專(zhuān)利名稱(chēng)：具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學(xué)顯微成像技術(shù)，尤其涉及一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法及裝置。
背景技術(shù)：
眾所周知，納米分辨熒光成像可以以納米的空間分辨率直觀(guān)地顯示被標(biāo)記分子在 被標(biāo)記物內(nèi)的空間分布，并能用來(lái)研究被標(biāo)記分子之間的相互作用過(guò)程，尤其可用來(lái)研究 細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和運(yùn)動(dòng)規(guī)律，是將細(xì)胞作為“試管”在位研究 主要生物大分子相互作用規(guī)律的重要工具。近年來(lái)出現(xiàn)了一類(lèi)利用熒光標(biāo)記物本身的開(kāi)關(guān) 效應(yīng)的熒光標(biāo)記物定位顯微技術(shù)，通過(guò)時(shí)分復(fù)用、質(zhì)心定位以及圖像復(fù)合來(lái)進(jìn)行納米分辨 成像，例如光敏定位顯微(PALM)，隨機(jī)光學(xué)重建顯微(STORM)等等。它們?cè)诿總€(gè)時(shí)刻獲取稀 疏分布的熒光標(biāo)記物的定位信息，然后將不同時(shí)刻獲得的定位信息疊加，最終實(shí)現(xiàn)高橫向 納米分辨，如果結(jié)合軸向分辨輔助元件或方法，例如在探測(cè)光路引入柱面鏡，或利用熒光自 干涉，或多焦面探測(cè)(MUM、dMUM)，還可以實(shí)現(xiàn)軸向的納米分辨。然而，如果將這類(lèi)分子定位顯微直接用于厚達(dá)一二十微米甚至更厚的細(xì)胞成像， 來(lái)自非焦平面熒光分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)將直接影響焦平面熒光分子的質(zhì)心定位精度，從而 降低橫向空間分辨率。正因?yàn)槿绱?，目前這些方法大都以結(jié)合全內(nèi)反射熒光顯微(TIRF) 的方式實(shí)現(xiàn)，通過(guò)TIRF只激發(fā)表面的熒光分子，從而有效遏制了非焦平面的熒光信號(hào)。但 TIRF同時(shí)也帶來(lái)一定的局限性，即這種成像方式只局限于細(xì)胞膜表面IOOnm左右范圍內(nèi)的 成像，應(yīng)用范圍受到很大限制。因此，對(duì)具有一定厚度的樣品，例如細(xì)胞進(jìn)行三維納米分辨 成像時(shí)，通常的做法是將開(kāi)關(guān)分子的稀疏程度降到很低的水平，單純依靠軸向分辨以及軸 向掃描手段實(shí)現(xiàn)三維納米分辨成像。但是，考慮到不同深度熒光開(kāi)關(guān)分子信號(hào)的疊加對(duì)定 位精度會(huì)產(chǎn)生影響，這種成像方式對(duì)熒光態(tài)分子稀疏程度的要求大大增加；而且，非探測(cè)區(qū) 域內(nèi)熒光分子的無(wú)效激發(fā)也使得這些分子面臨過(guò)早被漂白的危險(xiǎn)；同時(shí)，由于不同深度被 激發(fā)而發(fā)的熒光相互疊加，常常不得不拋棄一些發(fā)光點(diǎn)，從而進(jìn)一步降低了圖像信息的獲 取速率，使獲得完整三維圖像的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。單分子定位顯微需要結(jié)合一些輔助手段實(shí)現(xiàn)三 維納米成像。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種高效的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米 分辨成像方法及裝置，旨在解決現(xiàn)有分子定位顯微成像效率低的問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像 方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟產(chǎn)生激發(fā)光和熄滅光，所述激發(fā)光和熄滅光分別由激發(fā)光源和熄滅光源產(chǎn)生；分光，將所述激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，將所述熄滅光分成第一熄滅 光和第二熄滅光；
調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相位差和強(qiáng)度比，使所述第一激發(fā)光和第二激發(fā)光經(jīng)相對(duì)放置的第一物鏡和第二物鏡后相干形成激發(fā)光軸向調(diào)制照明作用于樣 品，所述樣品內(nèi)均勻分布有熒光標(biāo)記物，其中所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相位差 為(2η+2) π，其中n為非負(fù)整數(shù);調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差和強(qiáng)度比，使所述第一熄滅光和第二熄滅光經(jīng)所述第一物鏡和第二物鏡后相干形成熄滅光軸向調(diào)制照明作用于所述樣品， 其中所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差為(2η+1) π 士 δ，其中η為非負(fù)整數(shù)，δ 