專利名稱：一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)構(gòu)照明顯微系統(tǒng)，可以實現(xiàn)高速的光學(xué)超分辨和三維層析顯微成像，可廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)，生物物理以及材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展對微觀結(jié)構(gòu)的研究提出了越來越高的分辨率需求， 希望從分子水平揭示生命過程和材料性能的物理本質(zhì)。受光學(xué)衍射極限的限制，普通光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率一般只能達到200nm，縱向分辨率約500nm。這對于研究亞細胞結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)已無能為力。雖然電子顯微鏡和原子力顯微鏡可以達到亞納米的分辨率，但是其只能對非活性離體細胞樣品進行觀測的缺點限制了其在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
光學(xué)顯微成像技術(shù)根據(jù)探測模式可以分為兩大類即點掃描成像技術(shù)和寬場成像技術(shù)。
以激光共聚焦熒光顯微為代表的點掃描成像技術(shù)，用高度聚焦的激光束對樣品逐點掃描成像，熒光信號經(jīng)過探測針孔濾波后被光電倍增管探測收集，由于只有激光焦點處激發(fā)的熒光可以通過探測針孔，所以激光共聚焦顯微具有極低的背景噪聲，而且通過逐層掃描樣品，可以實現(xiàn)三維成像。但是激光共聚焦熒光顯微的橫向分辨率并沒有超過衍射極限。多光子熒光顯微與共聚焦顯微很類似，不同的是它使用超短脈沖激光作為激發(fā)光源，由于多光子吸收是非線性效應(yīng)，只發(fā)生在焦點處，所以探測器前不需要針孔濾光，并且由于激發(fā)光使用長波段的近紅外光，具有探測樣品更深層結(jié)構(gòu)的能力。
寬場成像技術(shù)采用面陣圖像傳感器(如(XD)，可以在一個時間點獲得一幅完整的二維圖像，具有速度快、圖像灰度級高等優(yōu)點。但是由于受樣品離焦部分的干擾，普通的寬場成像技術(shù)不具有三維層析成像能力。近年來，隨著各種新型熒光探針分子的出現(xiàn)和成像方法的改進，遠場光學(xué)成像的分辨率已經(jīng)突破了衍射極限的限制。其中方法之一是利用結(jié)構(gòu)照明的顯微技術(shù)(SIM)。SIM是一種寬場光學(xué)顯微技術(shù)，使用面陣C⑶并行采集圖像，與普通寬場顯微不同的是它還具有三維層析成像的能力。
結(jié)構(gòu)照明超分辨顯微的基本原理
顯微物鏡的空間分辨率取決于它能采集到的最大空間頻率&，f0取決于顯微物鏡的光學(xué)傳遞函數(shù)，f0 = 2ΝΑ/λ。當(dāng)樣品包含的高頻信息f > f0時，樣品的細節(jié)將難以被分辨。如果使用空間頻率為的正弦條紋結(jié)構(gòu)光照明樣品，則會產(chǎn)生空間頻率為乙=f"fj 的低頻莫爾條紋(MoiMfringes)。莫爾條紋實際上是樣品與結(jié)構(gòu)光的拍頻信號，它包含有樣品超衍射分辨的高頻信息f。當(dāng)fm < fo時，莫爾條紋可以在顯微物鏡下觀察到，通過軟件解碼，可以提取出樣品的超分辨率信息，重組出樣品的高分辨率圖像。從頻域來看，SIM將物鏡能收集到的最大空間頻率從fo提高到了 fo+A。因此越大，SIM顯微的空間分辨率就越高。但是結(jié)構(gòu)照明光場的空間頻率是受衍射極限限制的，當(dāng)> fo時，它將不能被分辨。因此，SIM顯微最大可以將光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍。結(jié)構(gòu)照明三維層4CN 102540446 A析成像顯微的基本原理普通的寬場顯微由于顯微物鏡有一定的景深，因此CCD相機得到的圖像實際上是像面信息和非像面信息的疊加。其中像面信息稱為目標(biāo)，非像面的信息成為了背景。正是由于非像面信息(背景)的干擾和影響，使得在研究像面信息(目標(biāo))時， 成像的信噪比和空間分辨率受到了很大的限制。結(jié)構(gòu)照明層析技術(shù)使用高空間頻率的結(jié)構(gòu)光場對樣品進行照明，能把寬場成像中的像面信息和非像面信息有效地分離，從而得到光切片或者層析圖。通過使用位移平臺在與光切片垂直的方向作線性掃描，可以得到樣品的三維層析圖。
