專利名稱：高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微系統(tǒng)，可廣泛 適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)，生物物理以及材料化學(xué)等領(lǐng)域的研究。
背景技術(shù)：
在材料化學(xué)以及生物學(xué)的研究中，科學(xué)家往往需要顯微鏡具有高空間分辨率的同 時(shí)還能夠檢測(cè)材料或生物細(xì)胞的分子構(gòu)成。隨著各種熒光探針的出現(xiàn)，使用不同的熒光探 針可以標(biāo)記樣品內(nèi)部不同的位置，從而可以探測(cè)樣品的分子構(gòu)成。熒光顯微鏡已經(jīng)成為化 學(xué)和生物樣品成像的有力工具。但是熒光顯微技術(shù)存在兩個(gè)缺點(diǎn)熒光探針的光漂白效應(yīng) 和熒光探針對(duì)樣品分子結(jié)構(gòu)的影響?；诜肿觾?nèi)部能級(jí)振動(dòng)特性的成像技術(shù)(紅外光譜和拉曼光譜)，既提供了分子 的振動(dòng)信息，又不用熒光標(biāo)記，是一種好的選擇。但是，紅外光的分辨率較低，再加上水在紅 外波段有較強(qiáng)的吸收，限制了紅外光譜在生物樣品成像上的應(yīng)用。將共焦顯微技術(shù)與拉曼 光譜技術(shù)結(jié)合，對(duì)樣品進(jìn)行功能性拉曼光譜成像，稱為共焦拉曼顯微術(shù)。該技術(shù)可以避免上 述問(wèn)題，且已經(jīng)有商業(yè)化的產(chǎn)品問(wèn)世。但是拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度很低并且難以避免熒光的干 擾。如果用來(lái)成像，有時(shí)需要曝光幾個(gè)小時(shí)。顯然不適用于許多需要?jiǎng)討B(tài)探測(cè)的研究。相干反斯托克斯拉曼散射(CoherentAnti-Stokes Raman Scattering，簡(jiǎn)稱 CARS)是一種相干散射過(guò)程。如圖1(a)所示，與拉曼光譜不同，相干反斯托克斯拉曼散射 是一種典型的三階非線性光學(xué)效應(yīng)，產(chǎn)生CARS需要將兩束超短脈沖激光，泵浦光(頻率為 ωρ)和斯托克斯光(頻率為《s)，同時(shí)匯聚于樣品上的一點(diǎn)，當(dāng)兩束光的頻率差(ωρ-ω3) 與樣品介質(zhì)的拉曼頻率(Ω)相同時(shí)，它們會(huì)在介質(zhì)中進(jìn)行相干混合產(chǎn)生一束新的反斯托 克斯拉曼散射光頻(《as = 2 p-cos)，即CARS信號(hào)。CARS信號(hào)以其散射強(qiáng)度高、方向性好、 背景干擾小，偏振特性等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)不僅可以對(duì)樣品進(jìn)行光譜研究，還可以在無(wú)需對(duì)樣品 染色的情況下對(duì)樣品進(jìn)行功能性成像，從而成為分子研究的有力工具。CARS顯微具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1、由于CARS是基于分子內(nèi)部振動(dòng)特性，所以不需要使用外來(lái)的熒光探針，不會(huì)對(duì) 樣品分子結(jié)構(gòu)造成影響。2,CARS信號(hào)具有較高的強(qiáng)度和很好的方向性，因此具有比普通拉曼散射顯微更高 的靈敏度。3、CARS是一種典型的三階非線性效應(yīng)，只能在激光的焦點(diǎn)出產(chǎn)生，通過(guò)光束掃描 可實(shí)現(xiàn)樣品的三維層析成像。4、CARS信號(hào)要比樣品的熒光信號(hào)具有更高的頻率，即使在較強(qiáng)的熒光背景中也能 被探測(cè)到。5、激發(fā)樣品的CARS信號(hào)通常需要使用短脈沖的近紅外鈦寶石飛秒脈沖激光器， 近紅外波段的光束在樣品中具有較高的穿透深度和很小的熱效應(yīng)。國(guó)外有很多大學(xué)和研究所在開(kāi)展這方面的研究工作。1999年，AndreasZumbusch等人通過(guò)使用共線強(qiáng)聚焦模式，首次得到了橫向分辨率為307nm的聚苯乙烯小球在 3053cm-l處的三維圖像；哈佛大學(xué)化學(xué)生物學(xué)系的Xie小組不僅在理論上對(duì)CARS顯微 術(shù)進(jìn)行了研究，而且對(duì)前向探測(cè)CARS顯微術(shù)(F-CARS)、背向探測(cè)CARS顯微術(shù)(E-CARS)、 偏振激發(fā)探測(cè)CARS顯微術(shù)(P-CARS)、多光譜CARS顯微術(shù)(M-CARS)、時(shí)間分辨CARS顯 微術(shù)(Time-resolved CARS)、外差探測(cè)CARS顯微術(shù)(I-CARS)和頻率調(diào)制CARS顯微術(shù) (FM-CARS)等做了細(xì)致的試驗(yàn)研究。