為所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差允許的誤差值；探測(cè)熒光，由探測(cè)器探測(cè)所述熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光；質(zhì)心定位，根據(jù)探測(cè)到的熒光確定所述熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向掃描，軸向移動(dòng)所述樣品，或調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的強(qiáng)度 比和所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的強(qiáng)度比，使所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光和所述 第一熄滅光與第二熄滅光在所述樣品的軸向不同位置實(shí)現(xiàn)所述軸向調(diào)制照明，探測(cè)所述熒 光標(biāo)記物發(fā)出的熒光，從而確定所述熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，結(jié)合所述熒光標(biāo)記物的二維位置及軸向位置，獲取所述樣品的三維納 米分辨圖像。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納 米分辨成像裝置，包括激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；熄滅光源，用于產(chǎn)生熄滅光；激發(fā)光分 光器件，用于將所述激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光；熄滅光分光器 件，用于將所述熄滅光源發(fā)出的熄滅光分成第一熄滅光和第二熄滅光；激發(fā)光光程調(diào)整裝 置，用于調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的光程差；激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置，用于調(diào)整 所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的強(qiáng)度比；熄滅光光程調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一熄 滅光與第二熄滅光之間的光程差；熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一熄滅光與第二 熄滅光之間的強(qiáng)度比；第一物鏡和第二物鏡，使所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光相對(duì)照射并 相干，同時(shí)使所述第一熄滅光與第二熄滅光相對(duì)照射并相干；微調(diào)樣品臺(tái)，用于放置和調(diào) 整具有熒光標(biāo)記物的樣品的位置，所述熒光標(biāo)記物為具有開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光分子或熒光分子 團(tuán)；探測(cè)器，用于探測(cè)所述熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光；多個(gè)鏡片，用于調(diào)整光路及導(dǎo)出所述熒 光。本發(fā)明實(shí)施例中所述激發(fā)光源和熄滅光源發(fā)出的光分光后經(jīng)過(guò)光強(qiáng)及光程調(diào)整 裝置調(diào)整形成軸向調(diào)制照明作用于樣品，所述樣品內(nèi)的熒光標(biāo)記物發(fā)出熒光，所述軸向調(diào) 制照明使處于樣品軸向中心位置的熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率最大，遠(yuǎn)離樣品軸向中心 位置的熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率大大降低，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞等厚樣品內(nèi)熒光標(biāo)記物的軸向 選擇性激發(fā)，避免了熒光標(biāo)記物定位顯微用于細(xì)胞等厚樣品成像時(shí)，不同層中處于熒光態(tài) 的熒光標(biāo)記物的相互串?dāng)_，降低了單次成像中無(wú)效成像的熒光標(biāo)記物數(shù)量，提高成像效率， 同時(shí)避免處于非探測(cè)層的熒光標(biāo)記物的無(wú)效激發(fā)次數(shù)以及可能的光漂白。