結(jié)構(gòu)照明層析技術(shù)使用三步相移光場，使成像中的像面信息與非像面信息有效地分離。具體做法是把正弦結(jié)構(gòu)光場的初相位依次設(shè)定為0°、120°,240°,分別照明樣品，并使用C⑶相機采集圖像，依次對應(yīng)記錄為Itl, I120, I240 ；通過下列公式算法，計算出某一縱向位置ζ處的寬場層析圖Iz (x，y)_9] iz(x,y) = Wo -A20)2+(A2O -Z240)2 + σ240 -/q)2)]/2CD
大多數(shù)的結(jié)構(gòu)照明顯微系統(tǒng)都使用衍射光柵產(chǎn)生結(jié)構(gòu)照明光場。改變結(jié)構(gòu)光場的相位通常使用電控平移臺和旋轉(zhuǎn)臺移動衍射光柵位置來實現(xiàn)。發(fā)明專利201010218778. 1 提出一種使用四棱錐鏡進行結(jié)構(gòu)照明熒光顯微的方法和裝置。平行光束經(jīng)過四棱錐鏡后發(fā)生折射，并產(chǎn)生具有二維空間結(jié)構(gòu)分布的四光束干涉場。樣品被該光場激發(fā)。平移作用在樣品上的干涉光場并通過圖像處理算法，可以實現(xiàn)三維層析成像。但是在該專利中需要旋轉(zhuǎn)光路中的玻璃片來改變結(jié)構(gòu)光場的相位，這將不可避免地帶來機械振動并降低系統(tǒng)的時間分辨率。
2009年臺灣同步輻射研究中心Chang等人使用液晶空間光調(diào)制器(LC-SLM)代替衍射光柵對入射激光進行調(diào)制，進行了結(jié)構(gòu)照明顯微實驗，通過編程控制空間光調(diào)制器可以實時控制干涉光束之間的相位差從而改變結(jié)構(gòu)光場的強度分布。由于使用空間光調(diào)制器代替電控平臺和衍射光柵，整個顯微系統(tǒng)的時間分辨率和穩(wěn)定性都得到了很大的提高。但制約其時間分辨率的主要因素是液晶空間光調(diào)制器的刷新頻率以及圖像重建的軟件算法速度。普通的透射型液晶空間光調(diào)制器的刷新頻率通常為60Hz，填充因子小于70%，光透過率約為30%。發(fā)明內(nèi)容
針對目前結(jié)構(gòu)照明顯微光能利用率低，速度慢的技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種基于數(shù)字微鏡器件(Digital Micromirror Device,DMD)的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)及方法。 本發(fā)明有兩種工作模式超分辨顯微成像模式和三維層析成像模式。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)，其特殊之處在于包括照明光源1、設(shè)置在照明光源光路上的分光棱鏡2、設(shè)置在分光棱鏡2的反射光路上的結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生器3、設(shè)置在分光棱鏡2的透射光路上的透鏡4、設(shè)置在透鏡光路上的分光鏡5、設(shè)置在分光鏡5上方光路上的顯微物鏡6和載物臺7、設(shè)置在分光鏡5下方光路上的反光鏡8和筒鏡9、設(shè)置在筒鏡后方的CXD相機10。
上述結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生器3為數(shù)字微鏡器件DMD。
上述照明光源為非相干單色LED光源或復(fù)色LED光源。
一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微方法，其特殊之處在于包括以下步驟