近年來(lái)，有大量文章在Nature、Science、PRL、PNAS、 APL、OL等著名學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表，許多新的探測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于CARS顯微領(lǐng)域。德國(guó)馬堡大 學(xué)Motzkus小組使用整形的單個(gè)飛秒脈沖實(shí)現(xiàn)了 CARS顯微；新加坡國(guó)立大學(xué)Huang等人開(kāi) 展了外差偏振CARS顯微的研究，芬蘭Lappeenranta大學(xué)Vartiainen小組與荷蘭阿姆斯特 丹大學(xué)Borm小組合作，利用軟件處理直接消除CARS非共振背景噪聲并應(yīng)用于微流體化學(xué) 反應(yīng)的研究。CARS顯微技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于生物學(xué)，化學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在細(xì)胞生物學(xué)的研究 中，可以用來(lái)研究不同生物細(xì)胞中脂肪分子的分布與濃度；由于CARS顯微使用的近紅外的 激光束在生物組織內(nèi)有較大的穿透深度，所以還可以用來(lái)進(jìn)行生物組織的三維成像；在化 學(xué)領(lǐng)域的研究中，可以對(duì)各種有機(jī)或無(wú)機(jī)材料薄膜進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的分析與實(shí)時(shí) 成像觀察；在醫(yī)學(xué)研究中，CARS顯微還可用于腫瘤的成像?，F(xiàn)有的光學(xué)顯微技術(shù)根據(jù)探測(cè)模式可分為兩大類寬場(chǎng)成像技術(shù)和點(diǎn)掃描成像技 術(shù)。寬場(chǎng)成像技術(shù)采用面陣圖像傳感器(如CCD相機(jī))，可以在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得一幅完整 的二維圖像，具有速度快、圖像灰度級(jí)高等優(yōu)點(diǎn)。但是由于受樣品離焦部分的干擾，普通的 寬場(chǎng)成像技術(shù)不具有三維層析成像能力。目前大多數(shù)的CARS顯微都采用點(diǎn)掃描成像方式。 使用高度聚焦的激光束對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描，CARS顯微屬于三階非線性光學(xué)效應(yīng)，只有在激光 焦點(diǎn)處才能產(chǎn)生，激發(fā)出的CARS信號(hào)被光電倍增管探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，通 過(guò)軟件重新組合生成一個(gè)整體平面的或立體的像。但由采用逐點(diǎn)掃描的成像方式，因此成 像速度比寬視場(chǎng)顯微要慢很多，不能適用于某些要求高速實(shí)時(shí)觀察的活體光學(xué)顯微成像。 另外，由于激光焦點(diǎn)處極高的光能量密度，逐點(diǎn)掃描完整個(gè)樣品有可能對(duì)活體生物組織帶 來(lái)?yè)p傷。在生物學(xué)的研究中，很多時(shí)候并不需要對(duì)樣品成三維圖像，二維圖像就可以滿足要 求。因此如果可以發(fā)明一種高速度，寬視場(chǎng)的CARS顯微技術(shù)，將會(huì)給生物學(xué)的研究帶來(lái)方 便。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有的CARS顯微技術(shù)成像速度慢、對(duì)活體生物組織的光損傷嚴(yán)重等技 術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)及方法。