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光三維納米分辨成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光三維納米分辨成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖(光源部分細(xì)化)；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中光程調(diào)整裝置另一種結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例第一層次的軸向選擇性激發(fā)中激發(fā)光和熄滅光形成的駐波 沿樣品軸向的強(qiáng)度分布圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例第一層次的軸向選擇性激發(fā)中熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概 率沿樣品軸向分布的曲線(xiàn)圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例更高層次的軸向選擇性激發(fā)中激發(fā)光和熄滅光形成的駐波 沿樣品軸向的強(qiáng)度分布圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例更高層次的軸向選擇性激發(fā)中熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概 率沿樣品軸向分布的曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。如圖1和圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光三維納米分辨成像裝置包括光源、分 光器、光強(qiáng)及光程調(diào)整裝置、微調(diào)樣品臺(tái)和探測(cè)器以及若干鏡片，樣品內(nèi)均勻分布有熒光標(biāo) 記物。所述光源由激發(fā)光源38和熄滅光源39組成，與此相對(duì)應(yīng)地，所述分光器具有激發(fā)光 分光器7和熄滅光分光器20，所述光強(qiáng)及光程調(diào)整裝置具有激發(fā)光光強(qiáng)及光程調(diào)整裝置和 熄滅光光強(qiáng)及光程調(diào)整裝置。所述微調(diào)樣品臺(tái)15為壓電陶瓷樣品臺(tái)。激發(fā)光和熄滅光的波 長(zhǎng)均取決于所采用的熒光標(biāo)記物的激發(fā)譜。一般來(lái)說(shuō)，激發(fā)光波長(zhǎng)在激發(fā)譜中激發(fā)較弱的 譜段選??；而熄滅光波長(zhǎng)在激發(fā)譜中激發(fā)較強(qiáng)的譜段選取。本實(shí)施例以Cy5作為熒光標(biāo)記 物，與此相適應(yīng)，所述激發(fā)光源38系產(chǎn)生中心波長(zhǎng)為514nm，帶寬為IOnm激發(fā)光的光源，此 波長(zhǎng)的光經(jīng)本成像裝置傳輸后可使熒光標(biāo)記物處于熒光狀態(tài)；所述熄滅光源39系產(chǎn)生中 心波長(zhǎng)為647nm，帶寬為IOnm熄滅光的光源，此波長(zhǎng)的光經(jīng)本成像裝置傳輸后可使熒光標(biāo) 記物處于非熒光狀態(tài)。為易于分析所述熒光標(biāo)記物的開(kāi)關(guān)特性，所述激發(fā)光和熄滅光優(yōu)選 單色性好的激光。為將原來(lái)為相干光的激發(fā)光和熄滅光轉(zhuǎn)化為成像裝置所需的非相干光， 所述激發(fā)光和熄滅光的傳輸光路上設(shè)散射片2，所述散射片2由電機(jī)3驅(qū)動(dòng)高速旋轉(zhuǎn)。為將 所述激發(fā)光擴(kuò)大到成像裝置所需的大小，所述激發(fā)光的傳輸光路上設(shè)準(zhǔn)直擴(kuò)束裝置4，所述 激發(fā)光經(jīng)此裝置后，被準(zhǔn)直擴(kuò)束成一束平行光。為排除帶寬之外雜光的影響，所述激發(fā)光的 傳輸光路上設(shè)第一窄帶濾光片5。經(jīng)所述第一窄帶濾光片5過(guò)濾的激發(fā)光的傳輸光路上設(shè) 方位角偏振片6，所述激發(fā)光變成方位角偏振光，這樣的激發(fā)光就適用于調(diào)制照明沿軸向的 強(qiáng)度分布公式。所述激發(fā)光分光器7將具有方位角偏振特性的激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第 二激發(fā)光，所述激發(fā)光分光器7為50/50分光棱鏡。本實(shí)施例中所述第一激發(fā)光經(jīng)由激發(fā) 光光程調(diào)整裝置、第一雙色鏡11、第一管鏡12、第二雙色鏡13和第一物鏡14照射至樣品， 所述激發(fā)光光程調(diào)整裝置由調(diào)整架10和設(shè)于所述調(diào)整架10的角錐棱鏡9構(gòu)成，所述調(diào)整 架10優(yōu)選高精度一維調(diào)整架，所述角錐棱鏡9(圖3a)可由相互垂直的反射鏡片40、41 (圖 3b)代替，這樣就可以調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的光程差。所述第一雙色鏡 11對(duì)波長(zhǎng)為514士 IOnm的激發(fā)光反射；所述第一管鏡12為成像透鏡；所述第一物鏡14為復(fù)消色差物鏡，其放大倍率為10(^，數(shù)值孔徑^々為1.4。所述第一激發(fā)光經(jīng)所述角錐棱鏡9出射后由所述第一雙色鏡11反射進(jìn)入所述第一管鏡12，從所述第一管鏡12出射后由所 述第二雙色鏡13反射進(jìn)入所述第一物鏡14，從所述第一物鏡14出射后照射至設(shè)于所述微 調(diào)樣品臺(tái)15上的樣品，所述微調(diào)樣品臺(tái)15由微調(diào)裝置驅(qū)動(dòng)，其軸向定位精度為39nm。這樣 就可以對(duì)樣品中不同深度的熒光標(biāo)記物的狀態(tài)進(jìn)行軸向掃描。