1形成結(jié)構(gòu)照明光場
照明光源產(chǎn)生的照明光入射到分光棱鏡2上，入射光經(jīng)分光棱鏡2反射，垂直照射在數(shù)字微鏡器件DMD上，數(shù)字微鏡器件DMD使反射光透過分光棱鏡2入射到透鏡4上，再經(jīng)過分光鏡5，通過顯微物鏡從下方照明放置在載物臺上樣品，形成結(jié)構(gòu)照明光場；
2CCD相機采集二維圖像
2. 1加載三幅結(jié)構(gòu)照明光場
控制數(shù)字微鏡器件DMD先后加載三幅具有相同空間方向、不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場；
2. 2采集圖像
CXD相機通過顯微物鏡分別對應(yīng)采集三幅結(jié)構(gòu)照明光場不同相位的二維圖像，得到三幅不同相位的二維圖像；
3圖像處理
將三幅不同相位的二維圖像分別進行傅里葉變換，再通過圖像處理算法求解出各個二維圖像的傅里葉頻譜分量，得到在當(dāng)前空間方向上樣品的高階和低階傅里葉頻譜信息；
4改變結(jié)構(gòu)照明光場的空間方向
4. 1控制數(shù)字微鏡器件DMD改變結(jié)構(gòu)照明光場的空間方向，使改變后的當(dāng)前空間方向與步驟2中的空間方向垂直，
4. 2重復(fù)步驟2. 2和步驟3，得到在當(dāng)前空間方向上樣品的高階和低階傅里葉頻譜信息；
5把步驟3和步驟4得到的兩個空間方向上樣品高階和低階傅里葉頻譜信息移動到它們所在樣品頻譜中的正確位置，再將各個頻譜分量進行數(shù)字濾波后按一定權(quán)重疊加在一起，進而得到樣品的全部高階和低階傅里葉頻譜信息；
6將樣品的全部高階和低階傅里葉頻譜信息進行逆傅里葉變換，得到超分辨的樣品圖像。
一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微方法，其特殊之處在于包括以下步驟
1形成結(jié)構(gòu)照明光場
照明光源產(chǎn)生的照明光入射到分光棱鏡2上，入射光經(jīng)分光棱鏡2反射，垂直照射數(shù)字微鏡器件DMD，數(shù)字微鏡器件DMD使反射光透過分光棱鏡2入射到透鏡4，再經(jīng)過分光鏡5，通過顯微物鏡從下方照明樣品，形成結(jié)構(gòu)照明光場；
2控制數(shù)字微鏡器件DMD加載三幅不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場，CXD相機通過顯微物鏡分別對應(yīng)采集三幅不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場的二維切面圖像Io、I120和124(1，得到對應(yīng)層的二維切面圖像；
3通過公式⑴進行圖像運算得到樣品的層析圖像Iz(x，y)
權(quán)利要求
1.一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)，其特征在于包括照明光源 (1)、設(shè)置在照明光源光路上的分光棱鏡O)、設(shè)置在分光棱鏡O)的反射光路上的結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生器(3)、設(shè)置在分光棱鏡O)的透射光路上的透鏡G)、設(shè)置在透鏡光路上的分光鏡 (5)、設(shè)置在分光鏡( 上方光路上的顯微物鏡(6)和載物臺(7)、設(shè)置在分光鏡( 下方光路上的反光鏡(8)和筒鏡(9)、設(shè)置在筒鏡后方的CCD相機(10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生器⑶為數(shù)字微鏡器件DMD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)，其特征在于所述照明光源(1)為非相干單色LED光源或復(fù)色LED光源。