本發(fā)明的第一技術(shù)解決方案一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特殊之處是包括泵浦激 光器1、設(shè)置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、設(shè)置在斯托克 斯光激光器3光路上的第二分束器42、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光時(shí)間同步的脈 沖同步控制器2、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光空間重合的合束鏡5、依次沿重合后 的泵浦光和斯托克斯光光路設(shè)置的聚焦物鏡7、樣品臺(tái)9、探測(cè)物鏡10、濾光片11、筒鏡12、 C⑶相機(jī)13以及計(jì)算機(jī)14。
上述泵浦激光器為鈦寶石激光器或光纖激光器；所述斯托克斯光激光器為OPO激 光器或光纖激光器。上述CXD相機(jī)13為電子倍增式CXD相機(jī)。上述速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)還可包括設(shè)置在合束鏡5和聚 焦物鏡7之間的反射鏡6。本發(fā)明的第二技術(shù)解決方案一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特殊之處是包括泵浦激 光器1、設(shè)置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、設(shè)置在斯托克斯 光激光器3光路上的第二分束器42、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光時(shí)間同步的脈沖 同步控制器2、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光空間重合的合束鏡5、依次沿重合后的 泵浦光和斯托克斯光光路設(shè)置的準(zhǔn)直鏡16和反射鏡6、設(shè)置在反射鏡6反射光路上的顯微 物鏡15和樣品臺(tái)9、依次設(shè)置在反射鏡6樣品臺(tái)上方的濾光片11、筒鏡12、CXD相機(jī)13以 及計(jì)算機(jī)14。上述泵浦激光器為鈦寶石激光器或光纖激光器；所述斯托克斯光激光器為OPO激 光器或光纖激光器。上述CXD相機(jī)13為電子倍增式CXD相機(jī)。本發(fā)明高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微方法，包括以下步驟1泵浦光激光器1發(fā)射的泵浦光通過(guò)脈沖同步控制器2與斯托克斯光激光器3發(fā) 射的斯托克斯光在時(shí)間上同步；2在時(shí)間上同步的泵浦光和斯托克斯光通過(guò)合束鏡5在空間上調(diào)節(jié)重合；3將樣品8放置在樣品臺(tái)9上；將時(shí)間和空間上重合的泵浦光和斯托克斯光弱匯 聚在樣品8上，使樣品產(chǎn)生CARS信號(hào)；聚焦光斑直徑50-200微米；4樣品產(chǎn)生的CARS信號(hào)經(jīng)過(guò)濾光片11和筒鏡12后進(jìn)入CXD相機(jī)13，從而得到 清晰的CARS圖像。上述方法還包括調(diào)節(jié)激光能量的步驟調(diào)節(jié)泵浦光激光器1和斯托克斯光激光器 3的能量，使作用在樣品上的激光能量密度為10_50μ J/cm2。上述方法還包括檢測(cè)樣品產(chǎn)生的信號(hào)是否為CRAS信號(hào)的步驟保持泵浦光和斯 托克斯光的功率不變，只改變他們的時(shí)間同步狀態(tài)，當(dāng)脈沖同步越好時(shí)信號(hào)越強(qiáng)，或者脈沖 同步差或者沒(méi)有時(shí)間同步時(shí)信號(hào)減弱或消失，則樣品產(chǎn)生的信號(hào)是CARS信號(hào)。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明利用相干反斯托克斯散射信號(hào)成像，是一種基于分子內(nèi)部能級(jí)振動(dòng)特性 的成像技術(shù)，可以探測(cè)樣品的化學(xué)構(gòu)成。與普通熒光顯微技術(shù)相比，具有不需要使用外來(lái)的 熒光探針，不會(huì)對(duì)樣品分子結(jié)構(gòu)造成影響的優(yōu)點(diǎn)。2、本發(fā)明使用電子倍增式CXD相機(jī)(EMCXD)采集樣品的CARS圖像，是一種寬場(chǎng)成 像技術(shù)，具有成像靈敏度高，速度快的優(yōu)點(diǎn)。3、本發(fā)明使用的激光能量密度低，對(duì)生物組織破壞比較小。本發(fā)明采用激光弱匯 聚方式，作用在樣品上的激光焦斑直徑大約為150 μ m。