本實(shí)施例中所述第二激發(fā)光 經(jīng)由激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第三雙色鏡25、第二管鏡26、第四雙色鏡27和第二物鏡28照射 至樣品。所述激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置為一個(gè)可調(diào)中性濾光片31，這樣就可以調(diào)整所述第一激 發(fā)光與第二激發(fā)光之間的強(qiáng)度比。所述第二激發(fā)光從所述激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置出射后，經(jīng) 所述第三雙色鏡25反射進(jìn)入所述第二管鏡26，從所述第二管鏡26出射后由所述第四雙色 鏡27反射進(jìn)入所述第二物鏡28，從所述第二物鏡28出射后照射至設(shè)于所述微調(diào)樣品臺(tái)15 上的樣品。所述第二管鏡26亦為成像透鏡，所述第二物鏡28為復(fù)消色差物鏡，其放大倍率 為10(^，數(shù)值孔徑1六為1.4。本實(shí)施例中所述熄滅光的傳輸光路與激發(fā)光的傳輸光路類(lèi)似，所述熄滅光源發(fā)出 的激光經(jīng)散射片2、準(zhǔn)直擴(kuò)束裝置17、第二窄帶濾光片18和方位角偏振片19傳輸至熄滅 光分光器20，此散射片2、準(zhǔn)直擴(kuò)束裝置17、第二窄帶濾光片18和方位角偏振片19適用于 647 士 IOnm的激光。所述熄滅光分光器20將具有方位角偏振的熄滅光分成第一熄滅光和第 二熄滅光，所述熄滅光分光器20為50/50分光棱鏡。本實(shí)施例中所述第一熄滅光經(jīng)由熄滅 光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第一雙色鏡11、第一管鏡12、第二雙色鏡13和第一物鏡14照射至樣品。 所述熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置亦為一個(gè)可調(diào)中性濾光片29，這樣就可以調(diào)整所述第一熄滅光與 第二熄滅光之間的強(qiáng)度比。所述第一熄滅光從所述熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置出射后，經(jīng)反射鏡 反射，再經(jīng)所述第一雙色鏡11透射進(jìn)入所述第一管鏡12，從所述第一管鏡12出射后由所 述第二雙色鏡13反射進(jìn)入所述第一物鏡14，從所述第一物鏡14出射后照射至設(shè)于所述微 調(diào)樣品臺(tái)15上的樣品。本實(shí)施例中所述第二熄滅光經(jīng)由熄滅光光程調(diào)整裝置、第三雙色鏡 25、第二管鏡26、第四雙色鏡27和第二物鏡28照射至樣品，所述熄滅光光程調(diào)整裝置亦由 調(diào)整架23和設(shè)于所述調(diào)整架23的角錐棱鏡22構(gòu)成，所述調(diào)整架23優(yōu)選高精度一維調(diào)整 架，所述角錐棱鏡22 (圖3c)可由相互垂直的反射鏡片42、43(圖3d)代替，這樣就可以調(diào) 整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的光程差。所述第二熄滅光由所述角錐棱鏡22出射 后經(jīng)所述第三雙色鏡25透射進(jìn)入所述第二管鏡26，從所述第二管鏡26出射后由所述第四 雙色鏡27反射進(jìn)入所述第二物鏡28，從所述第二物鏡28出射后照射至設(shè)于所述微調(diào)樣品 臺(tái)15上的樣品，所述微調(diào)樣品臺(tái)15由微調(diào)裝置驅(qū)動(dòng)，其軸向定位精度為39nm。這樣就可以 對(duì)樣品中不同深度的熒光標(biāo)記物的狀態(tài)進(jìn)行軸向掃描。所述第一雙色鏡11和第三雙色鏡 25均對(duì)波長(zhǎng)為647 士 IOnm的激光透射。本發(fā)明實(shí)施例提供的顯微成像裝置具有第一層次的軸向選擇性激發(fā)和更高層次 的軸向選擇性激發(fā)。第一層次的軸向選擇性激發(fā)中，激發(fā)光源38和熄滅光源39發(fā)出的光 均設(shè)為相干光，激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)光分光器7分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，此第 一激發(fā)光和第二激發(fā)光經(jīng)傳輸，分別在第一物鏡14和第二物鏡28的后焦面聚焦，再經(jīng)第一 物鏡14和第二物鏡28擴(kuò)散成平行光束，相對(duì)照射到樣品；調(diào)整激發(fā)光光程調(diào)整裝置，使第 一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相對(duì)相位差為(2η+2) π (η為非負(fù)整數(shù))，所述第一激發(fā)光與 第二激發(fā)光形成駐波照明作用于樣品，使樣品內(nèi)的熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)。第一層次的軸向選擇性激發(fā)中，熄滅光源發(fā)出的光經(jīng)熄滅光分光器20分成第一熄滅光和第二熄滅光，此 第一熄滅光和第二熄滅光經(jīng)傳輸，亦分別在第一物鏡14和第二物鏡28的后焦面聚焦，再經(jīng) 第一物鏡14和第二物鏡28擴(kuò)散成平行光束，相對(duì)照射到樣品；調(diào)整熄滅光光程調(diào)整裝置， 使第一熄滅光與第二熄滅光之間的相對(duì)相位差為(2η+1) π 士 δ (η為非負(fù)整數(shù))，δ為所 述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差允許的誤差值，所述誤差值S在0 0.4π范圍 內(nèi)取值。