4.一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微方法，其特征在于包括以下步驟1形成結(jié)構(gòu)照明光場照明光源產(chǎn)生的照明光入射到分光棱鏡(2)上，入射光經(jīng)分光棱鏡(2)反射，垂直照射在數(shù)字微鏡器件DMD上，數(shù)字微鏡器件DMD使反射光透過分光棱鏡( 入射到透鏡(4)上， 再經(jīng)過分光鏡(5)，通過顯微物鏡從下方照明放置在載物臺上樣品，形成結(jié)構(gòu)照明光場； 2C⑶相機采集二維圖像 2.1加載三幅結(jié)構(gòu)照明光場控制數(shù)字微鏡器件DMD先后加載三幅具有相同空間方向、不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場； 2. 2采集圖像C⑶相機通過顯微物鏡分別對應(yīng)采集三幅結(jié)構(gòu)照明光場不同相位的二維圖像，得到三幅不同相位的二維圖像； 3圖像處理將三幅不同相位的二維圖像分別進行傅里葉變換，再通過圖像處理算法求解出各個二維圖像的傅里葉頻譜分量，得到在當(dāng)前空間方向上樣品的高階和低階傅里葉頻譜信息； 4改變結(jié)構(gòu)照明光場的空間方向4. 1控制數(shù)字微鏡器件DMD改變結(jié)構(gòu)照明光場的空間方向，使改變后的當(dāng)前空間方向與步驟2中的空間方向垂直，4.2重復(fù)步驟2. 2和步驟3，得到在當(dāng)前空間方向上樣品的高階和低階傅里葉頻譜 fn息；5把步驟3和步驟4得到的兩個空間方向上樣品高階和低階傅里葉頻譜信息移動到它們所在樣品頻譜中的正確位置，再將各個頻譜分量進行數(shù)字濾波后按一定權(quán)重疊加在一起，進而得到樣品的全部高階和低階傅里葉頻譜信息；6將樣品的全部高階和低階傅里葉頻譜信息進行逆傅里葉變換，得到超分辨的樣品圖像。
5.一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微方法，其特征在于包括以下步驟1形成結(jié)構(gòu)照明光場照明光源產(chǎn)生的照明光入射到分光棱鏡(2)上，入射光經(jīng)分光棱鏡(2)反射，垂直照射數(shù)字微鏡器件DMD，數(shù)字微鏡器件DMD使反射光透過分光棱鏡( 入射到透鏡G)，再經(jīng)過分光鏡(5)，通過顯微物鏡從下方照明樣品，形成結(jié)構(gòu)照明光場；2控制數(shù)字微鏡器件DMD加載三幅不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場，CCD相機通過顯微物鏡分別對應(yīng)采集三幅不同相位的結(jié)構(gòu)照明光場的二維切面圖像Io、I12ci和124(1，得到對應(yīng)層的二維切面圖像；3通過公式⑴進行圖像運算得到樣品的層析圖像Iz(x，y)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于數(shù)字微鏡器件的高速結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)及方法，包括照明光源、設(shè)置在照明光源光路上的分光棱鏡、設(shè)置在分光棱鏡的反射光路上的結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生器、設(shè)置在分光棱鏡的透射光路上的透鏡、設(shè)置在透鏡光路上的分光鏡、設(shè)置在分光鏡上方光路上的顯微物鏡和載物臺、設(shè)置在分光鏡下方光路上的反光鏡和筒鏡、設(shè)置在筒鏡后方的CCD相機。本發(fā)明針對目前結(jié)構(gòu)照明顯微光能利用率低，速度慢的技術(shù)問題，優(yōu)點是成像刷新速度快(32KHz)，光能利用率高(大于90％)，更適用于活體生物細胞的實時三維成像研究和快速的動態(tài)過程觀測。
文檔編號G02B26/08GK102540446SQ201110448980
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者嚴(yán)紹輝, 但旦, 葉彤, 姚保利, 李澤, 楊延龍, 雷銘 申請人:中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機械研究所