實(shí)驗(yàn)中控制激光平均功率，作用在樣 品上的激光能量密度10-50 μ J/cm2，僅為采用點(diǎn)掃描成像方式的CARS顯微技術(shù)所使用激光 能量密度的1/2000。但是可以產(chǎn)生較強(qiáng)的CARS信號(hào)，很多情況下并不需要開(kāi)啟電子倍增式CCD相機(jī)的電子倍增模式就完全可對(duì)單個(gè)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行成像。完全滿足大 多數(shù)生物實(shí)驗(yàn)的要求。4、本發(fā)明與點(diǎn)掃描式CARS顯微系統(tǒng)相比，具有成像靈敏度高，速度快，樣品光損 傷小的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明并且完全可對(duì)單個(gè)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行成像。滿足大多數(shù)活體 生物實(shí)驗(yàn)的要求。


圖1 (a)是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)能級(jí)圖；圖1 (b)是相干反斯托克斯拉 曼散射(CARS)相位匹配關(guān)系；圖2是高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微系統(tǒng)示意圖(前向探 測(cè))；圖3是高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微系統(tǒng)示意圖(背向探 測(cè))；圖4是C. elegans線蟲蟲卵的CARS成像；其中(a)明場(chǎng)圖像(b)CARS圖像；圖5水中移動(dòng)直徑6 μ m聚苯乙烯小球并進(jìn)行CARS成像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明第一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)為前向探測(cè)，如圖2 所示，由泵浦光激光器1 (ω p，可選用鈦寶石激光器或光纖激光器)、脈沖同步控制器2、斯托 克斯光激光器3 (ω3，可選用OPO激光器或光纖激光器)、第一分束器41、第二分束器42、合 束鏡5、多個(gè)反射鏡6、聚焦物鏡7、樣品8、樣品臺(tái)9、探測(cè)物鏡10、濾光片11、筒鏡12、電子 倍增式CXD相機(jī)(EMCXD) 13、計(jì)算機(jī)14組成。激光器的輸出光通過(guò)兩個(gè)分束器41和42分出一小部分(< 2% )，輸入脈沖同步 控制器2，脈沖同步控制器2根據(jù)分束器的入射光來(lái)時(shí)間同步兩臺(tái)激光器的輸出光脈沖。泵浦和斯托克斯光必須要做到時(shí)間上和空間上的同步，時(shí)間同步指兩個(gè)脈沖時(shí)間 重合，空間同步指兩束光線空間共線(重合)，時(shí)間同步由脈沖同步控制器2來(lái)實(shí)現(xiàn)，空間同 步由調(diào)節(jié)合束鏡5來(lái)實(shí)現(xiàn)。沿光軸方向微調(diào)聚焦物鏡7將重合后的泵浦光與斯托克斯光弱匯聚(聚焦光斑直 徑50-200微米)在放置在樣品臺(tái)9上的樣品8 ；前向CARS信號(hào)被探測(cè)物鏡10收集后經(jīng)過(guò)濾光片11和筒鏡12后進(jìn)入CXD相機(jī) 13，得到清晰的CARS圖像。本發(fā)明第二種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)為后向探測(cè)，如圖3 所示，由泵浦光激光器1 (ω p，可選用鈦寶石激光器或光纖激光器)、脈沖同步控制器2、斯托 克斯光激光器3 (ω s，可選用OPO激光器或光纖激光器)、分束器4、合束鏡5、合束鏡6、顯微 物鏡15、樣品8、樣品臺(tái)9、準(zhǔn)直鏡16、濾光片11、筒鏡12、電子倍增式CXD相機(jī)(EMCXD) 13、 計(jì)算機(jī)14組成。如圖3所示，這時(shí)只需要使用一個(gè)顯微物鏡7同時(shí)用來(lái)激發(fā)和探測(cè)CARS信號(hào)。泵 浦和斯托克斯光經(jīng)過(guò)合束鏡5后，再經(jīng)過(guò)一個(gè)準(zhǔn)直鏡16，由合束鏡6反射進(jìn)入顯微物鏡15， 顯微物鏡15將泵浦和斯托克斯光弱匯聚在樣品8上，調(diào)節(jié)準(zhǔn)直鏡16可以改變作用在樣品8上的激發(fā)光斑直徑(光斑直徑50-200微米)。