隨機光學重建熒光顯微鏡及其實現(xiàn)方法，其通過外置照明系統(tǒng)與熒光顯微鏡組合，將普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺提供納米分辨率的超高分辨顯微鏡，且其成本大大低于商品化的同類顯微鏡產(chǎn)品。為達上述及其它目的，本發(fā)明提出一種隨機光學重建熒光顯微鏡，包括用于放置樣品的載物臺，緊挨該載物臺下方設置物鏡，另外，該顯微鏡還包括雙濾光片層，設置于該載物臺下方，包含兩層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒，一層用于走活化光路，一層用于走激光光路；活化光光源產(chǎn)生模塊，用于產(chǎn)生活化光，產(chǎn)生的活化光經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一層電動濾光片盒的二向色鏡及該物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供活化光；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，包括激光產(chǎn)生器、擴束裝置及聚焦裝置，該激光產(chǎn)生器產(chǎn)生的激發(fā)光，經(jīng)過該擴束裝置擴束、該聚焦裝置聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。進一步地，該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬鹵素燈或LED燈產(chǎn)生。
進一步地，該光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電
4動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光。進一步地，該上層電動濾光片盒中的二向色鏡周期性轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。進一步地，該顯微鏡利用一電動快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。進一步地，該激光產(chǎn)生器為半導體激光器，該半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從該顯微鏡的后口進入該顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。進一步地，該顯微鏡于成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實時調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。為達到上述及其他目的，本發(fā)明還提供一種隨機光學重建熒光顯微鏡的實現(xiàn)方法，用于改造普通單濾光片層的倒置熒光顯微鏡，包括如下步驟增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒以形成雙濾光片層；活化光光源產(chǎn)生模塊產(chǎn)生活化光光源，經(jīng)過擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺的樣品表面進行照明，提供活化光；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊利用激光產(chǎn)生器產(chǎn)生激光光光源，經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。進一步地，該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬鹵素燈或LED燈產(chǎn)生，該光源經(jīng)過該顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光。進一步地，該激光產(chǎn)生器為半導體激光器，半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從顯微鏡的后口進入顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。進一步地，于成像過程中，利用軟件控制該上層自動濾光片盒中的二向色鏡周期性的轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。進一步地，利用一電動快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明一種隨機光學重建熒光顯微鏡及其方法通過于普通的單濾光片層的熒光顯微鏡增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒，并利用汞燈等寬譜、便宜的光源作為隨機光學重建顯微鏡活化光光源，實現(xiàn)了將一臺普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺超高分辨顯微鏡的目的，大幅降低了實現(xiàn)超高分辨成像所需要的成本。


圖I為本發(fā)明一種隨機光學重建熒光顯微鏡的結(jié)構示意圖；圖2為本發(fā)明一種隨機光學重建顯微鏡的實現(xiàn)方法的步驟流程圖。
具體實施例方式以下通過特定的具體實例并結(jié)合

本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點與功效。本發(fā)明亦可通過其它不同的具體實例加以施行或應用，本說明書中的各項細節(jié)亦可基于不同觀點與應用，在不背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾與變更。
圖I為本發(fā)明一種隨機光學重建熒光顯微鏡的結(jié)構示意圖。如圖I所示，本發(fā)明一種隨機光學重建熒光顯微鏡，是在普通倒置熒光顯微鏡上進行改造形成的，該普通倒置突光顯微鏡為單濾光片層的顯微鏡，本發(fā)明之隨機光學重建突光顯微鏡，包括載物臺10、雙濾光片層11、活化光光源產(chǎn)生模塊12以及激光光光源產(chǎn)生模塊13。其中載物臺10用于放置試樣，緊挨著載物臺10下方設有物鏡(圖中未示出)，雙濾光片層11，設置于載物臺下方，是在原有的單濾光片層基礎上增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒形成的，一層用于走激光光路，一層走活化光光路；活化光光源產(chǎn)生模塊12，用于產(chǎn)生活化光光源，其產(chǎn)生的光源經(jīng)過擴束、聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進行照明，提供活化光，活化光光源產(chǎn)生模塊12可利用汞燈產(chǎn)生活化光光源，也可以利用金屬鹵素燈、LED燈等寬譜、便宜的光源，在本發(fā)明較佳實施例中，活化光光源產(chǎn)生模塊12的光源為一 100W的汞燈光源，汞燈光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光；激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊13，包括激光產(chǎn)生器130、擴束裝置131及聚焦裝置132，激光產(chǎn)生器130用于產(chǎn)生激發(fā)光光源，其經(jīng)過擴束裝置131擴束、聚焦裝置132聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光，在本發(fā)明較佳實施例中，激光產(chǎn)生器130為半導體激光器，半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從顯微鏡的后口進入顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。當然，除此之外，與普通倒置熒光顯微鏡一樣，本發(fā)明之隨機光學重建熒光顯微鏡還需CCD圖像傳感器(圖中未示出)，在此不予贅述。成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實時調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。成像過程中，可利用Micro Manager軟件控制上層自動濾光片盒中的二向色鏡周期性的轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光，以滿足STORM的成像要求，也可通過在活化光源前增加一電動快門以提供周期性的活化光，滿足STORM的成像要求。圖2為本發(fā)明一種隨機光學重建顯微鏡的實現(xiàn)方法的步驟流程圖。