所述第一熄滅光與第二熄滅光形成駐波照明共同作用于樣品，使樣品內(nèi)的熒光標(biāo) 記物處于非熒光態(tài)，如圖4所示。根據(jù)熒光標(biāo)記物本身的開(kāi)關(guān)特性以及樣品中熒光標(biāo)記物 的密度，調(diào)整第二激發(fā)光和\或第一熄滅光的光強(qiáng)和\或激發(fā)光與熄滅光之間的強(qiáng)度比，所 述激發(fā)光和熄滅光形成的駐波照明使得熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率沿樣品軸向分布具 有調(diào)制性，也就是說(shuō)，實(shí)現(xiàn)了熒光標(biāo)記物的軸向選擇性激發(fā)。如果樣品中熒光標(biāo)記物均勻分 布，處于熒光態(tài)的大部分熒光標(biāo)記物將集中在層寬(半高全寬)< IOOnm的幾層，如圖5所 示。由此可知，第一層次的軸向選擇性激發(fā)可以降低熒光標(biāo)記物定位顯微的背景噪聲。
更高層次的軸向選擇性激發(fā)中，激發(fā)光源和熄滅光源發(fā)出的光均設(shè)為非相干光。 激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)光分光器7分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，第一激發(fā)光經(jīng)由激發(fā) 光光程調(diào)整裝置、第一雙色鏡11、第一管鏡12和第二雙色鏡13傳輸至第一物鏡14的后焦 面形成具有一定大小的空間非相干的面光源，再經(jīng)第一物鏡14形成寬場(chǎng)照明；第二激發(fā)光 經(jīng)由激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第三雙色鏡25、第二管鏡26和第四雙色鏡27傳輸至第二物鏡 28的后焦面形成具有一定大小的空間非相干的面光源，再經(jīng)第二物鏡28形成寬場(chǎng)照明；這 樣第一激發(fā)光和第二激發(fā)光就相對(duì)照射到放置于壓電陶瓷樣品臺(tái)上的樣品。角錐棱鏡9的 位置由高精度一維調(diào)整架在軸向進(jìn)行調(diào)整，使得第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相對(duì)光程 差為(2η+2) π (η為非負(fù)整數(shù))；激發(fā)光可調(diào)中性濾光片31調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激 發(fā)光之間的強(qiáng)度比。所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光形成科勒照明作用于樣品，使樣品內(nèi)的 熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)。此更高層次的軸向選擇性激發(fā)中，熄滅光源發(fā)出的光經(jīng)熄滅光分 光器20分成第一熄滅光和第二熄滅光，第一熄滅光經(jīng)由熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第一雙色鏡 11、第一管鏡12和第二雙色鏡13傳輸至第一物鏡14的后焦面形成具有一定大小的空間非 相干的面光源，再經(jīng)第一物鏡14形成寬場(chǎng)照明；第二熄滅光經(jīng)由熄滅光光程調(diào)整裝置、第 三雙色鏡25、第二管鏡26和第四雙色鏡27傳輸至第二物鏡28的后焦面形成具有一定大小 的空間非相干的面光源，再經(jīng)第二物鏡28形成寬場(chǎng)照明；這樣第一熄滅光和第二熄滅光就 相對(duì)照射到放置于壓電陶瓷樣品臺(tái)上的樣品。角錐棱鏡9的位置由高精度一維調(diào)整架在軸 向進(jìn)行調(diào)整，使得第一熄滅光與第二熄滅光之間的相對(duì)光程差為(2η+1) π ；熄滅光可調(diào)中 性濾光片29調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的強(qiáng)度比。所述第一熄滅光與第二熄 滅光形成科勒照明共同作用于樣品，使樣品內(nèi)的熒光標(biāo)記物處于非熒光態(tài)。空間非相干光 的引入，使得遠(yuǎn)離軸向中心位置的熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率大大降低。如果樣品中熒 光標(biāo)記物分布均勻，大部分處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物集中在層寬(半高全寬)< IOOnm的 一層。由此可知，更高層次的軸向選擇性激發(fā)顯著降低熒光標(biāo)記物定位顯微的背景噪聲。樣品內(nèi)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光經(jīng)由第一物鏡14收集，第二雙色鏡13透射，第三窄 帶濾光片32過(guò)濾，第三管鏡33透射，最終成像在第一探測(cè)器34 ；所述第一探測(cè)器34為電 子倍增CCD探測(cè)器(EMCCD)。