背向CARS信號(hào)被顯微物鏡15收集后經(jīng)過(guò)合束鏡6、濾光片11和筒鏡12后進(jìn)入 CXD相機(jī)13，得到清晰的CARS圖像。本發(fā)明高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微方法，包括以下步驟1泵浦光激光器1發(fā)射的泵浦光通過(guò)脈沖同步控制器2與斯托克斯光激光器3發(fā) 射的斯托克斯光在時(shí)間上同步；2在時(shí)間上同步的泵浦光和斯托克斯光通過(guò)合束鏡5在空間上調(diào)節(jié)重合；3將時(shí)間和空間上重合的泵浦光和斯托克斯光弱匯聚，聚焦光斑直徑50-200微 米，調(diào)節(jié)泵浦光激光器1和斯托克斯光激光器3的能量，使作用在樣品上的激光能量密度為 10-50 μ J/cm2 ；再將樣品8放置在樣品臺(tái)上；4保持泵浦光和斯托克斯光的功率不變，只改變他們的時(shí)間同步狀態(tài)，當(dāng)脈沖同 步越好時(shí)信號(hào)越強(qiáng)，或者脈沖同步差或者沒(méi)有時(shí)間同步時(shí)信號(hào)減弱或消失，則樣品產(chǎn)生的 信號(hào)是CARS信號(hào)；5樣品產(chǎn)生的CARS信號(hào)經(jīng)過(guò)濾光片11和筒鏡12后進(jìn)入CXD相機(jī)13，從而得到 清晰的CARS圖像。具體操作步驟如下泵浦光激光器1通過(guò)脈沖同步控制器2與斯托克斯光激光器 3時(shí)間同步后，再由合束鏡5調(diào)節(jié)空間重合，重合后的泵浦光與斯托克斯光經(jīng)過(guò)反射鏡6后 進(jìn)入聚焦物鏡7，聚焦物鏡7將重合后的泵浦光與斯托克斯光弱匯聚在樣品8上，焦斑直徑 約為150m。樣品8位于樣品臺(tái)9上，通過(guò)控制樣品臺(tái)9可以三維移動(dòng)樣品8。由于泵浦光 與斯托克斯光會(huì)在樣品內(nèi)部發(fā)生散射和折射，微觀上可以滿足產(chǎn)生CARS所需要的相位匹 配條件。產(chǎn)生的CARS信號(hào)被探測(cè)物鏡10收集后經(jīng)過(guò)濾光片11、筒鏡12后進(jìn)入電子倍增式 CXD相機(jī)(EMCXD) 13，通過(guò)計(jì)算機(jī)14可以控制電子倍增式CXD相機(jī)(EMCXD) 13的增益系數(shù)、 CCD制冷溫度以及曝光時(shí)間，從而得到清晰的CARS圖像。本發(fā)明的理論基礎(chǔ)CARS是一種典型的三階非線性光學(xué)效應(yīng)，需要滿足相位匹配條件， kas-(2kp-ks) |1 < π，如圖1(b)所示，其中，、，1^，1^分別為泵浦光，斯托克斯光和041 光
的波矢，1是激光與物質(zhì)的相互作用長(zhǎng)度。采用點(diǎn)掃描成像方式的CARS顯微技術(shù)通常使用 高數(shù)值孔徑(NA)的顯微物鏡(NA通常大于0.8)來(lái)匯聚激光束，激光束可以被匯聚到幾百 納米尺度的一個(gè)焦點(diǎn)與樣品進(jìn)行相互作用。因此光與物質(zhì)的相互作用長(zhǎng)度1就非常小(只 有幾百納米)，并且由于高數(shù)值孔徑物鏡的強(qiáng)聚焦作用使得激光焦點(diǎn)附近的光場(chǎng)具有各個(gè) 角度的光矢量分量，因此在使用點(diǎn)掃描成像技術(shù)時(shí)，CARS相位匹配條件很容易得到滿足。寬場(chǎng)顯微技術(shù)通常將激光束弱聚焦為直徑幾十至幾百微米尺度的光斑來(lái)照明樣 品，如果按照高度聚焦光場(chǎng)才能滿足相位匹配的理論來(lái)分析，寬場(chǎng)顯微技術(shù)很難滿足產(chǎn)生 CARS所需要的相位匹配條件。眾所周知，生物實(shí)驗(yàn)中用到的絕大多數(shù)生物樣品都必須處于培養(yǎng)液環(huán)境，生物組 織與其周圍的培養(yǎng)液之間總是存在折射率差異。因此當(dāng)激光照射生物組織時(shí)會(huì)發(fā)生光的折 射或者散射，散射或者折射光的波矢在各個(gè)方向都有分量，由于樣品組織內(nèi)光的折射和散 射現(xiàn)象的普遍存在。我們認(rèn)為，泵浦光、斯托克斯光和CARS光的波矢kp，ks，kas在生物組織 的內(nèi)部在微觀上尺度下也可以滿足相位匹配條件，產(chǎn)生CARS信號(hào)?；谶@個(gè)理論，本發(fā)明提出一種高速寬視場(chǎng)CARS顯微技術(shù)。兩束高重復(fù)頻率(76MHz)同步、重合的脈沖激光(ωρ， ω3)弱匯聚于樣品上(光斑直徑約為150 μ m)，使用電子倍增式C⑶相機(jī)(EMCXD)作為探測(cè) 器。