如圖2所示，本發(fā)明一種隨機光學重建顯微鏡的方法，用于改造普通單濾光片層的顯微鏡，包括如下步驟步驟201，增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒以形成雙濾光片層，一層走激光光路，一層走活化光路；步驟202，活化光光源產(chǎn)生模塊12產(chǎn)生活化光光源，其產(chǎn)生的光源經(jīng)過擴束、聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進行照明，提供活化光，活化光光源產(chǎn)生模塊12可利用汞燈產(chǎn)生活化光光源，也可以利用金屬鹵素燈、LED燈等寬譜、便宜的光源，在本發(fā)明較佳實施例中，活化光光源產(chǎn)生模塊12的光源為一 100W的汞燈光源，汞燈光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光；以及步驟203，激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊13利用激光產(chǎn)生器產(chǎn)生激光光光源，其經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)雙濾光片層11的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺10上的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光，在本發(fā)明較佳實施例中，激光產(chǎn)生器為半導體激光器，半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從顯微鏡的后口進入顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。較佳的，本發(fā)明于成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實時調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。同時，于成像過程中，用Micro Manager軟件控制上層自動濾光片盒中的二向色鏡周期性的轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光，以滿足STORM的成像要求，也可通過在活化光源前增加一電動快門以提供周期性的活化光，滿足STORM的成像要求。綜上所述，本發(fā)明一種隨機光學重建熒光顯微鏡及其實現(xiàn)方法通過于普通的單濾光片層的突光顯微鏡增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒，并利用萊燈作為隨機光學重建顯微鏡活化光光源，實現(xiàn)了將一臺普通倒置熒光顯微鏡改造為一臺超高分辨顯微鏡的目的，分辨率達到幾十納米級。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何本領域技術人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發(fā)明的權利保護范圍，應如權利要求書所列。
權利要求
1.一種隨機光學重建熒光顯微鏡，包括用于放置樣品的載物臺、CCD圖像傳感器及緊挨該載物臺下方設置的物鏡，其特征在于，該顯微鏡還包括雙濾光片層，設置于該載物臺下方，包含兩層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒，一層用于走活化光路，一層用于走激光光路；活化光光源產(chǎn)生模塊，用于產(chǎn)生活化光，產(chǎn)生的活化光經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一層電動濾光片盒的二向色鏡及該物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供活化光；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，包括激光產(chǎn)生器、擴束裝置及聚焦裝置，該激光產(chǎn)生器產(chǎn)生的激發(fā)光，經(jīng)過該擴束裝置擴束、該聚焦裝置聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。
2.如權利要求I所述的一種隨機光學重建熒光顯微鏡，其特征在于該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬鹵素燈或LED燈產(chǎn)生。
3.如權利要求2所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡，其特征在于該光源經(jīng)過顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光。
4.如權利要求3所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡,其特征在于該上層電動濾光片盒中的二向色鏡周期性轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。
5.如權利要求3所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡,其特征在于該顯微鏡利用一電動快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。
6.如權利要求I所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡，其特征在于該激光產(chǎn)生器為半導體激光器，該半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從該顯微鏡的后口進入該顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。
7.如權利要求I所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡，其特征在于該顯微鏡于成像過程中，通過紅外光照在樣品表面反射回的信息對物鏡的高度做實時調(diào)整，以防止因樣品漂移而產(chǎn)生垂直方向失焦現(xiàn)象。
8.一種隨機光學重建熒光顯微鏡的實現(xiàn)方法，用于改造普通單濾光片層的倒置熒光顯微鏡，包括如下步驟增加一層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒以形成雙濾光片層；活化光光源產(chǎn)生模塊產(chǎn)生活化光，經(jīng)過擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺的樣品表面進行照明，提供活化光；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊利用激光產(chǎn)生器產(chǎn)生激光光光源，經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)該雙濾光片層的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在該載物臺的樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。
9.如權利要求8所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡的實現(xiàn)方法,其特征在于該活化光光源產(chǎn)生模塊的光源利用汞燈或金屬齒素燈或LED燈產(chǎn)生，該光源經(jīng)過該顯微鏡自帶通道，擴束、聚焦后，從上層右口導入，經(jīng)上層電動濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供活化光。
10.如權利要求8所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡的實現(xiàn)方法,其特征在于該激光產(chǎn)生器為半導體激光器，半導體激光器經(jīng)過擴束、聚焦，從顯微鏡的后口進入顯微鏡，經(jīng)底層濾光片盒的二向色鏡、物鏡后照在樣品表面進行照明，提供激發(fā)光。
11.如權利要求8所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡的實現(xiàn)方法,其特征在于于成像過程中，利用軟件控制該上層自動濾光片盒中的二向色鏡周期性的轉(zhuǎn)換，提供周期性的活化光。
12.如權利要求8所述的一種隨機光學重建突光顯微鏡的實現(xiàn)方法,其特征在于利用一電動快門加在活化光源前以提供周期性的活化光。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種隨機光學重建熒光顯微鏡及其實現(xiàn)方法，該顯微鏡包括載物臺、電子耦合器件及緊挨載物臺下方的物鏡，其還包括雙濾光片層，設置于該載物臺下方，包含兩層電動轉(zhuǎn)換的濾光片盒；活化光光源產(chǎn)生模塊，產(chǎn)生活化光，產(chǎn)生的活化光經(jīng)擴束、聚焦后，經(jīng)雙濾光片層的一層電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺的樣品表面照明；以及激發(fā)光光源產(chǎn)生模塊，其產(chǎn)生的激發(fā)光，經(jīng)過擴束聚焦后，經(jīng)雙濾光片層的另一電動濾光片盒的二向色鏡及物鏡后照在載物臺的樣品表面照明，本發(fā)明可以使得傳統(tǒng)熒光顯微鏡的分辨率從光學衍射極限(200nm)提高到納米尺度(20-50nm)，且實現(xiàn)的成本遠低于目前的商業(yè)化超高分辨率顯微鏡產(chǎn)品。
文檔編號G02B21/36GK102937743SQ201210487879
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權日2012年11月26日
發(fā)明者邵志峰, 李小衛(wèi), 袁志偉, 翟人寬, 孫潔林 申請人:上海交通大學