對(duì)第一探測(cè)器34獲得的熒光圖像進(jìn)行分析，可以獲得熒光標(biāo) 記物的定位信息。為獲得樣品內(nèi)不同深度的圖像，有以下兩種方式一、具有軸向精密移動(dòng)功能的微調(diào)樣品臺(tái)帶動(dòng)樣品在軸向移動(dòng)；二、調(diào)整所述相對(duì)光程差，使激發(fā)光和熄滅光光強(qiáng) 分布沿軸向移動(dòng)。此兩種軸向掃描方式結(jié)合二維質(zhì)心定位法實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記物的三維納米定 位。多次成像獲得的定位信息疊加，并通過(guò)樣品本身軸向移動(dòng)或者激發(fā)光/熄滅光強(qiáng)度分 布的軸向移動(dòng)，結(jié)合三維重構(gòu)，最終獲得樣品的三維納米分辨成像。本實(shí)施例優(yōu)選微調(diào)樣品 臺(tái)沿軸向精密移動(dòng)的方式。為更加高效地獲得三維納米分辨成像，探測(cè)結(jié)構(gòu)中還可以結(jié)合其他具有軸向定位 功能的結(jié)構(gòu)和算法，例如多焦面探測(cè)結(jié)構(gòu)(MUM、dMUM)和軸向定位算法(MUMLA)。此時(shí)，除第 一探測(cè)器34上獲得的部分熒光信號(hào)外；樣品內(nèi)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的另一部分熒光還可經(jīng)第 二物鏡28收集，第四雙色鏡27透射，第四窄帶濾光片35過(guò)濾，第四管鏡36透射，最終成像 在第二探測(cè)器37 ；通過(guò)所述軸向定位算法MUMLA分析第一探測(cè)器34和第二探測(cè)器37獲得 熒光圖像，計(jì)算出探測(cè)到的熒光標(biāo)記物的三維納米定位信息。由于軸向定位算法MUMLA是 一種可選的輔助軸向定位方法，因此圖1中的第四窄帶濾光片35、第四管鏡36和第二探測(cè) 器37均用虛線(xiàn)表示。第一探測(cè)器34多次曝光成像，或者結(jié)合MUMLA后，第一探測(cè)器34和 第二探測(cè)器37多次同時(shí)曝光成像，可以迅速獲得樣品與軸向垂直的某一薄層或若干薄層 內(nèi)所有熒光標(biāo)記物的三維納米定位信息。
所述第一層次的軸向選擇性激發(fā)和更高層次的軸向選擇性激發(fā)中，激發(fā)光源和熄 滅光源發(fā)出的光分光后經(jīng)過(guò)光強(qiáng)及光程調(diào)整裝置調(diào)整形成調(diào)制照明，所述激發(fā)光和熄滅光 沿樣品軸向的強(qiáng)度分布滿(mǎn)足以下公式
<formula>formula see original document page 9</formula>
其中QiS照射到樣品上的空間非相干光與樣品軸向的夾角；CIi為Qi的最大值， Ct1= α2 = 60。 ；I1 = Ιλ1 {1+Γ! cos [2k! cos ( θ ) ζ]}, I2 = Ιλ2 {l-r2 cos [2k2cos ( θ ) ζ]}； Ιλ2/Ιλ1 = 500。其中，Ιλ 為強(qiáng)度常數(shù)α為調(diào)制對(duì)比度，ri = r2 = 0. 9屯=2叫π / λ i ； λ i 為波長(zhǎng)，λ i = 514nm，λ 2 = 647nm ；^ 為折射率，Ii1 = 1. 512，n2 = 1. 520 ；下標(biāo) i 表示 對(duì)應(yīng)變量與激發(fā)光(i = 1)或熄滅光(i = 2)相關(guān)。激發(fā)光和熄滅光形成的駐波沿軸向的 強(qiáng)度分布，如圖6所示。在這種照明方式下，熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率ρ為ρ = kon/(kon+koff)-----②其中，k。n、k。ff為開(kāi)關(guān)速率，分別與激發(fā)光和熄滅光強(qiáng)度成正比k。n = η -----③，k。ff = η 2Ρ2-----④其中，1、η2為兩個(gè)比例系數(shù)常數(shù)，對(duì)于Cy5，有1 = 4/15，η2 = 4/11。利用式① 式④，經(jīng)過(guò)數(shù)值計(jì)算，可以得到熒光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率P沿樣 品軸向分布的曲線(xiàn)，如圖7所示，它只存在一個(gè)峰，層寬(半高全寬)為39nm;樣品軸向中 心位置P = 0. 025，遠(yuǎn)離樣品軸向中心位置處于熒光態(tài)的概率是位于樣品軸向中心位置熒 光標(biāo)記物處于熒光態(tài)的概率的1/50 ；樣品軸向中心位置附近90%處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記 物位于厚度為90nm的薄層內(nèi)。這表明，本裝置實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞等厚樣品內(nèi)熒光標(biāo)記物的軸向選 擇性激發(fā)。MUMLA算法實(shí)現(xiàn)樣品內(nèi)熒光標(biāo)記物的三維納米定位。MUMLA算法使用的兩幅源 圖像由第一探測(cè)器34和第二探測(cè)器37獲得，MUMLA算法的橫向定位精度比傳統(tǒng)的質(zhì)心定 位方法提高了 20% 35%;當(dāng)采集到的熒光標(biāo)記物數(shù)大于1000時(shí)，MUMLA算法可以對(duì)深度為O 500nm的熒光標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)20 30nm的軸向定位精度。 