實(shí)現(xiàn)了 33fps的重復(fù)頻率的動(dòng)態(tài)CARS顯微，完全滿足一般活體生物樣品成像的要求。 提高了現(xiàn)有CARS顯微技術(shù)的成像速度，更適用于活體生物的實(shí)驗(yàn)研究。CARS信號(hào)分為前向和背向兩種，一般來(lái)說(shuō)前向CARS信號(hào)強(qiáng)，主要由較大樣品(尺 寸微米量級(jí))產(chǎn)生，背向CARS信號(hào)弱，主要由小樣品產(chǎn)生(尺寸亞微米或納米量級(jí))。我們 提出的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微裝置可以探測(cè)前向CARS信號(hào)，也 可以測(cè)量背向CARS信號(hào)。實(shí)施例1圖4是本發(fā)明裝置對(duì)C. elegans線蟲蟲卵的CARS成像實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中的聚焦物鏡 為IOX顯微物鏡，NA = 0. 4，探測(cè)物鏡為40X顯微物鏡，NA = 0. 85，標(biāo)尺10 μ m，泵浦光激光 器選用鈦寶石激光器，脈沖寬度3ps，重復(fù)頻率76MHz，波長(zhǎng)700-980nm可調(diào)。斯托克斯光激 光器選用OPO激光器，脈沖寬度6ps，重復(fù)頻率76MHz，波長(zhǎng)680-990nm可調(diào)。實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)兩 激光器的波長(zhǎng)差，使之于脂肪分子的CH2鍵生共振，共振頻率2850CHT1?？梢郧宄赜^察到 C. elegans線蟲蟲卵的細(xì)胞膜以及內(nèi)部的脂肪組織。圖像對(duì)比度很高，EMCXD曝光時(shí)間0. 5 秒。實(shí)施例2圖5是在水中移動(dòng)直徑6 μ m聚苯乙烯小球并進(jìn)行CARS成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中 的聚焦物鏡為IOX顯微物鏡，NA = 0. 4，探測(cè)物鏡為40X顯微物鏡，NA = 0. 85，標(biāo)尺10 μ m, 泵浦光激光器選用鈦寶石激光器，脈沖寬度3ps，重復(fù)頻率76MHz，波長(zhǎng)700-980nm可調(diào)。斯 托克斯光激光器選用OPO激光器，脈沖寬度6ps，重復(fù)頻率76MHz，波長(zhǎng)680-990nm可調(diào)。實(shí) 驗(yàn)時(shí)調(diào)節(jié)兩激光器的波長(zhǎng)差，使之于聚苯乙烯分子的CH鍵發(fā)生共振，共振頻率βΟδΟοπΓ1?？?以清楚地觀察到水中移動(dòng)聚苯乙烯小球的動(dòng)態(tài)過(guò)程。可實(shí)現(xiàn)33fps的圖像采集速率。本發(fā) 明完全適用于一般活體生物體的成像研究。
權(quán)利要求
1.一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征在于包括泵浦激光器 1、設(shè)置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、設(shè)置在斯托克斯光激 光器3光路上的第二分束器42、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光時(shí)間同步的脈沖同步 控制器2、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光空間重合的合束鏡5、依次沿重合后的泵浦 光和斯托克斯光光路設(shè)置的聚焦物鏡7、樣品臺(tái)9、探測(cè)物鏡10、濾光片11、筒鏡12、CXD相 機(jī)13以及計(jì)算機(jī)14。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征在 于所述泵浦激光器為鈦寶石激光器或光纖激光器；所述斯托克斯光激光器為OPO激光器 或光纖激光器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征 在于所述CXD相機(jī)13為電子倍增式CXD相機(jī)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征在 于還包括設(shè)置在合束鏡5和聚焦物鏡7之間的反射鏡6。