本實(shí)施例中壓電陶瓷樣品臺(tái)的軸向移動(dòng)步長(zhǎng)為39nm，確保軸向掃描結(jié)束后，所有 軸向上的熒光標(biāo)記物均受到一致的激活次數(shù)。本發(fā)明基于軸向選擇性激發(fā)，得到高效的成像裝置。每次曝光成像時(shí)，大部分處于 熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物集中于樣品的一個(gè)薄層或若干薄層中，避免了熒光標(biāo)記物定位顯微用 于細(xì)胞等厚樣品成像時(shí)，不同層中處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物的相互串?dāng)_，降低了單次成像 中無(wú)效成像的熒光標(biāo)記物數(shù)量，提高成像效率，同時(shí)避免處于非探測(cè)層的熒光標(biāo)記物的無(wú) 效激發(fā)次數(shù)以及可能的光漂白。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，如將光程調(diào)整裝置的位置跟光強(qiáng)調(diào)整 裝置的位置進(jìn)行調(diào)換，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟產(chǎn)生激發(fā)光和熄滅光，所述激發(fā)光和熄滅光分別由激發(fā)光源和熄滅光源產(chǎn)生；分光，將所述激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，將所述熄滅光分成第一熄滅光和第二熄滅光；調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相位差和強(qiáng)度比，使所述第一激發(fā)光和第二激發(fā)光經(jīng)相對(duì)放置的第一物鏡和第二物鏡后相干形成激發(fā)光軸向調(diào)制照明作用于樣品，所述樣品內(nèi)均勻分布有熒光標(biāo)記物，其中所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相位差為(2n+2)π，其中n為非負(fù)整數(shù)；調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差和強(qiáng)度比，使所述第一熄滅光和第二熄滅光經(jīng)所述第一物鏡和第二物鏡后相干形成熄滅光軸向調(diào)制照明作用于所述樣品，其中所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差為(2n+1)π±δ，其中n為非負(fù)整數(shù)，δ為所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差允許的誤差值；探測(cè)熒光，由探測(cè)器探測(cè)所述熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光；質(zhì)心定位，根據(jù)探測(cè)到的熒光確定所述熒光標(biāo)記物的二維位置；軸向掃描，軸向移動(dòng)所述樣品，或調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的強(qiáng)度比和所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的強(qiáng)度比，使所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光和所述第一熄滅光與第二熄滅光在所述樣品的軸向不同位置實(shí)現(xiàn)所述軸向調(diào)制照明，探測(cè)所述熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光，從而確定所述熒光標(biāo)記物的軸向位置；三維重構(gòu)，結(jié)合所述熒光標(biāo)記物的二維位置及軸向位置，獲取所述樣品的三維納米分辨圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征 在于，所述熒光標(biāo)記物為具有開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光蛋白分子、熒光染料分子或熒光量子點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征 在于，所述熄滅光為使所述熒光標(biāo)記物從熒光態(tài)轉(zhuǎn)化為非熒光態(tài)所需的光源；所述激發(fā)光 為使所述熒光標(biāo)記物從非熒光態(tài)轉(zhuǎn)化為熒光態(tài)所需的光源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其 特征在于，所述激發(fā)光和熄滅光均為空間非相干光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特 征在于，所述激發(fā)光軸向調(diào)制照明的調(diào)制度由所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間強(qiáng)度比控 制；所述熄滅光軸向調(diào)制照明的調(diào)制度由所述第一熄滅光與第二熄滅光之間強(qiáng)度比控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征 在于，所述誤差值δ在O 0.4 π范圍內(nèi)取值。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征 在于，所述激發(fā)光與熄滅光之間的強(qiáng)度比為1/50 1/5000。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法，其特征 在于，所述第一激發(fā)光聚焦于所述第一物鏡的后焦面，所述第二激發(fā)光聚焦于所述第二物 鏡的后焦面；所述第一熄滅光聚焦于所述第一物鏡的后焦面，所述第二熄滅光聚焦于所述 第二物鏡的后焦面。
9.一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像裝置，包括 激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；熄滅光源，用于產(chǎn)生熄滅光；激發(fā)光分光器件，用于將所述激發(fā)光源發(fā)出的激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光； 熄滅光分光器件，用于將所述熄滅光源發(fā)出的熄滅光分成第一熄滅光和第二熄滅光； 激發(fā)光光程調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的光程差； 激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的強(qiáng)度比； 熄滅光光程調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的光程差； 熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置，用于調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的強(qiáng)度比； 第一物鏡和第二物鏡，使所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光相對(duì)照射并相干，同時(shí)使所述 第一熄滅光與第二熄滅光相對(duì)照射并相干；微調(diào)樣品臺(tái)，用于放置和調(diào)整具有熒光標(biāo)記物的樣品的位置，所述熒光標(biāo)記物為具有 開(kāi)關(guān)效應(yīng)的熒光分子或熒光分子團(tuán)；探測(cè)器，用于探測(cè)所述熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光； 多個(gè)鏡片，用于調(diào)整光路及導(dǎo)出所述熒光。
10.如權(quán)利要求9所述的具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像裝置，其特征 在于，所述多個(gè)鏡片包括第一雙色鏡、第二雙色鏡、第三雙色鏡、第四雙色鏡、第一管鏡和第 二管鏡；所述第一激發(fā)光經(jīng)由激發(fā)光光程調(diào)整裝置、第一雙色鏡、第一管鏡和第二雙色鏡傳 輸至第一物鏡的后焦面形成空間非相干面光源，再經(jīng)所述第一物鏡形成寬場(chǎng)照明；所述第 二激發(fā)光經(jīng)由激發(fā)光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第三雙色鏡、第二管鏡和第四雙色鏡傳輸至第二物鏡 的后焦面形成空間非相干面光源，再經(jīng)所述第二物鏡形成寬場(chǎng)照明；所述第一熄滅光經(jīng)由 熄滅光光強(qiáng)調(diào)整裝置、第一雙色鏡、第一管鏡和第二雙色鏡傳輸至第一物鏡的后焦面形成 空間非相干面光源，再經(jīng)所述第一物鏡形成寬場(chǎng)照明；第二熄滅光經(jīng)由熄滅光光程調(diào)整裝 置、第三雙色鏡、第二管鏡和第四雙色鏡傳輸至第二物鏡的后焦面形成空間非相干面光源， 再經(jīng)所述第二物鏡形成寬場(chǎng)照明。
全文摘要
本發(fā)明適用于細(xì)胞等樣品三維成像，提供了一種具有軸向選擇性激發(fā)的熒光三維納米分辨成像方法及裝置。所述方法包括以下步驟產(chǎn)生激發(fā)光和熄滅光；分光，將所述激發(fā)光分成第一激發(fā)光和第二激發(fā)光，將所述熄滅光分成第一熄滅光和第二熄滅光；調(diào)整所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光之間的相位差和強(qiáng)度比，調(diào)整所述第一熄滅光與第二熄滅光之間的相位差和強(qiáng)度比，使所述第一激發(fā)光與第二激發(fā)光和所述第一熄滅光與第二熄滅光在樣品軸向的一個(gè)薄層或幾個(gè)薄層處相干形成軸向調(diào)制照明實(shí)現(xiàn)軸向選擇性激發(fā)。所述軸向選擇性激發(fā)使大部分處于熒光態(tài)的熒光標(biāo)記物集中分布在軸向幾個(gè)或一個(gè)薄層內(nèi)，大大抑制了厚樣品成像時(shí)的背景噪聲，提高了圖像信息獲取速率。
文檔編號(hào)G02B21/36GK101813822SQ20101010347
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者于斌, 牛憨笨, 陳丹妮 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)