5.一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征在于包括泵浦激光器 1、設(shè)置在泵浦激光器1光路上的第一分束器41、斯托克斯光激光器3、設(shè)置在斯托克斯光激 光器3光路上的第二分束器42、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光時(shí)間同步的脈沖同步 控制器2、用于調(diào)節(jié)泵浦激光和斯托克斯光激光空間重合的合束鏡5、依次沿重合后的泵浦 光和斯托克斯光光路設(shè)置的準(zhǔn)直鏡16和反射鏡6、設(shè)置在反射鏡6反射光路上的顯微物鏡 15和樣品臺(tái)9、依次設(shè)置在反射鏡6樣品臺(tái)上方的濾光片11、筒鏡12、CXD相機(jī)13以及計(jì) 算機(jī)14。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征在 于所述泵浦激光器為鈦寶石激光器或光纖激光器；所述斯托克斯光激光器為OPO激光器 或光纖激光器。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)，其特征 在于所述CXD相機(jī)13為電子倍增式CXD相機(jī)。
8.一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微方法，其特征在于包括以下步驟1泵浦光激光器1發(fā)射的泵浦光通過(guò)脈沖同步控制器2與斯托克斯光激光器3發(fā)射的 斯托克斯光在時(shí)間上同步；2在時(shí)間上同步的泵浦光和斯托克斯光通過(guò)合束鏡5在空間上調(diào)節(jié)重合；3將樣品8放置在樣品臺(tái)9上；將時(shí)間和空間上重合的泵浦光和斯托克斯光弱匯聚在 樣品8上，使樣品產(chǎn)生CARS信號(hào)；聚焦光斑直徑50-200微米；4樣品產(chǎn)生的CARS信號(hào)經(jīng)過(guò)濾光片11和筒鏡12后進(jìn)入CXD相機(jī)13，從而得到清晰 的CARS圖像。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微方法，其特征在 于還包括調(diào)節(jié)激光能量的步驟調(diào)節(jié)泵浦光激光器1和斯托克斯光激光器3的能量，使作 用在樣品上的激光能量密度為10-50 μ J/cm2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微方法，其特征 在于還包括檢測(cè)樣品產(chǎn)生的信號(hào)是否為CRAS信號(hào)的步驟保持泵浦光和斯托克斯光的功 率不變，只改變他們的時(shí)間同步狀態(tài)，當(dāng)脈沖同步越好時(shí)信號(hào)越強(qiáng)，或者脈沖同步差或者沒(méi)有時(shí)間同步時(shí)信號(hào)減弱或消失，則樣品產(chǎn)生的信號(hào)是CARS信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高速寬視場(chǎng)相干反斯托克斯拉曼散射顯微系統(tǒng)及方法，用空間和時(shí)間完全重合的泵浦激光和斯托克斯光激光進(jìn)行弱匯聚，使樣品產(chǎn)生CARS信號(hào)；CARS信號(hào)經(jīng)過(guò)濾光片和筒鏡后進(jìn)入CCD相機(jī)，從而得到清晰的CARS圖像。本發(fā)明利用相干反斯托克斯散射信號(hào)成像，是一種基于分子內(nèi)部能級(jí)振動(dòng)特性的成像技術(shù)，可以探測(cè)樣品的化學(xué)構(gòu)成，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行成像，完全滿足大多數(shù)生物實(shí)驗(yàn)的要求。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的CARS顯微技術(shù)成像速度慢、對(duì)活體生物組織的光損傷嚴(yán)重等技術(shù)問(wèn)題，與普通熒光顯微技術(shù)相比，具有不需要使用外來(lái)的熒光探針，不會(huì)對(duì)樣品分子結(jié)構(gòu)造成影響的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G02F1/35GK102116929SQ20111003329
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者嚴(yán)紹輝, 但旦, 葉彤, 姚保利, 雷銘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所